JP3754584B2

JP3754584B2 - 微生物測定システムの検出感度チェック方法及び感度チェックに使用するチェックシート

Info

Publication number: JP3754584B2
Application number: JP31020499A
Authority: JP
Inventors: 寿洋高橋
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2006-03-15
Anticipated expiration: 2019-10-29
Also published as: JP2001120300A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ法を利用して微生物の存在を検知する微生物迅速検装置（以下、ＲＭＤＳという。）の感度チェックに係り、特に、感度ックに使用するためのサンプルとなる感度チェックシート及びこれを使用する感度チェック方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
例えば、ＡＴＰ−ルシフェラーゼ法を利用した微生物迅速検査装置（ＲＭＤＳ）は、生きた細胞に特異的にまとまって存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を利用してルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を行わしめ、ＡＴＰ含量に比例して発生する微小な発光を光度検出器で検出することにより、微生物の存在を確認するもので、この発光状態をＣＣＤ等の撮影手段を用いて映像化し、視覚的に観察することができる。
【０００３】
ＲＭＤＳで行う微生物検査は、先ず、検体液を濾過して生菌をフィルター上に補足し、このフィルターを微生物発光画像解析システムを用いて検出する。この微生物発光画像解析システムは、生菌を捕捉したフィルターを抽出試薬及び発光試薬で処理した後、標本ホルダーにセットし、光学系及び撮像手段（ＣＣＤ等）で構成されたテレビカメラを上記フィルターにできるだけ近接させてセッティングし、フィルターの発光状態を撮影し、画像処理装置、データ解析装置を介して画像データをディスプレイで表示、観察したり、解析結果をプリントアウトする。
【０００４】
図１は、微生物迅速検査装置（ＲＭＤＳ）１０のシステムの概要を示し、１はテーパーファイバー、光増幅部及び撮像管（ＣＣＤ）からなる高感度テレビカメラ、カメラコントローラ２、イメージプロセッサ３、データ解析装置４、テレビモニター５から構成されている。測定は、発光処理した生菌を保持したフィルター６を高感度テレビカメラ１に接近させておき、カメラコントローラ２及びイメージプロセッサ３を用いて光子を所定時間、例えば、２〜１８０秒間蓄積し、菌体からの発光を撮像し、データ解析装置４により発光ノイズを消去して生菌による強い発光のみを残してテレビモニター５に表示する。この処理によって菌体由来以外の発光がノイズとして消去され、測定された輝点数は生菌の数となる。微生物による発光点は、例えば、図２に示すように、撮像管の画素単位の座標により表示することができ（図２中、”１”は微生物による発光点を示す。）、フィルター６と撮像管との位置関係を関連付けておくことにより、フィルター６の位置での発光点を確認することができる。
【０００５】
このＲＭＤＳによる測定は、主として試料に噴霧する試薬の活性の度合、フィルター上に供給する試薬の量、検出器の感度が適正でかつ正常であることで初めて安定した測定が可能となる。
ＲＭＤＳの感度、即ち、検出器の感度のみをチェックするのであれば、ＲＭＤＳの検出限界に対応する発光量と同等の発光量を有する標準光源を用い、この標準光源の出力する光を輝点として認識することにより所定の感度が得られているか否かをチェックすることができる。
【０００６】
しかし、現実のＡＴＰ微発光を観測する場合、ＡＴＰの発光は発光試薬との反応により得られるものであるから、発光試薬の性能の良否、噴霧状態の良否（即ち、発光試薬噴霧器の良否）、等も観測の可不可に大きく係わり、装置の感度が実質的に問題なくても、観測できない場合がある。したがって、感度のチェックをする場合、試薬そのもの及び試薬噴霧状態に問題がないことを確認した上で装置の感度チェックをしなければ正確な感度のチェックができない。
【０００７】
これまで、試薬の活性、検出器の感度等、個別の要素、部分については、それぞれチェックする方法があるが、システム全体についての感度を保証する方法はこれまでなかった。
増殖の遅い微生物をＲＭＤＳの検出限界付近で測定するような場合、少しの感度の劣化で微生物の存在を見逃してしてしまう可能性がある。したがって、このような場合は、常に安定した感度のもとで測定していることを確認してなくてはならない。また、複数のシステムを複数の工場等で稼働させるためにシステムの感度の校正が必要となる。これを行うために、特定の微生物を用いてこれを検出できるか否かで確認を行う場合もあるが、定量的ではない。
【０００８】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたもので、誤差の少ない再現性のあるＲＭＤＳの感度のチェック方法とこれに使用するための基準となるチェックシートの作成方法を提供することにある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上述の従来の問題点を解決するためのもので、実際のＡＴＰ微発光観測と同等の状態でＲＭＤＳの感度チェックを行うことができ、かつ、発光試薬の良否、試薬噴霧器の噴霧特性の良否の影響を受けないＲＭＤＳシステムの感度チェック方法及びそれに使用する感度チェックシートを提供することにある。
【００１０】
即ち、シート上に、濃度が既知のＡＴＰを所要量滴下し、シート上の複数個所にＡＴＰスポットを形成し、当該シート上にＡＴＰ抽出試薬及びＡＴＰ発光試薬を噴霧して作成されたシートをサンプルとして、ＲＭＤＳにて当該サンプルのＡＴＰの微発光の有無を確認することによってＲＭＤＳのシステムの感度を確認するようにしたＲＭＤＳの感度チェック方法を提供することにある。
【００１１】
また、本発明は上記のように作製された感度確認用チェックシートを提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記課題は本発明の以下の手段により解決される。
本発明は新規な微生物測定システムの感度のチェック方法を提供するものであり、本発明の検出感度チェック方法は、
試料に抽出試薬と発光試薬を噴霧し、試料中のＡＴＰを検出する微生物測定装置により測定する微生物測定システムにおける検出感度のチェック方法であって、
定められた濃度のＡＴＰ溶液をシート上の周辺近傍部の定められた複数個所に滴下して乾燥させて製造してなる疎水性を有するチェックシートに抽出試薬、エタノール又はメタノールを噴霧して一時的に親水性を付与させた後、当該チェックシートに発光試薬を噴霧して、微生物測定装置により発光量を測定し、当該測定値が前記定められた濃度のＡＴＰ溶液の発光量を前記微生物測定システムで測定することにより予め定めた発光量に達しているか否かを判定して微生物測定システムの検出感度をチェックするようにしたことを特徴とする。
【００１３】
本発明のチェックシートを使用して微生物測定装置により発光量を測定することにより、発光試薬の品質、発光試薬の噴霧操作の適正度、測定装置自体の精度を含め、微生物測定システム全体の感度のチェックが可能となる。
また、本発明による微生物測定システムの検出感度のチェックに使用するチェックシートは、定められた濃度のＡＴＰ溶液をシート上に複数個所滴下して乾燥させて形成してなる微生物検出器により測定することのできるようにした構成であり、予めこのチェックシートを用意しておくことにより、必要の際に迅速に測定システム全体の検出感度をチェックすることができ、また、長期にわたり保存可能であり、使用に際しては、微生物測定装置でシート上の試料を測定するのと同じように発光量を測定するだけで測定システム全体の感度のチェックを行うことができる。
【００１４】
また、チェックシートは、シート上の周辺近傍の４個所にＡＴＰ溶液を滴下して作製することにより、少ないＡＴＰの滴下量で試薬の噴霧操作の適正度を含む検出感度のチェックを効果的に行うことができる。
また、ＡＴＰを定められた濃度に調整するための希釈液としてｐＨ７．５のリン酸バッファー液を用いることにより、ＡＴＰの発光度を高めることができ、また、保存期間を長くすることができる。
【００１５】
また、本発明による微生物測定システムの検出感度チェック用チェックシートは、シート上に定められた濃度のＡＴＰ溶液をシート上に複数個所滴下し、乾燥させてＡＴＰを保持させるようにして製造することができ、複雑な操作を必要としないで製造できる。
また、検出感度チェック用シートは、フィルターを載置するための複数の凹部が形成され、該凹部の底部にはＡＴＰ溶液を滴下する位置を示す印と、シートの基準位置と対応させる位置を示す表示部を有するシートホルダーを使用することにより、所定の位置に的確にＡＴＰを滴下することが可能となり、また、複数のチェックシートを効率的に作製することを可能とする。
【００１６】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態について図面と共に説明する。
先ず、本発明によるＲＭＤＳによる感度チェックに用いるチェックシート２０は、１例として図３に示すように、ＲＭＤＳに使用する試料保持用の円形フィルターと同一仕様のものを使用し、シートにＡＴＰの希釈液を４点滴下してチェックシート２０を作製したものである。
【００１７】
ここで、チェックシート２０の作製は以下の手順で行う。
（１）ＡＴＰ溶液（Parmacia 社製、Adenosine 5'-Triphosphate 27-2056-01 100 mM, pH 7.5)を10 mM リン酸 buffer pH 7.5で8 ×10⁶希釈する。
（２）減菌したシートをホルダー（後述する。）にセットする。（３）ガスクロ用のマイクロシリンジ（１μｌ）を使用してで０．９μｌのＡＴＰ溶液をとる。
【００１８】
（４）マイクロシリンジから０．２μｌを押し出し水滴を作る。
（５）水滴をシートに接触させ、シートに移す。
（６）１枚のシートに４点、水滴を落とす。
（７）ホルダーごとデシケータに入れ、５分間、吸引・乾燥させる、もしくは、インデックス式スプレーの乾燥器を利用する。
【００１９】
（８）乾燥したシートはすぐ使用されるものを除き、保存のため、少なくともＡＴＰを有する面をシールして保護する。１例として、ビニール等のシートに入れて、ポリシーラーでシールする。
（９）ビニールシートに製造Lot No. を記入して−２０°Ｃで保存する。
以上がＲＭＤＳの感度チェックシートの作製手順であるが、上記工程（２）において使用するＡＴＰ溶液滴下用のシートホルダーについて説明する。
【００２０】
図４は本願発明の実施例に係るシートホルダーホルダー３０を示す。シートホルダー３０は円盤３１からなる。円盤３１は中心軸３１ａを中心に回動可能に支持されるもので、図５に示す円形のフィルター４０を載置するための円形凹部３２が４個所形成される。この円形凹部３２の一部には、円盤３１の表面から円形凹部３２の底部３２ａにかけて傾斜して形成される矩形状切欠き部３３が形成されている。この切欠き部３３は円形凹部３２内に置かれたフィルター４０をピンセット等で取り出す際に操作を容易にするためのものである。
【００２１】
各円形凹部３２の底部３２ａには、４個所のＡＴＰ滴下位置を示す刻印３４が施されている。この刻印３４は円形凹部３２の底部３２ａのやや周辺部の近傍に４個所、等間隔に形成される。また、各円形凹部３２の所定位置には載置されるフィルター３０との位置関係を特定するための基準位置表示部となる細孔３５が円盤３１貫通して形成されている。
【００２２】
フィルター４０はリング枠４１にポリカーボネートの薄膜４２から成り、リング枠４１の一部に基準位置を示す表示部４１ａを有している。フィルター４０を上記フィルターホルダー３０の円形凹部３２に載置する際にはフィルター４０の表示部４１ａを円形凹部３２の細孔３５に合わせてセットする。
なお、上記シートに用いるフィルターの素材については、疎水性の高いもの、例えば、ポリカーボネートの外、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリスルフォン、ポリビニルデンフルオライド等がよい。これはシート上に滴下したＡＴＰが拡散して所定濃度未満にならないようにする必要があるからである。
【００２３】
前述のチェックシートの作製手順における（２）〜（６）の作業は、上記フィルターホルダ３０を使用して行う。シートーホルダー３０の４個所の円形凹部３２に夫々４個のフィルター４０をその表示部４１ａと円形凹部３２の細孔３５の位置が合致するようにしてセットする。そして、ＡＴＰ液を円形凹部３２の刻印３４の位置に合わせて４個所滴下する。これにより、常に、フィルター４０の基準位置の表示部４１ａを基準とする所定位置に４個所ＡＴＰ液が滴下されることとなる。これにより、図３に示すフィルター４０上にやや周辺に近い位置に４個所ＡＴＰが滴下された標準サンプルのとなるチェックシート２０が得られる。次に、このチェックシート２０を使用してＲＭＤＳの感度のチェックを行う方法について説明する。
【００２４】
先ず、ビニールシートによりシールされているチェックシート２０を取出し、ＲＭＤＳを使用する通常の試料の測定と同様に、抽出試薬と発光試薬を噴霧する。チェックシート２０にはすでに抽出されたＡＴＰが保持されているのであるから、ここで抽出試薬の噴霧は本来必要ないものであるが、抽出試薬を噴霧することによりシートに親水性を持たせ、発光試薬との接触を良好にすることができる。すなわち、シートそのものは滴下されたＡＴＰが必要以上に拡散しないように疎水性を有する。しかし、発光試薬を噴霧するに当たり、必要最小量の発光試薬でＡＴＰを滴下したシート部分を湿らせるためには一時的に親水性にしたほうが効率的である。抽出試薬にはメタノールあるいはエタノール等が使用されるため、抽出試薬を噴霧して一時的に疎水性を弱めることができる。次に上記の発光試薬の処理を施したチェックシート２０をＲＭＤＳにかけ発光量を測定する。発光量の測定は４つのＡＴＰ滴下部の領域の光子数ををそれぞれ測定する。各領域の輝点の測定は、図２に示す撮像管の画素の座標を指定することにより領域を指定し、その領域内の光子数を計数することにより行うことができる。
【００２５】
図６は指定領域の輝点計数の例を示す図であり、発光する領域内で図示のようなサークル領域を指定してその画素領域に含まれる発光する光子数を計数することができる。
本実施例においては、チェックシート２０のフィルター４０の基準位置を示す表示部４１ａを利用してＲＭＤＳのフィルター設置台（図示せず）の基準位置に合わせるように設置することにり、チェックシート２０のＡＴＰ滴下点と撮像管の画素座標による計数領域を対応させることができ、これによって、４個所の領域の輝点を計数することができる。各チェックシートの発光量はこのようにして計数した４個所の領域の輝点の合計を発光量としている。そして、所定レベル値以上の測定値が得られればそのＲＭＤＳの感度は所定の基準を満たすとすることができる。
【００２６】
本実施例のチェックシートは、前述のように、４点のＡＴＰ滴下点をフィルター上の周辺近傍に設けているが、これは、試薬の噴霧状態を判定する上で、周辺分で良好な結果が得られれば中心部ではさらに安定した良好な噴霧状態が得られているという実験結果からの知見に基づくものである。
【００２７】
【実験例】
次に、チェックシートのサンプルを前述の手法により試験的に作製し、これをＲＭＤＳにて観測した実験例を示す。
チェックシートのＡＴＰの濃度は、２．５×１０^-15ｍｏｌとし、シート上にスポットを形成するための滴下量は０．２μｌとした。これに、ＡＴＰ抽出試薬、及び発光試薬を順次噴霧し、サンプルを作製した。こうして作製したサンプルをＲＭＤＳを用いて発光の有無、発光時の発光量の測定を行った。図７はその製作した４６サンプルの測定結果をを示す。比較のため、ＡＴＰの濃度を１．３×１０^-15ｍｏｌ及び６．３×１０^-16ｍｏｌとした場合についての測定結果も併せて示す。
【００２８】
上記実験例からすると、ＲＭＤＳの検出限界は６．３×１０^-16ｍｏｌのスポットが９５％以上の信頼度で検出できる感度を示す。必ず、この濃度を検出する必要がない場合は、例えば、これより４倍の濃度である２．５×１０^-15ｍｏｌの濃度のものを用いて測定し、システムの感度の判定を行う。このときの最小測定値は１，７１４ＲＵＬである。したがって、システムの判定基準値を１，７００ＲＬＵとし、これ以上の値が確認できた場合に正常とし、基準が越えなかったものについては、感度不良の原因の調査を行い、是正した上で感度の確認を行う。
【００２９】
なお、本実施例では、ＡＴＰの希釈液としてｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸バッファーを使用したが、この溶媒のｐＨと発光量との関係は、図８に示す実験結果からもわかるように、ｐＨ７．５において安定した良好な発光を示すことが判明しており、この結果により採用した値である。また、ｐＨ７．５のリン酸バッファーにより希釈して製作したチェックシートは、約６ヶ月間保存可能であり（−２０℃）、ｐＨ６．０のものより保存期間が著しく長くなることが判明した。
【００３０】
以上のように、本実施例で作製したチェックシートを使用するこにより、ＲＭＤＳによる微生物の測定における、抽出試薬、噴霧試薬の試薬の品質（活性度）や噴霧操作を含む測定系システムの感度のチェックを簡単に実施することができ、ＲＭＤＳを使用して微生物を検査する場合、常に精度の高い検査を行うことができる。なお、チェックシート２０は通常の生菌観測と同様に発光試薬を噴霧するための試薬の活性、噴霧状態の良し悪しの影響を受ける。したがって、定期的にチェックシートを検査し、問題のないことを確認する。この感度チェック用のチェックシートで発光量が定められた値に達しなかった場合には、検出器の感度だけでなく、試薬の活性確認、噴霧器の噴霧状態も確認する必要がある。
【００３１】
なお、上述の例では、チェックシート２０にはＡＴＰの滴下点は４点としているが、必ずしも４点に限定される必要はなく、ＡＴＰの濃度と滴下量に応じて変更できる。また、シートホルダー３０の凹部３２も４個所にすることなく適宜変更できる。
【００３２】
【発明の効果】
以上のように、本実施例で作製したチェックシートを使用するこにより、ＲＭＤＳによる微生物の測定における、抽出試薬、噴霧試薬の試薬の品質（活性度）や噴霧操作を含む測定系システムの感度のチェックを簡単に実施することができ、ＲＭＤＳを使用して微生物を検査する場合、常に精度の高い検査を行うことができる。
【００３３】
また、本発明によるチェックシートは、同一品質のものを多数製造して用意しておくことができ、必要に応じて随時微生物の検出システムの感度のチェック行うことができ、また、複数の施設に設置してある微生物測定装置を共通の標準により感度のチェックを行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】微生物迅速検査装置（ＲＤＭＳ）のシステムの概要を示し図である。
【図２】撮像管の画素の座標の説明図である。
【図３】本発明によるチェックシートの説明図である。
【図４】チェックシート製造に使用するシートホルダーを示す図である。（ａ）は平面図、（ｂ）Ａ−Ａ断面図を示す。
【図５】チェックシートを製造するために使用されるフィルターを示す図である。
【図６】撮像管の指定領域の輝点計数例を示す図である。
【図７】本発明の実施例によるチェックシートに製造例を示す図である。
【図８】ＡＴＰの溶媒のｐＨと発光量の関係を示す図である。
【符号の説明】
１０微生物迅速検査装置（ＲＤＭＳ）
２０チェックシート
３０シートホルダー
３１円盤
３２凹部
３３切欠き部
３４滴下位置表示部
３５細孔
４０フィルター
４１リング枠
４１ａ基準位置表示部

Claims

試料に抽出試薬と発光試薬を噴霧し、試料中のＡＴＰを検出する微生物測定装置により測定する微生物測定システムにおける検出感度のチェック方法であって、
定められた濃度のＡＴＰ溶液をシート上の周辺近傍部の定められた複数個所に滴下して乾燥させて製造してなる疎水性を有するチェックシートに抽出試薬、エタノール又はメタノールを噴霧して一時的に親水性を付与させた後、当該チェックシートに発光試薬を噴霧して、微生物測定装置により発光量を測定し、当該測定値が前記定められた濃度のＡＴＰ溶液の発光量を前記微生物測定システムで測定することにより予め定めた発光量に達しているか否かを判定して微生物測定システムの検出感度をチェックするようにした微生物測定システムの検出感度のチェック方法。
リン酸バッファーを加えて作製された、定められた濃度のＡＴＰ溶液をシート上の周辺近傍部の定められた複数個所に滴下して乾燥させてなるチェックシートを使用した請求項１に記載の微生物測定システムの検出感度のチェック方法。