CN116410973A - 一种基因组dna提取试剂盒及基因组dna的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及DNA提取的技术领域，具体公开了一种基因组DNA提取试剂盒及基因组DNA的提取方法。本申请提供的基因组DNA提取试剂盒，包括组织保存液；所述组织保存液包含500‑1000mM的NaCl、5‑15mM且pH为8.3的Tris‑Cl、10‑75mM的EDTA、0.5‑2%(v/v)的Triton® X‑100、0.5‑2%的十二烷基硫酸钠。本申请利用上述试剂盒提供了基因组DNA的提取方法，该方法提取到的基因组DNA完整性高，纯度好，能够满足动物三代测序基因组DNA的需求；且该提取方法适用于海洋动物样本和昆虫样本，普适性强。

Description

一种基因组DNA提取试剂盒及基因组DNA的提取方法
技术领域
本申请涉及DNA提取的技术领域，具体涉及一种基因组DNA提取试剂盒及基因组DNA的提取方法。
背景技术
随着测序技术的发展，第三代测序即单分子测序技术，近几年发展迅速。其特点是可以基于基因组层面的de novo组装和重测序，可以实现对每一条DNA分子的单独测序；不依赖于PCR扩增的三代测序技术对基因组DNA的总量、纯度等要求很高，是测序成功的关键所在。
比较经典的CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）方法需要搭配酚氯仿等有毒试剂进行杂质的去除，而硅胶吸附膜方法由于离心力的剪切作用，会损伤基因组的完整性。采用离子交换的原理提取基因组DNA，所提核酸的完整性较好，纯度高，特别适合大分子核酸提取，可适用于三代测序。
针对一些油脂含量高的海洋样本、几丁质含量高的昆虫样本，此类样本次生代谢产物多，会干扰基因组DNA的分离并影响纯度。因此，开发出一款普适性强的三代测序基因组DNA提取试剂盒是非常迫切的需求。
发明内容
为了提高基因组DNA提取方法的普适性，同时保证所提基因组DNA的得率和纯度，本申请提供一种基因组DNA提取试剂盒及基因组DNA的提取方法。
第一方面，本申请提供一种基因组DNA提取试剂盒，所述基因组DNA提取试剂盒包括组织保存液、裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液；
所述组织保存液包含500-1000mM的NaCl、5-15mM且pH为7.5-9.0的Tris-Cl、10-75mM的EDTA、0.5-2%(v/v)的Triton® X-100、0.5-2%的十二烷基硫酸钠；
所述平衡结合液、漂洗液、洗脱液中盐离子浓度的大小关系为平衡结合液<漂洗液<洗脱液。
本申请利用上述组织保存液和裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液组成基因组DNA提取试剂盒，可以最大程度的保护核酸，提高基因组DNA的得率和纯度，可用于提取海洋动物和昆虫等样本，普适性强。利用该试剂盒提取到的基因组DNA完整性大于30kb，得率高，OD260/280和OD260/230纯度好，能够满足三代测序基因组DNA的需求。
优选地，所述基因组DNA提取试剂盒还包括CS1组织过滤器；所述CS1组织过滤器包含30ml注射器、两层20um筛板、一层无纺布。
优选地，所述基因组DNA提取试剂盒还包括DEAE（二乙基氨基乙基）弱阴离子交换树脂；所述DEAE弱阴离子交换树脂是二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉，粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol。
进一步地，所述DEAE弱阴离子交换树脂填充于耗材中制作成DNA吸附柱。
本申请提供的CS1组织过滤器可以初步过滤掉杂质，流出液在适当盐离子及pH值的平衡结合液的条件下，利用重力流条件，释放出来的基因组DNA结合于DEAE弱阴离子交换树脂的吸附柱上，多余的杂质随流出液流出。然后，利用较高盐离子浓度的溶液作为漂洗液，可以将结合在DNA吸附柱上的蛋白等杂质漂洗掉，然后继续增加盐离子浓度、并改变pH值范围作为洗脱液，基因组DNA从预装柱上洗脱下来。整个操作流程具有方便、快速等优点，且全程利用重力，没有剪切力，可以最大程度保留基因组DNA的完整性。
优选地，所述裂解液包含100-500mM的Guanidine-HCl（盐酸胍）、10-50mM且pH为7.5-8.5的Tris-Cl、10-50mM的EDTA、100-500mM的NaCl、0.15-1% (v/v)的Triton®X-100、5-100mM的DTT（二硫苏糖醇）。
优选地，所述平衡结合液包含300-700mM的NaCl、50-100mM且pH为6.5-7.5的MOPS（3-吗啉丙磺酸）、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15% (v/v)的TritonX-100。
优选地，所述漂洗液包含700-1200mM的NaCl、50-100mM且pH为4.5-5.5的NaAc、10-15%(v/v) 的异丙醇或者无水乙醇。
优选地，所述洗脱液包含1200-1700mM的NaCl、50-100mM且pH为8.0-9.0的MOPS、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇。
优选地，所述基因组DNA提取试剂盒还包括组织保护剂；所述组织保护剂选自有机还原剂。
进一步地，所述核酸保护剂选自巯基乙醇、二硫苏糖醇或三（2-羧乙基）膦盐酸盐中的至少一种。
进一步地，所述核酸保护剂的终浓度为5-100mM。
需要说明的是，“核酸保护剂的终浓度”是指核酸保护剂加入生物样本后，在生物样本中的终浓度。
本申请的发明人经过大量实验可得，采用上述浓度的核酸保护剂对核酸的保护效果较好，可防止生物样本中的核酸降解，抑制核酸酶，并保证得到更完整的基因组DNA。
第二方面，本申请提供了上述基因组DNA提取试剂盒在基因组DNA提取方法中的应用。
第三方面，本申请提供了一种基因组DNA的提取方法，具体包括以下步骤：
向样本中加入所述组织保存液保护核酸，然后加入所述裂解液和蛋白酶K进行裂解，然后加入所述平衡结合液，混匀得到待纯化液；
利用所述CS1组织过滤器将所述待纯化液注射到所述DEAE弱阴离子交换树脂中，至所有溶液流过，弃流出液；
向所述DEAE弱阴离子交换树脂中加入所述漂洗液，至所有溶液流过，弃漂洗流出液；向所述DEAE弱阴离子交换树脂中加入所述洗脱液，至所有溶液流过，收集洗脱流出液；
将所述洗脱流出液依次经过异丙醇洗涤、乙醇漂洗、晾干、溶解，即得所述基因组DNA。
可选地，所述样本选自海洋动物样本和昆虫样本中的任意一种。
综上所述，本申请的技术方案具有以下效果：
本申请利用组织保存液和裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液、CS1组织过滤器、DEAE弱阴离子交换树脂组成基因组DNA提取试剂盒，提供了基因组DNA的提取方法，该方法提取到的基因组DNA完整性高，纯度好，能够满足动物三代测序基因组DNA的需求；且该提取方法适用于海洋动物样本和昆虫样本，普适性强。
附图说明
图1为实施例1中蛏子基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果（E1-1表示使用组织保存液，E1-2表示未使用组织保存液）。
图2为实施例2中蛤蜊基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果（E2-1表示使用CS1组织过滤器，E2-2表示未使用CS1组织过滤器）。
图3为实施例3中6种海洋动物样本基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果（E3-1、E3-2、E3-3、E3-4、E3-5、E3-6依次表示虾、蛏子、蛤蜊、鱼、海螺、扇贝）。
图4为实施例4中4种昆虫样本基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果（E4-1、E4-2、E4-3、E4-4依次表示蚜虫、面包虫、飞蛾、甲虫）。
图5为实施例5中面包虫样本基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果（E5-1表示本申请的提取方法，E5-2表示其他厂家的提取方法）。
图6为实施例6中面包虫基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳结果（E6-1、E6-2、E6-3、E6-4依次表示X厂家、Y厂家、Z厂家、本申请）。
具体实施方式
第一方面，本申请提供一种基因组DNA提取试剂盒，包括组织保存液、DEAE弱阴离子交换树脂、CS1组织过滤器、裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液。
其中，组织保存液包含500-1000mM的NaCl、5-15mM且pH为7.5-9.0的Tris-Cl、10-75mM的EDTA、0.5-2%(v/v)的Triton® X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、0.5-2%的十二烷基硫酸钠；
DEAE弱阴离子交换树脂是二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉，粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol；
CS1组织过滤器包含30ml注射器、两层20um筛板、一层无纺布；
裂解液包含100-500mM的Guanidine-HCl、10-50mM且pH为7.5-8.5的Tris-Cl、10-50mM的EDTA、100-500mM的NaCl、0.15-1% (v/v)的Triton®X-100、5-100mM的DTT；
平衡结合液包含300-700mM的NaCl、50-100mM且pH为6.5-7.5的MOPS、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15% (v/v)的TritonX-100；
漂洗液包含700-1200mM的NaCl、50-100mM且pH为4.5-5.5的NaAc、10-15%(v/v) 的异丙醇或者无水乙醇；
洗脱液包含1200-1700mM的NaCl、50-100mM且pH为8.0-9.0的MOPS、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇。
第二方面，本申请提供的基因组DNA的提取方法，具体包括以下步骤：
S1：柱平衡
取DEAE修饰的离子交换硅胶粉1-2g（粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol）作为DEAE弱阴离子交换树脂，填充到30 ml柱体积的预装柱中，作为DNA吸附柱；
向DNA吸附柱中加入5ml平衡结合液，通过重力作用使平衡结合液流过吸附柱，待吸附柱中的溶液流尽后，弃溶液，DNA吸附柱备用。
注意：平衡结合液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
S2：样本前处理：
取100-500mg动物组织加入液氮充分研磨，转移到50ml收集管中。
具体地，当样本为核酸含量高的肝脏等样本，可以取样100-300mg左右；当样本为核酸含量较低的昆虫、肌肉等组织样本，可以取样300-500mg。
S3：基因组DNA吸附和纯化
S3.1：向步骤S2中装有样本的收集管中迅速加入1ml组织保存液静置5min，加入4ml裂解液，50µl核酸保护剂ST（天根生化科技（北京）有限公司），200µl Proteinase K，迅速振荡混匀后，将离心管放在50℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管数次以混合样品；
加入100µl 10mg/ml的RNase A （天根生化科技（北京）有限公司），充分混匀，室温静置5min；
加入10ml平衡结合液，颠倒混匀30s，得到待纯化液。
S3.2：利用CS1组织过滤器将待纯化液用推杆注射到步骤S1中平衡后的DNA吸附柱中，至所有溶液流过，弃流出液。
S3.3：取10ml漂洗液加入至DNA吸附柱中，至所有溶液流过，弃漂洗流出液。
S3.4：向DNA吸附柱中加入7.5 ml洗脱液，至所有溶液流过，收集洗脱流出液至一个干净的50ml离心管。
S3.5：向收集的洗脱流出液中加入5ml的异丙醇，充分混匀；于4℃下8000rpm离心10min，小心倒掉上清（注意：可以在离心管上标记沉淀的位置，倒去上清时避免沉淀损失）；
向含有沉淀的离心管中加入2ml 70%（v/v）的乙醇漂洗沉淀，并于4℃下8000rpm离心5min，小心弃掉一半上清（注意：漂洗沉淀不能剧烈涡旋，轻晃离心管至沉淀重悬即可）；
用剪过的蓝枪头转移剩余上清及沉淀，至1.5 ml的离心管中，并于4℃下8000 rpm离心5 min；
用枪头弃去管底残留液体，室温干燥5-10 min；
加入100-300µl的洗脱缓冲液TB溶解基因组DNA，并于适当条件保存（注意：可以将洗脱液置于50℃加热10 min，以充分溶解DNA）。
S4：针对个别极其复杂样本，如果提取产物纯度不满足，建议使用0.8倍体积的Beckman XP或者Tiangen NG316磁珠按照操作说明进行纯化一遍。
以下结合实施例以及试验结果对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例
实施例1
本实施例提供了一种蛏子基因组DNA的提取方法。
本实施例分为两组试验：一组使用组织保存液（E1-1），一组是未加组织保存液（E1-2）；实施例所用溶液具体为：
组织保存液包含750mM的NaCl、10mM且pH为8.3的Tris-Cl、50mM的EDTA、1.2%(v/v)的Triton® X-100、1.2%的十二烷基硫酸钠；
裂解液包含300mM的Guanidine-HCl、30mM且pH为8.0的Tris-Cl、30mM的EDTA、300mM的NaCl、0.5% (v/v)的Triton®X-100、50mM的DTT；
平衡结合液包含500mM的NaCl、75mM且pH为7.0的MOPS、12%(v/v) 的异丙醇、0.1%(v/v)的TritonX-100；
漂洗液包含1000mM的NaCl、75mM且pH为5.0的NaAc、12%(v/v) 的异丙醇；
洗脱液包含1500mM的NaCl、75mM且pH为8.5的MOPS、12%(v/v)的异丙醇；
本实施例中蛏子基因组DNA的提取方法，具体包括以下步骤：
S1：柱平衡
取DEAE修饰的离子交换硅胶粉1.5g（粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol）作为DEAE弱阴离子交换树脂；填充到30 ml柱体积的预装柱中，作为DNA吸附柱；
向DNA吸附柱中加入5ml平衡结合液，通过重力作用使平衡结合液流过吸附柱，待吸附柱中的溶液流尽后，弃溶液，DNA吸附柱备用。
S2：样本前处理
取300mg蛏子动物组织样本加入液氮充分研磨，转移到50ml收集管中。
S3：基因组DNA吸附和纯化
S3.1：向步骤S2中装有样本的收集管中迅速加入1ml组织保存液静置5min，加入4ml裂解液，50µl核酸保护剂ST，200µl Proteinase K，迅速振荡混匀后，将离心管放在50℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管数次以混合样品；
加入100µl RNase A (10mg/ml)，充分混匀，室温静置5min；
加入10ml平衡结合液，颠倒混匀30s，得到待纯化液。
S3.2：利用CS1组织过滤器将待纯化液用推杆注射到步骤S1中平衡后的DNA吸附柱中，至所有溶液流过，弃流出液。
S3.3：取10ml漂洗液加入至DNA吸附柱中，至所有溶液流过，弃漂洗流出液。
S3.4：向DNA吸附柱中加入7.5 ml洗脱液，至所有溶液流过，收集洗脱流出液至一个干净的50ml离心管。
S3.5：向收集的洗脱流出液中加入5ml的异丙醇，充分混匀；于4℃下8000rpm离心10min，小心倒掉上清（注意：可以在离心管上标记沉淀的位置，倒去上清时避免沉淀损失）；
向含有沉淀的离心管中加入2ml 70%的乙醇漂洗沉淀，并于4℃下8000rpm离心5min，小心弃掉一半上清（注意：漂洗沉淀不能剧烈涡旋，轻晃离心管至沉淀重悬即可）；
用剪过的蓝枪头转移剩余上清及沉淀，至1.5 ml的离心管中，并于4℃下8000 rpm离心5 min；
用枪头弃去管底残留液体，室温干燥5-10 min；
加入200µl的洗脱缓冲液TB溶解基因组DNA，并于适当条件保存（注意：可以将洗脱液置于50℃加热10 min，以充分溶解DNA）。
试验结果：蛏子基因组DNA的提取结果如图1和表1所示。
表1 实施例1中蛏子基因组DNA的提取结果
Figure SMS_1
从提取的NanoDrop 2000测值及琼脂糖凝胶电泳结果（图1）结果看，未加组织保存液提取的基因组DNA OD 260/230比值偏高，电泳条带明显降解。而本申请加入组织保存液后，提取的基因组DNA核酸的比值变好，OD 260/230比值接近2.2，电泳条带完整性较好，主带在48kb左右，可以满足三代测序对核酸的纯度要求。
实施例2
本实施例提供了一种蛤蜊基因组DNA的提取方法。
本实施例分为两组试验：一组使用CS1组织过滤器（E2-1），一组未使用CS1组织过滤器（E2-2）。
本实施例中蛤蜊基因组DNA的提取方法与实施例1中试验组E1-1的不同之处在于：样本为150mg蛤蜊样本。
试验结果：蛤蜊基因组DNA的提取结果如图2和表2所示。
表2 实施例2中蛤蜊基因组DNA的提取结果
Figure SMS_2
从提取的NanoDrop 2000测值及琼脂糖凝胶电泳结果（图2）结果看，未使用CS1组织过滤器提取的核酸浓度低，电泳条带有明显拖尾现象，且泳道口有杂质残留。而本申请使用CS1组织过滤器提取的核酸浓度高，电泳条带完整性较好，泳道口干净，无杂货残留，可以满足三代测序对核酸浓度和纯度的要求。
实施例3
本实施例验证了基因组DNA的提取方法对不同海洋动物样本提取的普适性。
本实施例分为六组试验：选取6种常见海洋动物样本（虾、蛏子、蛤蜊、鱼、海螺、扇贝），分别取300mg的样本按照实施例1中试验组E1-1提供的提取方法进行提取基因组DNA。
试验结果：基因组DNA的提取结果如图3和表3所示。
提取过程中没有出现样本粘稠堵柱子的情况，DNA洗脱液无色素残留，提取得率和纯度均能达到三代测序基因组DNA的要求，说明本申请提供的基因组DNA的提取方法具有较广的样本适用性。
表3 实施例3中6种海洋动物样本基因组DNA的提取结果
Figure SMS_3
实施例4
本实施例验证了基因组DNA的提取方法对不同昆虫组织基因样本提取的普适性。
本实施例分为六组试验：选取4种昆虫组织样本（蚜虫、面包虫、飞蛾、甲虫），分别按照表4的取样量进行取样，并按照实施例1中试验组E1-1提供的提取方法进行提取基因组DNA。
试验结果：基因组DNA的提取结果如图4和表4所示。
表4 实施例4中4种不同昆虫基因组DNA的提取结果
Figure SMS_4
提取过程中没有出现样本粘稠堵柱子的情况，DNA洗脱液无色素残留，提取得率和纯度均能达到三代测序基因组DNA的要求，说明本申请提供的基因组DNA的提取方法具有较广的样本适用性。从结果看，本申请的提取方法同样适用于昆虫类的样本基因组DNA提取。
实施例5
本实施例提供了利用本申请与其他厂家对面包虫基因组DNA提取的试验结果对比。
本实施例选取300mg面包虫样本进行提取，并分为两组试验：一组为利用本申请实施例1中试验组E1-1提供的提取方法（E5-1），一组是利用其他厂家（Qiagen产品操作说明书）提供的提取方法（E5-2）。
试验结果：基因组DNA的提取结果如图5和表5所示。
表5 实施例5中面包虫样本基因组DNA的提取结果
Figure SMS_5
从提取的NanoDrop 2000测值结果看，其他厂家产品提取得率较低，洗脱液杂质残留严重，DNA洗脱液呈现浑浊状态，泳道口残留严重。而利用本申请提供的提取方法的得率较高，比值均较好，杂质去除效果较好，DNA洗脱液无色素残留。
实施例6
本实施例提供了利用不同厂家填料对面包虫基因组DNA提取的结果。
本实施例选取300mg面包虫样本进行提取，并利用不同来源（X厂家、Y厂家、Z厂家、本申请）的DEAE修饰的离子交换填料1.5g对面包虫基因组DNA进行提取，分为四组试验。
试验结果：基因组DNA的提取结果如图6和表6所示。
表6 实施例6中利用不同厂家填料对面包虫基因组DNA提取的结果
Figure SMS_6
从提取的NanoDrop 2000测值结果看，所用其他厂家的离子交换填料提取得率较低，纯度较差，均不能满足三代测序的上机要求。而本申请方法所使用的离子交换填料效果最好，所提的基因组DNA浓度和纯度均能满足三代测序的需求。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述基因组DNA提取试剂盒包括组织保存液、裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液；
所述组织保存液包含500-1000mM的NaCl、5-15mM且pH为7.5-9.0的Tris-Cl、10-75mM的EDTA、0.5-2%(v/v)的Triton® X-100、0.5-2%的十二烷基硫酸钠；
所述平衡结合液、漂洗液、洗脱液中盐离子浓度的大小关系为平衡结合液<漂洗液<洗脱液。
2.根据权利要求1所述的基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述基因组DNA提取试剂盒还包括CS1组织过滤器；所述CS1组织过滤器包含30ml注射器、两层20um筛板、一层无纺布。
3.根据权利要求1所述的基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述基因组DNA提取试剂盒还包括DEAE弱阴离子交换树脂；所述DEAE弱阴离子交换树脂是二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉，粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol。
4.根据权利要求1所述的基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包含：100-500mM的Guanidine-HCl、10-50mM且pH为7.5-8.5的Tris-Cl、10-50mM的EDTA、100-500mM的NaCl、0.15-1% (v/v)的Triton®X-100、5-100mM的DTT。
5.根据权利要求1所述的基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述平衡结合液包含：300-700mM的NaCl、50-100mM且pH为6.5-7.5的MOPS、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15% (v/v)的TritonX-100。
6.根据权利要求1所述的基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液包含：700-1200mM的NaCl、50-100mM且pH为4.5-5.5的NaAc、10-15%(v/v) 的异丙醇或者无水乙醇。
7.根据权利要求1所述的基因组DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包含：1200-1700mM的NaCl、50-100mM且pH为8.0-9.0的MOPS、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇。
8.如权利要求1-7任一项所述的基因组DNA提取试剂盒在基因组DNA提取方法中的应用。
9.根据权利要求8所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
向样本中加入所述组织保存液保护核酸，然后加入所述裂解液和蛋白酶K进行裂解，然后加入所述平衡结合液，混匀得到待纯化液；
利用所述CS1组织过滤器将所述待纯化液注射到所述DEAE弱阴离子交换树脂中，至所有溶液流过，弃流出液；
向所述DEAE弱阴离子交换树脂中加入所述漂洗液，至所有溶液流过，弃漂洗流出液；向所述DEAE弱阴离子交换树脂中加入所述洗脱液，至所有溶液流过，收集洗脱流出液；
将所述洗脱流出液依次经过异丙醇洗涤、乙醇漂洗、晾干、溶解，即得所述基因组DNA。
10.根据权利要求9所述的基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述样本选自海洋动物样本和昆虫样本中的任意一种。
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