CN116904445A - 一种mRNA富集方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种mRNA富集方法，属于生物技术领域。本申请的方法通过分别使用第一捕获磁珠和第二捕获磁珠对mRNA进行两轮抓取，能够有效减少产物中的rRNA残留，得到高纯度的mRNA产物，进而提高下游转录分析的数据有效性。

Description

一种mRNA富集方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种mRNA富集方法。
背景技术
在过去的十年中，转录组测序(RNA-seq)已经成为在全转录组范围内分析差异基因表达和mRNAs差异剪接的重要工具。转录组（transcriptome）是指在某一特定生理条件下，细胞、组织或者生物体内所有转录产物的集合，即转录出来的所有RNA的总和，包括编码RNA（mRNA）和非编码RNA（tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等不同类型的RNA分子，其中，rRNA约占RNA总量的80%以上，是最多的一类RNA（Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNAsequencing: the teenage years. Nat Rev Genet. 2019 Nov;20(11):631-656.）。rRNA作为总RNA中最丰富的成员，提供的转录本信息却少之又少，且检测过多会掩盖其它基因的表达丰度，从而增加低丰度转录本的检测难度。因此，通常在测序之前从总RNA样品中去除rRNA，rRNA去除的效率也被视为最大化读取到转录物的关键因素。
目前，大多数已发表的RNA-seq数据都是基于Oligo(dT)富集的mRNA方法，这种方法会选择包含poly(A)尾的转录本，并将集中测序那些在转录组的蛋白质编码区上。但是目前已知的mRNA抓取方案，在不同物种上的rRNA残留性能十分不一致，在动物组织上能达到不错的富集效果，rRNA ratio低于5%，但在不同的植物和真菌上效果却很差，个别rRNA 残留会高达90%，这显著限制了转录组分析的有效性。
发明内容
本申请的目的在于提供一种能显著降低rRNA残留的mRNA富集方法。其在现有技术的基础上进行优化，在mRNA第二次富集时使用第二捕获磁珠进行抓取，让mRNA结合到新的Oligo(dT)磁珠上，可以有效减少产物中的rRNA残留，提高mRNA占比，进而有利于增加低丰度转录本的检测效率和转录分析的有效性。
本申请的第一方面提供一种mRNA富集方法，所述方法包括如下步骤：
（1） 将总RNA样本与第一捕获磁珠混合，孵育，所述第一捕获磁珠上含有Oligo(dT)；
（2） 外加磁场，移除上清；
（3） 洗涤所述第一捕获磁珠，移除洗涤液；
（4） 洗脱所述第一捕获磁珠上的mRNA，获得洗脱产物；
（5） 外加磁场，转移所述洗脱产物并弃去所述第一捕获磁珠，向所述洗脱产物中加入第二捕获磁珠，孵育，所述第二捕获磁珠上含有Oligo(dT)；
（6） 外加磁场，移除上清；
（7） 洗涤所述第二捕获磁珠，移除洗涤液；
（8） 洗脱所述第二捕获磁珠上的mRNA。
在一些实施方案中，所述第一捕获磁珠和第二捕获磁珠的表面偶联有寡聚胸腺嘧啶核苷酸（Oligo(dT)），其与mRNA的PolyA尾互补结合，所述寡聚胸腺嘧啶核苷酸的核苷酸数量为5-50个，优选5-30个，包括所述范围内的5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个和30个。
在一些实施方案中，所述步骤（1）的孵育温度是50-80℃，优选55-75℃，包括所述范围内的55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃和75℃。
在一些实施方案中，所述步骤（1）的孵育时间是1-10 min，包括所述范围内的1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min和10min
在一些实施方案中，所述步骤（1）的孵育条件是例如50-80℃孵育1-10min，例如50-75℃孵育1-10min，例如55-75℃孵育1-10min，例如55-75℃孵育1-8min，例如55-75℃孵育2-8min，例如60-75℃孵育2-8min，例如60-75℃孵育3-8min，例如60-70℃孵育3-8min，例如60-70℃孵育3-7min，例如60-70℃孵育3-6min，例如62-68℃孵育3-6min，例如62-68℃孵育4-6min，例如65℃孵育5min，包括但不限于前述孵育温度和孵育时间的任意组合。
在一些实施方案中，所述步骤（1）的孵育条件包括先50-80℃孵育1-10 min，再室温孵育1-10min；优选的，所述室温孵育1-10min，例如2-8min，例如2-7min，例如3-7min，例如4-6min，例如5min。所述室温是室温20-35℃，包括所述范围内的20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃和35℃。
在一些实施方案中，所述步骤（1）的孵育条件包括65℃孵育5 min和室温孵育5min。
在一些实施方案中，所述步骤（5）的孵育条件包括室温孵育1-10min，例如2-8min，例如2-7min，例如3-7min，例如4-6min，例如5min，所述室温是室温20-35℃，包括所述范围内的20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃和35℃。
在一些实施方案中，所述步骤（5）的孵育条件包括先50-80℃孵育1-10 min，再室温孵育1-10min；例如先60-70℃孵育1-10 min，再室温孵育1-10min；又例如60-70℃孵育3-8 min，再室温孵育3-8min；又例如先65℃孵育5 min，再室温孵育5min。
在一些实施方案中，所述步骤（2）、步骤（5）和步骤（6）的外加磁场例如是将样本置于磁力架上。
在一些实施方案中，所述洗涤包括加入洗涤液，例如加入洗涤液重悬磁珠，吹打混匀。在一些实施方案中，所述洗涤液包括但不限于一切本领域已知的磁珠洗涤液，例如所述洗涤液包含盐和缓冲成分。在一些实施方案中，所述洗涤的温度是室温，例如室温20-35℃，包括所述范围内的20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃和35℃。
在一些实施方案中，所述洗涤可以重复一次或两次或多次。
在一些实施方案中，所述洗脱包括加入洗脱液，所述洗脱液是例如纯水或Tris缓冲液，洗脱的温度为50-90℃，例如50-85℃，例如60-85℃，例如70-85℃，例如75-80℃，例如80℃。在一些实施方案中，洗脱步骤需孵育1-10min，例如1-8min，例如1-6min，例如1-6min，例如1-3min，例如2min。
在一些实施方案中，所述总RNA样本来自于真核生物，所述真核生物包括但不限于动物、植物、原生生物和真菌等。
在一些实施方案中，所述动物包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、牛、猪、鱼、龟、猫、羊、鸽、鸡、青蛙、蟾蜍、马、食蟹猴、恒河猴、猩猩、蛇、狒狒、绒猴、棉鼠和雪貂等；所述真菌包括但不限于酵母菌、锈菌、白地霉菌、链霉菌、黄曲霉菌、青霉菌、禾谷镰孢菌、大丽轮枝菌、布氏白粉菌、米曲霉菌、禾生球腔菌、曲霉菌、炭疽菌、镰刀菌、亚麻栅锈菌、隐球菌、烟曲霉菌、耳念珠菌、毛霉菌、白色念珠菌、麦角菌、毛壳菌和蕈菌等，所述蕈菌是例如香菇、草菇、木耳、银耳、猴头菇、竹荪、双孢菇、松茸、灵芝、虫草、松露、牛肝菌、羊肚菌和马鞍菌等；所述原生生物包括但不限于草履虫、变形虫、疟原虫、单细胞藻类和黏菌等；所述植物是例如种子植物或孢子植物，包括但不限于水稻、拟南芥、番茄、小麦、香樟树、地毯草、树莓、草莓、苹果、冷杉、海桐、椴树、蛇床、槐树、铁树、茶树、蒲公英、无患子、杜鹃、罗汉松、棕榈、银杏、蒜、梨、樱桃、马铃薯、散尾葵、桃、连翘、桂花树、龙眼、芒果、橡树、枇杷、竹子、枸杞、杏树、海棠、柿树、椰树、龟背竹、春羽、荔枝、胶漆树、甘蔗、槐树、月季、榆树、紫藤树、白桦、菊花、油菜、大豆、藻类植物、菌类植物、地衣植物、苔藓植物和蕨类植物等，所述植物的取样部位是例如叶片、种子、根、花、果实和茎等。
本申请的第二方面提供一种转录组文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：
（1） 使用第一方面所述的方法捕获mRNA；
（2） 对所述mRNA进行逆转录，合成cDNA一链；任选地，在cDNA一链合成之后再合成cDNA二链；
（3） 加入转座酶复合物进行孵育，得到片段化的cDNA；
（4） 加入带有接头序列的引物，通过PCR扩增得到带有接头的扩增；
（5） 任选地，对所述扩增产物进行纯化。
在一些实施方案中，所述逆转录使用M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶，优选M-MLV逆转录酶。
在一些实施方案中，所述逆转录使用的引物是Oligo(dT)引物或随机六聚体，优选随机六聚体。
在一些实施方案中，所述转座酶复合物包括转座酶和转座酶识别核心序列（ME序列），优选地，所述转座酶复合物还包括标签序列。
在一些实施方案中，所述转座酶是Tn5转座酶，所述Tn5转座酶是本领域已知的任何Tn5转座酶或其活性突变体。
在一些实施方案中，所述Tn5转座酶是具有打断RNA-cDNA杂合链活性的Tn5转座酶。
在一些实施例中，所述引物包括带有第一接头序列的第一引物和带有第二接头序列的第二引物。
在一些实施方案中，所述接头序列是当前或将来测序平台（包括但不限于iontorrent平台、illumina平台和华大平台）使用的测序基质相关序列。
在一些实施方案中，所述第一接头序列是Illumina平台的P5接头序列，所述第二接头序列是Illumina平台的P7接头序列，反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一接头序列是ion torrent平台的P1衔接头序列，所述第二接头序列是Ion torrent平台的A衔接头，反之亦然。
在一些实施方案中，所述第一接头序列是MGI平台的单端标签建库上游夹板序列，所述第二接头序列是MGI平台的单端标签建库下游夹板序列，反之亦然。在一些实施方案中，所述第一接头序列是MGI平台的双端标签建库上游夹板序列，所述第二接头序列是MGI平台的双端标签建库下游夹板序列，反之亦然。
在一些实施方案中，所述引物还包括索引序列（index）。在一些实施方案中，所述索引序列为例如6-8个碱基，优选8个。
在一些实施方案中，所述引物还包括与Tn5识别核心序列（ME序列）相同或互补的序列。在一些实施方案中，所述引物还包括与标签序列互补的序列。
在一些实施方案中，所述第一引物是N5引物，所述第二引物是N7引物，反之亦然。
在一些实施方案中，所述方法还包括终止片段化反应的步骤，例如使转座酶失活，例如加入EDTA。
在一些实施方案中，所述纯化步骤中采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法，优选磁珠法。
本申请的第三方面提供一种转录组文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：
（1） 使用第一方面所述的方法捕获mRNA；
（2） 打断，获得片段化的mRNA；
（3） 对所述片段化的mRNA进行逆转录合成cDNA；
（4） 对所述cDNA进行末端修复；
（5） 接头连接；
（6） 文库扩增。
在一些实施方案中，所述打断包括但不限于采用片段化酶法、化学法和/或机械法对所述mRNA进行片段化。在一些实施方案中，所述机械法为例如超声断裂法、离心法或热休克法，所述化学法为例如利用化学试剂处理所述mRNA使其断裂为多个片段。在一些实施方案中，所述片段化酶法是例如使用Endonuclease Ⅴ、Dnase I、Fragmentase、T7endonuclease I中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述逆转录使用M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶，优选M-MLV逆转录酶。在一些实施方案中，所述逆转录使用的引物是Oligo(dT)引物或随机六聚体，优选随机六聚体。
在一些实施方案中，所述步骤（2）和步骤（3）可以合并为一步，或所述步骤（3）和步骤（4）可以合并为一步，或所述步骤（4）和步骤（5）可以合并为同一步。
在一些实施方案中，所述cDNA是双链cDNA。
在一些实施方案中，所述末端修复包括对所述cDNA的末端进行补平，以使所述cDNA能够与平端接头进行连接。
在一些实施方案中，所述末端修复还包括加A的步骤，即在末端补平后的cDNA的3’末端加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，以实现将所述cDNA与所述接头通过A-T连接。
在一些实施方案中，对所述cDNA进行末端补平的酶为例如T4 DNA聚合酶，所述加A步骤使用的酶为例如Klenow DNA 聚合酶（3'-5' exo-）。
在一些实施方案中，所述接头是Illumina平台的Y型衔接头或华大智造MGI平台的泡状接头或Ion Torrent平台的测序接头。
在一些实施方案中，所述接头连接使用T4 DNA连接酶。
在一些实施方案中，所述方法还包括对文库扩增的产物进行纯化，所述纯化采用磁珠法、高盐沉淀法、离心柱法或酚氯仿抽提法，优选磁珠法。
本申请的第四方面提供一种转录组分析方法，所述方法包括如下步骤：
（1） 使用第二方面或第三方面所述的方法构建文库；
（2） 测序。
本申请的第五方面提供一种检测mRNA表达的方法，所述方法包括：
（1） 使用第一方面所述的方法捕获mRNA；
（2） 进行qRT-PCR检测。
附图说明
图1：现有技术（一轮抓取）和本申请提供技术方案（两轮抓取）的操作流程对比；
图2：样本投入量为200ng时两种方案检测的rRNA比例；
图3：样本投入量为500ng时两种方案检测的rRNA比例；
图4：样本投入量为200ng时两种方案检测的mRNA比例；
图5：样本投入量为500ng时两种方案检测的mRNA比例；
图6：样本投入量为200ng时两种方案检测的基因检出数；
图7：样本投入量为500ng时两种方案检测的基因检出数；
图8：样本投入量为200ng，使用Yeasen的mRNA抓取磁珠时两种方案检测的rRNA比例；
图9：样本投入量为500ng，使用Yeasen的mRNA抓取磁珠时两种方案检测的rRNA比例；
图10：11种不同样本，投入量为500ng时使用两种方案检测的rRNA比例；
图11：优化的两轮抓取技术方案操作流程；
图12：样本投入量为500ng时，使用两种两轮抓取方案检测的rRNA比例。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案，但下述的实例仅仅是本申请的简易例子，并不代表或限制本申请的权利保护范围，本申请的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
实施例1
1.以293细胞，番茄果实，大丽轮枝菌，小麦种子中提取的总RNA为样本，根据Vazyme mRNA抓取磁珠货号N403说明书中的操作进行方案测试，N403中的磁珠上具有Oligo(dT)，其可帮助抓取mRNA。总RNA投入量分别为200ng和500ng，分别采用图1所示的两种实验方案，其中一轮抓取为目前常规方法（图1左侧流程），其在第一次洗脱下mRNA后直接在洗脱产物中加入磁珠结合液，使磁珠对mRNA进行第二次抓取，即第二次抓取所用磁珠为上一步骤释放出来的磁珠）；图1右侧流程为二轮抓取方法，其在第二次抓取mRNA时增加了转移上清并更换新磁珠的步骤。
2.对上述产物进行RNA-seq文库构建，具体流程参照Vazyme#NR605说明书进行。
3.对上述构建完成的RNA-seq文库进行PE150测序，统计测序Reads中的rRNA残留，结果如图2-图3所示；统计测序Reads中的mRNA比例，结果如图4-图5所示；统计测序结果中的基因检出数，结果如图6-图7所示，其中纵坐标的Expression Gene指mRNA reads最后的mapping到的基因的数量。结果显示：创新的两轮抓取能显著降低rRNA残留，如图3，在总RNA投入量为500ng时，其中293细胞rRNA 数据占比由0.4%下降至0.1%，大丽轮枝菌rRNA 数据占比由83%下降至0.5%，小麦种子rRNA 数据占比由83%下降至0.7%，番茄果实rRNA 数据占比由0.2%下降至0.1%。同时，本申请提供的方法还有利于提升mRNA比例和基因检出数，如图4和图6，其中在总RNA投入量为200ng时，大丽轮枝菌样本mRNA数据占比由21.5%上升至72.3%，基因检出数由2600提升至9401。
实施例2
使用其他公司的mRNA抓取磁珠（Yeasen#12310ES96）进行测试，其中样本、投入量和实验流程同实施例1，统计测序Reads中的rRNA残留，结果如图8-图9所示。其中在总RNA投入量为500ng时，293细胞rRNA数据占比由0.9%下降至0.16%，大丽轮枝菌rRNA 数据占比由96%下降至0.5%，小麦种子rRNA 数据占比由95%下降至0.7%，番茄果实rRNA 数据占比由0.5%下降至0.1%。结果显示，本申请提供的方法对不同的磁珠具有普遍适用性，都能够降低rRNA的残留，实现了与实施例1相同的效果。
实施例3
针对rRNA残留严重的植物叶片样本（树莓、连翘、马铃薯、枸杞、茶树、竹子、番茄和蒜头果）、蛇床根茎样本和灵芝根茎样本的总RNA进行测试，样本投入量为500ng，实验流程同实施例1，统计测序Reads中的rRNA残留，结果如图10所示。结果显示，和一轮抓取相比，经过两轮抓取的所有物种的rRNA残留均降低50%以上。
实施例4
在实施例1的基础上进一步优化二轮抓取的技术方案，其中在第二次磁珠抓取mRNA的步骤中仅有25℃、5min孵育处理，具体流程如图11所示。
其中样本和其它实验流程同实施例1的二轮抓取，样本投入量为500ng，统计测序Reads中的rRNA残留，结果如图12所示。比较优化前后的数据，两种处理方式对rRNA残留的影响不大，测得的rRNA占比接近，说明只要使用新的磁珠完成第二轮抓取过程，均能降低rRNA残留。

Claims (20)

1.一种mRNA富集方法，所述方法包括如下步骤：
（1）将总RNA样本与第一捕获磁珠混合，孵育，所述第一捕获磁珠上含有Oligo(dT)；
（2）外加磁场，移除上清；
（3）洗涤所述第一捕获磁珠，移除洗涤液；
（4）洗脱所述第一捕获磁珠上的mRNA，获得洗脱产物；
（5）外加磁场，转移所述洗脱产物并弃去所述第一捕获磁珠，向所述洗脱产物中加入第二捕获磁珠，孵育，所述第二捕获磁珠上含有Oligo(dT)；
（6）外加磁场，移除上清；
（7）洗涤所述第二捕获磁珠，移除洗涤液；
（8）洗脱所述第二捕获磁珠上的mRNA。
2.权利要求1所述的方法，所述步骤（1）的孵育条件包括50-80℃孵育1-10min。
3.权利要求2所述的方法，所述步骤（1）的孵育条件包括先50-80℃孵育1-10min，再室温孵育1-10min。
4.权利要求1所述的方法，所述步骤（5）的孵育条件包括室温孵育1-10min。
5.权利要求4所述的方法，所述步骤（5）的孵育条件包括先50-80℃孵育1-10min，再室温孵育1-10min。
6.权利要求1所述的方法，所述洗涤包括加入洗涤液，所述洗涤的温度是室温。
7.权利要求1所述的方法，所述洗脱包括加入洗脱液，所述洗脱的条件为50-90℃孵育1-10min。
8.权利要求1所述的方法，所述总RNA样本来自于真核生物。
9.一种转录组文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：
（1）使用权利要求1-8任一项所述的方法捕获mRNA；
（2）对所述mRNA进行逆转录，合成cDNA一链；或对所述mRNA进行逆转录，合成cDNA一链之后再合成cDNA二链；
（3）加入转座酶复合物进行孵育，得到片段化的cDNA；
（4）加入带有接头序列的引物，通过PCR扩增得到带有接头的扩增产物；
（5）对所述扩增产物进行纯化。
10.权利要求9所述的方法，所述转座酶复合物包括转座酶、转座酶识别核心序列和标签序列。
11.权利要求9所述的方法，所述引物还包括索引序列和/或与标签序列互补的序列。
12.权利要求9所述的方法，所述引物包括带有第一接头序列的第一引物和带有第二接头序列的第二引物。
13.权利要求12所述的方法，所述第一接头序列是Illumina平台的P5接头序列，所述第二接头序列是Illumina平台的P7接头序列。
14.一种转录组文库的构建方法，所述方法包括如下步骤：
（1） 使用权利要求1-8任一项所述的方法捕获mRNA；
（2） 打断，获得片段化的mRNA；
（3） 对所述片段化的mRNA进行逆转录合成cDNA；
（4） 对所述cDNA进行末端修复；
（5） 接头连接；
（6） 文库扩增。
15.权利要求14所述的方法，所述末端修复包括对所述cDNA的末端进行补平。
16.权利要求15所述的方法，所述末端修复还包括在所述cDNA的3’末端加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸。
17.权利要求14所述的方法，所述打断方式是片段化酶法、化学法和/或机械法。
18.权利要求14所述的方法，所述接头是Illumina平台的Y型衔接头或华大智造MGI平台的泡状接头或Ion Torrent平台的测序接头。
19.一种转录组分析方法，所述方法包括如下步骤：
（1）使用权利要求9-18任一项所述的方法构建测序文库；
（2）测序。
20.一种检测mRNA表达的方法，所述方法包括：
（1） 使用权利要求1-8任一项所述的方法捕获mRNA；
（2） 进行qRT-PCR检测。
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