KR102285085B1

KR102285085B1 - 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR102285085B1
Application number: KR1020207029972A
Authority: KR
Inventors: 호다카 후지이; 도시츠구 후지타
Original assignee: 에피제네론, 인크.
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2021-08-06
Also published as: SG11202009878VA; IL277764B; WO2019203350A1; CA3096462C; US20210147940A1; KR20200125745A; IL277764A; EP3789504A4; CN111989408A; CA3096462A1; KR102501070B1; EP3789504A1; US11155873B2; KR20210088760A; JPWO2019203350A1; JP6653932B1

Abstract

표적 핵산 영역을 포함하는 핵산을 주형으로 기준서열을 포함하는 범위를 증폭시키는 주형 의존적 핵산 증폭 반응에서, 표적 핵산 영역 내의 기준서열과 혼성화하는 10개 내지 200개 염기로 이루어진 단일가닥 핵산을 반응계에 첨가하여 반응을 수행하는 공정과, 증폭산물을 확인하는 공정을 포함하고, 단일가닥 핵산은 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라이며, 단일가닥 핵산의 기준서열에 대한 상보율은, 기준서열에 대한 차이를 포함하는 기준외서열에 대한 상보율보다 높은 것을 특징으로 하는, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 검출하는 방법을 제공한다.

Description

표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 검출하는 방법

본 발명은 주형 의존적 핵산 증폭반응(template dependent nucleic acid amplication reaction)을 이용하여 표적 핵산 영역내의 기준서열에 대한 차이를 검출하는 방법에 관한 것이다.

DNA와 RNA의 1개 내지 복수개의 염기 변이(삽입, 결실 또는 치환), 다시 말해 기준서열(예를 들면, 야생형 서열)에 대한 차이를 검출하는 방법으로는 다음과 같은 기술이 알려져 있다.

(1) 염기서열 분석

변이의 검출에는 분석 대상의 핵산 서열을 결정하고, 야생형 서열과 비교하는 방법이 일반적으로 이용된다. 서열 분석 방법으로는 생거법(디데옥시법, dideoxy method), 일련의 차세대 시퀀싱 방법(비특허문헌 1) 등이 사용된다. 이를 통해, 분석 대상 샘플이 변이를 가지고 있는지의 여부, 또한 어떤 변이를 가지고 있는 것인지 최종 결정된다. 그러나, 이 방법은 각각의 세포로부터 핵산을 추출하여 PCR법에 의하여 당해 핵산 서열을 증폭한 후 직접 또는 플라스미드 등에 클로닝하고 시퀀싱 반응을 해야할 필요가 있고, 예를 들면 게놈 편집된 세포나 임상검체 중의 변이 세포를 검출하는 데 엄청난 시간이 걸린다. 따라서 염기서열 분석은 적어도 변이를 갖는 세포의 스크리닝 목적으로는 적합하지 않다. 스크리닝의 목적에는 보다 간편하게 실시할 수 있는 방법이 필요하다.

(2) 변이를 가질 것으로 예상되는 DNA 영역에 대한 프라이머를 이용한 PCR법

변이를 가질 것으로 예상되는 야생형 DNA 영역에 대한 프라이머와, 그것과의 조합을 통해 증폭산물이 생기는 프라이머를 이용한 PCR법이 보고되어 있다(비특허문헌 2, 3, 4). 이 방법은 야생형 DNA로부터는 PCR 산물이 증폭되는 것에 반해, 변이를 가지고 있는 DNA로부터는 증폭 산물이 발생하지 않음을 이용하여, 변이 DNA를 포함한 샘플을 검출하는 방법이다. 이 방법은 증폭산물이 발생하지 않는다는 음성 시그널이 변이 검출의 원리인 바, PCR 반응이 진행하기 어려워지는 요인은 다수 존재하므로, 위양성(陽性, false positive)이 되는 경우가 많다. 그러므로, 정확하게 변이를 검출하기 위해서는 다수의 샘플을 분석할 필요가 있다.

(3) TaqMan 프로브 등의 형광물질과 ??처 수식(quencher modification) 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 PCR법

형광물질(프로브의 5'측)과 ??처(프로브의 3'측)에서 수식(修飾)된, 변이를 갖는 것으로 예상되는 DNA 영역에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브를 PCR 반응계에 추가함으로써, 변이를 갖는 DNA를 검출하는 방법이 많이 사용되고 있다(비특허문헌 5 내지 7). 이 방법은, 야생형의 주형 DNA에 대해서는 프로브가 어닐링되므로, PCR에 사용되는 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 프로브가 절단되고, 형광물질과 ??처가 괴리되는 결과, 반응계에 형광이 발생하는 원리에 기초하고 있다. 변이를 갖는 주형 DNA에 대해서는 프로브가 어닐링되지 않으므로, 형광이 발생하지 않는다. 그러나, 이 분석의 실시에는 형광을 검출할 수 있는 실시간 PCR 장비 또는 디지털 PCR 장치가 필요하다. 또한 샘플 중에 야생형과 변이형 DNA가 혼재하는 경우에는, 샘플중에 야생형 DNA가 존재함으로 인한 형광이 발생하므로, 이러한 헤테로 변이의 검출에는 사용하기 어렵다.

(4) 서베이어 분석(surveyor assay)

서베이어 분석은, PCR법으로 증폭한 대조 DNA와 테스트 DNA를 시험관내에서 혼합하여, 열변성·재이중나선화를 수행하고, 서베이어 뉴클레아제를 사용하여 미스매치 염기(mismatched base)의 3'말단측을 절단함으로써, 테스트 DNA가 대조 DNA와 다른 염기를 포함하고 있음을 검출하는 것이다(비특허문헌 8). 이 방법은 통상, 세포로부터 핵산을 추출하고 PCR법에 의해 당해 핵산 서열을 증폭한 후에 실시된다. 이 방법은 비교적 간편하고 게놈을 편집한 세포 「집단」으로부터 DNA를 추출하고, 게놈 편집의 효율을 검정하기 위해 주로 사용되고 있다. 이 경우에는 게놈 편집 효율이 100%라는 것은 통상적으로 없고, 또한 게놈 편집의 방식도 다양하기 때문에, 대조 DNA를 투입할 필요는 없다. 그러나, 개별 게놈 편집 세포의 검출에서는, 야생형 세포에서 유래한 DNA를 혼합하지 않으면, 호모의 변이가 검출되지 않기 때문에, 야생형 세포에서 유래한 DNA를 혼합할 필요가 있다. 또한 개별 세포 유래의 분석을 수행할 경우에는, 상기의 염기서열 분석 방법이 더 직접적이기 때문에, 통상 서베이어 분석은 사용되지 않는다.

(5) High Resolution Melting Analysis(HRMA)

이 방법은 PCR 산물의 멜팅 커브를 분석함으로써, 염기서열의 차이를 검출하는 방법이다(비특허문헌 9). 이 분석은 간편하게 실시할 수 있지만, 멜팅 커브를 검출하기 위한 장비(실시간 PCR cycler 등)가 필요하다.

(6) 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)

이 방법은 모세관 전기영동에 의해 변이가 있는 영역을 포함하는 PCR 산물을 분석하고, 그 길이를 정밀하게 측정함으로써, 염기의 삽입이나 결실을 검출하는 것이다(비특허문헌 10, 11). 그러나, 상당한 수고가 드는 것 외에도, 모세관 전기영동 장치가 필요할 뿐만 아니라, 염기의 치환 변이의 경우에는 PCR 산물의 길이가 변하지 않기 때문에, 야생형과의 차이를 검출할 수 없다.

본 발명자들은 표적 영역에 혼성화하는 단일가닥 핵산을 반응계에 첨가함으로써, 표적 영역의 핵산 증폭을 특이적으로 억제하는 방법을 개발하여, 특허 출원하였다(특허문헌 1). 그러나, 특허문헌 1에는 표적 핵산 영역 내의 변이(기준서열에 대한 차이)를 검출하는 방법에 대해서 아무 기재도 없고, 특허문헌 1의 발명을 핵산 변이의 검출에 이용하려는 동기 부여는 제공하고 있지 않다.

일본 특개 제2016-049107호 공보

Shendure, 2012, Nature Biotechnology 30, 1084-1094 Harayama, 2017, PLoS ONE 12(6): e0179165 Yu, 2014, PLoS ONE 9(6): e98282 Hua, 2017, J. Genet. Genomics, 44(4), 207-213 Mock, 2015, Nucleic Acids Res., 43(11):5560-5571 Miyaoka,2014, Nat. Methods 11(3):291-293 Findlay, 2016, PLoS ONE 11(4): e0153901 Zhu, 2014, Scientific Reports 4, 6420 Dahlem, 2012, PLoS Genet., 8(8): e1002861 Young, 2015, Nucleic Acids Res., 43(9):e59 Ramlee, 2015, Sci, Rep. 5: 15587

본 발명은 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 간편하면서 저비용으로 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한 1개 염기 이상의 결실, 삽입 또는 치환을 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

[1] 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 검출하는 방법에 있어, 상기 표적 핵산 영역을 포함하는 핵산을 주형으로 하여 기준서열을 포함하는 범위를 증폭시키는 주형 의존적 핵산 증폭반응에 있어서, 상기 표적 핵산 영역 내의 기준서열과 혼성화하는 10개 내지 200개 염기로 이루어진 단일가닥 핵산을 반응계에 첨가하여 반응을 수행하는 공정과, 증폭산물을 확인하는 공정을 포함하고, 상기 단일가닥 핵산은 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라이며, 단일가닥 핵산의 기준서열에 대한 상보율은, 기준서열에 대한 차이를 포함하는 기준외서열에 대한 상보율보다 높은 것을 특징으로 하는 검출 방법.

[2] 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이가, 기준서열에서의 1개 염기 이상의 결실, 삽입 또는 치환인 것을 특징으로 하는 상기 [1]에 기재된 검출 방법.

[3] 주형 의존적 핵산 증폭반응은 PCR법, RT-PCR법, LAMP법, ICAN법, NASBA법, LCR법, SDA법, TRC법, TMA법 및 RPA법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [2]에 기재된 검출 방법.

[4] 주형 의존적 핵산 증폭반응이 PCR법인 상기 [3]에 기재된 검출 방법.

[5] PCR법이 변성 단계, 어닐링 단계 및 신장 단계로 이루어진 상기 [4]에 기재된 검출 방법.

[6] 어닐링 단계 및 신장 단계가 동일한 온도에서 실시되는 상기 [5]에 기재된 검출 방법.

[7] 단일가닥 핵산이 15 내지 30개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 상기 [1] 내지 [6]의 어느 하나에 기재된 검출 방법.

[8] 단일가닥 핵산이 단일가닥 RNA인 상기 [1] 내지 [7]의 어느 하나에 기재된 검출 방법.

[9] 표적 핵산 영역을 포함하는 핵산이 피시험자의 임상검체(clinical specimen)로부터 얻은 핵산인 것을 특징으로 하는, 상기 [1] 내지 [8]의 어느 하나에 기재된 검출 방법.

[10] 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 갖는 세포를 스크리닝하는 방법에 있어, 피시험세포(被試驗細胞)로부터 핵산을 제조하는 공정, 얻어진 핵산을 주형으로 하여 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 검출 방법을 제공하고 증폭산물의 유무를 확인하는 공정, 및 증폭산물이 확인된 세포를 선택하는 공정를 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.

[11] 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 갖는 핵산의 비율을 증가시키는 방법에 있어, 피시험세포 집단으로부터 핵산을 제조하는 공정, 얻어진 핵산을 주형으로 하여 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 검출 방법을 제공하고 증폭산물을 회수하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.

[12] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 검출 방법에서 사용하기 위한 키트로서, 표적 핵산 영역 내의 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라인 단일가닥 핵산을 포함하는 키트.

[13] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 검출 방법에서 사용하기 위한 검출제에 있어, 표적 핵산 영역 내의 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라인 단일가닥 핵산을 포함하는 검출제.

본 발명에 의해, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 고정밀도로 간편하게 양성 시그널로 검출할 수 있으면서, 1개 염기 이상의 결실, 삽입 또는 치환를 검출할 수 있는 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이의 검출 방법을 제공할 수 있다.

[도 1] (A)는, 인간 THYN1 유전자 로커스의 CRISPR 절단 위치를 포함하는 표적 핵산 영역의 염기서열(서열번호 35)과 올리고리보뉴클레오티드(ORN_20b, ORN_24b 또는 ORN_Target, 표 1 참조)와의 혼성화 상태, 및 THYN1 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타내는 도면이며, (B)는 야생형 세포에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 이들 올리고리보뉴클레오티드를 첨가하여 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 2] 야생형 세포로부터 추출한 게놈 DNA와, 게놈 편집을 수행한 5개 종류의 세포(T1, T4, T6, T7 및 T9)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, 올리고리보뉴클레오티드(ORN_20b 또는 ORN_306F(NC), 표 1 참조)를 첨가하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 3] 야생형 세포에서 추출한 게놈 DNA와, 게놈 편집을 수행한 5개 종류의 세포(T1, T4, T6, T7 및 T9)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, 올리고리보뉴클레오티드(ORN_24b, ORN_Target 또는 ORN_302F(NC), 표 1 참조)를 첨가하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 4] 야생형 세포에서 추출한 게놈 DNA, 양 대립유전자에 동일한 변이를 가지는 T4 세포 또는 T9 세포에서 추출한 게놈 DNA, 및 야생형 세포에서 추출한 게놈 DNA와 대립유전자에 동일한 변이를 갖는 T4 세포 또는 T9 세포에서 추출한 게놈 DNA를 1:1의 비율로 혼합하고 단일 대립유전자 변이를 모방한 게놈 DNA(WT+T4, WT+T9)를 주형으로 하여 올리고리보뉴클레오티드(ORN_20b, ORN_24b, ORN_Target, ORN_302F(NC) 또는 ORN_306F(NC), 표 1 참조)를 첨가하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 5] KOD DNA 중합효소 대신 Pfu DNA 중합효소를 이용한 것을 제외하고는, 실시예 1 (1-2) 및 (1-3)과 동일한 조건에서 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 6] 야생형 세포에서 추출한 게놈 DNA, 양 대립유전자에 변이를 갖는 세포(T4와 T6)에서 추출한 게놈 DNA, 및 단일 대립유전자 변이를 모방한 게놈 DNA (WT+T4)를 주형으로 하고, 올리고리보뉴클레오티드 (ORN_24b, ORN_302F(NC))을 첨가하여 실시간 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 7] 야생형 세포에서 추출한 게놈 DNA, 양 대립유전자에 변이를 갖는 세포(T4와 T6)에서 추출한 게놈 DNA, 및 단일 대립유전자 변이를 모방한 게놈 DNA (WT+T4)를 주형으로 하고, 표적 특이적인 올리고리보뉴클레오티드 대신에 CRISPR 표적 부위에 상보적인 RNA 서열을 포함하는 crRNA_Target, 및 대조군으로서 관계없는 유전자 로커스에 상보적인 RNA 서열을 포함하는 crRNA_NC을 첨가하여 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 8] (A)는 인간 CDKN2A(p16)의 CRISPR 절단 위치를 포함하는 표적 핵산 영역의 염기서열(서열번호 37)과 올리고리보뉴클레오티드(ORN_p16 표 1 참조)와의 혼성화 상태, 및 CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타내는 도면이고, (B)는 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하는 CRISPR 복합체를 트랜스펙션(transfection)된 세포로부터 단리한 12클론(C1 내지 C12)의 각 게놈 DNA를 주형으로 하고, ORN_p16을 첨가하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 9] (A)는 CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역(상단) 및 THYN1 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역(하단)을 나타내는 도면이며, (B)는 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하는 CRISPR 복합체와 THYN1 유전자 로커스를 표적으로 하는 CRISPR 복합체를 트랜스펙션된 세포로부터 단리한 11클론 (CT1 내지 CT11)의 각 게놈 DNA를 주형으로 하고 ORN_p16 및 ORN_24b을 첨가하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 10] (A)는 한쪽의 대립유전자에 1개 염기 결실을 갖는 세포(C4)에서 추출한 게놈 DNA와, 한쪽의 대립유전자에 2개 염기 결실을 갖는 세포(C6)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, ORN_p16을 첨가하여 어닐링/신장 온도 62℃ 또는 70℃의 2단계 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이며, (B)는 각 어닐링/신장 온도에서의 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 11] (A)는 한쪽의 대립유전자에 1개 염기 삽입을 갖는 세포(CT11)에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, ORN_24b을 첨가하여 어닐링 온도 62℃ 또는 68℃의 PCR을 실시한 결과를 나타낸 도면이며, (B)는 각 어닐링 온도에서의 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 12] (A)는 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 한쪽 대립유전자에 1개 염기(G)의 삽입이 존재하는 HCT116 세포에서 추출한 게놈 DNA와 ORN_Gx5와의 혼성화 상태, 및 CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타내는 도면이며, (B)는 어닐링/신장 온도 68℃ 또는 72℃의 2단계 PCR의 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 13] (A)는 마우스 Tax1bp1 유전자 로커스의 표적 핵산 영역의 염기서열(서열번호 41)과 올리고리보뉴클레오티드 (ORN_Tax 표 1 참조)와의 혼성화 상태, 및 Tax1bp1 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타내는 도면이며, (B)는 2단계 PCR 반응 조건을 나타내는 도면이고, (C)는 야생형 게놈 DNA를 주형으로 하여 ORN_Tax을 첨가하고 2단계 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 14] (A)는 인간 c-FOS 유전자 로커스의 표적 핵산 영역의 염기서열(서열번호 42)과 올리고리보뉴클레오티드(ORN_FOS 표 1 참조)와의 혼성화 상태, 및 c-FOS 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타내는 도면이며, (B)는 2단계 PCR 반응 조건을 나타내는 도면이고, (C)는 야생형 게놈 DNA를 주형으로 하여 ORN_FOS을 첨가하고, 2단계 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 15] (A)는 인간 c-FOS 유전자 로커스의 TALEN 절단 위치를 포함한 표적 핵산 영역의 염기서열(서열번호 43)과 올리고리보뉴클레오티드(ORN_FOS, 표 1 참조)와의 혼성화 상태, 및 c-FOS 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타내는 도면이며, (B)는 c-FOS 유전자 로커스를 표적으로 하는 TALEN와 트랜스펙션한 세포에서 분리된 14클론 (F1 내지 F14)의 각 게놈 DNA를 주형으로 하여 ORN_FOS을 첨가하고 2단계 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 16] (A)는 인간 EGFR 유전자 로커스의 표적 핵산 영역의 염기서열(서열번호 44)과 올리고리보뉴클레오티드(ORN_EGFR_L858 표 1 참조)와의 혼성화 상태, 및 EGFR 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타내는 도면이고, (B)는 2단계 PCR 반응 조건을 나타내는 도면이며, (C)는 293T 또는 NCI-H1975 게놈 DNA를 주형으로 하여 ORN_EGFR_L858을 첨가하고 2단계 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이고, (D)는 어닐링 및 신장 온도 59℃의 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 17] (A)는 실시예 7 (7-1) 실험 모식도이고, (B)는 인간 THYN1 유전자 로커스의 표적 핵산 영역의 염기서열(서열번호 51)과 올리고리보뉴클레오티드(ORN_24b, 표 1 참조)와의 혼성화 상태를 나타내는 도면이며, (C)는 야생형 세포 또는 게놈 편집 도입 후의 세포집단의 게놈 DNA를 주형으로 하여 ORN_24b을 첨가하고 2단계 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이며, (D)는 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 18] (A)는 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 표적 핵산 영역의 염기서열(서열번호 53)과 crRNA(crRNA_lef5 서열번호 47)와의 혼성화 상태를 나타내는 도면이고, (B)는 야생형 세포 또는 게놈 편집 도입후의 세포집단의 게놈 DNA를 주형으로 하여, crRNA_lef5을 첨가하고 2단계 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이며, (C)는 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
[도 19] (A)는 바이설파이트 처리한 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 검출 방법을 실시하는 경우의 모식도이고, (B)는 바이설파이트 처리한 HCT116 세포 게놈 DNA를 주형으로 했을 때, CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트(hCDKN2A-Bisul-CpG-free-F (서열번호 48) 및 hCDKN2A-Bisul-CpG-free-R (서열번호 49))에 의해 증폭된 DNA 영역(서열번호 55)에 있어서, 바이설파이트 처리 전의 염기서열을 나타내는 도면이며, (C)는 바이설파이트 처리 후의 (B)의 음영부분 서열의 상보서열(메틸화 시토신을 포함하지 않는 경우(위)와 메틸화 시토신을 포함하는 경우(아래))과 ORN_hCDKN2A_U (서열번호 50)와의 혼성화 상태를 나타내는 도면이며, (D)는 바이설파이트 처리후 게놈 DNA를 주형으로 하여 ORN_hCDKN2A_U를 첨가하고 2단계 PCR을 수행한 결과를 나타내는 도면이며, (E)는 증폭산물의 염기서열을 분석한 결과((B)의 서열의 밑줄이 있는 서열 부분)를 나타내는 도면이다.

본 발명은 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 검출하는 방법(이하, 「본 발명의 검출 방법」이라고 함)을 제공한다. 본 발명의 검출 방법은, 표적 핵산 영역을 포함하는 핵산을 주형으로 하고 기준서열을 포함하는 범위를 증폭시키는 주형 의존적 핵산 증폭반응에 있어서, 상기 표적 핵산 영역 내의 기준서열과 혼성화하는 10개 내지 200개 염기로 이루어진 단일가닥 핵산을 반응계에 첨가하여 반응을 수행하는 공정과, 증폭산물의 존재를 확인하는 공정를 포함하는 것이면 된다. 본 발명의 검출 방법은, 기준서열에 대한 차이의 유무를 검출하고자 하는 피시험 핵산을 주형으로 하여 주형 의존적 핵산 증폭반응을 수행할 때, 피시험 핵산이 표적 핵산 영역내에 기준서열에 대한 차이를 가지지 않는 경우에는, 단일가닥 핵산의 주형과 혼성화에 의해 증폭이 저해되어 증폭산물이 생성되지 않지만, 피시험 핵산이 표적 핵산 영역내에 기준서열에 대한 차이를 갖는 경우에는 증폭이 저해되지 않고 증폭산물이 얻어지는 것을 특징으로 하고 있다.

본 명세서에서 「기준서열」은 차이를 분석하기 위한 기준이 되는 서열이며, 목적에 따라 임의로 결정할 수 있다. 기준서열의 길이(염기 길이)는 특별히 제한되지 않는다. 표적 핵산 영역에만 존재하고, 표적 핵산 영역 이외의 영역에 존재하지 않는 것이 특정될 수 있는 길이인 것이 바람직하지만, 표적 핵산 영역 이외의 영역에 극히 드물게 존재하는 서열로 특정할 수 있는 길이이면 무방하다. 구체적으로는, 예를 들어 10개 염기 이상인 것이 바람직하고, 15개 염기 이상인 것이 보다 바람직하며, 20개 염기 이상인 것이 한층 더 바람직하다.

「표적 핵산 영역」은 기준서열과의 차이를 분석하고자 하는 서열 부분을 포함하는 영역이면 되고, 기준서열이 존재하는 위치에 따라 적절하게 규정할 수 있다. 기준서열과의 차이로는, 기준서열에 대한 결실변이, 삽입변이, 치환변이나 기준서열 내의 염기의 메틸화 등을 예로 들 수 있다. 또한 유전자 다형성을 갖는 핵산에 대해서는, 특정 서열을 기준서열로 할 때, 기준서열과 다른 다형을 갖는 경우에 기준서열과의 차이를 포함하는 서열로 검출된다. 본원 명세서에서, 기준서열에 대하여 차이를 포함하는 서열을 「기준외서열」이라고 칭한다.

주형 의존적 핵산 증폭반응은, 핵산 합성 효소가 주형 핵산에 기초하여 상보가닥의 합성을 반복함으로써, 목적하는 영역의 핵산 가닥을 증폭시키는 것이면 된다. 증폭되는 범위는 기준서열을 포함하는 범위이면 되고, 사용하는 주형 의존적 핵산 증폭반응에 따라 적절한 범위(염기 길이)로 설정할 수 있다. 주형 핵산은 단일가닥일 수도 있고, 이중가닥일 수도 있다. 또한 주형 핵산은 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드의 어느 것이어도 된다. 또한 구성 뉴클레오티드가 인공적인 유도체에 치환되어 있는 것이나, 천연 DNA 또는 RNA가 수식되어 있는 것이라도, 상보가닥 합성의 주형으로 기능하는 한 주형 핵산에 포함된다. 주형 핵산으로서, 구체적으로는, 예를 들면 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA, 전RNA, mRNA, rRNA, miRNA, 합성 RNA 등이 있다. 본 발명의 검출 방법에서는, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 검출하려고 하는 피시험핵산이 주형 핵산으로 된다. 주형 핵산은 그 종류에 따라 각각 공지의 방법을 이용하여 얻을 수 있다.

주형 핵산으로서, 피시험자의 임상검체에서 얻은 핵산(예: 혈액이나 생검 조직에서 추출한 게놈 DNA)을 이용하면, 본 발명의 검출 방법에 의해 피시험자의 특정 유전자(예를 들어, 암 유전자)의 변이의 유무와 유전자 다형성을 검출할 수 있다. 또한 바이설파이트 처리한 핵산(DNA)를 주형으로 이용하면, 기준서열의 메틸화 염기(메틸화 시토신 등)를 검출할 수 있다. 기준서열의 메틸화 염기를 검출하는 경우, 기준서열은 바이설파이트 처리한 핵산(DNA)의 표적영역 내에 존재하는 염기서열의 상보서열일 수도 있다.

주형 의존적 핵산 증폭반응은, 주형 핵산에 프라이머를 어닐링시켜 프라이머의 3'말단으로부터 핵산을 신장시킴으로써 핵산 가닥을 증폭하는 반응이 바람직하다. 이러한 주형 의존적 핵산 증폭반응으로는 PCR법(Polymerase Chain Reaction : White, TJ et al., Trends Genet. 5, 185(1989)), RT-PCR법 (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction: James W. Larrick, Trends in Biotechnology, 10, 146-152, 1992), LAMP법(Loop-mediated isothermal Amplification : 국제공개 제WO00/28082호), ICAN법(isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids: 국제공개 제02/16639호), NASBA법(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification: 일본특허 제2650159호 공보), LCR법(Ligase Chain Reaction : Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, p.189-193, 1991), SDA법(Strand Displacement Amplification: 일본특허공개 평성07-114718호 공보), TRC법(Transcription-Reverse Transcription-Concerted method: Nakaguchi Y. et al., J. Clin. Microbiol., vol.42: p.4248-4292(2004)), TMA법(Transcription-Mediated-Amplification: Sarrazin C. et al., J. Clin. Microbiol., vol.39: p.2850-2855(2001)), RPA법(Recombinase Polymerase Amplification: Piepenburg, O., et al., PLoS Biol. 2006, vol.4, e204) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 검출 방법은 어떠한 주형 의존적 핵산 증폭 방법에도 적용할 수 있지만, PCR 법에 적용하는 것이 바람직하다.

주형 의존적 핵산 증폭반응에서 사용하는 프라이머는, 각각의 핵산 증폭 방법에 따라 적절한 프라이머를 이용할 수 있다. 각각의 핵산 증폭 방법에 적절한 프라이머는, 공지기술에 따라 설계할 수 있고, 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 또한 주형 의존적 핵산 증폭반응의 반응 조건은, 각각의 핵산 증폭 방법의 원리에 입각한 특이적 증폭산물이 생성되는 한 특별히 제한되지 않고, 공지기술에 따라 적절하게 설정할 수 있다.

본 발명의 검출 방법에 사용하는 단일가닥 핵산으로, 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라가 바람직하게 사용된다. 보다 바람직하게는 단일가닥 RNA이다. RNA와 키메라를 구성하는 타핵산으로는 DNA, 수식된 DNA, 수식된 RNA 등을 들 수 있다. 단일가닥 핵산이 RNA와 타핵산과의 키메라인 경우, 타핵산은 전체 염기 길이의 50% 이하인 것이 바람직하고, 40% 이하인 것이 보다 바람직하며, 30% 이하인 것이 더욱 바람직하고, 20% 이하인 것이 더욱 바람직하며, 10% 이하인 것이 더욱 바람직하고, 5% 이하인 것이 더욱 바람직하다.

표적 핵산 영역 내의 기준서열에 혼성화하는 단일가닥 핵산은, 기준서열을 포함하는 표적 핵산 영역의 염기서열 정보에 따라 설계할 수 있다. 이러한 염기서열 정보는, 통상 공지된 데이터베이스(DDBJ/GenBank/EMBL 등)에서 얻을 수 있다. 원하는 염기서열 정보가 공지의 데이터베이스에서 검색할 수 없는 경우는, 공지의 염기서열 분석법을 이용하여 기준서열을 포함하는 표적 핵산 영역의 염기서열 정보를 얻을 수 있다. 주형 핵산이 두 가닥(예를 들어, 전사가닥 및 비전사가닥으로 이루어진 이중가닥 DNA)인 경우, 단일가닥 핵산은 어느 한쪽 가닥에 혼성화하는 것이면 된다.

단일가닥 핵산의 길이(염기 길이)는 기준서열의 길이 이상이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 10개 내지 200개의 염기가 바람직하고, 10개 내지 150개의 염기가 보다 바람직하며, 10개 내지 120개의 염기가 더욱 바람직하고, 10개 내지 100개의 염기가 더욱 바람직하며, 10개 내지 90개의 염기가 더욱 바람직하고, 10개 내지 80개의 염기가 더욱 바람직하며, 10개 내지 70개의 염기가 더욱 바람직하고, 10개 내지 60개의 염기가 더욱 바람직하며, 10개 내지 50개의 염기가 더욱 바람직하고, 15개 내지 30개의 염기가 더욱 바람직하다.

단일가닥 핵산이 기준서열과 동일한 길이(염기수)인 경우, 단일가닥 핵산의 염기서열은 기준서열의 상보서열과 완전히 일치하는 서열일 수도 있고, 염기서열과 혼성화가 가능하다면, 기준서열의 상보서열과 다른 염기를 포함한 서열일 수도 있다. 바람직하게는, 단일가닥 핵산의 염기서열은 기준서열의 상보서열과 완전히 일치하는 서열이다. 또한 단일가닥 핵산의 기준서열에 대한 상보율은, 기준외서열에 대한 상보율보다 높은 것이 바람직하다. 본 명세서에서 「상보율」은 기준서열의 상보서열과 단일가닥 핵산의 염기서열의 일치율을 의미하며, 기준서열의 상보서열과 단일가닥 핵산의 염기서열이 완전히 일치하는 경우가 100%이다. 따라서 「단일가닥 핵산의 염기서열과 기준서열과의 미스매치 염기수는 단일가닥 핵산의 염기서열과 기준외서열과의 미스매치 염기수보다 적은 것이 바람직하다.」라고 바꾸어 말할 수 있다.

단일가닥 핵산이 기준서열보다 긴(염기수가 많은) 경우, 단일가닥 핵산에 포함된 기준서열과 혼성화 가능한 염기서열에 대해서는, 상기와 동일한 기준이 적용된다. 기준서열과 혼성화 가능한 염기서열 이외의 염기서열은 특별히 제한되지 않는다. 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 인접하는 염기서열과 혼성화 가능한 서열일 수도 있고, 표적 핵산 영역의 기준서열 이외의 염기서열과 혼성화하지 않는 염기서열일 수도 있다.

단일가닥 핵산은 그 5'말단 및/또는 3'말단이 수식되어 있을 수도 있다. 예를 들어, 5'말단 및/또는 3'말단이 디옥시화, 인산화, 아미노화, 비오틴화, 티올화, 콜레스테롤화, DIG(디곡시제닌)화, ??처(BHQ-1, BHQ-3 등), 형광색소(DNP, Cy3, Cy5, TAMRA, 6-FAM 등) 등으로 수식된 단일가닥 핵산을 사용할 수 있다.

단일가닥 핵산은 표적 핵산 영역의 기준서열과 혼성화가 가능한 한, 그 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드)는, 당, 염기 및/또는 인산염이 화학적으로 수식(modification)된 뉴클레오티드일 수 있다. 염기가 수식된 뉴클레오티드로는, 예를 들어, 5위 수식된 우리딘 또는 시티딘(예를 들어, 5-프로피닐우리딘, 5-프로피닐시티딘, 5-메틸시티딘, 5-메틸우리딘, 5-(2-아미노)프로필우리딘, 5-할로시티딘, 5-할로우리딘, 5-메틸옥시우리딘 등); 8위 수식된 아데노신 또는 구아노신(예를 들어, 8-브로모구아노신 등); 데아자뉴클레오티드(예를 들면 7-데아자아데노신 등); O- 및 N-알킬화 뉴클레오티드(예를 들면, N6-메틸아데노신 등) 등이 있다. 또한 당이 수식된 뉴클레오티드로는, 예를 들면 리보뉴클레오티드의 2'-OH가 H, OR, R, 할로겐 원자, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂ 또는 CN(여기서, R은 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기를 나타낸다) 등에 의해 치환된 2'위 당 수식, 5'말단이 모노인산화된 5'말단 인산화 수식이 있다. 인산염이 수식된 뉴클레오티드로는, 인접하는 리보뉴클레오티드를 결합하는 인산에스테르기를 티오인산에스테르(phosphorothioate)기로 치환한 것을 예로 들 수 있다.

단일가닥 핵산은, 공지의 방법으로 인공적으로 화학 합성하여 제작할 수 있다. 또한 단일가닥 RNA는 주형 DNA로부터 in vitro 전사법에 의해 제작할 수 있다.

주형 의존적 핵산 증폭반응에 사용하는 핵산 합성 효소는 특별히 제한되지 않고, 상기에 예시한 각각의 핵산 증폭방법에 적합한 DNA 중합효소 및/또는 RNA 중합효소를 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 주형 의존적 핵산 증폭반응에 DNA 중합효소를 사용하는 경우, 사용하는 DNA 중합효소는 특별히 제한되지 않고, 상기 예시한 각각의 핵산 증폭 방법에 적합한 DNA 중합효소를 사용할 수 있다. 예를 들어, polI형, α형, 비polI비α형 또는 혼합형 DNA 중합효소(복수 DNA 중합효소의 혼합물) 등이 있다. 그 중에서도 α형 DNA 중합효소를 이용하는 것이 바람직하다. α형 DNA 중합효소는 3'-5'엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소이다. α형 DNA 중합효소로는, 예를 들면, KOD DNA 중합효소(도요보), Pyrobest DNA 중합효소(다카라바이오), Pfu DNA 중합효소(프로메가) 등이 시판되고 있으며, 이들을 바람직하게 사용할 수 있다. α형 DNA 중합효소를 이용하는 주형 의존적 핵산 증폭반응으로는 PCR이 바람직하다.

핵산 증폭반응의 반응액은, 원하는 반응이 진행되는 조성의 반응액이라면 특별히 제한되지 않지만, 일반적으로 주형핵산, 프라이머(프라이머 세트), 핵산 합성 효소(DNA 중합효소 및/또는 RNA 중합효소), 핵산 합성 효소의 기질이 되는 뉴클레오티드가 포함된다. 이 외에도, 반응액에는 완충제, 염류 등이 첨가되고, 필요에 따라 효소의 보호제, Tm값의 조정제, 계면활성제 등이 첨가된다. 완충제로는 Tris-HCl 등의 중성으로부터 약알칼리성에서 완충작용을 가지는 것이 이용된다. pH는 사용하는 핵산 합성 효소에 따라 최적의 pH 부근으로 조정된다. 염류는 효소의 활성 유지나 핵산의 Tm값 조정을 위해 적절하게 첨가되고, 구체적으로는 KCl, NaCl, MgCl₂, MgSO₄, (NH₄)₂SO₄ 등이 이용된다. 효소의 보호제로는 우혈청 알부민이나 당류가 사용된다. 또한 Tm값의 조정제는 디메틸설폭사이드(DMSO), 포름아미드, 베타인(N,N,N-trimethylglycine) 등이 사용된다. 계면활성제로는 Tween 20, Triton X 등이 사용된다. 반응액의 구체적인 조성은 공지기술에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 반응액의 구체적인 조성은 실제로 사용하는 주형, 프라이머, 핵산 합성효소, 단일가닥 핵산의 구체적인 조합에 따라 예비검토를 실시하여 적절히 설정하는 것이 바람직하다.

주형 의존적 핵산 증폭반응계에서 단일가닥 핵산의 첨가량은, 기준서열에 대해 차이가 없는 염기서열을 갖는 주형으로부터의 증폭이 인정되지 않고, 기준서열에 대해 차이가 있는 염기서열을 갖는 주형의 증폭이 인정될 수 있는 농도이면 된다. 적용하는 핵산 증폭반응의 구체적인 조건에 대해 예비검토를 실시하여 적절히 설정하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 2μM 이하가 바람직하고, 1.5μM 이하가 보다 바람직하며, 1μM 이하가 한층 더 바람직하다. 하한은 특별히 한정되지 않지만, 10nM 이상이 바람직하고, 50nM 이상이 보다 바람직하며, 100nM 이상이 더욱 바람직하고, 500nM 이상이 더욱 바람직하다.

본 발명의 검출 방법에 있어서, 주형 의존적 핵산 증폭반응으로 PCR 반응을 이용하는 경우, 어닐링 온도를 적절하게 설정함으로써, 1개 염기 결실, 1개 염기 삽입 또는 1개 염기 치환을 검출할 수 있다. 어닐링 온도는 단일가닥 핵산중의 기준 서열에 혼성화하는 염기서열 부분의 Tm값을 고려하여 설정하는 것이 바람직하다. Tm값은 최근접 이웃 염기법(Nearest Neighbor method), GC% 법 등의 공지의 계산방법에 기초하여 산출할 수 있지만, 다음의 계산식으로 산출하는 것이 보다 바람직하다.

Tm =(a+u) * 2 +(g+c) * 4

여기에서, a, u, g, c는 A, U, G, C 각각의 염기의 수를 나타낸다.

어닐링 온도, 예를 들면 상기 계산식으로 산출되는 Tm값의 ± 10℃가 바람직하고, ± 6℃가 보다 바람직하며, ± 3℃가 더욱 바람직하다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 단일가닥 핵산과 혼성화하는 기준서열 사이에 미스매치가 없을 때는 기준서열을 포함하는 영역의 핵산 증폭을 저해하지만, 하나의 미스매치가 있을 때에는 기준서열을 포함하는 영역의 핵산 증폭의 저해는 미스매치가 없을 때보다 약하고, 증폭산물이 얻어질 수 있는 어닐링 온도를 설정하는 것이 바람직하다. 이러한 이유로, 실제로 사용하는 주형, 프라이머, 핵산 합성 효소, 단일가닥 핵산의 구체적인 조합에 따라 예비검토를 실시하여 적절한 어닐링 온도를 설정하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 검출 방법에 있어서, 주형 의존적 핵산 증폭반응으로 PCR 반응을 사용하는 경우, 일반적인 3단계 방법(변성 → 어닐링 → 신장 사이클)으로 수행할 수도 있지만, 2단계 방법(변성 → 어닐링/신장 사이클)으로 수행하는 것이 바람직하다. 어닐링 온도는 기준서열과 혼성화하지만, 신장온도에서는 기준서열과 혼성화하지 않는 염기서열을 갖는 단일가닥 핵산을 이용한 경우, 변이를 가지지 않는 주형으로부터 증폭산물이 얻어져서, 위양성이 되는 경우가 있다. 2단계 방법을 채택하고, 어닐링/신장 온도에서 단일가닥 핵산이 기준서열과 혼성화하는 온도를 설정함으로써, 이러한 위양성의 결과가 유도될 가능성을 배제할 수 있다. 2단계 방법을 실시하는 경우에도, 실제로 사용하는 주형, 프라이머, 핵산 합성효소, 단일가닥 핵산의 구체적인 조합에 따라 예비 검토를 수행하여 최적 조건을 설정하는 것이 바람직하다.

본 발명의 검출 방법에 있어서, 주형 의존적 핵산 증폭반응으로 PCR 반응을 이용하는 경우, 정량 PCR(실시간 PCR, 디지털 PCR 등)을 수행할 수 있다.

증폭산물의 존재를 확인하는 공정에서는, 핵산 증폭반응 후에 반응액 중에 증폭산물이 있는지 유무를 공지의 방법으로 확인하면 된다. 구체적으로는, 예를 들면, 핵산 증폭반응 후 반응액을 아가로스 겔 전기영동에 투입하고, 표적 영역의 증폭산물에 대한 밴드의 유무를 확인하면 된다. 표적영역의 증폭산물의 존재가 확인된 경우에, 해당 반응에 투입한 주형핵산은 표적 핵산 영역내에 변이를 가지고 있다고 판단할 수 있다. 또한 증폭산물의 염기서열 분석을 실시하여, 표적 핵산 영역내에 변이가 존재하는 것을 확인할 수 있다.

본 발명의 검출 방법은 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 검출하는 것이므로, 서열 특이적 변이를 도입하는 게놈 편집 세포의 변이 검출에 적합하다. 또한, 본 발명의 검출 방법은, 특정 유전자(예를 들어, 암 유전자)에 변이를 가지고 있는지 여부를 확인하는 경우에도 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법은 동물과 식물의 다형성 검출이나 품종의 판정 등에 이용될 수 있다.

본 발명의 검출 방법은, 샘플이 기준서열에 대한 차이를 갖는 경우에 양성 시그널로 검출되므로, 헤테로 변이의 검출에 사용할 수 있는 점에서 매우 뛰어나다. 또한, 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위해 고가의 장비를 필요로하지 않고, 모든 연구실에도 있는 장비(PCR 장비 등)에서 간편하게 실시할 수 있다. 게다가 1개 염기의 결실, 삽입 또는 치환을 검출할 수 있기 때문에 매우 유용하다. 또한, 기준서열에 대한 차이가 있는 경우에도 양성 시그널이 검출되기 때문에, 다수의 세포 중 일부에만 기준서열에 대한 차이가 있는 경우에도 차이의 검출이 가능하다는 점에서 매우 우수하다. 또한 양성 시그널로 검출되기 때문에 검출된 증폭산물을 시퀀서에 제공함으로써, 기준서열에 대한 차이가 있는지 유무를 추가로 확인할 수 있다.

본 발명의 검출 방법은 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 변이도입 처리를 실시한 세포집단에서 실제로 변이가 도입된 세포를 스크리닝할 때 유용하다. 또한 유전자 다형성을 가지는 세포집단에서 다형성를 갖는 세포를 스크리닝하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명은 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 갖는 세포 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 스크리닝 방법은 다음 각 공정을 포함하는 것이면 된다:

(1) 피시험세포로부터 핵산을 제조하는 공정,

(2) 얻어진 핵산을 주형으로 상기 본 발명의 검출 방법에 투입하고, 증폭산물의 유무를 확인하는 공정, 및

(3) 증폭산물이 확인된 세포를 선택하는 공정.

공정 (1)에서는 피시험세포에서 핵산을 제조한다. 피시험세포로부터 핵산을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다. 피시험세포는 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이의 유무를 검출하고자 하는 세포라면 어떤 세포로도 무방하다. 구체적으로는, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 변이 도입처리한 세포집단에서 단리된 클론 유래의 세포, 유전자 다형성을 가진 세포집단에서 단리된 클론 유래의 세포 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 변이 도입 처리를 실시한 세포집단을 사용하는 경우, 변이 도입 처리는 서열 특이적으로 변이를 도입하는 처리라면 어떤 처리도 무방하다. 예를 들어, 공지의 게놈 편집 기술을 바람직하게 사용할 수 있다. 세포 집단에서 클론의 단리는 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다.

공정 (2) 및 (3)은 상기 본 발명의 검출 방법의 설명에 따라 실시할 수 있다.

본 발명의 검출 방법은 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 갖는 핵산의 비율을 증가시킬 때 유용하다. 따라서, 본 발명은 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 갖는 핵산의 비율을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 핵산의 비율을 증가시키는 방법은, 다음 각 공정을 포함하는 것이면 된다:

(1) 피시험세포 집단으로부터 핵산을 제조하는 공정,

(2) 얻어진 핵산을 주형으로 하여, 상기 본 발명의 검출 방법에 투입하고 증폭산물을 회수하는 공정.

공정 (1)에서는 피시험세포 집단으로부터 핵산을 제조한다. 피시험세포 집단으로부터 핵산을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다. 피시험세포 집단은 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 갖는 세포와, 차이를 갖지 않는 세포가 혼재하고 있을 가능성이 있는 세포집단이라면, 어떠한 세포집단이라도 무방하다. 예를 들면, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 변이 도입처리한 세포집단 등을 바람직하게 사용할 수 있다. 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 변이 도입처리한 세포집단을 사용하는 경우, 변이 도입처리는 서열 특이적 변이를 도입하는 과정이라면 어떤 처리라도 무방하다. 예를 들어, 공지의 게놈 편집기술을 바람직하게 사용할 수 있다. 공정 (1)에서는, 세포집단으로부터 클론을 단리하지 못하고, 세포집단 전체으로부터 핵산을 제조한다.

공정 (2)은 상기 본 발명의 검출 방법의 설명에 따라 실시할 수 있다. 증폭산물을 회수하는 방법은 특별히 제한되지 않고, 공지의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, 증폭산물의 유무를 아가로스 전기영동으로 확인하는 경우, 증폭산물의 밴드를 포함하는 겔 부분을 절단하고 꺼내어 증폭산물을 회수할 수 있다. 회수한 증폭산물은 어떠한 분석에 제공하더라도 무방하다. 예를 들면, 회수한 증폭산물의 서열을 분석함으로써 변이 패턴을 분석할 수 있다.

본 발명은 상기 본 발명의 검출 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 표적 핵산 영역 내의 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라인 단일가닥 핵산을 포함하는 것이면 된다. 이들 이외의 키트의 구성은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어, 주형 의존적 핵산 증폭반응용 튜브, 시약류(예를 들면, DNA 중합효소, 기준서열을 포함하는 범위를 증폭하기 위한 프라이머 세트, dNTP Mixture, 완충액 등), 취급 설명서 등이 포함되어 있다. 본 발명의 키트를 사용하여 상기 본 발명의 검출 방법을 간편하고 신속하게 실시할 수 있다.

본 발명은 상기 본 발명의 검출 방법에서 사용하기 위한 검출제를 제공한다. 본 발명의 검출제는 표적 핵산 영역 내의 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라인 단일가닥 핵산을 유효성분으로 포함하는 것이면 된다. 해당 단일가닥 핵산은 상기 본 발명의 검출 방법에 있어서 설명한 대로 실시할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

[올리고리보뉴클레오티드 및 프라이머]

실시예에서 사용한 올리고리보뉴클레오티드(이하 「ORN」라고 함) 및 프라이머는 모두 그라이너(Greiner)사에 위탁하여 합성한 것을 사용했다. 이용한 ORN을 표 1에, 이용한 프라이머를 표 2에 나타내었다.

[표 1]

[표 2]

[세포 및 게놈 DNA 추출]

Raji 세포는 10% 우태아혈청(FBS)을 포함하는 RPMI-1640(Wako)에서 배양하였다. 293T 세포는 10% FBS를 포함하는 DMEM(Wako)에서 배양하였다. HCT116 세포는 10% FBS를 포함하는 McCoy's 5A(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다. Ba/F3 세포는 10% FBS, 10mM HEPES 버퍼(PH7.2), 1x 비필수아미노산, 1mM 피루브산 나트륨, 5μM 2-메르캅토에탄올, 1ng/ml IL-3를 포함하는 RPMI-1640에서 배양하였다. NCI-H1975 세포는 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640에서 배양하였다. 표준적인 페놀/클로로포름 추출법에 의해 세포로부터 게놈 DNA를 추출했다.

[PCR 조건]

인간 THYN1 유전자 로커스를 표적으로 하는 PCR에서는, 10μl 중에 20ng의 Raji 세포의 게놈 DNA, 0.3μM의 각 프라이머 및 0.1-2μM의 ORN을 포함하는 PCR 반응액을, 제조업자의 프로토콜에 따라 제조하였다. 반응은, 최초 94℃에서 2분간의 변성에 이어, 98℃에서 10초, 62℃에서 30초 및 68℃에서 1분을 35사이클 실시했다.

인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하는 PCR에서는, 10μl 중에 20ng의 293T 세포 또는 HCT116 세포의 게놈 DNA, 0.3μM의 각 프라이머 및 1μM의 ORN을 포함하는 PCR 반응액을 제조했다. 실시예 2의 반응은, 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초, 62℃에서 30초, 및 68℃에서 1분을 30사이클 실시했다. 실시예 3의 반응은, 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초 및 62 내지 72℃에서 20초의 2단계를 30사이클 실시했다.

인간 THYN1 유전자 로커스와 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 모두를 표적으로 하는 PCR에서는 10μl 중에 20ng의 293T 세포의 게놈 DNA, 0.3μM의 각 프라이머 및 1μM의 각 ORN을 포함한 PCR 반응액을 제조했다. 반응은 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초, 62℃에서 30초 및 68℃에서 1분을 30사이클 실시했다. 실시예 3의 반응은 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초, 62℃에서 30초, 68℃에서 1분을 30사이클, 또는 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초 및 68℃에서 1분 30초의 2단계를 30사이클 실시했다.

마우스 Tax1bp1 로커스를 표적으로 하는 PCR에서는, 10μl 중에 20ng의 Ba/F3 세포의 게놈 DNA, 0.3μM의 각 프라이머 및 1μM의 ORN을 포함한 PCR 반응액을 제조했다. 실시예 4의 반응은 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초 및 50 내지 65℃에서 80초의 2단계를 30사이클 실시했다.

인간 c-FOS 유전자 로커스를 표적으로 하는 PCR에서는, 10μl 중에 20ng의 293T 세포의 게놈 DNA, 0.3μM의 각 프라이머 및 1μM의 ORN을 포함한 PCR 반응액을 제조했다. 실시예 4의 반응은 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초 및 50 내지 68℃에서 80초의 2단계를 30사이클 실시했다. 실시예 5의 반응은 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초 및 65℃에서 80초의 2단계를 30사이클 실시했다.

인간 EGFR 유전자 로커스를 표적으로 하는 PCR에서는 10μl 중에 20ng의 293T 세포 또는 NCI-H1975 세포의 게놈 DNA, 0.3μM의 각 프라이머 및 1μM의 ORN을 포함한 PCR 반응액을 제조했다. 실시예 6의 반응은 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초 및 59 내지 65℃에서 70초의 2단계를 30사이클 실시했다.

PCR 산물을 1% 또는 2%의 아가로스겔을 이용한 전기영동에 제공하고, 필요에 따라 DNA 서열분석을 실시했다. DNA 서열 분석에는 Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다.

[실시간 PCR 조건]

실시간 PCR에는, KOD SYBR qPCR Mix(Toyobo)를 사용하였다. 10μl 중에 20ng의 게놈 DNA, 0.2μM의 각 프라이머 및 0.25μM의 ORN을 포함하는 PCR 반응액을 제조업자의 프로토콜에 따라 제조하였다. 반응은 최초에 98℃에서 2 분간 변성에 이어, 98℃에서 10초, 62℃에서 30초 및 68℃에서 1분을 30사이클 실시했다. 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)를 이용하여 반응 및 정량을 실시했다. PCR 산물을 1% 아가로스겔을 이용한 전기영동에 제공하여, 예상된 크기의 증폭산물을 얻을 수 있음을 확인했다.

[플라스미드]

Cas9 발현 플라스미드(Addgene #41815) 및 키메라 단일가닥 가이드 RNA(single guide RNA : sgRNA) 발현 플라스미드(Addgene #41824)는, George Church 박사로부터 Addgene을 통해 제공되었다. 인간 THYN1 유전자 로커스를 표적으로 하는 sgRNA 발현 플라스미드를 구축하기 위해, CRISPR 표적 서열을 hCRISPR gRNA 합성 프로토콜(https://media.addgene.org/data/93/40/adf4a4fe-5e77-11e2-9c30 -003048dd6500.pdf)에 따라 sgRNA 발현 플라스미드 중의 U6 프로모터의 하류에 클로닝하였다. 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하는 Cas9 플러스 sgRNA 발현 플라스미드를 구축하기 위해, Cas9 발현 플라스미드 중의 Cas9 발현 카세트의 상류에 CDKN2A(p16)(Gx4 #2)의 sgRNA 발현 카세트를 클로닝하였다.

[CRISPR를 통한 게놈 편집]

인간 THYN1 유전자 로커스의 게놈 편집을 위해, Cas9 발현 플라스미드(120μg), 인간 THYN1 유전자 로커스를 표적으로 하는 sgRNA 발현 플라스미드(120μg) 및 pEGFP-N3(0.3μg, Clontech)를 Gene Pulser II(Bio-Rad)를 이용하여 250V 및 950μF에서 전기천공(electroporation)함으로써 Raji 세포 (1x10⁷개)에 트랜스펙션하였다. 1일 후, GFP 양성 세포를 개별적으로 선별하여 증식시켰다.

인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스 게놈 편집을 위해, 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하는 Cas9 플러스 sgRNA 발현 플라스미드(4μg) 및 pcDNA3.1/Hygro(-)(0.4μg, Thermo Fisher Scientific)를 Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 293T 세포(4x10⁵개)에 트랜스펙션하였다. 2일 후, 하이그로마이신을 첨가하고(0.4mg/ml), 하이그로마이신 내성 콜로니를 채취하여 배양하였다.

인간 THYN1 및 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 게놈 편집을 위해, 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하는 Cas9 플러스 sgRNA 발현 플라스미드(4μg), 인간 THYN1을 표적으로 하는 sgRNA 발현 플라스미드(4μg) 및pcDNA3 .1/Hygro(-)(0.4μg)을 Lipofectamine 3000을 이용하여 293T 세포(4 Х 10⁵개)에 트랜스펙션했다. 2일후, 하이그로마이신을 첨가(0.4mg/ml)하고, 하이그로마이신 내성 콜로니를 채취하여 배양하였다.

[TALEN을 통한 게놈 편집]

인간 c-FOS 유전자 로커스의 게놈 편집을 위해 인간 c-FOS 유전자 로커스를 표적으로 하는 TALEN 플라스미드(TALEN-left 및 TALEN-right, 각 4μg) 및 pcDNA3.1/Hygro(-)(0.4μg, Thermo Fisher Scientific)를 Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 293T 세포(4 x 10⁵개)에 트랜스펙션했다. 2일 후, 하이그로마이신을 첨가(0.4mg/ml)하고, 하이그로마이신 내성 콜로니를 채취하여 배양하였다.

[실시예 1 : 인간 THYN1 유전자 로커스 변이 검출]

(1-1) 인간 THYN1 유전자 로커스를 표적으로 하는 ORN에 의한 PCR 증폭 억제

ORN은 ORN_20b, ORN_24b 및 ORN_Target을 사용하였다(표 1 참조).

도 1 (A)에 인간 THYN1 유전자 로커스의 CRISPR 절단 위치를 포함하는 표적 핵산 영역의 염기서열 CTGCAGCGTGACCATGTCGAGACCCCGGAAGAGGCTGGC(서열번호 35)과 각 ORN과의 혼성화 상태와, THYN1 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타냈다. 도면 중 밑줄 부분은 CRISPR 표적 부위(기준서열)을 나타내며, 음영부분은 PAM(protospacer adjacent motif)을 나타내고, 화살표는 CRISPR 절단 위치를 나타낸다. ORN_20b 및 ORN_24b은 그 서열의 중앙으로 표적 부위, 즉 PAM의 3염기 상류의 CRISPR 절단 위치와 혼성화하고, ORN_Target은 게놈 편집에 사용되는 sgRNA 및 PAM의 염기서열과 일치한다.

이들 ORN, Raji 세포의 게놈 DNA, THYN1 특이적 프라이머 세트 (hTHYN1-gRNA-target-15-F3 및 hTHYN1-gRNA-target-15-R3, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소 (KOD-Plus-Ver.2(Toyobo))를 이용하여, 상기 PCR 조건에서 표적 서열 주위의 0.9kbp을 증폭시켰다. 결과를 도 1 (B)에 나타냈다. 인간 Raji 세포에서 추출한 게놈 DNA를 ORN 비존재 하에서 PCR에 사용하면, 0.9kbp 영역이 특이적으로 증폭되었다. ORN_20b 또는 ORN_24b를 0.1μM 내지 2μM의 범위에서 반응액에 첨가하면 증폭이 강하게 억제되었다. ORN_Target을 0.5μM 내지 2μM의 범위에서 반응액에 첨가한 경우도 증폭이 억제되었다. 한편, 관계없는 유전자 로커스(인간 IRF-1 유전자 로커스)에 혼성화하는 ORN_306F(NC)의 첨가는 증폭에 영향을 주지 않았다. 이 결과에서, 표적 핵산 영역 내의 기준서열과 혼성화하는 ORN을 PCR 반응액에 첨가함으로써, 표적 핵산 영역의 PCR 증폭을 특이적으로 억제할 수 있음을 확인했다.

(1-2) 게놈 편집 세포의 검출

표적 핵산 영역 내의 기준서열에 혼성화하는 ORN을 첨가했을 때, 표적 핵산 영역에 변이를 갖는 주형으로부터의 PCR 증폭이 어떻게 변화하는지를 검토하였다.

Raji 세포에 대해 THYN1 유전자 로커스의 CRISPR 매개 게놈 편집을 수행하고, 양쪽 대립유전자의 기준서열이 변이된 5개 종류의 게놈 편집 클론(T1, T4, T6, T7 및 T9)를 작성했다. 각 게놈 편집 클론은, 야생형 인간 THYN1 유전자 로커스의 CRISPR 절단 위치를 포함하는 표적 핵산 영역의 염기서열 GCACTAAAGTCCCCTGCAGCGTGACCATGTCGAGACCCCGGAAGAGGCTGGC(서열번호 36, 밑줄 부분이 CRISPR 표적 부위(기준서열), 25 ~ 27번째 CCA가 PAM, 30번째의 T와 31번째의 C 사이가 CRISPR 절단 위치)에서, 아래의 변이를 갖는다.

T1 : 한쪽의 대립유전자에서 서열번호 36의 염기서열 9 ~ 30번째 염기가 결실, 다른쪽 대립유전자에서 CRISPR 절단 위치에 115 개의 염기가 삽입

T4 : 양쪽 대립유전자에서 서열번호 36의 염기서열의 24 ~ 30번째 염기가 결실

T6 : 한쪽의 대립유전자에서 서열번호 36의 염기서열의 21 ~ 36번째 염기가 결실, 다른쪽 대립유전자에서 30 ~ 32번째 염기가 결실

T7 : 한쪽 대립유전자에서 서열번호 36의 염기서열의 27 ~ 37번째 염기가 결실, 다른쪽 대립유전자에서 31 ~ 36 번째 염기가 결실

T9 : 양쪽 대립유전자에서 CRISPR 절단 위치에 동일한 서열의 501개의 염기가 삽입

야생형 세포 및 각 게놈 편집 클론에서 각각 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, THYN1 특이적 프라이머 세트 (hTHYN1-gRNA-target-15-F3 및 hTHYN1-gRNA-target-15-R3, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소 (KOD-Plus-Ver.2)를 이용하여, ORN을 첨가하거나 첨가하지 않고, PCR을 수행하였다. ORN으로 ORN_20b 또는 ORN_306F(NC)를 사용하였다 (표 1 참조). 결과를 도 2에 나타내었다. 왼쪽은 ORN을 첨가하지 않은 결과, 중앙은 ORN_20b을 첨가한 결과, 오른쪽은 ORN_306F (NC)의 결과이다. ORN을 첨가하지 않은 경우, 야생형 세포(WT) 및 모든 게놈 편집 세포의 게놈 DNA로부터 표적 핵산 영역이 증폭되었다. ORN_20b를 첨가한 경우는, 야생형 세포(WT)의 게놈 DNA로부터의 증폭이 완전히 억제되었으나, 게놈 편집 세포의 게놈 DNA로부터의 증폭은 억제되지 않았다. 관련이 없는 유전자 로커스(인간 IRF-1 유전자 로커스)에 혼성화하는 ORN_306F(NC)의 첨가는 표적 핵산 영역의 증폭에 영향을 주지 않았다.

CRISPR 표적 부위의 각 대립유전자에 다른 변이를 갖는 세포 유래의 게놈 DNA를 주형으로 하는 경우, ORN_20b는 대립유전자 특이적(allele-specific)으로 PCR 증폭을 억제할 가능성이 있기 때문에, CRISPR 표적 부위의 각 대립유전자에 다른 변이를 갖는 T1, T6 및 T7 세포의 게놈 DNA로부터 ORN을 첨가하지 않은 PCR 산물과, ORN_20b을 첨가한 PCR 산물의 서열 분석을 실시했다. 그 결과, 양자의 PCR 산물에서 동일한 두가지 패턴의 서열 시그널이 얻어졌다. 따라서 ORN_20b는 이들 게놈 DNA의 증폭에 영향을 주지 않는 것이 명백해졌다.

다음으로, 다른 ORN(ORN_24b, ORN_Target 또는 ORN_302F(NC), 표 1 참조)를 이용하여, 동일한 조건에서 PCR을 수행하였다. 결과를 도 3에 나타내었다. 왼쪽은 ORN_24b 첨가의 결과, 중앙은 ORN_Target 첨가의 결과, 오른쪽은 ORN_302F(NC)의 결과이다. ORN_24b 또는 ORN_Target을 첨가한 PCR에서는, ORN_20b를 첨가한 PCR과 동일한 PCR 패턴을 보여주었다. 관련없는 유전자 로커스 (인간 IRF-1 유전자 로커스)에 혼성화하는 21 염기의 ORN_302F(NC)의 첨가는 증폭에 영향을 주지 않았다.

이러한 결과로부터, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 혼성화하는 ORN을 PCR 반응액에 첨가하여 PCR을 수행함으로써, 표적 핵산 영역에 변이를 갖지 않는 야생형 핵산서열(기준서열)과 표적 핵산 영역의 양 대립유전자에 삽입 결실 변이를 갖는 변이형 핵산서열(기준외서열)이 구별될 수 있음을 보여준다.

(1-3) 단일 대립유전자 변이의 검출

상기 (1-2)에서 양 대립유전자에 삽입 결실 변이를 갖는 게놈 편집 세포에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로서 사용하였으나, 한쪽 대립유전자에만 변이를 갖는 단일 대립유전자 변이를 야생형 핵산 서열(기준서열)과 구별할 수 있는지 여부를 검토했다. 따라서, 야생형 세포에서 추출한 게놈 DNA와, 양 대립유전자에 동일한 변이를 갖는 T4 세포 또는 T9 세포에서 추출한 게놈 DNA를 1:1의 비율로 혼합하여, 단일 대립유전자 변이를 모방하였다. 야생형 세포(WT)에서 추출한 게놈 DNA, T4 세포 및 T9 세포에서 각각 추출한 게놈 DNA, 및 WT+T4 혼합 게놈 DNA 및 WT+T9 혼합 게놈 DNA를 주형으로 하고, THYN1 특이적 프라이머 세트(hTHYN1-gRNA-target-15-F3 및 hTHYN1-gRNA-target-15-R3, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소 (KOD-Plus-Ver.2)를 이용하여, ORN을 첨가하거나 첨가하지 않고, PCR을 실시했다. ORN으로 ORN_20b, ORN_24b, ORN_Target, ORN_302F (NC) 또는 ORN_306F (NC)를 사용하였다(표 1 참조).

결과를 도 4에 나타내었다. ORN_20b, ORN_24b 또는 ORN_Target을 첨가하여 PCR을 수행한 경우, 변이형 게놈 DNA를 포함하지 않는 야생형 게놈 DNA(WT)를 주형으로 한 경우에만 증폭이 억제되고, WT+T4 혼합 게놈 DNA와 WT+T9 혼합 게놈 DNA로부터는, 각각 T4 게놈 DNA와 T9 게놈 DNA로부터의 증폭과 동일한 크기의 단일 밴드가 출현되었다. WT+T4 혼합 게놈 DNA를 주형으로 하고, ORN_20b를 첨가한 PCR 산물(0.9kb)의 서열 분석을 실시한 바, T4 게놈 DNA로부터의 증폭산물의 서열과 동일한 시그널이 검출되고, WT 게놈 DNA와 동일한 서열 시그널은 검출되지 않았다. 이러한 결과로부터, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 혼성화하는 ORN을 PCR 반응액에 첨가하여 PCR을 수행함으로써, 표적 핵산 영역내에 변이를 갖지 않는 야생형 핵산 서열(기준서열)과, 표적 핵산 영역의 한쪽 대립유전자에 삽입 결실 변이를 갖는 변이형 핵산서열(기준외서열)을 구별할 수 있음이 보여졌다.

(1-4) Pfu DNA 중합효소를 이용한 PCR에 의한 게놈 편집 세포의 검출

Pfu DNA 중합효소는 실시예 1에서 사용한 KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)와 동일하게 3'-5'엑소뉴클레아제 활성을 유지하는 α형 DNA 중합효소이다. 여기서, KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2) 대신 Pfu DNA 중합효소를 이용한 것을 제외하고는 상기 (1-2) 및 (1-3)과 동일한 조건으로 PCR을 실시했다. 구체적으로는, 야생형 세포(WT)에서 추출한 게놈 DNA, T1, T4, T6, T7 및 T9 세포에서 각각 추출한 게놈 DNA, 및 WT+T4 혼합 게놈 DNA와 WT+T9 혼합 게놈 DNA를 주형으로 하고, THYN1 특이적 프라이머 세트 (hTHYN1-gRNA-target-15-F3 및 hTHYN1-gRNA-target-15-R3, 표 2 참조), Pfu DNA 중합효소를 이용하여, ORN을 첨가하거나 첨가하지 않고, PCR을 수행하였다. ORN으로 ORN_20b, ORN_24b 또는 ORN_306F(NC)를 사용하였다(표 1 참조).

결과를 도 5에 나타내었다. KOD DNA 중합효소를 이용한 경우와 마찬가지로, ORN_20b 또는 ORN_24b를 첨가한 경우는, WT 게놈 DNA로부터 표적 핵산 영역의 증폭은 저해되었지만, 기준서열에 변이를 갖는 게놈 DNA로부터 표적 핵산 영역이 증폭되었다.

(1-5) 실시간(정량) PCR에 의한 게놈 편집 세포의 검출

실시간 PCR에 의해, 단일 대립유전자 삽입결실 변이와 양 대립유전자 삽입결실 변이가 구별될 수 있는지 여부를 검토하였다.

야생형 세포(WT)에서 추출한 게놈 DNA, 양 대립유전자 변이를 갖는 T4 세포 및 T6 세포에서 각각 추출한 게놈 DNA, 및 단일 대립유전자 변이를 모방한 WT+T4 혼합 게놈 DNA를 주형으로 하고, THYN1 특이적 프라이머 세트 (hTHYN1-gRNA-target-15-F3 및 hTHYN1-gRNA-target-15-R3, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD SYBR qPCR Mix)를 이용하여, ORN_24b 또는 ORN_302F(NC)를 첨가하거나, 또는 ORN을 첨가하지 않고, 실시간 PCR을 수행하였다.

결과를 도 6에 나타내었다. ORN_24b이 존재하는 실시간 PCR에서, WT 게놈 DNA로부터 표적 핵산 영역의 증폭은 검출되지 않았다. T4 세포 또는 T6 세포의 게놈 DNA로부터 표적 핵산 영역의 증폭은 영향을 받지 않고, 단일 대립유전자 삽입 결실 변이를 모방한 주형(WT+T4)에서의 표적 핵산 영역의 증폭은 약 60% 억제되었다. 관련없는 유전자 로커스(인간 IRF-1 유전자 로커스)에 혼성화하는 ORN_302F(NC)의 첨가는, 표적 핵산 영역의 증폭에 영향을 주지 않았다. 이러한 결과로부터, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 혼성화하는 ORN을 PCR 반응액에 첨가하여 실시간 PCR을 수행함으로써, 표적 핵산 영역내에 변이를 갖지 않는 야생형 핵산 서열(기준서열)과, 표적 핵산 영역의 양 대립유전자에 삽입결실 변이를 갖는 변이형 핵산서열(기준외서열), 표적 핵산 영역 내의 한쪽 대립유전자에 삽입결실 변이를 갖는 변이형 핵산서열(기준외서열)을 구별할 수 있음이 보여졌다.

(1-6) CRISPR RNA를 이용한 PCR의 검토

재조합 CRISPR 리보핵단백질(RNP)을 세포에 트랜스펙션하여 게놈편집을 할 수 있다. 이 접근법에서는, 합성된 sgRNA 또는 CRISPR RNA(crRNA) + 트랜스활성화 crRNA(tracrRNA)의 복합체가 gRNA로 사용된다. CRISPR RNP를 이용하여 게놈 편집할 경우, 게놈 편집 세포를 검출하기 위해, 표적 특이적인 ORN을 사용하는 것보다 오히려 crRNA를 사용하는 것이 비용효율이 높을 것으로 생각된다. 그래서, 표적 특이적 ORN 대신 crRNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. crRNA는, CRISPR 표적 부위에 상보적인 RNA 서열을 포함하는 crRNA_Target(서열번호 8, 표 1 참조)과, 대조군으로 관련이 없는 유전자 로커스(닭 Pax5 유전자 로커스)에 상보적인 RNA 서열을 포함하는 crRNA인 crRNA_NC(서열번호 9, 표 1 참조)을 사용하였다. 야생형 세포(WT)에서 추출한 게놈 DNA, T4 세포 및 T6 세포에서 각각 추출한 게놈 DNA, 및 WT+T4 혼합 게놈 DNA를 주형으로 하고, THYN1 특이적 프라이머 세트(hTHYN1-gRNA-target-15-F3 및 hTHYN1-gRNA-target-15-R3, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하여, 상기 2종류의 crRNA를 각각 첨가하여 PCR을 수행하였다.

결과를 도 7에 나타내었다. crRNA_Target이 존재하는 조건에서의 PCR 증폭 패턴은, THYN1 특이적 ORN으로 얻어진 것과 동일하였다(도 2, 3 및 4 참조). crRNA_NC의 첨가는 표적 핵산 영역의 증폭에 영향을 주지 않았다.

[실시예 2 : 게놈 편집 세포의 스크리닝]

(2-1) 인간 293T 세포의 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 편집한 세포의 스크리닝

인간 293T 세포에 대해 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 CRISPR 매개 게놈 편집을 수행하고, 본 발명의 검출 방법을 이용하여 CDKN2A(p16) 유전자 로커스에 변이가 도입된 세포의 스크리닝을 시도하였다. 도 8 (A)에 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 CRISPR 절단 위치를 포함하는 표적 핵산 영역의 염기서열 CTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGGTCGGGTAGAGGAGGTGCGGG(서열번호 37)과 상보서열, 및 ORN_p16과의 혼성화 상태를 나타내고, 또한 CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타내었다. 도면 중 밑줄부분은 CRISPR 표적 부위(기준서열)을 나타내며, 음영부분은 PAM을 나타내고, 화살표는 CRISPR 절단 위치를 나타낸다.

인간 293T 세포에 대해 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 CRISPR 매개 게놈 편집을 수행하고, 단일 콜로니를 단리한 후, 12 클론(C1 내지 C12)의 세포로부터 게놈 DNA를 추출했다. 이들 게놈 DNA를 주형으로 하고, CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트(hCDKN2A-ORN-F 및 hCDKN2A-ORN-R, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하여, ORN_p16을 첨가하거나 ORN을 첨가하지 않고, PCR을 수행하였다.

결과를 도 8 (B)에 나타내었다. 12개의 샘플 중 11개의 샘플에서 표적 핵산 영역이 증폭되고, 이들 클론에서 게놈 편집이 이루어졌다고 생각되었다. C9, C11 및 C12의 게놈 DNA로부터는 2개의 PCR 산물이 검출되고, 이들 클론은 양 대립유전자에 상이한 게놈 편집이 이루어지고 있다고 생각되었다. C10으로부터의 증폭산물은 1kb를 초과하는 분자량이었으므로, 삽입 변이가 발생한 것으로 생각되었다. C1, C3 내지 C8의 게놈 DNA로부터의 증폭산물은, 야생형 게놈 DNA를 주형으로 하여 ORN을 첨가하지 않고 실시한 PCR 산물과 동일한 크기(0.8kbp)였으므로, 이들 클론의 변이의 종류를 특정하기 위해 증폭산물의 서열 분석을 실시했다. 그 결과, 변이를 갖지 않는 CRISPR 표적 부위에 대응하는 서열 시그널이 검출되지 않았으므로, 이들 클론의 표적 부위에 양 대립유전자 변이가 도입된 것으로 생각되었다. 이 결과로부터, 본 발명의 검출 방법은, 게놈 편집 세포의 스크리닝에 이용될 수 있음이 보여졌다.

(2-2) 복수의 표적 부위가 편집된 세포의 스크리닝

게놈 편집은, 단일 세포내의 복수 로커스에 동시에 도입할 수 있다. 그래서, 복수의 표적 부위가 편집된 세포의 스크리닝에 본 발명의 검출 방법을 적용할 수 있는지 여부를 검토하였다.

인간 293T 세포에 대해 CDKN2A(p16) 유전자 로커스 및 THYN1 유전자 로커스의 CRISPR 매개 게놈 편집을 수행하고, 단일 콜로니를 단리한 후, 11개의 클론(CT1 내지 CT11)로부터 게놈 DNA를 추출했다. 이들 게놈 DNA를 주형으로 하고, CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트(hCDKN2A-ORN-F 및 hCDKN2A-ORN-R, 표 2 참조) 및 THYN1 특이적 프라이머 세트(hTHYN1-gRNA-target-15-F2 및 hTHYN1-gRNA-target-15-R2, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하여, ORN_p16 및 ORN_24b을 첨가하거나 ORN을 첨가하지 않고, PCR을 수행하였다(도 9 (A) 참조).

결과를 도 9 (B)에 나타내었다. 11개의 클론 중 9개의 클론(CT1, CT3-CT8, CT10, CT11)의 게놈 DNA로부터 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 증폭산물이 얻어졌고, 11개의 클론의 모든 게놈 DNA로부터 THYN1 유전자 로커스의 증폭산물이 얻었졌으므로, 게놈 편집이 각 유전자 로커스에서 원활히 이루어졌다고 생각되었다. CT3, CT7 및 CT10의 증폭산물은 길이가 달랐고, 표적 유전자의 단일 대립유전자 또는 양 대립유전자에 변이가 도입된 것으로 생각되었다. 이들 이외의 클론에 대해서는, ORN을 첨가하지 않고 PCR을 수행하여, 증폭산물의 서열 분석을 실시했다. 표 3에 나타낸 바와 같이, CT2 및 CT9는 THYN1 유전자 로커스에 변이가 있었으나, CDKN2A(p16) 유전자 로커스에는 변이가 없었다. CT1, CT4 내지 CT8 및 CT11은, 양쪽 유전자 로커스에 변이를 가지고 있었다. 이 결과로부터, 본 발명의 검출 방법은, 복수의 표적 부위가 편집된 세포의 스크리닝에 사용될 수 있음이 보여졌다.

[표 3]

[실시예 3 : 점돌연변이(point mutation)의 검출]

게놈 편집을 사용하여 점돌연변이를 도입할 수 있으며, 이 변이를 검출할 수 있는 것이 실용상 중요하다는 점을 고려하여, 본 발명의 검출 방법이 점돌연변이를 검출할 수 있을지 여부를 검토하였다.

(3-1) 1개 염기 결실 변이의 검출

상기 (2-1)의 C4 및 C6의 서열 분석의 결과, 이들은 야생형 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 CRISPR 절단 위치를 포함하는 표적 핵산 영역의 염기서열 CTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGGTCGGGTAGAGGAGGTGCGGG(서열번호 38, 밑줄 부분이 CRISPR 표적 부위(기준서열), 26 ~ 28번째의 GGG가 PAM, 22번째 G와 23번째 G의 사이가 CRISPR 절단 위치)에서 다음의 변이를 가지는 것이 명백해졌다.

C4 : 한쪽 대립유전자에서 서열번호 38의 염기서열의 20 ~ 25 번째의 6개의 염기가 결실, 다른쪽 대립유전자에서 22번째 1개 염기가 결실

C6 : 한쪽 대립유전자에서 서열번호 38의 염기서열의 20 ~ 25 번째의 6개의 염기가 결실, 다른쪽 대립유전자에서 22 ~ 23 번째의 2개 염기가 결실

야생형 세포(WT)에서 추출한 게놈 DNA, C4 세포 및 C6 세포에서 각각 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트(hCDKN2A-(-)Bisul-F2 및 hCDKN2A-(-)Bisul-R2, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하고, ORN_p16을 첨가하여 어닐링/신장 온도 62℃ 또는 70℃의 2단계 PCR을 수행하였다. 결과를 도 10(A)에 나타내었다. 어닐링/신장 온도 62℃(왼쪽) 및 70℃(오른쪽)의 두 조건에서도 C4와 C6의 게놈 DNA로부터 증폭산물을 얻을 수 있었지만, WT 게놈 DNA로부터 증폭산물을 얻을 수 없었다.

얻어진 증폭산물에 대한 염기서열 분석을 실시했다. 결과를 도 10(B)에 나타내었다. 어닐링/신장 온도 62℃에서, C6는 2개의 서열 시그널이 검출되었지만, C4에서는 6개 염기 결실의 대립유전자의 서열 시그널만 검출되지 않고, 1개 염기 결실 대립유전자의 증폭은 ORN_p16의 혼성화에 의해 저해된 것으로 생각되었다. 한편, 어닐링/신장 온도 70℃에서는, C4의 증폭산물 중에 1개 염기 결실 대립유전자의 서열 시그널이 검출되었다. 이 결과로부터, 사용하는 ORN에 따라 어닐링/신장 온도를 조정함으로써 기준서열내의 1개 염기 결실을 검출할 수 있음이 보여졌다.

(3-2) 1개 염기 삽입 변이의 검출

상기 (2-2)의 CT11은 THYN1 유전자 로커스의 한쪽 대립유전자에 1개 염기의 삽입을 가지고 있다(다른쪽 대립유전자는 11개 염기의 결실, 표 3 참조). 그래서, 야생형 세포(WT)에서 추출한 게놈 DNA 및 CT11 세포에서 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여, THYN1 특이적 프라이머 세트(hTHYN1-gRNA-target-15-F5 및 hTHYN1-gRNA-target-15-R5, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하고, ORN_24b을 첨가하여 어닐링 온도 62℃ 또는 68℃의 PCR을 수행하였다. 결과를 도 11 (A)에 나타내었다. 어닐링 온도 62℃(왼쪽) 및 68℃(오른쪽)의 두 조건에서도 CT11의 게놈 DNA로부터 증폭산물을 얻을 수 있었지만, WT 게놈 DNA로부터 증폭산물은 얻을 수 없었다.

얻어진 증폭산물에 대한 염기서열 분석을 실시했다. 결과를 도 11(B)에 나타내었다. 어닐링 온도 62℃에서는, 1개 염기 삽입된 염기서열의 서열 시그널이 검출되지 않았지만, 어닐링 온도 68℃에서는, 1개 염기 삽입된 염기서열의 서열 시그널이 검출되었다. 이 결과로부터, 사용하는 ORN에 따라 어닐링 온도를 조정함으로써, 표적 핵산 영역의 1개 염기 삽입을 검출할 수 있음이 보여졌다.

(3-3) 1개 염기 치환의 검출

CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 한쪽 대립유전자에 1개 염기(G)의 삽입이 존재하는 HCT116 세포에서 추출한 게놈 DNA와, 변이가 말단에 위치하는 ORN(ORN_Gx5)을 이용하여 변이의 검출을 시도했다. 도 12(A)에 나타낸 바와 같이, Gx5의 염기서열 CCGCGGCCCGGGGGTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCG(서열번호 39)은 Gx4의 염기서열 CCGCGGCCCGGGGTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCG(서열번호 40)의 9번째 C와 10번째 G 사이에 G가 삽입되어 있고, 양자를 서열정렬(alignment)하면 Gx4의 염기서열의 9번째 C가, Gx5에서는 G로 치환되어 있는 것으로 해석할 수 있다. ORN_Gx5는, Gx5의 염기서열의 10번째 ~ 30번째 염기(기준서열)과 완전히 상보적인 서열이며, Gx4의 염기서열의 11번째 ~ 30번째는 완전히 상보적이지만 10번째의 C와는 미스매치되어 있다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하여, CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트(hCDKN2A-(-)Bisul-F2 및 hCDKN2A-(-)Bisul-R2, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하고, ORN_Gx5을 첨가하여 어닐링/신장 온도 64℃, 68℃ 또는 72℃의 2단계 PCR을 수행하였다. 그 결과, 어닐링/신장 온도 64℃에서 증폭산물을 얻을 수 없었지만, 어닐링/신장 온도 68℃ 및 72℃에서는 모두 증폭산물이 얻어졌다.

어닐링/신장 온도 68℃ 및 72℃에서 얻어진 증폭산물에 대한 염기서열 분석을 실시했다. 결과를 도 12(B)에 나타내었다. 어닐링/신장 온도 68℃에서는, ORN_Gx5과의 미스매치가 없는 Gx5의 염기서열의 서열 시그널은 매우 약한 것이어서, 증폭이 억제되어 있는 것으로 생각되었다. 어닐링/신장 온도 72℃에서는, Gx5의 염기서열의 서열 시그널이 강하게 검출되어, 증폭이 억제되지 않은 것으로 생각되었다. 이 결과에서, 사용하는 ORN에 따라 어닐링/신장 온도를 조정함으로써, 표적 핵산 영역의 1개 염기 치환을 검출할 수 있음이 보여졌다. 또한 검출하고자 하는 변이의 위치는 혼성화하는 ORN의 중앙 부근임을 요하지 않고, 말단이더라도 무방한 것으로 나타났다.

[실시예 4 : 2단계 PCR의 조건 검토]

(4-1) 마우스 Tax1bp1 유전자 로커스를 표적으로 하는 ORN에 의한 2단계 PCR에서의 증폭 억제

ORN으로는, ORN_Tax을 사용하였다(표 1 참조).

도 13(A)에는, 마우스 Tax1bp1 유전자 로커스의 표적 핵산 영역의 염기서열 CCATTACACCTTAACTCCGTATATCCAT(서열번호 41)과 ORN_Tax과의 혼성화 상태와, Tax1bp1 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타냈다.

ORN_Tax, Ba/F3 세포의 게놈 DNA, Tax1bp1 특이적 프라이머 세트(mTax1bp1-exon2-F2 및 mTax1bp1-exon2-R2, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소 (KOD-Plus-Ver.2)를 이용하여, 도 13(B)에 나타낸 바와 같이, 어닐링/신장 온도를 50 ~ 65℃ 범위에서 6단계로 설정하고, 2단계 PCR을 수행하였다. 결과를 도 13(C)에 나타내었다. 마우스 Ba/F3 세포에서 추출한 게놈 DNA를 ORN가 존재하지 않는 조건에서 PCR에 사용하면, 0.6kbp 영역이 증폭되었다. ORN_Tax을 1μM로 반응액에 첨가하면, 어닐링/신장 온도가 56℃ 이하에서 ORN에 의한 증폭 억제를 볼 수 있고, 50 및 53℃에서는 증폭이 강하게 억제되었다. 이 결과로부터, 사용하는 ORN에 따라 어닐링/신장 온도를 조정함으로써, 표적 핵산 영역의 PCR 증폭을 2단계 PCR에서 특이적으로 억제할 수 있음을 확인했다. 또한, 이 결과로부터, ORN_Tax1이 주형 DNA와 혼성화하는 온도가 53 ~ 56℃인 것이 시사되었다.

(4-2) 인간 c-FOS 유전자 로커스를 표적으로 하는 ORN에 의한 2단계 PCR에서의 증폭 억제

ORN은 ORN_FOS을 사용하였다(표 1 참조).

도 14(A)에 인간 c-FOS 유전자 로커스의 표적 핵산 영역의 염기서열 GTTATAAAAGCAGTGGCTGCGGCGCCTCGT(서열번호 42)과 ORN_FOS와의 혼성화 상태와, c-FOS 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타냈다.

ORN_FOS, 293T 세포의 게놈 DNA, c-FOS 특이적 프라이머 세트(hc-fos-prom-F 및 hc-fos-prom-R, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하여, ㄷ도 14(B)에 나타낸 바와 같이, 어닐링/신장 온도를 50 ~ 68℃의 범위에서 7단계로 설정하고, 2단계 PCR을 수행하였다. 결과를 도 14(C)에 나타내었다. 인간 293T 세포에서 추출한 게놈 DNA를 ORN이 존재하지 않는 조건에서 PCR에 사용하면, 어닐링/신장 온도 53 ~ 68℃에서 0.8kbp 영역이 특이적으로 증폭되었다. ORN_FOS을 1μM로 반응액에 첨가하면 어닐링/신장 온도가 53 ~ 65℃에서 증폭이 강하게 억제되고, 68℃의 경우에만 0.8kbp 영역의 특이적 증폭이 관찰되었다. 이 결과에서도, 사용하는 ORN에 따라 어닐링/신장 온도를 조정함으로써, 표적 핵산 영역의 PCR 증폭을 2단계 PCR에서 특이적으로 억제할 수 있음을 확인했다. 또한, 이 결과로부터, ORN_FOS가 주형 DNA와 혼성화하는 온도가 65 ~ 68℃인 것이 시사되었다.

DNA의 Tm값의 예측 방법으로 다음의 계산식 알려져있다.

Tm =(a+t) * 2 + (g+c) * 4

여기에서, a, t, g, c는 A, T, G, C 각각의 염기의 수를 나타낸다.

상기 계산식에 따라 염기 T를 U로 하여 ORN_Tax 및 ORN_FOS의 Tm값을 계산한 결과, ORN_Tax의 Tm값은 54℃, ORN_FOS의 Tm값은 66℃였다(표 4). ORN_Tax의 실제 Tm값은 도 12의 결과로부터 53 ~ 56℃이며, ORN_FOS의 실제 Tm값은, 도 13의 결과에서 65 ~ 68℃인 것으로부터, ORN의 Tm값을 예측할 수 있음이 시사되었다.

[표 4]

[실시예 5 : 2단계 PCR에 의한 게놈 편집 세포의 스크리닝]

(5-1) 인간 293T 세포 c-FOS 유전자 로커스를 편집한 세포의 스크리닝

인간 293T 세포에 대해 c-FOS 유전자 로커스의 TALEN 매개 게놈 편집을 실시하고, 본 발명의 검출 방법을 이용하여 c-FOS 유전자 로커스에 변이가 도입된 세포의 스크리닝을 시도했다. 도 15 (A)에 인간 c-FOS 유전자 로커스의 TALEN 절단 위치를 포함한 표적 핵산 영역의 염기서열 CTCATTCATAAAACGCTTGTTATAAAAGCAGTGGCTGCGGCGCCTCGTACTCCAACCGCATCTGC(서열번호 43) 및 ORN_FOS과의 혼성화 상태를 나타내고, 또한 c-FOS 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 영역을 나타냈다. 도면 중 밑줄부분은 TALEN-left 및 TALEN-right 표적 부위를 나타내며, 양자 사이에 끼워져 있는 영역이 절단된다.

인간 293T 세포에 c-FOS 유전자 로커스의 TALEN 매개 게놈 편집을 수행하고, 단일 콜로니를 단리한 후, 14클론(F1 내지 F14)의 세포에서 게놈 DNA를 추출했다. 이들 게놈 DNA를 주형으로 하고, c-FOS 특이적 프라이머 세트(hc-fos-prom-F 및 hc-fos-prom-R, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하여, ORN_FOS을 첨가하고, 어닐링/신장 온도 65℃에서 2단계 PCR을 수행하였다.

결과를 도 15(B)에 나타내었다. 14개 샘플 중 9개 샘플에서 명료한 증폭산물의 밴드가 관찰되며, 이들 클론에서 게놈 편집이 이루어졌다고 생각되었다. F4 및 F10의 게놈 DNA로부터는 2개의 PCR 산물이 검출되고, 이들 클론은 양 대립유전자에 다른 게놈 편집이 이루어진 것으로 생각되었다. 또한 F9의 게놈 DNA로부터는 3개의 PCR 산물이 검출되어, 이 클론은 게놈 편집이 이루어진 세포가 여러 종류 포함되어 있을 가능성이 있는 것으로 생각되었다. F4 및 F9을 제외한 클론의 변이 유무와 종류를 특정하기 위해, ORN을 첨가하지 않고 PCR 증폭을 실시하여, PCR 산물의 서열 분석을 실시했다. 그 결과, 증폭산물의 명료한 밴드가 보이지 않았던 F2, F3, F5, F13, F14은 TALEN 표적 부위에 변이는 보이지 않고, 명료한 밴드가 보인 것은, 변이를 갖는 TALEN 표적 부위에 대응하는 서열 시그널이 검출되었으므로, 이들 클론의 표적 부위의 양 대립유전자 또는 한쪽 대립유전자에 변이가 도입된 것으로 생각되었다. 결과를 표 5에 나타내었다. 이 결과로부터, 2단계 PCR을 이용한 본 발명의 검출 방법은 게놈 편집 세포의 스크리닝에 이용될 수 있음이 보여졌다.

[표 5]

[실시예 6 : 2단계 PCR에 의한 1개 염기 치환 변이의 검출]

(6-1) 인간 NCI-H1975 세포의 EGFR 유전자 로커스에서 1개 염기 치환 변이의 검출

NCI-H1975 세포에서는, EGFR 유전자 로커스의 한쪽 대립유전자에 1개 염기 치환 변이가 존재한다. 도 16(A)에 나타낸 바와 같이, NCI-H1975 세포에서는, 한쪽의 대립유전자의 정상적인 염기서열 TCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGG(서열번호 44)의 16번째 T가 G로 치환되어 있다. ORN_EGFR_L858은, 정상적인 염기서열의 6번째 ~ 26번째 염기(기준서열)과 완전히 상보적인 서열이고, 1개 염기 치환의 염기서열의 16번째 G와 미스매치되어 있다. NCI-H1975 세포 및 1개 염기 치환 변이가 없는 293T 세포로부터 각각 게놈 DNA를 추출했다. 이들 게놈 DNA를 주형으로 하여, EGFR 특이적 프라이머 세트(hEGFR-Exon21-F 및 hEGFR-Exon21-R, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하고, ORN_EGFR_L858을 첨가 또는 무첨가하여, 도 16(B)에 나타낸 바와 같이, 어닐링/신장 온도를 59 ~ 65℃의 범위에서 3단계로 설정하고, 2단계 PCR을 수행하였다. 그 결과, 도 16(C)에 나타낸 바와 같이, ORN_EGFR_L858 무첨가의 경우, 게놈 DNA를 주형으로 이용한 모두에서 증폭산물이 보였지만, ORN_EGFR_L858를 첨가한 경우, 어닐링 및 신장 온도 59℃에서는, 293T의 게놈 DNA를 이용한 경우는 증폭산물이 보이지 않았고, NCI-H1975 세포의 게놈 DNA를 이용한 경우에 증폭산물이 보였다.

어닐링/신장 온도 59℃에서 얻어진 증폭산물에 대한 염기서열 분석을 실시했다. 결과를 도 16(D)에 나타내었다. 293T 세포의 게놈 DNA를 주형으로 이용한 경우, ORN 무첨가에서는 정상적인 염기서열의 시그널이 검출되었다. NCI-H1975 세포의 게놈 DNA를 이용한 경우, ORN 무첨가에서는 정상적인 염기서열 및 1개 염기 치환 변이의 염기서열의 두 시그널이 검출되었다. 한편, ORN_EGFR_L858를 첨가한 경우, 1개 염기 치환 변이의 염기서열 시그널만 검출되었다. 이 결과로부터, 2단계 PCR을 이용한 본 발명의 검출 방법은, 표적 핵산 영역 내의 1개 염기 치환 변이를 검출할 수 있음이 보여졌다.

[실시예 7 : 게놈 편집된 염기서열군의 증폭]

(7-1) 게놈 편집된 인간 THYN1 유전자 로커스 염기서열군의 증폭

게놈 편집 처리된 세포집단으로부터 추출한 DNA를 이용하여 본 발명의 검출 방법을 실시함으로써, 표적 핵산 영역내에 변이를 갖는 염기서열군이 증폭되는가를 검토하였다.

인간 THYN1 유전자 로커스의 게놈 편집을 위해, Cas9발현 플라스미드(4μg) 및 인간 THYN1 유전자 로커스를 표적으로 하는 sgRNA 발현 플라스미드(4μg)를 Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 HCT116 세포(4 Х10개)에 트랜스펙션하였다. 3일 후, Quick-DNA Universal Kit(Zymo Research)를 이용하여 게놈 DNA를 추출했다.

인간 THYN1 유전자 로커스를 표적으로 하는 PCR에서는, 10μl 중에 20ng의 HCT116 세포의 게놈 DNA, 0.3μM의 각 프라이머 및 0.5μM의 ORN을 포함하는 PCR 반응액을 제조했다. 반응은 최초에 94℃의 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초 및 68℃에서 90초의 2단계를 34사이클 실시했다.

PCR 산물을 1% 아가로스겔을 이용한 전기영동에 투입하고, 필요에 따라 직접 또는 pCR4-TOPO(Thermo Fisher Scientific)에 클로닝한 후, DNA 서열 분석을 실시했다. DNA 서열 분석은 Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0(Thermo Fisher Scientific)을 이용하였다.

본 실험 모식도를 도 17(A)에 나타내었다. HCT116 세포에 대해 THYN1 유전자 로커스의 CRISPR 매개 게놈 편집을 실시하고, 세포의 클론화없이 게놈 DNA를 한꺼번에 추출하였다. 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, THYN1 특이적 프라이머 세트(hTHYN1-gRNA-target-15-F5 및 hTHYN1-gRNA-target-15-R5, 표 2 참조), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2 )를 이용하여, ORN_24b(표 1 참조)를 첨가하거나 첨가하지 않고, PCR을 수행하였다.

도 17(B)에 인간 THYN1 유전자 로커스의 CRISPR 절단 위치를 포함한 표적 핵산 영역의 염기서열 CAGCGTGACCATGTCGAGACCCCGGAAGAGGCT(서열번호 51)과 ORN_24b과의 혼성화 상태를 나타냈다. 도면 중 밑줄부분은 CRISPR 표적 부위(기준서열)을 나타내며, 음영부분은 PAM을 나타내고, 화살표는 CRISPR 절단 위치를 나타낸다.

결과를 도 17(C)에 나타내었다. ORN을 첨가하지 않은 경우, 야생형 세포 및 게놈 편집 처리된 세포집단의 게놈 DNA로부터 표적 핵산 영역이 증폭되었다. ORN_24b를 첨가한 경우는, 야생형 세포의 게놈 DNA로부터의 증폭이 완전히 억제되었으나, 게놈 편집 처리된 세포집단의 게놈 DNA로부터의 증폭은 완전히 억제되지는 않았다. ORN을 첨가하지 않은 PCR 산물과, ORN_24b을 첨가한 PCR 산물의 서열 분석을 실시한 결과, ORN을 첨가하지 않은 PCR 산물로부터는 야생형의 염기서열(TGCAGCGTGACCATGTCGAGACCCCGGAAGAGGCTGGCTGG : 서열번호 52) 시그널만 검출된 반면, ORN_24b을 첨가한 PCR 산물로부터는 여러 종류의 염기서열 시그널을 얻을 수 있었다(도 17(D) 참조). 또한 ORN_24b을 첨가한 PCR 산물로부터는 야생형의 염기서열 시그널은 보이지 않았다. 따라서 ORN_24b는, 게놈 편집 처리된 세포집단 중 야생형 세포 유래의 게놈 DNA로부터의 THYN1 유전자 로커스의 증폭을 억제하고, 게놈 편집이 도입된 세포의 게놈 DNA로부터의 증폭에는 영향을 주지 않음이 밝혀졌다.

다음으로, ORN을 첨가하지 않은 PCR 산물과 ORN_24b을 첨가한 PCR 산물을 플라스미드에 클로닝한 후, 각 클론의 염기서열을 분석했다. 결과를 표 6에 나타내었다. ORN을 첨가하지 않은 PCR 산물을 클로닝한 경우에는, 11개의 클론 중 2개가 게놈 편집된 염기서열이었다. 반면, ORN_24b를 첨가한 PCR 산물을 클로닝한 경우에는, 7개의 모든 클론이 게놈 편집된 염기서열이었다. 이러한 결과로부터, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 혼성화하는 ORN을 PCR 반응액에 첨가하여 PCR을 수행함으로써, 표적 핵산 영역에 변이를 갖지 않는 야생형 핵산 서열(기준서열)의 증폭을 억제하고, 표적 핵산 영역내에 변이를 갖는 변이형 핵산서열(기준외서열)을 증폭할 수 있음이 보여졌다.

[표 6]

(7-2) 게놈 편집된 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스 염기서열군의 증폭

다음으로, 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하여, 표적 특이적 ORN 대신 crRNA을 사용하여 동일한 검토를 수행했다.

인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 게놈 편집을 위해, Cas9 발현 플라스미드(4μg) 및 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하는 sgRNA 발현 플라스미드(4μg)를 Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 HCT116 세포(4x10⁵개)에 트랜스펙션하였다. 3일 후, Quick-DNA Universal Kit(Zymo Research)를 이용하여 게놈 DNA를 추출했다.

인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하는 PCR에서는, 10μl 중에 20ng의 HCT116 세포의 게놈 DNA, 0.3μM의 각 프라이머 및 0.25μM의 crRNA을 포함한 PCR 반응액을 제조하였다. 반응은, 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초 및 74℃에서 70초의 2단계를 34사이클 실시했다.

PCR 산물을 1% 아가로스겔을 이용한 전기영동에 투입하고, 필요에 따라 직접 DNA 서열 분석을 실시했다. DNA 서열 분석은 Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다.

도 17(A)에 나타낸 실험 모식도와 동일하게, HCT116 세포에 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 CRISPR 매개 게놈 편집 처리를 수행하고, 세포의 클론화없이 게놈 DNA를 한꺼번에 추출하였다. 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스 특이적 프라이머 세트(hCDKN2A-CpG-645-F 및 hCDKN2A-CpG-645-R), KOD DNA 중합효소(KOD-Plus-Ver.2)를 이용하여, crRNA_lef5를 첨가하거나 첨가하지 않고, PCR을 수행하였다.

hCDKN2A-CpG-645-F : ggagacccaacctggggcgacttca (서열번호 45)

hCDKN2A-CpG-645-R : ctgtacgcgcgtggctcctcattcc (서열번호 46)

crRNA_lef5 : uggggcggaccgcgugcgcuguuuuagagcuaugcuguuu (서열번호 47)

도 18(A)에 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 CRISPR 절단 위치를 포함하는 표적 핵산 영역의 염기서열 GGTGGGGCGGACCGCGTGCGCTCGGCG(서열번호 53)과 상보서열 및 crRNA_lef5과의 혼성화 상태를 나타냈다. 도면 중 밑줄부분은 CRISPR 표적 부위(기준서열)을 나타내며, 음영부분은 PAM을 나타내고, 화살표는 CRISPR 절단 위치를 나타낸다.

결과를 도 18(B)에 나타내었다. crRNA을 첨가하지 않은 경우, 야생형 세포 및 게놈 편집 처리된 세포집단의 게놈 DNA로부터 표적 핵산 영역이 증폭되었다. crRNA_lef5를 첨가한 경우는, 야생형 세포의 게놈 DNA로부터의 증폭이 완전히 억제되었으나, 게놈 편집 처리된 세포집단의 게놈 DNA의 증폭은 완전히 억제되지 않았다. 다음으로, crRNA_lef5를 첨가하지 않은 PCR 산물과 crRNA_lef5을 첨가한 PCR 산물의 염기서열 분석을 실시한 결과, crRNA_lef5를 첨가하지 않은 PCR 산물에서는 야생형의 염기서열(GGTGGGGCGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGG : 서열번호 54) 시그널이 주로 검출된 반면, crRNA_lef5를 첨가한 PCR 산물로부터는 여러 종류의 염기서열 시그널을 얻을 수 있었다(도 18(C) 참조). 따라서 crRNA_lef5는, 게놈 편집 처리된 세포집단 중 야생형 세포 유래의 게놈 DNA로부터의 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 증폭을 억제하고, 게놈 편집이 도입된 세포의 게놈 DNA로부터 증폭에는 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과로부터, 표적 핵산 영역 내의 기준서열에 혼성화하는 crRNA를 PCR 반응액에 첨가하여 PCR을 수행함으로써, 표적 핵산 영역내에 변이를 갖지 않는 야생형 핵산 서열(기준서열)의 증폭을 억제하고, 표적 핵산 영역내에 변이를 갖는 변이형 핵산서열(기준외서열)을 증폭할 수 있음이 보여졌다.

이상과 같이 본 발명의 검출 방법은, 표적 핵산 영역내에 변이를 갖는 변이형 핵산서열(기준외서열)을 갖는 핵산의 비율을 증가시킴으로써, 보다 효율적으로 변이패턴을 분석할 수 있으며, 게놈 편집 처리후의 세포집단에 있어서 게놈 편집 세포의 유무의 확인에도 이용할 수 있음이 밝혀졌다. 또한, PCR 산물의 클로닝 및 시퀀싱에 의한 염기서열의 분석 대신에, 차세대 염기서열 분석에 사용할 수도 있다.

[실시예 8 : 메틸화된 시토신을 포함하는 DNA 영역의 바이설파이트 처리후의 증폭]

(8-1) 메틸화된 시토신을 포함하는 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 바이설파이트 처리후에 증폭

CpG가 다수 존재하는 CpG 아일랜드 영역에서는, CpG 서열의 시토신이 메틸화되는 것으로 알려져있다. 바이설파이트 처리에 의해, 메틸화되지 않은 시토신은 우라실로 변환되지만, 메틸화되어 있는 시토신은 변환되지 않는다. 따라서 바이설파이트 처리한 DNA를 이용한 PCR에서는, 메틸화되지 않은 시토신은 티민으로 증폭되고, 메틸화된 시토신은 그대로 시토신으로 증폭된다. 즉, 바이설파이트 처리한 DNA에서는, CpG의 시토신의 메틸화 유무에 따라 염기서열에 차이가 발생하고, 본 발명의 검출 방법을 실시함으로써, CpG의 시토신에 메틸화가 있는(또는 없는) DNA 영역 유래의 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있을 것으로 생각되었다.

HCT116 세포에서, 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스의 CpG 아일랜드 영역은, 한쪽 대립유전자만 CpG의 메틸화가 되는 것으로 알려져 있다. 그래서, 추출한 DNA를 이용하여, 바이설파이트 처리후에 본 발명의 검출 방법을 실시함으로써, CDKN2A(p16) 유전자 로커스 CpG 아일랜드 영역의 CpG의 시토신에 메틸화를 갖는 DNA 영역 유래의 염기서열을 특이적으로 증폭할 수 있는지 여부를 검토했다.

HCT116 세포에서 추출한 게놈 DNA를, EZ DNA Methylation-Lightning Kit(Zymo Research)를 이용하여 바이설파이트 처리했다. 인간 CDKN2A(p16) 유전자 로커스를 표적으로 하는 PCR에서는, 10μl 중에 1μl의 바이설파이트 처리 후의 HCT116 세포의 게놈 DNA, 0.3μM의 각 프라이머 및 1μM의 ORN을 포함한 PCR 반응액을 제조했다. 반응은 최초에 94℃에서 2분간 변성에 이어, 98℃에서 10초 및 56℃에서 60초의 2단계를 35사이클 실시했다. PCR 산물을 2% 아가로스겔을 이용한 전기영동에 투입하고, 필요에 따라 DNA 서열분석을 수행했다. DNA 서열 분석은 Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0(Thermo Fisher Scientific)를 이용하였다.

바이설파이트 처리한 DNA를 주형으로 하여 본 발명의 검출 방법을 실시하는 경우의 모식도를 도 19(A)에 나타내었다. HCT116 세포에서 게놈 DNA를 추출하고, 바이설파이트 처리한 것을 주형으로 하여, CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트(hCDKN2A-Bisul-CpG-free-F 및 hCDKN2A-Bisul-CpG-free-R)과 KOD-Multi & Epi-(도요보)를 이용하여, ORN_hCDKN2A_U를 첨가하거나 첨가하지 않고 PCR을 수행하였다.

hCDKN2A-Bisul-CpG-free-F:tttttagaggatttgagggatagg (서열번호 48)

hCDKN2A-Bisul-CpG-free-R:ctacctaattccaattcccctacaaacttc (서열번호 49)

ORN_hCDKN2A_U: guggggaguaguauggaguuuuu (서열번호 50)

바이설파이트 처리한 HCT116 세포 게놈 DNA를 주형으로 했을 때, 상기 CDKN2A(p16) 특이적 프라이머 세트에 의해 증폭되는 DNA 영역(서열번호 55)에 대해, 바이설파이트 처리 전의 염기서열을 도 19(B)에 나타내었다. 바이설파이트 처리 후(B)의 음영 부분의 서열의 상보서열과 ORN_hCDKN2A_U와의 혼성화 상태를 도 19(C)에 나타내었다. 상단이 (B)의 음영 부분의 서열이 메틸화 시토신을 포함하지 않는 경우, 하단이 (B)의 음영 부분의 서열이 메틸화 시토신을 포함하는 경우이다. ORN_hCDKN2A_U는, (B)의 음영 부분의 서열이 메틸화 시토신을 포함하지 않는 경우에는, 그 상보서열(AAAAACTCCATACTACTCCCCAC : 서열번호 56)과 완벽하게 상보적으로 되고, (B)의 음영 부분의 서열이 메틸화 시토신을 포함하는 경우에는 그 상보서열(GAAAACTCCATACTACTCCCCGC : 서열번호 57)과 2개 염기의 미스매치가 생긴다.

결과를 도 19(D)에 나타내었다. ORN 첨가 및 비첨가의 모두에서 바이설파이트 처리한 게놈 DNA로부터 표적 CpG 아일랜드 영역이 증폭되었지만, ORN_hCDKN2A_U를 첨가한 경우, 표적 CpG 아일랜드 영역의 증폭은 약하게 감소했다. 다음으로, ORN을 첨가하지 않은 PCR 산물과, ORN_hCDKN2A_U를 첨가한 PCR 산물의 염기서열 분석을 실시했다. 도 19(B)의 밑줄부분 영역의 염기서열에 대해, 메틸화 시토신을 포함하는 경우의 바이설파이트 처리후의 염기서열(CGGATCGCGTGCGTTCGGCGG : 서열번호 58) 시그널을 도 19(E)에 나타내었다. ORN을 첨가하지 않은 PCR 산물로부터는 CpG 사이트에서 메틸화시토신 및 비메틸화 시토신 유래의 염기서열 시그널이 검출된 것에 반해, ORN_hCDKN2A_U를 첨가한 PCR 산물로부터는 메틸화 시토신 유래의 염기서열 시그널만이 검출되었다. 따라서 ORN_hCDKN2A_U는, CDKN2A(p16) 유전자 로커스 CpG 아일랜드 영역의 CpG의 시토신 메틸화를 갖지 않는 DNA 영역으로부터의 DNA 증폭을 억제하고, 시토신 메틸화를 갖는 DNA 영역으로부터의 DNA 증폭에는 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌다.

이상으로부터, 본 발명의 검출 방법은 바이설파이트 처리후에, CpG의 시토신 메틸화를 갖는(또는 갖지 않는) DNA 영역 유래의 염기서열을 특이적으로 증폭(농축)할 수 있음이 판명되었다. 본 발명의 검출 방법을 이용함으로써, 대상으로 하는 DNA 영역의 CpG의 메틸화 패턴을 보다 효율적으로 분석할 수 있다.

또한 본 발명은 상술한 각 실시예 및 실시예에 한정되는 것이 아니라, 청구항에 나타낸 범위에서 다양한 변경이 가능하며, 다른 실시예에 각각 개시된 기술적 수단을 적절하게 조합하여 얻어지는 실시형태도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 학술 논문 및 특허 문헌의 전부는 본 명세서에서 참고 자료로 원용된다.

<110> EPIGENERON,INC. <120> METHOD FOR DETECTING DIFFERENCE IN REFERENCE SEQUENCE IN TARGET NUCLEIC ACID REGION <130> P20-4169 <150> JP 2018/081752 <151> 2018-04-20 <160> 58 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo Ribonucleic Acid <400> 1 cggggucucg acauggucac 20 <210> 2 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo Ribonucleic Acid <400> 2 uccggggucu cgacaugguc acgc 24 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo Ribonucleic Acid <400> 3 ccucuuccgg ggucucgaca ugg 23 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo Ribonucleic Acid <400> 4 ccgggggcgc ugggcugucc c 21 <210> 5 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo Ribonucleic Acid <400> 5 ggggccgggg gcgcugggcu guccc 25 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo Ribonucleic Acid <400> 6 caccuccucu acccgacccc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> 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<220> <223> Primer <400> 33 gcctttccat tctttggatc ag 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 ctgcagggag agactgaaac ct 22 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 35 ctgcagcgtg accatgtcga gaccccggaa gaggctggc 39 <210> 36 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 36 gcactaaagt cccctgcagc gtgaccatgt cgagaccccg gaagaggctg gc 52 <210> 37 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 37 ctggccacgg ccgcggcccg gggtcgggta gaggaggtgc ggg 43 <210> 38 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 38 ctggccacgg ccgcggcccg gggtcgggta gaggaggtgc ggg 43 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 39 ccgcggcccg ggggtcgggt agaggaggtg cgggcg 36 <210> 40 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 40 ccgcggcccg gggtcgggta gaggaggtgc gggcg 35 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mus musculus <400> 41 ccattacacc ttaactccgt atatccat 28 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 42 gttataaaag cagtggctgc ggcgcctcgt 30 <210> 43 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 43 ctcattcata aaacgcttgt tataaaagca gtggctgcgg cgcctcgtac tccaaccgca 60 tctgc 65 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens <400> 44 tcacagattt tgggctggcc aaactgctgg g 31 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 ggagacccaa cctggggcga cttca 25 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 ctgtacgcgc gtggctcctc attcc 25 <210> 47 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligo Ribonucleic Acid <400> 47 uggggcggac cgcgugcgcu guuuuagagc uaugcuguuu 40 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 tttttagagg 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cggcggctgc 120 ggagaggggg agagcaggca gcgggcggcg gggagcagca tggagccggc ggcggggagc 180 agcatggagc cttcggctga ctggctggcc acggccgcgg cccggggtcg ggtagaggag 240 gtgcgggcgc tgctggaggc gggggcgctg cccaacgcac cgaatagtta cggtcggagg 300 ccgatccagg tgggtagagg gtctgcagcg ggagcagggg atggcgggcg actctggagg 360 acgaagtttg caggggaatt ggaatcaggt ag 392 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA amplified using bisulfite-treated DNA as a template <400> 56 aaaaactcca tactactccc cac 23 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA amplified using bisulfite-treated DNA as a template <400> 57 gaaaactcca tactactccc cgc 23 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA amplified using bisulfite-treated DNA as a template <400> 58 cggatcgcgt gcgttcggcg g 21

Claims

표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 검출하는 방법에 있어서,
기준서열에 대한 차이를 검출하려고 하는 핵산의 표적 핵산 영역은, 기준서열을 갖는 핵산의 기준서열의 전후의 서열과 동일한 서열을 포함하고,
상기 표적 핵산 영역의 기준 서열을 포함하는 범위를 증폭시키는 주형 의존적 핵산 증폭반응에서, 기준서열에 대한 차이를 검출하려고 하는 핵산을 주형으로 하고, 추가로, 기준서열에 혼성화하는 10개 내지 200개의 염기로 구성된 단일가닥 핵산을 반응계에 첨가하여 반응을 수행하는 공정과, 증폭산물을 확인하는 공정을 포함하고,
상기 단일가닥 핵산은 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라이며, 단일가닥 핵산의 기준서열에 대한 상보율은, 기준서열에 대한 차이를 포함하는 기준외서열에 대한 상보율보다 높은 것을 특징으로 하며,
상기 기준서열에 대한 차이가, 기준서열 내 결실변이, 삽입변이 또는 기준서열 내 염기의 메틸화인, 검출 방법.
청구항 1에 있어서,
기준서열을 갖는 핵산의 표적 핵산 영역과 기준서열에 대한 차이를 검출하고자 하는 핵산의 표적 핵산 영역이, 동일 유전자 로커스를 포함하는 것인, 검출 방법.
청구항 1에 있어서,
단일가닥 핵산의 기준서열에 대한 상보율이 100%인, 검출 방법.
삭제
청구항 1에 있어서,
주형 의존적 핵산 증폭 반응이, PCR법, RT-PCR법, LAMP법, ICAN법, NASBA법, LCR법, SDA법, TRC법, TMA법 및 RPA법으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
청구항 5에 있어서,
주형 의존적 핵산 증폭 반응이 PCR법인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
청구항 6에 있어서,
PCR법이 변성 단계, 어닐링 단계 및 신장 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 검출 방법.
청구항 7에 있어서,
어닐링 단계 및 신장 단계가 동일한 온도에서 실시되는 것을 특징으로 하는 검출 방법
청구항 1에 있어서,
단일가닥 핵산이 15개 내지 30개의 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 검출 방법.
청구항 1에 있어서,
단일가닥 핵산이 단일가닥 RNA인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
청구항 1에 있어서,
표적 핵산 영역을 포함하는 핵산이 피시험자의 임상검체로부터 얻어진 핵산인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
표적 핵산 영역 내의 기준서열에 대한 차이를 갖는 세포를 스크리닝하는 방법에 있어서,
피시험세포로부터 핵산을 제조하는 공정, 얻어진 핵산을 주형으로 하여 청구항 1 내지 3 및 5 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법에 투입하고, 증폭산물의 유무를 확인하는 공정, 및 증폭산물이 확인된 세포를 선택하는 공정이 포함되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
청구항 1 내지 3 및 5 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법에 사용하기 위한 키트에 있어서,
표적 핵산 영역 내의 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라인 단일가닥 핵산을 포함하는 키트.
청구항 1 내지 3 및 5 내지 11 중 어느 한 항에 기재된 검출 방법에 사용하기 위한 검출제에 있어서,
표적 핵산 영역 내의 기준서열과 상보적인 서열을 포함하는, RNA 또는 RNA와 타핵산과의 키메라인 단일가닥 핵산을 포함하는 검출제.