CN111808933A - 一种用于illumina二代测序平台的标准品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术二代测序技术领域，且公开了一种用于illumina二代测序平台的标准品，包括以下步骤：S1、引物设计；S2、PCR扩增；S3、文库质控；S4、上机测序；通过使用自行设计的扩增引用，用PCR扩增的方法，在Phix文库测序接头中添加i5和i7双端index标签，构建了Phix‑i5‑i7标准品文库。原illumina的Phix文库由于没有index标签，无法进行数据拆分质控，仅能用于平衡测序文库池碱基分布，保证高质量测序数据。本发明中Phix‑i5‑i7标准品文库保留了原本Phix文库测序区段碱基序列，依然可用于平衡测序混池碱基分布，保证高质量测序数据；同时可通过i5‑i7双端index标签对Phix文库进行数据拆分质控，通过Phix文库下机质控数据评估本次测序过程中仪器、试剂是否存在异常因素。

Description

一种用于illumina二代测序平台的标准品

技术领域

本发明涉及分子生物学技术二代测序技术领域，具体为一种用于illumina二代测序平台的标准品。

背景技术

随着测序技术的快速发展，测序成本称超摩尔定律水平下降，吸引着越来越多的科研工作着使用测序平台助力科研事业。众多测序平台中，目前最经典最大众的测序平台是illumina二代高通量测序平台。由于测序平台的技术局限，illumina二代高通量测序平台对测序文库碱基平衡性要求很高，而很多通过固定区域捕获技术得到的文库或者某种特殊结构的文库，测序碱基随机性较差，会严重影响测序质量，为保证高质量测序数据，illumina平台推出碱基平衡的文库Phix作为测序标准品，按比例添加到待测序的混池文库中，用于改善待测序文库的碱基随机性。但是由于illumina公司Phix文库不含index，后续数据拆分困难，很难作为质控品来评估整个测序状态是否正常。

为了能使Phix文库在测序过程中既能起到平衡碱基的作用，又能作为质控品，评估测序状态是否正常。我们在不破坏Phix文库碱基平衡性的前提下对现有illumina Phix文库进行DNA分子改造，构建了Phix-i5-i7含双端index标签的标准品文库，使标准品文库不仅能起到平衡测序混池文库碱基分布问题，同时可通过index标签对标准品文库进行数据拆分质控，通过Phix文库测序质量评估测序状态是否正常，为后续测序异常问题溯源提供了可靠依据。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于illumina二代测序平台的标准品，解决了上述背景技术中所提出的问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于illumina二代测序平台的标准品，包括以下步骤：

S1、引物设计；

S2、PCR扩增；

S3、文库质控；

S4、上机测序；

S5、下机数据分析质控。

优选的，所述步骤S1中的引物为：

Primer-F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC【i5-index】ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

Primer-R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT【i7-index】GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；

其中i5-index和i7-index的序列分别为GCTCTCTA和ATGATTCA。

优选的，所述步骤S2中的PCR扩增步骤为：

(1)、PCR扩增体系：

使用DNA聚合酶Taq DNA Polymerase(Mg2+plus Buffer,with dNTP)进行PCR扩增，扩增体系如下：

10×Taq Buffer(Mg2+plus)为5μl、dNTP Mix(10mM each)为1μl、Primer F(10μM)为2μl、Primer R(10μM)为2μl、Taq DNA Polymerase(5U/μl)为0.5μl、Template DNA(10ng/ul)为1μl、Nuclease-free Water To 50μl；

(2)、PCR扩增程序：

95℃预变性3min；95℃变性30sec,56℃退火30sec，72℃延伸45sec，共15个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存；

(3)、产物纯化：

①、纯化前将磁珠液提前30min从2～8℃取出，静置使其温度平衡至室温；

②、旋涡振荡使磁珠液充分混匀，吸取40μl磁珠液加入50μl DNA扩增产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上；

③、将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；

④、保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；

⑤、再次加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；

⑥、保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5-10min；

⑦、将样品从磁力架上取出，加入50μl Nuclease-free Water，涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2min；

⑧、在磁力架上静置5min待溶液澄清后，小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中，做好标记待用。

优选的，所述步骤S3中的文库质控步骤为：

(1)、使用Agilent 4200TapeStation检测Phix文库和Phix-i5-i7文库扩增片段大小、是否存在引物二聚体污染；

(2)、使用实时荧光定量PCR：QuantStudio 6Flex Real-Time PCR System检测Phix-i5-i7文库浓度。Phix-i5-i7文库浓度为39.58nM。

优选的，所述步骤S4中的上机测序方式为：选择206个微生物16S V3+V4区域和微生物ITS1区域捕获扩增产物文库等比例混池测序，添加8％的Phix_i5_i7文库，提高碱基分布随机性，从而保证测序质量，使用illuminaMiseq测序平台PE301+8+8+301程序测序。

优选的，所述步骤S5中下机数据拆分质控方式为：

(1)、Miseq RUN：190823_M05392_0114_000000000-CJ35P下机数据总体情况；

(2)、190823_M05392 Miseq RUN中Phix_i5_i7文库相关质控参数；

(3)结论：

①、在本次测试中，整个Run质量值较低(整体Q30％均值84.39)，其中207个文库中Phix_i5_i7文库的Q30％91.37，是最高的。Phix质量参数达标，可做为质控品评估该Run测序状态是否正常；

②、在本次测试中，Phix_i5_i7文库碱基Base％图和原illumina标准品Phix文库碱基Base％图相似度很高；且Phix_i5_i7文库GC含量图和测序质量分布图均正常、达标，以上分析证明Phix_i5_i7文库碱基随机性很好，可替代原illumina-Phix文库，做为control文库平衡测序Run的碱基分布。

(三)有益效果

本发明提供了一种用于illumina二代测序平台的标准品，具备以下有益效果：

本发明通过使用自行设计的扩增引用，用PCR扩增的方法，在Phix文库测序接头中添加i5和i7双端index标签，构建了Phix-i5-i7标准品文库。原illumina的Phix文库由于没有index标签，无法进行数据拆分质控，仅能用于平衡测序文库池碱基分布，保证高质量测序数据。本发明中Phix-i5-i7标准品文库保留了原本Phix文库测序区段碱基序列，依然可用于平衡测序混池碱基分布，保证高质量测序数据；同时可通过i5-i7双端index标签对Phix文库进行数据拆分质控，通过Phix文库下机质控数据评估本次测序过程中仪器、试剂是否存在异常因素。增加了标准品的在测序环节的作用范围，为后续测序异常问题溯源提供了可靠依据。

附图说明

图1为原illumina标准品Phix文库结构图；

图2为改进后标准品Phix-i5-i7文库结构图；

图3为Phix文库Agilent 4200峰图；

图4为Phix_i5_i7文库Agilent 4200峰图；

图5为本次下机的207个文库Q30 rate分布区间占比图；

图6为原illumina标准品Phix碱基分布图；

图7为Phix_i5_i7文库碱基分布base图；

图8为Phix_i5_i7文库CG含量分布图；

图9为Phix_i5_i7文库测序质量分布图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种技术方案：一种用于illumina二代测序平台的标准品，包括以下步骤：

S1、引物设计：

Primer-F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC【i5-index】ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

Primer-R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT【i7-index】GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；

其中i5-index和i7-index的序列分别为GCTCTCTA和ATGATTCA；

引物中R1 SP序列和R2 SP与illumina标准品Phix文库的R1 SP序列和R2 SP序列通过搭桥扩增，实现在illumina标准品Phix文库结果中添加i5和i7双index标签，用于下机数据拆分；

S2、PCR扩增：

(1)、PCR扩增体系：

使用DNA聚合酶Taq DNA Polymerase(Mg2+plus Buffer,with dNTP)进行PCR扩增，扩增体系如下：

10×Taq Buffer(Mg2+plus)为5μl、dNTP Mix(10mM each)为1μl、Primer F(10μM)为2μl、Primer R(10μM)为2μl、Taq DNA Polymerase(5U/μl)为0.5μl、Template DNA(10ng/ul)为1μl、Nuclease-free Water To 50μl；

(2)、PCR扩增程序：

95℃预变性3min；95℃变性30sec,56℃退火30sec，72℃延伸45sec，共15个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存；

(3)、产物纯化：

①、纯化前将磁珠液提前30min从2～8℃取出，静置使其温度平衡至室温；

②、旋涡振荡使磁珠液充分混匀，吸取40μl磁珠液加入50μl DNA扩增产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上；

③、将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；

④、保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；

⑤、再次加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；

⑥、保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5-10min；

⑦、将样品从磁力架上取出，加入50μl Nuclease-free Water，涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2min；

⑧、在磁力架上静置5min待溶液澄清后，小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中，做好标记待用；

S3、文库质控：

(1)、使用Agilent 4200TapeStation检测Phix文库和Phix-i5-i7文库扩增片段大小、是否存在引物二聚体污染；

(2)、使用实时荧光定量PCR：QuantStudio 6Flex Real-Time PCR System检测Phix-i5-i7文库浓度。Phix-i5-i7文库浓度为39.58nM；

S4、上机测序：

选择206个微生物16S V3+V4区域和微生物ITS1区域捕获扩增产物文库等比例混池测序，添加8％的Phix_i5_i7文库，提高碱基分布随机性，从而保证测序质量，使用illumina Miseq测序平台PE301+8+8+301程序测序；

S5、下机数据分析质控：

(1)、Miseq RUN：190823_M05392_0114_000000000-CJ35P下机数据总体情况；

(2)、190823_M05392 Miseq RUN中Phix_i5_i7文库相关质控参数；

(3)结论：

①、在本次测试中，整个Run质量值较低(整体Q30％均值84.39)，其中207个文库中Phix_i5_i7文库的Q30％91.37，是最高的。Phix质量参数达标，可做为质控品评估该Run测序状态是否正常；

②、在本次测试中，Phix_i5_i7文库碱基Base％图和原illumina标准品Phix文库碱基Base％图相似度很高；且Phix_i5_i7文库GC含量图和测序质量分布图均正常、达标，以上分析证明Phix_i5_i7文库碱基随机性很好，可替代原illumina-Phix文库，做为control文库平衡测序Run的碱基分布。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种用于illumina二代测序平台的标准品，其特征在于，包括以下步骤：

S1、引物设计；

S2、PCR扩增；

S3、文库质控；

S4、上机测序；

S5、下机数据分析质控。

2.根据权利要求1所述的一种用于illumina二代测序平台的标准品，其特征在于：所述步骤S1中的引物为：

Primer-F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC【i5-index】ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

Primer-R:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT【i7-index】GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；

其中i5-index和i7-index的序列分别为GCTCTCTA和ATGATTCA。

3.根据权利要求1所述的一种用于illumina二代测序平台的标准品，其特征在于：所述步骤S2中的PCR扩增步骤为：

(1)、PCR扩增体系：

使用DNA聚合酶Taq DNA Polymerase(Mg2+plus Buffer,with dNTP)进行PCR扩增，扩增体系如下：

10×Taq Buffer(Mg2+plus)为5μl、dNTP Mix(10mM each)为1μl、Primer F(10μM)为2μl、Primer R(10μM)为2μl、Taq DNA Polymerase(5U/μl)为0.5μl、Template DNA(10ng/ul)为1μl、Nuclease-free Water To 50μl；

(2)、PCR扩增程序：

95℃预变性3min；95℃变性30sec,56℃退火30sec，72℃延伸45sec，共15个循环；最后72℃延伸5min；4℃保存；

(3)、产物纯化：

①、纯化前将磁珠液提前30min从2～8℃取出，静置使其温度平衡至室温；

②、旋涡振荡使磁珠液充分混匀，吸取40μl磁珠液加入50μl DNA扩增产物中，使用移液器轻轻吸打10次充分混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上；

③、将样品置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；

④、保持样品始终处于磁力架上，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；

⑤、再次加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30sec，小心移除上清；

⑥、保持样品始终处于磁力架上，室温下开盖干燥磁珠约5-10min；

⑦、将样品从磁力架上取出，加入50μl Nuclease-free Water，涡旋振荡或使用移液器吹打充分混匀，室温静置2min；

⑧、在磁力架上静置5min待溶液澄清后，小心吸取上清至一个新的无核酸酶离心管中，做好标记待用。

4.根据权利要求1所述的一种用于illumina二代测序平台的标准品，其特征在于：所述步骤S3中的文库质控步骤为：

(1)、使用Agilent 4200TapeStation检测Phix文库和Phix-i5-i7文库扩增片段大小、是否存在引物二聚体污染；

(2)、使用实时荧光定量PCR：QuantStudio 6Flex Real-Time PCR S ystem检测Phix-i5-i7文库浓度。Phix-i5-i7文库浓度为39.58nM。

5.根据权利要求1所述的一种用于illumina二代测序平台的标准品，其特征在于：所述步骤S4中的上机测序方式为：选择206个微生物16S V3+V4区域和微生物ITS1区域捕获扩增产物文库等比例混池测序，添加8％的Phix_i5_i7文库，提高碱基分布随机性，从而保证测序质量，使用illumina Miseq测序平台PE301+8+8+301程序测序。

6.根据权利要求1所述的一种用于illumina二代测序平台的标准品，其特征在于：所述步骤S5中下机数据拆分质控方式为：

(1)、Miseq RUN：190823_M05392_0114_000000000-CJ35P下机数据总体情况；

(2)、190823_M05392 Miseq RUN中Phix_i5_i7文库相关质控参数；

(3)结论：

①、在本次测试中，整个Run质量值较低(整体Q30％均值84.39)，其中207个文库中Phix_i5_i7文库的Q30％91.37，是最高的。Phix质量参数达标，可做为质控品评估该Run测序状态是否正常；

②、在本次测试中，Phix_i5_i7文库碱基Base％图和原illumina标准品Phix文库碱基Base％图相似度很高；且Phix_i5_i7文库GC含量图和测序质量分布图均正常、达标，以上分析证明Phix_i5_i7文库碱基随机性很好，可替代原illumina-Phix文库，做为control文库平衡测序Run的碱基分布。

Images