CN103805574A - 一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法 - Google Patents
一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103805574A CN103805574A CN201410037509.3A CN201410037509A CN103805574A CN 103805574 A CN103805574 A CN 103805574A CN 201410037509 A CN201410037509 A CN 201410037509A CN 103805574 A CN103805574 A CN 103805574A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hepatitis
- virus
- hav
- magnetic bead
- immunomagnetic beads
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y02A50/54—
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法，其包括如下步骤：制备富集甲肝病毒的特异性免疫磁珠；免疫磁珠富集甲肝病毒；定量检测甲肝病毒的富集效率。本发明构思合理，采用了免疫磁珠富集水体中甲肝病毒，突显了操作简便、特异性强、分离速度快、可重复性好，不需要昂贵的仪器设备等优点。另外，本发明在1mg的活化磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，可使病毒浓度为1.52×103拷贝/μl的300μl甲肝病毒水样富集效率最高达64.54%；使病毒浓度为1.52×106拷贝/μl的300μl甲肝病毒水样富集效率最高达91.45%。本方法对于富集水体中的甲肝病毒及其检测具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术应用领域和环境监测技术领域，具体采用免疫磁珠的免疫学反应原理及磁场力的特性富集水体中污染的甲肝病毒。
技术背景
甲肝病毒（Hepatitis A Virus，HAV）是一种RNA病毒，属小RNA病毒科，嗜肝病毒属，为常见的肠道病毒之一。甲肝病毒高浓度存在于感染者的粪便中，早在1973年，Feinslone利用免疫电镜技术在患病者的粪便样品中观测到了甲肝病毒(Martin and Lemon2006)，它们主要通过粪-口途径传播，无论是直接从人到人的传播或是接触了受污染的食物或水域，都会引起暴发流行。甲肝病毒较一般肠道病毒抵抗力强，耐酸碱，室温下可生存1周，在淡水、海水、污水以及海产品中（如毛蚶）存活数天至数月，25℃时在干粪中能生存30天。
我国是甲型肝炎的高发区，在卫生条件比较差的农村，由于无自来水设施，人们多饮用井水、河水。若不慎饮用了污染水源，极易引起感染；在一些城市和发达的江浙沪等地区，人群甲肝病毒的流行也呈逐年增加的趋势，因此依然有暴发流行的可能，且这种危险将长期存在。由此可见找到高效准确检测甲肝病毒方法的重要性。2012年国家饮用水卫生监督监测工作方案明确规定将甲肝病毒列为水性疾病监测的重要对象。
水体中甲肝病毒检测的难点在于含量低、干扰测定的基体成分复杂，给准确测定造成了很大的困难。大部分水体需通过水样体积的浓缩，先将病毒富集，才能进行检测，但水中不必要的污染物也因此被富集，从而干扰实验结果。如通常使用絮凝沉淀法对水样进行浓缩，但其残留的有机物质可能会对PCR的检测结果造成影响。另外传统的病毒富集检测方法,如细胞培养病毒鉴定,在操作上比较耗时，在技术成本的花费上比较昂贵，而且甲肝病毒很难在体外环境下培养(Brooks,Gersberg et al.2005)。
免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic beads separation techniques,IMBS)是上世纪后期发展起来的一项免疫学检测和磁性分离相结合的免疫学技术。免疫磁珠以磁性微球为载体，通过功能基团（羧基、氨基、羟基、醛基等）共价结合免疫配基（酶、细胞、抗体、抗原、DNA、RNA等生物活性物质），利用特异性的免疫学反应在外部磁场力的作用下分离检测靶物质。其具有灵敏度高、分离速度快、特异性强、操作简便、可重复性好，不需要昂贵的仪器设备等优点。另外，免疫磁珠分离技术与荧光定量PCR检测技术相结合，能有效祛除PCR反应的抑制物(Haramoto,Kitajima et al.2010)。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强、操作简便、省时高效的水体中甲肝病毒的富集方法，它以水体中的甲肝病毒为对象，采用免疫磁珠特异性吸附甲肝病毒，又在磁场力的作用下分离，实现水体中甲肝病毒的富集。
本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：
本发明提供的基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法，其步骤包括：
（1）制备富集甲肝病毒的特异性免疫磁珠：
通过活化羧基磁珠，磁珠与甲肝病毒抗体偶联和封闭的步骤制备所述特异性免疫磁珠；
（2）免疫磁珠富集甲肝病毒：
将1mg制备的特异性免疫磁珠与300μl甲肝病毒吸附，室温孵育2小时；
（3）定量检测甲肝病毒的富集效率：
提取甲肝病毒RNA，反转录成cDNA；荧光定量PCR检测水体富集的甲肝病毒拷贝数；计算甲肝病毒富集效率。
所述的定量检测甲肝病毒的富集效率时，使用Trizol法提取病毒RNA，具体是：将吸附病毒的免疫磁珠加入600μl Trizol，室温静置5min；再往EP管中加入300μl氯仿，震荡30秒，在冰上放置5分钟后，12000r/min、4℃离心15min，磁珠沉降在EP管底部；轻轻吸取上层水相液体，置于新的无RNA酶EP管中，余下部分丢弃，再加等体积的异丙醇和1μl Glyco BlueCoprecip，震荡后在-20℃冰箱放置2分钟，12000r/min、4℃离心10min；弃去上清液，加200ml75%乙醇进行洗涤，12000r/min、4℃离心10min；、弃掉上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用12μl Rnase-free water溶解RNA。
本发明使用的磁珠为以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为3μm的羧基磁珠，使用的甲肝病毒抗体为VP2蛋白抗原决定簇的鼠源单克隆抗体。
所述的磁珠与抗体偶联，当1mg活化磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，偶联甲肝病毒抗体的量为≤17.26μg；当1mg活化磁珠与25-75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，甲肝病毒抗体的偶联率为21.96-54.32%。
所述的免疫磁珠富集甲肝病毒，当1mg的活化磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，免疫磁珠对甲肝病毒的富集效率最高，可达92.87%；当1mg的活化磁珠与25-250μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，富集300μl浓度7.99×105拷贝/μl甲肝病毒水样，其富集效率为49.69-92.87%。
所述的1mg免疫磁珠，其偶联75μg甲肝病毒单克隆抗体的免疫磁珠时，使病毒浓度为1.52×103拷贝/μl的300μl甲肝病毒水样富集效率最高达64.54%；使病毒浓度为1.52×106拷贝/μl的300μl甲肝病毒水样富集效率最高达91.45%。
本发明与现有技术相比，主要有以下效果：
1.采用了免疫磁珠富集病毒与荧光定量PCR检测相结合的技术，免疫磁珠富集病毒可有效消除富集浓缩时残留的PCR抑制物，突显了操作简便、特异性强、分离速度快、灵敏度高、可重复性好，不需要昂贵的仪器设备等优点。
2.使用Trizol法提取病毒RNA，可避免使用直接加热法提取核酸分离磁珠与裂解缓冲液时，含有核酸的缓冲液体积的损失。
3.有效缩短了常规检测致病微生物的过程中最为耗时的扩增培养微生物的步骤。
4.在1mg活化磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，可使病毒浓度为1.52×103拷贝/μl的300μl甲肝病毒水样富集效率最高达64.54%；使病毒浓度为1.52×106拷贝/μl的300μl甲肝病毒水样富集效率最高达91.45%。
附图说明
图1为免疫磁珠富集水体中甲肝病毒的工作流程图。
具体实施方式
以下详细描述本发明的实施例，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不应当作对本发明的限制。
本发明采用无锡知益微球科技有限公司的羧基磁珠，磁珠以超顺磁性Fe3O4为内核，粒径为3μm，浓度为25mg/ml，羧基密度≥2.8μmol/mg。甲肝病毒抗体采用北京科兴中维生物技术有限公司针对甲肝病毒VP2蛋白抗原决定簇的鼠源单克隆抗体，其蛋白浓度为1mg/ml。
实施例1.偶联最佳抗体量的活化磁珠富集病毒的效率
1.富集甲肝病毒的特异性免疫磁珠制备：
（1）活化羧基磁珠：
取2mg(25mg/ml)充分摇匀的羧基磁珠至2ml离心管中，再加1ml浓度为0.01M的2-(4-吗啉)乙磺酸（MEST，pH5.0，0.05%Tween-20）活化缓冲液在涡旋混合器上混合均匀，将离心管置于磁分离器上，待磁珠被完全吸附后，弃掉上清液；再加入1ml MEST活化缓冲液将磁珠洗涤2遍后，分别加入300μl浓度为5mg/ml的活化试剂碳二亚胺(EDC，由0.01M pH5.0的MES缓冲液配制)和300μl浓度为5mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，由0.01M pH5.0的MES缓冲液配制)溶液，经涡旋仪混匀，固定在静音混合器上，37℃活化45min。用磁分离器分离磁珠，弃掉上清液，加500μl pH7.4PBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤需在混合器上充分混合，再加入200μlPBS缓冲液，悬浮磁珠。
（2）磁珠与甲肝病毒抗体偶联：
取6份1mg的活化磁珠分别置于2ml离心管中，各加入甲肝病毒单克隆抗体10、25、50、75、100、250μg（用PBS缓冲液补齐至500μl），用涡旋仪混匀，固定在静音混合器上，37℃偶联2小时。用磁分离器分离磁珠，收集各管上清液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒（购自碧云天生物技术研究所）检测上述各管中上清液剩余的抗体量，用酶标仪测其OD值，可得1mg磁珠偶联的抗体量，并依此计算其偶联率。
往上述剩余的磁珠中加入500μl PBS（或用500μl PBS+0.1%BSA）缓冲液，在摇床上震荡5min，用磁分离器分离磁珠，弃掉上清液；再加500μl PBS（或用500μl PBS+0.1%BSA）缓冲液洗涤2次，去除未与磁珠结合的抗体。
由表1可知，当1mg活化磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，偶联甲肝病毒抗体的量最大为17.26μg。当1mg活化磁珠与25-75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，甲肝病毒抗体的偶联率为21.96-54.32%。
（3）封闭：
在上述6份磁珠的离心管中，加入500μl1%BSA（由pH7.4的PBS缓冲液配制）封闭液，经涡旋仪混匀，固定在静音混合器上，37℃封闭1小时（或者4℃封闭过夜）。
用磁分离器分离磁珠，弃掉上清封闭液，加500μl PBS（或用500μl PBS+0.1%BSA）缓冲液洗涤3次，每次洗涤需在混合器上充分混合，最后加入300μl PBS缓冲液，贮存于4℃以备用。
2.免疫磁珠富集甲肝病毒：
此6份1mg免疫磁珠各加入300μl浓度为7.99×105拷贝/μl的甲肝病毒（即冻干甲型肝炎减毒活疫苗，购自中国医学科学院医学生物学研究所），用涡旋仪混匀，固定在静音混合器上，室温孵育2小时。用磁分离器分离磁珠，弃掉上清液，加500μl PBS（或用500μlPBS+0.1%BSA）缓冲液，在摇床上震荡5min，用磁分离器分离磁珠，弃掉上清液；再加500μlPBS（或用500μl PBS+0.1%BSA）缓冲液洗涤2次，去除未吸附病毒。
3.定量检测甲肝病毒的富集效率：
（1）Trizol法提取病毒RNA：
将上述吸附病毒的免疫磁珠从离心管转移到无RNA酶的EP管中，用磁分离器分离磁珠，弃掉上清液，加入600μl Trizol，室温静置5min；再往EP管中加入300μl氯仿，震荡30秒，在冰上放置5分钟后，12000r/min、4℃离心15min，磁珠沉降在EP管底部；轻轻吸取上层水相液体，置于新的无RNA酶EP管中，余下部分丢弃，再加入等体积的异丙醇和1μl Glyco BlueCoprecip(Invitrogen)，震荡后在-20℃冰箱放置2分钟，12000r/min、4℃离心10min；弃去上清液，加200ml75%乙醇(Rnase-free water配制)进行洗涤，12000r/min、4℃离心10min；弃掉上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用12μl Rnase-free water溶解RNA。
反转录：12μl的RNA template加入0.5μl的Random hexamer primer（20μM）、0.5μl的Oligo（dt）（20μM）。混合均匀后，将各反应管置于PCR仪中，70℃,5min，马上冰浴5min，继续加入：5μl的5×reaction buffer(Promega)、1μl的Ribolockribo nuclease inhibitor(20U/μlTaKaRa)、5μl的dNTP mix（2.5mM TaKaRa）、1μl的M-MLV Reverse transcriptase(200U/μlPromega)。混合均匀，置于PCR仪中，42℃，60min;95℃，5min，反应完成后将产物置于-20℃备用。
（2）SYBR Green荧光定量PCR检测甲肝病毒的富集效率
用荧光定量PCR检测富集甲肝病毒的拷贝数，反应体系：cDNA模板1μL、20μM甲肝病毒正反向引物各0.5μL、2×SsoFast EvaGreen Supermix（Bio-Rad）10μL、用ddH2O补足20μL。反应条件：95℃3min，以95℃10s、55℃30s扩增40个循环，熔点曲线绘制温度55℃～95℃。
（3）甲肝病毒富集效率的计算：
公式如下：
根据表2中的计算结果，当1mg的活化磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，免疫磁珠对甲肝病毒的富集效率最高，可达92.87%，此结果与1mg的活化磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时偶联量最大的结果相一致。当1mg的活化磁珠与25-250μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，富集300μl浓度7.99×105拷贝/μl甲肝病毒水样，其富集效率可达49.69-92.87%。
实施例2.单位免疫磁珠吸附甲肝病毒的能力
1.单位免疫磁珠吸附甲肝病毒：
浓度为1.52×106拷贝/μl的甲肝病毒，按1:10、1:100、1:1000的比例稀释。取4份1mg免疫磁珠（偶联75μg甲肝病毒单克隆抗体的免疫磁珠）分别与原浓度、1:10、1:100、1:1000稀释的300μl病毒吸附，室温孵育2小时。用磁分离器分离磁珠，弃掉上清液，加500μl PBS（或用500μl PBS+0.1%BSA）缓冲液，在摇床上震荡5min，用磁分离器分离磁珠，弃掉上清液；再加500μl PBS（或用500μl PBS+0.1%BSA）缓冲液洗涤2次，去除未吸附病毒。
2.定量检测甲肝病毒的富集效率
（1）Trizol法提取病毒RNA：
将上述吸附病毒的免疫磁珠从离心管转移到无RNA酶的EP管中，用磁分离器分离磁珠，弃掉上清液，加入600μl Trizol，室温静置5min；再往EP管中加入300μl氯仿，震荡30秒，在冰上放置5分钟后，12000r/min、4℃离心15min，磁珠沉降在EP管底部；轻轻吸取上层水相液体，置于新的无RNA酶EP管中，余下部分丢弃，再加等体积的异丙醇和1μl Glyco BlueCoprecip(Invitrogen)，震荡后在-20℃冰箱放置2分钟，12000r/min、4℃离心10min；弃去上清液，加200ml75%乙醇(Rnase-free water配制)进行洗涤，12000r/min、4℃离心10min；、弃掉上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用12μl Rnase-free water溶解RNA。
反转录：12μl的RNA template加入0.5μl的Random hexamer primer（20μM）、0.5μl的Oligo（dt）（20μM）。混合均匀后，将各反应管置于PCR仪中，70℃,5min，马上冰浴5min，继续加入：5μl的5×reaction buffer(Promega)、1μl的Ribolockribo nuclease inhibitor(20U/μlTaKaRa)、5μl的dNTP mix（2.5mM TaKaRa）、1μl的M-MLV Reverse transcriptase(200U/μlPromega)。混合均匀，置于PCR仪中，42℃，60min;95℃，5min，反应完成后将产物置于-20℃备用。
（2）SYBR Green荧光定量PCR检测甲肝病毒的富集效率
用荧光定量PCR检测富集甲肝病毒的拷贝数，反应体系：cDNA模板1μL、20μM甲肝病毒正反向引物各0.5μL、2×SsoFast EvaGreen Supermix（Bio-Rad）10μL、用ddH2O补足20μL。反应条件：95℃3min，以95℃10s、55℃30s扩增40个循环，熔点曲线绘制温度55℃～95℃。
（3）甲肝病毒富集效率的计算：
公式如下：
根据荧光定量RCR结果及计算，单位免疫磁珠对甲肝病毒的富集效率见表3。单位质量（1mg）免疫磁珠吸附300μl原浓度（1.52×106拷贝/μl）的甲肝病毒，其富集效率可达91.45%；单位质量（1mg）免疫磁珠吸附300μl1:1000倍稀释（1.52×103拷贝/μl）的甲肝病毒，其富集效率为64.54%。
上述实施例中，所述技术参数也可以依据实际情况而定。
附表
表1活化磁珠偶联抗体效率
| 加入抗体量（μg） | 抗体剩余量（μg） | 偶联量（μg） | 偶联率（%） |
| 10 | 8.25 | 1.75 | 17.50 |
| 25 | 11.42 | 13.58 | 54.32 |
| 50 | 39.02 | 10.98 | 21.96 |
| 75 | 57.74 | 17.26 | 23.01 |
| 100 | 96.64 | 3.36 | 3.36 |
| 250 | 245.56 | 4.44 | 1.78 |
表2与不同量抗体偶联的免疫磁珠捕获病毒富集效率的比较
| 加入抗体量（μg） | Cq值 | 拷贝数（拷贝/μl） | 富集效率（%） |
| 10 | 22.61 | 1.88×105 | 23.53 |
| 25 | 21.60 | 3.97×105 | 49.69 |
| 50 | 21.21 | 5.28×105 | 66.08 |
| 75 | 20.76 | 7.42×105 | 92.87 |
| 100 | 21.32 | 4.93×105 | 61.70 |
| 250 | 21.05 | 5.97×105 | 74.72 |
表3单位免疫磁珠对甲肝病毒的富集效率
| 稀释比例 | Cq值 | 拷贝数（拷贝/μl） | 富集效率（%） |
| 1 | 19.49 | 1.39×106 | 91.45 |
| 1:10 | 23.74 | 1.32×105 | 86.84 |
| 1:100 | 27.16 | 1.23×104 | 80.92 |
| 1:1000 | 30.82 | 9.81×102 | 64.54 |
Claims (6)
1.一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于采用包括以下步骤的方法：
（1）制备富集甲肝病毒的特异性免疫磁珠：
通过活化羧基磁珠，磁珠与甲肝病毒抗体偶联和封闭的步骤制备所述特异性免疫磁珠；
（2）免疫磁珠富集甲肝病毒：
将1mg制备的特异性免疫磁珠与300μl甲肝病毒吸附，室温孵育2小时；
（3）定量检测甲肝病毒的富集效率：
提取甲肝病毒RNA，反转录成cDNA；荧光定量PCR检测水体富集的甲肝病毒拷贝数；
计算甲肝病毒富集效率。
2.如权利要求1所述的基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于所述的定量检测甲肝病毒的富集效率时，使用Trizol法提取病毒RNA，具体是：将吸附病毒的免疫磁珠加入600μl Trizol，室温静置5min；再往EP管中加入300μl氯仿，震荡30秒，在冰上放置5分钟后，12000r/min、4℃离心15min，磁珠沉降在EP管底部；轻轻吸取上层水相液体，置于新的无RNA酶EP管中，余下部分丢弃，再加等体积的异丙醇和1μl GlycoBlue Coprecip，震荡后在-20℃冰箱放置2分钟，12000r/min、4℃离心10min；弃去上清液，加200ml75%乙醇进行洗涤，12000r/min、4℃离心10min；、弃掉上清液，让沉淀的RNA在室温下自然干燥；用12μl Rnase-free water溶解RNA。
3.如权利要求1所述的基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于使用的磁珠为以超顺磁性Fe3O4为内核、粒径为3μm的羧基磁珠，使用的甲肝病毒抗体为VP2蛋白抗原决定簇的鼠源单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于所述的磁珠与抗体偶联，当1mg活化磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，偶联甲肝病毒抗体的量为≤17.26μg；当1mg活化磁珠与25-75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，甲肝病毒抗体的偶联率为21.96-54.32%。
5.如权利要求1所述的基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于所述的免疫磁珠富集甲肝病毒，当1mg的活化磁珠与75μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，免疫磁珠对甲肝病毒的富集效率最高，可达92.87%；当1mg的活化磁珠与25-250μg甲肝病毒单克隆抗体偶联时，富集300μl浓度7.99×105拷贝/μl甲肝病毒水样，其富集效率为49.69-92.87%。
6.如权利要求1所述的基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法，其特征在于所述的1mg免疫磁珠，其偶联75μg甲肝病毒单克隆抗体的免疫磁珠时，使病毒浓度为1.52×103拷贝/μl的300μl甲肝病毒水样富集效率最高达64.54%；使病毒浓度为1.52×106拷贝/μl的300μl甲肝病毒水样富集效率最高达91.45%。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410037509.3A CN103805574A (zh) | 2014-01-26 | 2014-01-26 | 一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410037509.3A CN103805574A (zh) | 2014-01-26 | 2014-01-26 | 一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103805574A true CN103805574A (zh) | 2014-05-21 |
Family
ID=50702961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410037509.3A Pending CN103805574A (zh) | 2014-01-26 | 2014-01-26 | 一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103805574A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105652007A (zh) * | 2016-03-09 | 2016-06-08 | 南昌大学 | 一种基于Fe3O4纳米粒子的病毒快速检测方法 |
| CN107765000A (zh) * | 2017-03-13 | 2018-03-06 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种基于免疫磁珠特异性富集o型口蹄疫病毒的方法 |
| CN111187769A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-05-22 | 常州天地人和生物科技有限公司 | 一步快速高效提取病毒核酸的方法 |
| CN113322302A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-08-31 | 重庆医科大学 | 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 |
| CN114200127A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-03-18 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 一种乙型肝炎病毒富集荧光pcr检测方法 |
| CN115786326A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-03-14 | 重庆医科大学 | 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法 |
-
2014
- 2014-01-26 CN CN201410037509.3A patent/CN103805574A/zh active Pending
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| N. JOTHIKUMAR等: "Immunomagnetic Capture PCR for Rapid Concentration and Detection", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
| S. BIDAWID: "Rapid concentration and detection of hepatitis A virus from lettuce and strawberries", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
| 石良等: "羧基化磁性纳米微球的表面生物修饰方法", 《食品与生物技术学报》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105652007A (zh) * | 2016-03-09 | 2016-06-08 | 南昌大学 | 一种基于Fe3O4纳米粒子的病毒快速检测方法 |
| CN107765000A (zh) * | 2017-03-13 | 2018-03-06 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种基于免疫磁珠特异性富集o型口蹄疫病毒的方法 |
| CN111187769A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-05-22 | 常州天地人和生物科技有限公司 | 一步快速高效提取病毒核酸的方法 |
| CN111187769B (zh) * | 2020-04-01 | 2024-03-08 | 常州天地人和生物科技有限公司 | 一步快速高效提取病毒核酸的方法 |
| CN113322302A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-08-31 | 重庆医科大学 | 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 |
| CN113322302B (zh) * | 2021-06-02 | 2023-08-11 | 重庆医科大学 | 一种hbv完整病毒颗粒的免疫捕获分子检测方法 |
| CN114200127A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-03-18 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 一种乙型肝炎病毒富集荧光pcr检测方法 |
| CN114200127B (zh) * | 2021-11-15 | 2024-04-02 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 一种乙型肝炎病毒富集荧光pcr检测方法 |
| CN115786326A (zh) * | 2022-11-04 | 2023-03-14 | 重庆医科大学 | 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法 |
| CN115786326B (zh) * | 2022-11-04 | 2023-10-03 | 重庆医科大学 | 一种病毒核酸提取试剂盒及利用该试剂盒提取完整病毒颗粒核酸的方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103805574A (zh) | 一种基于免疫磁珠富集水体甲肝病毒的方法 | |
| Kasorndorkbua et al. | Infectious swine hepatitis E virus is present in pig manure storage facilities on United States farms, but evidence of water contamination is lacking | |
| Choi et al. | Identification of swine hepatitis E virus (HEV) and prevalence of anti-HEV antibodies in swine and human populations in Korea | |
| Jothikumar et al. | A broadly reactive one-step real-time RT-PCR assay for rapid and sensitive detection of hepatitis E virus | |
| Baumgarte et al. | Prevalence, types, and RNA concentrations of human parechoviruses, including a sixth parechovirus type, in stool samples from patients with acute enteritis | |
| Viana et al. | High prevalence of hepatitis B virus and hepatitis D virus in the western Brazilian Amazon. | |
| Nainan et al. | Diagnosis of hepatitis A virus infection: a molecular approach | |
| Maalouf et al. | Strain-dependent norovirus bioaccumulation in oysters | |
| Kageyama et al. | Coexistence of multiple genotypes, including newly identified genotypes, in outbreaks of gastroenteritis due to Norovirus in Japan | |
| Dalton et al. | Hepatitis E: an emerging infection in developed countries | |
| Takahashi et al. | Hepatitis E Virus (HEV) strains in serum samples can replicate efficiently in cultured cells despite the coexistence of HEV antibodies: characterization of HEV virions in blood circulation | |
| Kitajima et al. | Prevalence and genetic diversity of Aichi viruses in wastewater and river water in Japan | |
| Steyer et al. | High prevalence of enteric viruses in untreated individual drinking water sources and surface water in Slovenia | |
| Rodríguez-Díaz et al. | Detection and characterization of waterborne gastroenteritis viruses in urban sewage and sewage-polluted river waters in Caracas, Venezuela | |
| Tanaka et al. | Development and characterization of a genotype 4 hepatitis E virus cell culture system using a HE-JF5/15F strain recovered from a fulminant hepatitis patient | |
| Miura et al. | Development of an effective method for recovery of viral genomic RNA from environmental silty sediments for quantitative molecular detection | |
| Hassine-Zaafrane et al. | Molecular prevalence of bovine noroviruses and neboviruses detected in central-eastern Tunisia | |
| Liu et al. | Seroprevalence and molecular characteristics of hepatitis E virus in household-raised pig population in the Philippines | |
| Kapusinszky et al. | Local virus extinctions following a host population bottleneck | |
| Mocé-Llivina et al. | Double-layer plaque assay for quantification of enteroviruses | |
| de Souza et al. | First report of equine pegivirus in South America, Brazil | |
| Vecchia et al. | Presence of Torque teno virus (TTV) in tap water in public schools from Southern Brazil | |
| CN1814790A (zh) | 轮状病毒的rt－pcr检测试剂盒及其检测方法 | |
| Ahmad et al. | Assessment of the risk for human health of enterovirus and hepatitis A virus in clinical and water sources from three metropolitan cities of Pakistan | |
| CN100410391C (zh) | 诺瓦克病毒和轮状病毒多重rt-pcr检测方法及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140521 |