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Description
本出願で特定されるすべての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること;
前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);ならびに
前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目2)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);ならびに
前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目3)
前記二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件が、有機溶媒の添加および/または耐熱性DSNと組み合わせた温度の上昇を含む、項目1〜2のいずれか一項に記載の方法。
(項目4)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する)
;
前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること;ならびに
前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目5)
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
各プローブが、ロックド核酸、ペプチド核酸、異種核酸(XNA)、任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはRNAを含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に対する1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記核酸サンプルが、尿、血漿または他の体液中のゲノムDNAまたは循環DNAを含む、項目1〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
項目2または4に記載の方法を実行する前に、以下:前記核酸サンプルと、トップ鎖およびボトム鎖上の目的の異なる核酸に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させること、前記トップ鎖およびボトム鎖上の目的の核酸への前記ベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にすること、ならびにそれに結合した前記目的の核酸を有するベイトオリゴヌクレオチドを残りの核酸から単離することによって、目的の領域について前記核酸を濃縮することをさらに含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記ベイトオリゴヌクレオチドが一方の末端においてビオチン化されている、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記ベイトオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着されている、項目11に記載の方法。
(項目13)
項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを増幅条件に供する、項目1〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目1〜13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記増幅条件が、PCR、COLD−PCR、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性PCRまたはCOLD−PCR、マルチプレックスPCRおよび等温増幅からなる群より選択される、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、項目13〜14のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、前記DSN切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるDNA分解条件に供することであって、前記切断位置で分解を開始させることによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
MALDI−TOF、HR融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング(MPS)、パイロシーケンシング、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCRおよび定量PCRからなる群より選択される方法の1つまたはそれよりも多くを使用して、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を分析することをさらに含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的である、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
その後に濃縮するための目的のメチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的の非メチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的の非メチル化核酸のボトム鎖に相補的である、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸および目的のメチル化標的核酸の両方を調製するために使用され、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含み;ならびに
前記反応混合物に対して項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用され、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;ならびに
(c)前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目24)
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、項目23に記載の方法。
(項目25)
工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目23〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、項目23〜25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記変性温度が65〜85℃である、項目23〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記標的DNA上のそれらの対応する配列への、異なるTmを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度間の漸減温度勾配を適用することによって、前記温度を低下させる工程(c)を実施する、項目23〜27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
DSN消化中に67℃〜64℃の漸減温度勾配を適用して、64〜67℃の異なるTmを有するプローブがそれらの個々の標的にハイブリダイズすることを可能にする、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記温度勾配が2〜20℃の範囲である、項目28または29に記載の方法。
(項目31)
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目23〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、項目23〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目23〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペア(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する)と、PCR増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製すること;
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
(c)前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること(ここで、前記DSNは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない);ならびに
(d)前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮すること
を含む、方法。
(項目35)
工程(d)を行う前に、工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
工程(b)、(c)および(d)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目34〜35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、項目34〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記変性温度が65〜85℃である、項目34〜37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、項目34〜38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、項目34〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
PCR増幅に使用されるプライマーが、工程(c)において適用された温度未満の融解温度を有する、項目34〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
野生型核酸と比べて2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を濃縮するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目34〜41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記増幅条件がCOLD−PCRである、項目34〜42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供すること;
(d)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、最適なDSN活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記DSNが、前記メチル化二本鎖核酸を切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
(項目45)
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること;
(d)前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること;ならびに
(e)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、最適なDSN活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記DSNが、前記メチル化二重鎖を優先的に切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
(項目46)
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程;ならびに
(d)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断するが、前記メチル化二本鎖核酸を切断しない、方法。
(項目47)
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること;
(d)前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること;ならびに
(e)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断するが、前記メチル化二重鎖を切断しない、方法。
(項目48)
工程(b)の前記核酸増幅反応が、PCR;完全COLD−PCR、高速COLD−PCR;ice−COLD−PCR、耐温COLD−PCRおよび変性時間限定COLD−PCRからなる群より選択される、項目44〜47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記切断非メチル化一本鎖核酸および前記非切断メチル化二重鎖を、工程(a)においてライゲーションされた前記亜硫酸水素塩耐性アダプターを使用した増幅条件に供する、項目44〜48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記増幅条件が、PCR;完全COLD−PCR、高速COLD−PCR;ice−COLD−PCR、耐温COLD−PCRおよび変性時間限定COLD−PCRからなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記亜硫酸水素ナトリウム処理の前に、天然にATリッチな配列を除去する、項目44〜50のいずれか一項に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること;
前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);ならびに
前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目2)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);ならびに
前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目3)
前記二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件が、有機溶媒の添加および/または耐熱性DSNと組み合わせた温度の上昇を含む、項目1〜2のいずれか一項に記載の方法。
(項目4)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する)
;
前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること;ならびに
前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目5)
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
各プローブが、ロックド核酸、ペプチド核酸、異種核酸(XNA)、任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはRNAを含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に対する1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目1〜7のいずれか一項に記載の方法。
(項目9)
前記核酸サンプルが、尿、血漿または他の体液中のゲノムDNAまたは循環DNAを含む、項目1〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
項目2または4に記載の方法を実行する前に、以下:前記核酸サンプルと、トップ鎖およびボトム鎖上の目的の異なる核酸に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させること、前記トップ鎖およびボトム鎖上の目的の核酸への前記ベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にすること、ならびにそれに結合した前記目的の核酸を有するベイトオリゴヌクレオチドを残りの核酸から単離することによって、目的の領域について前記核酸を濃縮することをさらに含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記ベイトオリゴヌクレオチドが一方の末端においてビオチン化されている、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記ベイトオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着されている、項目11に記載の方法。
(項目13)
項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを増幅条件に供する、項目1〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目1〜13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記増幅条件が、PCR、COLD−PCR、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性PCRまたはCOLD−PCR、マルチプレックスPCRおよび等温増幅からなる群より選択される、項目13または14に記載の方法。
(項目16)
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、項目13〜14のいずれか一項に記載の方法。
(項目17)
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、前記DSN切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるDNA分解条件に供することであって、前記切断位置で分解を開始させることによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
MALDI−TOF、HR融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング(MPS)、パイロシーケンシング、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCRおよび定量PCRからなる群より選択される方法の1つまたはそれよりも多くを使用して、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を分析することをさらに含む、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的である、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
その後に濃縮するための目的のメチル化標的核酸を調製するために使用され、前記反応混合物に対して項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的の非メチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的の非メチル化核酸のボトム鎖に相補的である、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目21)
その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸および目的のメチル化標的核酸の両方を調製するために使用され、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含み;ならびに
前記反応混合物に対して項目2または4に記載の方法を実行する前に、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理する、項目1〜18のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用され、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む、項目21に記載の方法。
(項目23)
野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する);
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;ならびに
(c)前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない、方法。
(項目24)
前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、項目23に記載の方法。
(項目25)
工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目23〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、項目23〜25のいずれか一項に記載の方法。
(項目27)
前記変性温度が65〜85℃である、項目23〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記標的DNA上のそれらの対応する配列への、異なるTmを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度間の漸減温度勾配を適用することによって、前記温度を低下させる工程(c)を実施する、項目23〜27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
DSN消化中に67℃〜64℃の漸減温度勾配を適用して、64〜67℃の異なるTmを有するプローブがそれらの個々の標的にハイブリダイズすることを可能にする、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記温度勾配が2〜20℃の範囲である、項目28または29に記載の方法。
(項目31)
切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、項目23〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、項目23〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目23〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペア(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異を含有する前記標的核酸上の配列と重複する)と、PCR増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製すること;
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
(c)前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること(ここで、前記DSNは、前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を切断するが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を切断しない);ならびに
(d)前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮すること
を含む、方法。
(項目35)
工程(d)を行う前に、工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
工程(b)、(c)および(d)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、項目34〜35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、項目34〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記変性温度が65〜85℃である、項目34〜37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、項目34〜38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、項目34〜39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
PCR増幅に使用されるプライマーが、工程(c)において適用された温度未満の融解温度を有する、項目34〜40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
野生型核酸と比べて2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を濃縮するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、項目34〜41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記増幅条件がCOLD−PCRである、項目34〜42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供すること;
(d)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、最適なDSN活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記DSNが、前記メチル化二本鎖核酸を切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
(項目45)
対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること;
(d)前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること;ならびに
(e)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、最適なDSN活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記DSNが、前記メチル化二重鎖を優先的に切断するが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断しない、方法。
(項目46)
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程;ならびに
(d)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を切断するが、前記メチル化二本鎖核酸を切断しない、方法。
(項目47)
対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること;
(d)前記温度を低下させることであって、非メチル化二重鎖ではなくメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること;ならびに
(e)前記非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断するが、前記メチル化二重鎖を切断しない、方法。
(項目48)
工程(b)の前記核酸増幅反応が、PCR;完全COLD−PCR、高速COLD−PCR;ice−COLD−PCR、耐温COLD−PCRおよび変性時間限定COLD−PCRからなる群より選択される、項目44〜47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記切断非メチル化一本鎖核酸および前記非切断メチル化二重鎖を、工程(a)においてライゲーションされた前記亜硫酸水素塩耐性アダプターを使用した増幅条件に供する、項目44〜48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記増幅条件が、PCR;完全COLD−PCR、高速COLD−PCR;ice−COLD−PCR、耐温COLD−PCRおよび変性時間限定COLD−PCRからなる群より選択される、項目49に記載の方法。
(項目51)
前記亜硫酸水素ナトリウム処理の前に、天然にATリッチな配列を除去する、項目44〜50のいずれか一項に記載の方法。
Claims (51)
- 野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化する条件に供すること;
前記不安定化した二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとを接触させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する);ならびに
前記相補的な野生型−プローブ二重鎖および前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。 - 野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する);ならびに
前記反応混合物を、前記二本鎖野生型核酸および二本鎖標的突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件に供することであって、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。 - 前記二本鎖野生型核酸および二本鎖突然変異体核酸を不安定化して、前記野生型核酸および突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件が、有機溶媒の添加および/または耐熱性DSNと組み合わせた温度の上昇を含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
- 野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する)
;
前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
前記反応混合物の温度を低下させることであって、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖との形成を可能にすること;ならびに
前記反応混合物を二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)に曝露すること
を含み、
前記DSNが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。 - 前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 各プローブが、ロックド核酸、ペプチド核酸、異種核酸(XNA)、任意の公知の修飾塩基を有する核酸、またはRNAを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に対する1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各標的突然変異体核酸およびプローブペアについて、前記プローブの一方が前記標的突然変異体核酸の前記野生型核酸対応物のトップ鎖に相補的であり、他方が前記標的突然変異体核酸の前記野生型核酸対応物のボトム鎖に相補的である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸サンプルが、尿、血漿または他の体液中のゲノムDNAまたは循環DNAを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸サンプルと、トップ鎖およびボトム鎖上の目的の異なる核酸に結合するベイトオリゴヌクレオチドとを接触させること、前記トップ鎖およびボトム鎖上の目的の核酸への前記ベイトオリゴヌクレオチドの結合を可能にすること、ならびにそれに結合した前記目的の核酸を有するベイトオリゴヌクレオチドを残りの核酸から単離することによって、目的の領域について前記核酸を最初に濃縮することをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記ベイトオリゴヌクレオチドが一方の末端においてビオチン化されている、請求項10に記載の方法。
- 前記ベイトオリゴヌクレオチドが、ビーズに付着されている、請求項11に記載の方法。
- 最初に前記核酸サンプルを増幅条件に供することをさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅条件が、PCR、COLD−PCR、共通のライゲーションアダプターを使用したライゲーション媒介性PCRまたはCOLD−PCR、マルチプレックスPCRおよび等温増幅からなる群より選択される、請求項13または14に記載の方法。
- 各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、請求項13〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を、前記DSN切断野生型−プローブ二重鎖を酵素的に加水分解するさらなるDNA分解条件に供することであって、前記切断位置で分解を開始させることによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- MALDI−TOF、HR融解、ジデオキシシーケンシング、単一分子シーケンシング、大量並列シーケンシング(MPS)、パイロシーケンシング、SSCP、RFLP、dHPLC、CCM、デジタルPCRおよび定量PCRからなる群より選択される方法の1つまたはそれよりも多くを使用して、切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を分析することをさらに含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸を調製するために使用され、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで最初に処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が前記目的のメチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが前記目的のメチル化核酸のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブは、前記目的のメチル化核酸に相補的である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- その後に濃縮するための目的のメチル化標的核酸を調製するために使用され、前記核酸サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで最初に処理し、前記オリゴヌクレオチドプローブの一方が亜硫酸水素塩変換した前記目的の非メチル化核酸のトップ鎖に相補的であり、前記他方のオリゴヌクレオチドプローブが亜硫酸水素塩変換した前記目的の非メチル化核酸のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブが亜硫酸水素塩変換した前記目的の非メチル化核酸に相補的である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- その後に濃縮するための目的の非メチル化標的核酸および目的のメチル化標的核酸の両方を調製するために使用され、前記核酸サンプルを、亜硫酸水素ナトリウムで最初に処理し、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的の非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブが、前記非メチル化核酸を含む鎖に結合するオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が、前記目的のメチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、前記目的のメチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のボトム鎖に相補的であり、前記疑われる突然変異と重複する前記プローブが、非メチル化核酸を含む鎖に結合するオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む2つのオリゴヌクレオチドプローブペアを用いる、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。 - 複数の目的の標的核酸であって、その一部が目的のメチル化標的核酸であり、その一部が目的の非メチル化標的核酸である複数の目的の標的核酸を調製するために使用され、
(i)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、一つのプローブが、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他のプローブが、目的の各非メチル化標的核酸のメチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア、
(ii)オリゴヌクレオチドプローブペアであって、一つのプローブが、目的の各メチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のトップ鎖に相補的であり、他方が、目的の各メチル化標的核酸の亜硫酸水素塩変換した非メチル化形態のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペア
を含む複数のオリゴヌクレオチドプローブペアを用いる、請求項21に記載の方法。 - 野生型核酸と比べてその後に濃縮するための標的突然変異体核酸を調製するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸とを含む核酸サンプルを、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的であるオリゴヌクレオチドプローブペアとに曝露することであって、反応混合物を作ること(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する);
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;ならびに
(c)前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること
を含み、
前記DSNが、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する、方法。 - 前記プローブが、前記野生型核酸および標的核酸と比較して100倍〜10億倍モル過剰である、請求項23に記載の方法。
- 工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項23〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変性温度が65〜85℃である、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的DNA上のそれらの対応する配列への、異なるTmを有するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする温度間の漸減温度勾配を適用することによって、前記温度を低下させる工程(c)を実施する、請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法。
- DSN消化中に67℃〜64℃の漸減温度勾配を適用して、64〜67℃の異なるTmを有するプローブがそれらの個々の標的にハイブリダイズすることを可能にする、請求項28に記載の方法。
- 前記温度勾配が2〜20℃の範囲である、請求項28または29に記載の方法。
- 切断野生型−プローブ二重鎖および非切断標的突然変異体核酸を有する反応混合物を増幅条件に供することによって、前記野生型核酸と比べて前記標的突然変異体核酸を濃縮することをさらに含む、請求項23〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項23〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 対応する野生型核酸と比べてその後に濃縮するための2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を調製するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項23〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 標的突然変異体核酸を濃縮するための方法であって、
(a)二本鎖野生型核酸と、突然変異を含有すると疑われる二本鎖標的核酸と、耐熱性二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、オリゴヌクレオチドプローブペアであって、その一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的あるオリゴヌクレオチドプローブペア(ここで、前記プローブの少なくとも一方は、前記疑われる突然変異と重複する)と、PCR増幅成分とを含む増幅反応混合物を調製すること;
(b)前記反応混合物を変性温度に供することであって、前記野生型核酸および前記標的突然変異体核酸の変性を可能にすること;
(c)前記温度を低下させることであって、前記野生型核酸および標的突然変異体核酸上のそれらの対応する配列への前記プローブのハイブリダイゼーションを可能にし、それにより、トップ鎖およびボトム鎖上の相補的な野生型−プローブ二重鎖と、部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖とを形成すること(ここで、前記DSNは、前記部分的に相補的な標的突然変異体−プローブ二重鎖と比べて前記相補的な野生型−プローブ二重鎖を優先的に切断する);ならびに
(d)前記反応混合物を増幅条件に供し、それにより、前記切断野生型核酸と比べて前記非切断標的突然変異体核酸を濃縮すること
を含む、方法。 - 工程(d)を行う前に、工程(b)および(c)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項34に記載の方法。
- 工程(b)、(c)および(d)を2サイクルまたはそれを超えて反復することをさらに含む、請求項34〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が有機溶媒をさらに含む、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記変性温度が65〜85℃である、請求項34〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブの一方が、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記トップ鎖上の配列と重複し、前記他方のプローブが、前記突然変異を含有する前記標的核酸の前記ボトム鎖上の配列と重複し、前記2つのプローブが互いに部分的に重複する、請求項34〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 各プローブが、ポリメラーゼ伸長を防止するように3’末端で改変されている、請求項34〜39のいずれか一項に記載の方法。
- PCR増幅に使用されるプライマーが、工程(c)において適用された温度未満の融解温度を有する、請求項34〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 野生型核酸と比べて2つまたはそれを超える異なる標的突然変異体核酸を濃縮するために使用され、前記異なる野生型核酸に向けた1つまたはそれを超えるさらなるプローブペアをさらに含み、各プローブペアについて、前記プローブの一方が前記野生型核酸のトップ鎖に相補的であり、他方が前記野生型核酸のボトム鎖に相補的である、請求項34〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅条件がCOLD−PCRである、請求項34〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、メチル化核酸と比べて亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸の優先的変性を可能にする温度に供すること;
(d)前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、最適なDSN活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記DSNが、亜硫酸水素塩変換した前記非メチル化一本鎖核酸と比べて前記メチル化二本鎖核酸を優先的に切断する、方法。 - 対応するメチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的の非メチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること;
(d)前記温度を低下させることであって、亜硫酸水素塩変換した非メチル化二重鎖と比べてメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること;ならびに
(e)前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸を、二本鎖特異的ヌクレアーゼ(DSN)と、最適なDSN活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記DSNが、前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化一本鎖核酸と比べて前記メチル化二重鎖を優先的に切断する、方法。 - 対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸の優先的変性を可能にするがメチル化核酸は依然として二本鎖である温度に供する工程;ならびに
(d)前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記メチル化二本鎖核酸と比べて前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断する、方法。 - 対応する非メチル化核酸と比べてその後に濃縮するための目的のメチル化核酸を調製するための方法であって、以下のステップ:
(a)亜硫酸水素塩耐性アダプターを目的の二本鎖核酸にライゲーションすること;
(b)前記アダプターに連結された核酸を亜硫酸水素ナトリウム処理および核酸増幅反応に供することであって、二本鎖亜硫酸水素塩処理核酸を形成すること;
(c)前記亜硫酸水素塩処理核酸を、亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸の両方の変性を可能にする変性温度に供することであって、非メチル化一本鎖核酸およびメチル化一本鎖核酸を形成すること;
(d)前記温度を低下させることであって、亜硫酸水素塩変換した非メチル化二重鎖と比べてメチル化二重鎖の優先的形成を可能にすること;ならびに
(e)前記亜硫酸水素塩変換した非メチル化核酸およびメチル化核酸を、エキソヌクレアーゼと、最適なエキソヌクレアーゼ活性のための条件とに曝露すること
を含み、前記エキソヌクレアーゼが、前記メチル化二重鎖と比べて前記非メチル化一本鎖核酸を優先的に切断する、方法。 - 工程(b)の前記核酸増幅反応が、PCR;完全COLD−PCR、高速COLD−PCR;ice−COLD−PCR、耐温COLD−PCRおよび変性時間限定COLD−PCRからなる群より選択される、請求項44〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記切断非メチル化一本鎖核酸および前記非切断メチル化二重鎖を、工程(a)においてライゲーションされた前記亜硫酸水素塩耐性アダプターを使用した増幅条件に供する、請求項44〜48のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅条件が、PCR;完全COLD−PCR、高速COLD−PCR;ice−COLD−PCR、耐温COLD−PCRおよび変性時間限定COLD−PCRからなる群より選択される、請求項49に記載の方法。
- 前記亜硫酸水素ナトリウム処理の前に、天然にATリッチな配列を除去する、請求項44〜50のいずれか一項に記載の方法。
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