JP2020508083A - 標的ヌクレオチド配列の富化及び決定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
以下、ASCIIフォーマットで提出する内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる:コンピュータ読み込み可能な形式(CRF)の配列表(名称:776252000140SEQLIST.txt、記録日:2017年7月26日、サイズ:17KB)。
本明細書において互換的に用いられる「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、かつDNAとRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び/又はそれらの類似体であってもよく、DNAやRNAポリメラーゼによってポリマーに組み込まれることができる任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含んでもよい。
本願の一局面は、次世代シークエンシングに用いられる標的の富化方法に関し、つまり次世代シークエンシング技術により標的ヌクレオチド配列を決定する前に、1つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する方法である。
第1のステップとして、本明細書に記載の方法は、ユニバーサルアダプターを核酸試料中の1つないしそれ以上の核酸テンプレートにライゲートすることを含む。いくつかの実施形態では、核酸試料は、標的ヌクレオチド配列及び非標的ヌクレオチド配列の両方を含有する核酸テンプレートを含む。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは核酸試料中の実質的にすべての核酸テンプレートにライゲートされている。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは、標的ヌクレオチド配列を含む標的核酸テンプレート、及び標的ヌクレオチド配列を含まない非標的核酸テンプレートの両方にライゲートされている。
外部プライマーを用いて、ライゲートされた核酸に対して1つないしそれ以上のプライマー伸長サイクル又は線形的増幅サイクルを行う。標的ヌクレオチド配列を含む核酸テンプレートは各プライマー伸長サイクルにおいてテンプレートとして働くので、プライマー伸長サイクルは標的ヌクレオチド配列の量を線形的に増加させることができる。いくつかの実施形態では、プライマー伸長サイクルを1回又は複数回繰り返す。いくつかの実施形態では、プライマー伸長サイクルを繰り返さない。いくつかの実施形態では、当該方法は少なくとも2又はより多くのプライマー伸長サイクルを含み、例えば少なくとも約5、10、15、20、25、30のうちのいずれか又はより多くの反復プライマー伸長サイクルを含む。いくつかの実施形態では、当該方法は約2〜100のプライマー伸長サイクルを含み、例えば約5〜50、約5〜30、約5〜20、約10〜20、約10〜15、約15〜30、約30〜50又は約10〜30のうちのいずれかのプライマー伸長サイクルを含む。各プライマー伸長サイクルは、1)鎖の分離(例えば熱変性)、2)標的ヌクレオチド配列を含むライゲートされた核酸の第1の鎖への外部プライマーのアニーリング、及び、3)アニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼによる伸長のステップ、を含む。これらのステップの各々にとって必要な条件及び時間は、当業者によって考案されうる。プライマー伸長サイクルはサーマルサイクラーにおいて行うことができ、その多くは市販されている。
ユニバーサルアダプタープライマーと内部プライマーと必要に応じてシークエンシングアダプタープライマーを用いて、一本鎖プライマー伸長生成物に対して1つないしそれ以上のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅サイクルを行う。前のポリメラーゼ伸長生成物は連続的サイクル伸長のテンプレートとして使用されているので、PCR増幅サイクルは標的ヌクレオチド配列の量を指数的に増加させることができる。いくつかの実施形態では、当該方法は少なくとも2以上のPCR増幅サイクルを含み,例えば少なくとも約5、10、15、20、25、30のうちのいずれか又はより多くの反復PCR増幅サイクルを含む。いくつかの実施形態では、当該方法は約2〜100のPCR増幅サイクルを含み、例えば約5〜50、約5〜30、約5〜20、約10〜20、約10〜15、約15〜30、約30〜50又は約10〜30のうちのいずれかのPCR増幅サイクルを含む。各PCR増幅サイクルは、1)鎖の分離(例えば熱変性)、2)鋳型分子へのユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーのアニーリング、および、3)アニールしたプライマーの核酸ポリメラーゼによる伸長の段階を含む。これらの段階の各々にとって必要な条件および時間は、当業者によって考案されうる。PCR増幅サイクルはサーマルサイクラーにおいて行うことができ、その多くは市販されている。
本明細書に記載の方法はその他のステップを含んでもよく、断片化、酵素消化及び/又はクリーンアップステップを含むが、これらに限定されない。
本明細書に記載の方法ではオリゴヌクレオチドアダプター及びプライマーが用いられており、ユニバーサルアダプター、ネストされた標的特異的プライマー(つまり外部プライマー及び内部プライマー)、ユニバーサルアダプタープライマー及びシークエンシングアダプタープライマー、並びに特定のNGSプラットフォームに適するシークエンシングプライマーを含む。本明細書に記載のプライマー及びアダプターは、高い特異性、感度、効率(例えばライゲーション、プライマー伸長、PCR増幅又はNGSシークエンシング)、及び/又はあるタイプの配列(例えば高いGC含有量の配列)に対して少ないバイアスを実現するために、特別に設計及び最適化することができる。
本明細書に用いられるユニバーサルアダプターは、第1の末端にライゲート可能な二本鎖部分を含み、かつ第2の末端に非二本鎖部分を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは、2つの別々の鎖、つまり第1の鎖及び第2の鎖を有する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルアダプターは第1の鎖及び第2の鎖を含む。ユニバーサルアダプターの第1の鎖とは、3'末端がユニバーサルアダプターの第1の末端(つまりライゲート可能な末端)にある鎖を指す。ユニバーサルアダプターの第2の鎖とは、5'末端がユニバーサルアダプターの第1の末端(つまりライゲート可能な末端)にある鎖を指す。
本明細書に記載の方法は、1組又は複数組の外部プライマー及び内部プライマーを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化する。関心対象の遺伝子座について、内部プライマーは外部プライマーに対してネストされたものである。いくつかの実施形態では、1つの外部プライマー及び1つの内部プライマーを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を増幅する。いくつかの実施形態では、複数の(例えば2、3、4、5、6、10、12、15のうちのいずれか又はより多くの)外部プライマー及び複数の(例えば2、3、4、5、6、10、12、15のうちのいずれか又はより多くの)内部プライマーを用いて、関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を増幅する。いくつかの実施形態では、1つの関心対象の遺伝子座の外部プライマー及び内部プライマーは、鋳型核酸の同一の鎖に特異的にアニールする。いくつかの実施形態では、複数の外部プライマー及び対応する内部プライマーは、鋳型核酸の1つの鎖に特異的にアニールし、かつ複数の外部プライマー及び対応する内部プライマーは、鋳型核酸の相補的鎖に特異的にアニールする。
本明細書に記載の方法は各種の核酸試料に使用可能である。いくつかの実施形態では、核酸試料はゲノムDNA又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はRNAを含み、例えばmRNA、miRNA、lincRNA、rRNAなど又はそれらの断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はcDNA又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はゲノムDNAとRNAとの混合物を含む。いくつかの実施形態では、核酸試料はゲノムDNAとcDNAとの混合物を含む。
本明細書に記載の方法により様々な関心対象の遺伝子座を研究することができる。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、配列変異体(染色体再編成、単一ヌクレオチド変異(SNV)、挿入または欠失、スプライス変異、コピー数多型(CNV)及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない)に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は、染色体再編成(例えば染色体融合又は遺伝子融合)に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は染色体転座に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は単一ヌクレオチド変異(SNV)に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は挿入変異又は欠失変異(総称して「挿入または欠失」変異と呼ばれる)に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座は置換変異に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座はコピー数多型に関連する。いくつかの実施形態では、関心対象の遺伝子座はスプライス変異に関連している。関心対象の遺伝子座は任意の長さであってもよく、例えば少なくとも1、2、5、10、20、50、100、200、300、400、500、1000、2000のうちのいずれか又はより少ないbpであってもよい。
本願はさらに、上述のいずれかの1つの標的富化方法によって標的ヌクレオチド配列のアンプリコンをシークエンシングすることにより、核酸試料中の1つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定する方法を提供する。
本願はさらに、本明細書に記載の標的ヌクレオチド配列の決定方法のいずれかにより核酸試料中に1つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定し、かつ標的ヌクレオチド配列中の配列変異体を検出することを含む、核酸テンプレートを含む核酸試料中の関心対象の遺伝子座での配列変異体を検出する方法をさらに含む。
上記方法は、臨床診断及び予後並びに遺伝子操作ためのツールを含む複数種の応用に利用し得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて、個体由来の核酸試料中の関心対象の遺伝子座における疾患に関連する配列変異体を検出することにより、疾患についての診断を提供する、個体の疾患(例えば遺伝性疾患又はがん)を診断する方法を提供する。
本願はさらに、1つないしそれ以上の関心対象の遺伝子座を有するヌクレオチド配列を補強及び決定するための組成物、キット及び製品、或いは本明細書に記載の各種の応用を提供する。前記組成物、キット及び製品は、本明細書に記載のユニバーサルアダプター、ネストされた標的特異的プライマー、ユニバーサルアダプタープライマー、シークエンシングアダプタープライマー及びシークエンシングプライマーのうちのいずれか1種又は複数種を含みうる。
以下の実施例は、本発明について例示するのみのためであり、本発明をいかなる形でも限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例及び詳しい記載は、本発明を限定するものではなく、説明するためのものである。
当該実施例は、がん関連配列変異体を検出する例示的な方法を示している。8つのユニバーサルアダプターの各々は、多重シークエンシングライブラリーの作製のための試料バーコードを有する。各核酸試料から、遺伝子座を合計246個有する標的配列を富化する。開始インプットヒトDNA試料の2つの異なる量、つまり5ngと50ngを使用する。KAPA酵素を例として説明する。図1は当該方法を示す模式図である。
表2に示される1つの上鎖オリゴヌクレオチド(TOP−Oligo、第1の鎖)と1つの下鎖オリゴヌクレオチド(BOT−Oligo、第2の鎖)をアニールして各ユニバーサルアダプターを調製する。また、表2には、ユニバーサルアダプタープライマー、シークエンシングプライマー、及び、TP53遺伝子における複数の関心対象の遺伝子座に対する外部プライマー及び内部プライマーの例示的なプールが示されている。
1)断片化:氷上で、断片化緩衝液(10X)2.5μL、断片化酵素(Frag Enzyme)(KAPA Bio)5.0μL、及びDNA試料を混合することによって断片化したマスターミックスを調製し、かつヌクレアーゼフリー水を用いてマスターミックスを17.5μLにした。反応物を37℃で15分間インキュベートした。4℃で温度保持した。
2)末端修復及びA−テーリング:氷上で、末端修復及びA−テーリング緩衝液3.5μL、末端修復及びA−テーリング酵素混合物1.5μLを混合することによってマスターミックスを調製した。このマスターミックス5.0μLを上記断片化した反応物中に加え、穏やかにボルテックスして短時間遠心分離した。直ちに反応物をサーマルサイクラーに戻し、37℃で15分間、65℃で15分間インキュベーションし、次に4℃で温度保持して末端修復及びA−テーリングを行い、直ちに次のステップに入る。
3)アダプターライゲーション:氷上で、結合緩衝液15.0μLと、DNAリガーゼ5.0μLを混合することによってマスターミックスを調製した。10μMユニバーサルアダプター(試料バーコード付)5.0μLを上記末端修復及びA−テーリング反応物に加え、ピペッティングを5回行って穏やかに混合し、次いでマスターミックス20.0μLを上記ステップ2)由来の各反応物に添加し、穏やかにボルテックスして短時間遠心分離し、次に16℃で30分間、30℃で30分間インキュベーションし、かつ12℃で温度保持した。
4)ライゲーション後のクリーンアップ(PCR前領域に行う):1.5容量(すなわち82.5μL)のAMPURE(R)ビーズを製造業者のプロトコルに従って使用してライゲーション反応をクリーンアップし、これを最終20μLの1X Tris−緩衝液中で溶出させた。ビーズを次のステップ(プライマー伸長)に移す。
ヌクレアーゼフリー水4.4μL、Taqポリメラーゼ緩衝液(10X、マグネシウムフリー、ThermoFisher)3.0μL、dNTP混合物(10mM)0.6μL、Mg2+(50mM)1.2μL、PLATINUM(TM) Taqポリメラーゼ(5U/μL)0.3μL、及び外部プライマープール(50μM)0.5μLを混合することによって、プライマー伸長マスターミックスを調製した。ライゲーション後のクリーンアップ試料20.0μLをプライマー伸長マスターミックス30.0μLに加えた。得られた混合物をサーマルサイクラー中でインキュベートし、95℃で5分間保持し、[+0.2℃/秒の速度で95℃までに昇温、95℃で10秒間保持、−0.2℃/秒の速度で60℃までに降温、60℃で10分間保持]を20サイクル行い、そして、4℃で温度保持するというプロセスでプライマー伸長反応を行った。
ヌクレアーゼフリー水1.9μL、Taqポリメラーゼ緩衝液(10X、マグネシウムフリー、ThermoFisher)3.0μL、dNTP混合物(10mM)0.6μL、Mg2+(50mM)1.2μL、PLATINUM(TM) Taqポリメラーゼ(5U/μL)0.3μL、P5プライマー(10μM)1.0μL、及び内部プライマープール(50μM)1.0μLを混合することによって、PCRマスターミックスを調製した。プライマー伸長後のクリーンアップ試料20.0μLをPCRマスターミックス9.0μL中に加え、かつ各試料中に、1.0μLの各対応するI7プライマー(バーコード付、10μM)を添加した。得られた混合物をサーマルサイクラー中でインキュベートし、95℃で5分間保持し、[95℃で30秒、60℃で5分間]を15サイクル行い、そして、4℃で温度保持する、というプロセスでポリメラーゼ連鎖反応を行った。
クリーンアップしたPCR産物をKAPA qPCRキットにより定量化し、かつ標準プロトコルに従って Illuminaシークエンシングシステムによりシークエンシングを行った。
bcl2fqパッケージを用いて、BCLフォーマットのシークエンシングデータをFASTQフォーマットに変換し、I7バーコードを用いて試料の逆多重化を行った。カスタムスクリプトを用いて、初期処理されたFASTQファイルを、リード1に統合されたアダプターバーコードに基づいてさらに逆多重化し、次いでアダプター配列を切断した。BWA−MEMを用いて、二重逆多重化されたFASTQファイルをヒトゲノム(hg19)にマッピングした。分子バーコード配列に基づいて、同じ核酸テンプレートに由来する増幅産物配列を同定してプールした。BEDtools、ターゲットBEDファイル及びカスタムスクリプトを用いてシークエンシング仕様を計算した。ユニーク分子インデックスを認識し得るスクリプトを用いてSNV及び挿入または欠失(Indel)を呼び出すことにより、変異体を呼び出した。
図4(a)〜図4(b)は、IGVソフトウェアに由来するマッピングされたリードを示す図であり、EGFR遺伝子内に関心対象の遺伝子座を有するリード集積を示している。図4(a)は図S5の複製であり、Zheng Z. et al. Nature Medicine 20: 1479−1484 (2014)の記載に基づいて、使用名が「固定多重PCR」又は「AMP」の方法の結果を示している。AMP法においてインプットDNAを5ng使用する場合、マッピングされたリードは関心対象の遺伝子座の周りにブロック状のリード集積を有することから、少量のインプットDNAを使用する場合にライブラリーの複雑さが低くなり、ライブラリー構築効率が低下することが分かった。
本実施例は、1つのシークエンシング反応においてRNAとgDNAに由来する配列変異体を検出することを説明する。
簡単に言えば、まずFORMAPURE(R) FFPEキットを用いてFFPE試料からRNAを抽出した。QUBIT(R) RNAキットを用いてRNA濃度を測定した。合計約15ngの全核酸(10ngの抽出したRNA及び 5ngのgDNAを含む)を次のステップに供する。
1)RNA変性: PCRチューブ内に各RNA試料が11.0μLになるようにDEPC処理された水を用いて調整し、次にランダム六量体(300ng/μL)1.0μL及びdNTP(10mM)1.0μLを添加した。ピペッティングを5回行って混合物を混合し、かつ65℃で5分間インキュベートする(103℃で熱蓋(heat lid)を「on」にする)ことによりRNA変性を行った。インキュベートした後、直ちに試料プレートを氷水上で少なくとも1分間冷却し、短時間遠心分離し、氷上に戻した。
2)逆転写(第1の鎖cDNAの合成):SUPERSCRIPT(R) IV緩衝液(5X, ThermoFisher)5.0μL、RNASEOUT(R)1.0μL、SUPERSCRIPT(R) IV(ThermoFisher)1.0μL、及びDTT(新鮮で0.1M)2.0μLを混合することによって、マスターミックスを調製した。マスターミックス9.0μLをPCRプレートにおける反応物の各々に加え、ピペッティングを5回行って十分に混合した。PCRプレートをサーマルサイクラー中でインキュベートし、25℃で10分間、42℃で30分間、70℃で15分間、4℃で温度保持する(103℃で熱蓋を「on」にする)というプロセスで逆転写を行った。
3)第2の鎖cDNAの合成:DEPC処理された水18.0μL、10x第2の鎖反応緩衝液5.0μL、DNAポリメラーゼI 4.0μL、及びRNase H 1.0μLを混合することによって、マスターミックスを調製した。スターミックス28μLを以上のステップに由来する各反応物に加え、ピペッティングを5回行って穏やかに混合した。混合の反応温度を16℃以下に制御した。反応混合物を16℃で2時間インキュベートし、次に4℃に温度保持した(熱蓋を「off」にした)。
本実施例は、標的富化1(つまり実施例1のステップ2)における指数的増幅(つまりAMP法)と線形的増幅(つまり本願の例示的な方法)、プライマー伸長サイクルの間の高速温度勾配モードと低速温度勾配モード、及び、異なる開始量のDNA試料を含む種々の標的富化方法を対比する。
Claims (68)
- 標的ヌクレオチド配列を含有する核酸テンプレートを含む核酸試料から、関心対象の遺伝子座を有する前記標的ヌクレオチド配列を富化する方法であって、
(a)第1の末端に二本鎖部分を有し、第2の末端に非二本鎖部分を有するオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターを、前記第1の末端によって前記核酸テンプレートにライゲートすることにより、ライゲートされた核酸を提供するステップと、
(b)前記ライゲートされた核酸を、前記標的ヌクレオチド配列を含む第1の鎖、及び第2の鎖に解離させるステップと、
(c)外部プライマーは、前記ライゲートされた核酸の第1の鎖中の前記標的ヌクレオチド配列の近傍にアニールするステップと、
(d)DNAポリメラーゼを用いて、前記外部プライマーを、前記ライゲートされた核酸の第1鎖の全長にわたって伸長させることにより、新生プライマー伸長二本鎖を提供するステップと、
(e)十分に高い温度で前記新生プライマー伸長二本鎖を、前記ライゲートされた核酸の第1の鎖と一本鎖プライマー伸長生成物に解離させるステップと、
(f)ステップ(c)〜(e)を繰り返して1つないしそれ以上のプライマー伸長サイクルを行うステップと、
(g)前記標的ヌクレオチド配列のPCR増幅に十分な条件下で、前記一本鎖プライマー伸長生成物をDNAポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー及び内部プライマーに接触させるステップであって、前記ユニバーサルアダプタープライマーは、前記一本鎖プライマー伸長生成物における前記ユニバーサルアダプターの前記非二本鎖部分の相補的配列にアニールし、前記内部プライマーは、3'末端において、前記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ、前記関心対象の遺伝子座について、前記内部プライマーは前記外部プライマーに対してネストされたものであるステップと、
(h)ステップ(g)を繰り返して1つないしそれ以上のPCR増幅サイクルを行って、前記標的ヌクレオチド配列のアンプリコンを提供することにより、前記標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、
を含む方法。 - 前記標的ヌクレオチド配列の前記アンプリコンは、次世代シークエンシング(NGS)に使用される、請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、前記ライゲートされた核酸の第1の鎖に特異的にアニール可能な第1組の外部プライマー及び第1組の内部プライマーと、前記ライゲートされた核酸の第2の鎖に特異的にアニール可能な第2組の外部プライマー及び第2組の内部プライマーとを用いて、前記関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を富化することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記第1組の外部プライマー及び前記第2組の外部プライマーは、少なくとも約13ヌクレオチド長の第1の5'タグ配列を含み、かつ、前記第1組の内部プライマー及び前記第2組の内部プライマーは、少なくとも約13ヌクレオチド長の第2の5'タグ配列を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記第1の5'タグ配列のGC含有量は、前記核酸テンプレートのGC含有量と実質的に類似している、請求項4に記載の方法。
- 前記方法は、複数組の外部プライマー及び内部プライマーを用いて、異なる関心対象の遺伝子座を有する複数の標的ヌクレオチド配列を富化することを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的ヌクレオチド配列中の少なくとも2つは、前記核酸テンプレートの異なる鎖中に存在している、請求項6に記載の方法。
- 前記方法は、異なる関心対象の遺伝子座を約2〜5000個有する複数の標的ヌクレオチド配列を富化することを含む、請求項6または7に記載の方法。
- ステップ(c)〜(e)を約2〜100サイクル繰り返す、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外部プライマーは、前記内部プライマーよりも前記関心対象の遺伝子座から約1〜100ヌクレオチド離れた領域にアニールする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記外部プライマー及び/又は前記内部プライマーの少なくとも最後の12のヌクレオチドは、前記核酸試料中に異なるアニーリング遺伝子座を約20個未満有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸テンプレートはゲノムDNAである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAは染色体DNAである、請求項12に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAはミトコンドリアDNA又はその他の染色体外DNAである、請求項12に記載の方法。
- 前記核酸テンプレートはエクソームDNAである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸テンプレートはcDNAである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記cDNAは全RNAの逆転写によって得られるものである、請求項16に記載の方法。
- 前記cDNAは、mRNA、miRNA又はその他の非コードRNAの逆転写によって得られるものである、請求項16に記載の方法。
- 前記核酸試料はゲノムDNA及びcDNAの両方を含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸テンプレートは無細胞DNAである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸試料は血液試料に由来する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸試料は細胞又は組織試料に由来する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸試料は腫瘍生検試料に由来する、請求項22に記載の方法。
- 前記核酸試料はホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料に由来する、請求項22または23に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子座は染色体再編成に関連する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記染色体再編成は染色体転座である、請求項25に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子座は単一ヌクレオチド変異(SNV)に関連する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子座は挿入または欠失に関連する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子座はスプライス変異に関連する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子座はがんに関わる遺伝子中にある、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子座は免疫細胞受容体をコードする遺伝子中にある、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子座は遺伝性疾患に関わる遺伝子中にある、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記関心対象の遺伝子座はCRISPR遺伝子編集のオフターゲット部位にある、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記核酸テンプレートは前記次世代シークエンシングに適したサイズに断片化される、請求項2〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、ステップ(a)の前に前記核酸テンプレートに対して末端修復およびA−テーリングを行うことをさらに含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ユニバーサルアダプターの前記非二本鎖部分は、ブロッキング部分を有する3'末端を含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ブロッキング部分は逆位ヌクレオチドである、請求項36に記載の方法。
- 前記ブロッキング部分は、1つ又は複数のホスホロチオエート修飾を有するフラッピング状のヌクレオチドフラグメントである、請求項36に記載の方法。
- 前記ユニバーサルアダプターの前記非二本鎖部分は、縮重設計された核酸塩基を含有する分子バーコードを含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ユニバーサルアダプターの前記二本鎖部分は試料バーコードを含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料バーコードは前記ユニバーサルアダプターの第1の末端にある、請求項39または40に記載の方法。
- 前記試料バーコードは約4〜13のヌクレオチドからなる、請求項41に記載の方法。
- 前記ユニバーサルアダプターの第1の末端には、ステップ(b)〜(f)の間に残存ユニバーサルアダプターによる無差別プライミングを防止するために、十分に短い長さの一定の核酸塩基を含む、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記十分に高い温度は少なくとも約90℃である、請求項1〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ライゲートされた核酸はステップ(b)の前にクリーンアップ工程に供される、請求項1〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマー伸長生成物はステップ(g)の前にクリーンアップ工程に供される、請求項1〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(g)を約2〜100サイクル繰り返す、請求項1〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ユニバーサルアダプタープライマーの5'末端又は前記ユニバーサルアダプターは、前記NGSに用いられる第1のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む、請求項2〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップ(g)は、前記標的ヌクレオチド配列のPCR増幅に十分な条件下で、前記一本鎖プライマー伸長生成物をDNAポリメラーゼ、ユニバーサルアダプタープライマー、内部プライマー及びシークエンシングアダプタープライマーに接触させることを含み、前記シークエンシングアダプタープライマーは、3'末端において、前記標的ヌクレオチド配列に特異的にアニールする配列を含み、かつ、5'末端において、前記NGSに用いられる第2のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む、請求項48に記載の方法。
- 核酸試料中に関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を決定する方法であって、前記核酸試料は核酸テンプレートを含み、前記核酸テンプレートは前記標的ヌクレオチド配列を含み、前記方法は、
(i)請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法により前記関心対象の遺伝子座を有する前記標的ヌクレオチド配列を富化するステップと、
(ii)前記標的ヌクレオチド配列の前記アンプリコンに対して次世代シークエンシングを行うことにより、前記標的ヌクレオチド配列を提供するステップと、を含む方法。 - 約2〜5000個の異なる関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列が同時に決定される、請求項50に記載の方法。
- 前記方法は、ステップ(ii)の前記次世代シークエンシングの前に、前記標的ヌクレオチド配列の前記アンプリコンを用いてシークエンシングライブラリーを作製することをさらに含む、請求項1〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸試料中の関心対象の遺伝子座における配列変異体を検出する方法であって、前記核酸試料は核酸テンプレートを含み、前記核酸テンプレートは前記関心対象の遺伝子座を有する標的ヌクレオチド配列を含み、前記方法は、
(1)請求項50〜52のいずれか一項に記載の方法により前記関心対象の遺伝子座を有する前記標的配列を決定するステップと、
(2)前記標的ヌクレオチド配列中の前記配列変異体を検出するステップと、を含む方法。 - 前記配列変異体は約1:100を超えない対立遺伝子頻度で存在している、請求項53に記載の方法。
- 前記配列変異体は生殖細胞系DNAの中で遺伝している、請求項54または55に記載の方法。
- 前記配列変異体は体細胞突然変異又は染色体再編成である、請求項54または55に記載の方法。
- 複数種の配列変異体が検出される、請求項53〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数種の配列変異体は、染色体再編成、スプライス変異、SNP、欠失、挿入、コピー数多型(CNV)、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項57に記載の方法。
- 前記方法は、cDNA配列に基づく染色体再編成又はCNVと、gDNA配列に基づく突然変異とを同時に検出する、請求項53〜58のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項53〜58のいずれか一項に記載の方法を用いて、個体由来の核酸試料中の関心対象の遺伝子座における疾患に関連する配列変異体を検出することにより、前記疾患の診断を提供することを含む、個体の疾患を診断する方法。
- (a)第1の末端にライゲート可能な二本鎖部分を含み、第2の末端に非二本鎖部分を含むオリゴヌクレオチドであるユニバーサルアダプターと、
(b)前記ユニバーサルアダプターの前記非二本鎖部分の相補的配列にアニール可能なユニバーサルアダプタープライマーと、
(c)外部プライマーと、
(d)内部プライマーと、を含み、
関心対象の遺伝子座について、前記内部プライマーが前記外部プライマーに対してネストされたものである、キット。 - 前記ユニバーサルアダプター又は前記ユニバーサルアダプタープライマーの5'末端に、NGSプラットフォームと適合する第1のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む、請求項60に記載のキット。
- 前記内部プライマーは、前記NGSプラットフォームと適合する第2のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含む、請求項62に記載のキット。
- 3'末端に前記内部プライマーの配列と同一の配列を含み、5'末端に前記NGSプラットフォームと適合する第2のシークエンシングプライマーの配列と同一の又は相補的な配列を含むシークエンシングアダプタープライマーをさらに含む、請求項62に記載のキット。
- 複数組の外部プライマー及び内部プライマーを含む、請求項61〜64のいずれか一項に記載のキット。
- がんの診断に用いられる、請求項61〜65のいずれか一項に記載のキット。
- 前記がんは肺がん、乳がん又は大腸がんである、請求項66に記載のキット。
- 前記関心対象の遺伝子座は、ALK、BRAF、EGFR、ERBB2、HRAS、KDR、KIT、KRAS、MET、NRAS、NTRK1、PDGFRA、PIK3CA、PTEN、RET、ROS1及びTP53から選ばれる遺伝子のうちのいずれか1つ又は複数にある、請求項61〜67に記載のキット。
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