CN109234813B - 一种构建链特异rna文库的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的构建链特异RNA文库的方法，尤其涉及一种构建链特异RNA文库的方法及应用。该方法将RNA片段化处理得到片段化的RNA，将片段化的RNA逆转录后采用RNase H消化RNA/DNA杂合体，消化产物与接头连接得到连接产物，连接产物进行PCR扩增，扩增产物即为链特异RNA文库。本发明采用RNase H消化RNA/DNA杂合体后，直接进行双端接头连接，得到链特异性RNA文库；同时优化的反应体系使得从样品RNA到接头连接完成只需在一管中顺次加入反应试剂即可进行。与常规链特异性RNA文库构建方法相比，克服了技术的复杂性与繁琐性，节省了大量人力、时间与试剂成本。

Description

一种构建链特异RNA文库的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种新的构建链特异RNA文库的方法，尤其涉及一种构建链特异RNA文库的方法及应用。
背景技术
随着二代测序技术的发展，越来越多的科研工作者着重于进行基因组测序分析、转录组测序分析及转录组与蛋白组之间关系的分析。RNA测序作为科研工作的重要手段，越来越被广泛的应用。特别是链特异性RNA文库构建，对于RNA深层次的研究有着重要的作用。
通常进行链特异性RNA文库构建需要经过以下繁琐步骤：样本RNA打断成适当长度、纯化打断的RNA、利用随机引物反转录、加入dUTP进行第二链合成、纯化cDNA、末端修复、加A、连接接头、纯化连接产物、UDG酶消化以及PCR富集、PCR产物纯化等。整个过程十分繁琐，浪费人力、时间；同时大量的反应步骤也消耗了大量试剂，提高了检测成本。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种构建链特异RNA文库的方法及应用，获得一种操作简便、成本低廉、耗时短的RNA文库构建方法。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
一种构建链特异RNA文库的方法，包括以下步骤：将RNA片段化处理得到片段化的RNA，将片段化的RNA逆转录后采用RNase H消化RNA/DNA杂合体，消化产物与接头连接得到连接产物，连接产物进行PCR扩增，扩增产物即为链特异RNA文库。
优选的，所述RNA为total RNA、mRNA、去除核糖体RNA或lncRNA。
优选的，所述接头的一端含有随机碱基N，所述随机碱基N的个数为3-6个。
优选的，所述片段化处理中加入片段化缓冲液，所述片段化缓冲液为Mg2+缓冲液。
优选的，所述消化RNA/DNA杂合体反应中还加入BSA溶液，所述BSA溶液为0.1％BSA溶液。
优选的，消化产物与接头连接的连接体系中包括T4 DNA连接酶、接头和缓冲液。
优选的，所述Mg2+缓冲液包括15mM MgCl2、250mM Tris-HCl(pH8)、300mM KCl、1mMDTT和10mM随机引物。
一种构建链特异RNA文库的方法应用于高通量测序文库构建方面。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明采用RNase H消化RNA/DNA杂合体后，直接进行双端接头连接，得到链特异性RNA文库；同时优化的反应体系使得从样品RNA到接头连接完成只需在一管中顺次加入反应试剂即可进行。与常规链特异性RNA文库构建方法相比，克服了技术的复杂性与繁琐性，节省了大量人力、时间与试剂成本。
附图说明
图1为本发明的一种构建链特异RNA文库的流程示意图；
图2为采用本发明进行链特异RNA文库构建的Agilent 2100质检图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件按照说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本实施例采用人细胞RNA进行链特异RNA文库构建，以illumina测序平台为例，对本发明进行进一步说明。实验方法如图1所示：
1、采用illumina公司的Ribo-ZeroTMMagnetic Gold Kit进行样本RNA的核糖体去除，具体步骤参照说明书。
2、去除核糖体后的RNA在PCR管中浓缩至5μL，加入5μL片段化缓冲液，在PCR仪上94℃处理3min，立即置于冰上。
3、在上述片段化反应液中加入如下组分：
Figure BDA0001795695340000021
Figure BDA0001795695340000031
在PCR仪中运行如下程序：
步骤 温度 时间
1 25℃ 10min
2 42℃ 30min
3 70℃ 15min
4 4℃ 保持
4、在上述片逆转录反应液中加入如下组分：
试剂 体积(μL)
逆转录溶液 20
0.1％BSA 1
RNaseH(5U) 1
总体积 22
在PCR仪中运行如下程序：
步骤 温度 时间
1 37℃ 30min
2 95℃ 10min
5、上述反应结束后立即置于冰上，加入如下组分：
Figure BDA0001795695340000032
Figure BDA0001795695340000041
在PCR仪中运行：25℃，15min，进行连接反应；
其中，所述5’接头和3’接头的序列如下所示：
5’接头：
编号 序列
SEQ ID NO:1 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
SEQ ID NO:2 NNNNNNAGATCGGAAGAGCGTC
3’接头：
编号 序列
SEQ ID NO:3 AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC
SEQ ID NO:4 GTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN
6、连接产物经过AMpure XP磁珠进行片段筛选及纯化后，溶于23μL纯水中，并配置如下PCR反应组分：
反应组分 体积(μL)
2 X Q5 High-Fidelity Master Mix 25
纯化DNA 23
P5引物(10μM) 1
P7引物(10μM) 1
总体积 50
在PCR仪中执行以下反应程序：
Figure BDA0001795695340000042
Figure BDA0001795695340000051
7、扩增产物经磁珠纯化后，采用Agilent 2100进行质检，结果见图2。采用本发明所述方法得到了平均长度约为400bp的文库，质检图谱与预期一致。
序列表
<110> 南京迪康金诺生物技术有限公司
<120> 一种构建链特异RNA文库的方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
nnnnnnagat cggaagagcg tc 22
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
agatcggaag agcacacgtc tgaactccag tc 32
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
gtgtgctctt ccgatctnnn nnn 23

Claims (8)

1.一种构建链特异RNA文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：将RNA片段化处理得到片段化的RNA，将片段化的RNA逆转录后采用RNase H消化RNA/DNA杂合体，消化产物与接头连接得到连接产物，连接产物进行PCR扩增，扩增产物即为链特异RNA文库。
2.根据权利要求1所述的一种构建链特异RNA文库的方法，其特征在于，所述RNA为total RNA、mRNA或lncRNA。
3.根据权利要求1所述的一种构建链特异RNA文库的方法，其特征在于，所述接头的一端含有随机碱基N，所述随机碱基N的个数为3-6个。
4.根据权利要求1所述的一种构建链特异RNA文库的方法，其特征在于，所述片段化处理中加入片段化缓冲液，所述片段化缓冲液为Mg2+缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种构建链特异RNA文库的方法，其特征在于，消化RNA/DNA杂合体反应中还加入BSA溶液，所述BSA溶液为0.1％BSA溶液。
6.根据权利要求1所述的一种构建链特异RNA文库的方法，其特征在于，消化产物与接头连接的连接体系中包括T4DNA连接酶、接头和缓冲液。
7.根据权利要求4所述的一种构建链特异RNA文库的方法，其特征在于，所述Mg2+缓冲液包括15mM MgCl2、250mM pH8的Tris-HCl、300mM KCl、1mM DTT和10mM随机引物。
8.权利要求1所述的一种构建链特异RNA文库的方法应用于高通量RNA测序文库构建方面。
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