JPWO2006093104A1 - アルコール飲料の香味を制御する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法を提供し、同定された遺伝子の発現を制御することにより望ましい香味を備えるアルコール飲料の製造を可能とすることを目的とする。上記目的を達成するために、ＤＮＡアレイ又はＤＮＡアレイと二次元電気泳動による遺伝子解析手段を用いた醸造用酵母の遺伝子を同定する方法、同定された遺伝子が結合したＤＮＡアレイ、当該ＤＮＡアレイを利用した醸造用酵母の選抜方法を提供する。

Description

本発明は、アルコール飲料の香味を制御する方法に関するものであり、特に、醸造用酵母の遺伝子を同定する方法、ＤＮＡアレイ、醸造用酵母の選抜方法、アルコール飲料の製造方法及びアルコール飲料に関する。

酵母を使用して得られる発酵飲食品において、香味はその品質を位置付ける重要な因子である。例えば、アルコール飲料（ビール、ワイン、清酒など）、発酵調味料（味噌、醤油、酢など）及びパンは、使用される酵母の香気成分（エステル類、アルコール類など）によりその特性が決定される側面がある。

ビール酵母などの有用な醸造酵母を選抜する方法としては、これまではビール醸造所で用いられている優良なビール酵母を選択するという方法が伝統的に行われてきた。この方法では、酵母細胞集団の中から多数の単一細胞を取得した後に発酵試験を行い、ガスクロマトグラフィーによる香気成分の分析や官能検査などを行うことにより、優良な酵母を選択する必要があったため、多くの手間と時間がかかっていた。

最近では、遺伝子工学的な手法を用いて、目的とする遺伝子を醸造用遺伝子に導入・発現させることが可能であり、遺伝子の機能解析や解析された遺伝子を利用することにより、望ましい形質を備える酵母を育種することが可能である。

例えば、ビール酵母や清酒酵母のエステル合成に関する遺伝子を操作した酵母株として以下のものが作製されている：酢酸イソアミル生成酵素の構造遺伝子（ＡＴＦ１）の高発現により酢酸イソアミル生産を増大させた株（特許文献１）；分岐鎖アミノ酸のアミノ基転移酵素の構造遺伝子の発現を制御（阻止又は高発現）することにより、イソアミルアルコール、イソブタノール及び酢酸イソアミルの生産量を改変させた株（特許文献２）；酢酸エステルを分解するエステラーゼ遺伝子を破壊することにより、酢酸イソアミル生産量を増大させた株（特許文献３）。

特開平６−０６２８４９号公報 特開平１１−２３５１７６号公報 特開平９−２３４０７７号公報

しかしながら、既に全ゲノム塩基配列が知られているパン酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と比べて、下面発酵酵母では全ゲノム塩基配列が公開されておらず、下面発酵酵母の醸造特性に関する遺伝子及びビール醸造におけるそれらの遺伝子の働きについての知見は非常に少ない。また、ある特定の遺伝子の発現レベルの差異にのみ着目して醸造用酵母を育種しても、その遺伝子が望ましい形質を表現するには、複数の遺伝子の発現を網羅的に解析し、他の要因で変動する遺伝子ではないことを調べておく必要があり、従来の手法では多検体における複数遺伝子の発現を同時に調べることは困難であった。更に、醸造アルコールの香味に関連する遺伝子が見出された場合であっても、ｍＲＮＡの発現量のみが変化してタンパク質の発現量が変化しない遺伝子を排除し、ｍＲＮＡの転写レベルとタンパク質の翻訳レベルで正の相関関係を持って香味を制御する遺伝子を同定することは困難であった。

そこで、本発明は、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法を提供し、醸造特性に関する遺伝子の情報が不明であっても、アルコール飲料の香味を制御することにより、望ましい香味を備えるアルコール飲料の製造を可能とすることを目的とする。また、本発明は、望ましい香味を備える醸造用酵母を選抜する方法及びこれに用いるＤＮＡアレイを提供することも目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、（ａ）２種類の醸造用酵母を用いて同一の発酵条件で発酵させることにより、又は同一種類の酵母を用いて２種類の発酵条件で発酵させることにより、香味に差がある２種類のアルコール飲料を製造するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）における発酵途中の醸造用酵母から、それぞれトータルＲＮＡを抽出するステップと、（ｃ）上記トータルＲＮＡから２種のｃＤＮＡ又は２種のｍＲＮＡを調製し、一方の種のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを第１の蛍光色素で、他方の種のｃＤＮＡ又はｍＲＮＡを第２の蛍光色素で標識して２種の標識ｃＤＮＡ又は２種の標識ｍＲＮＡを得るステップと、（ｄ）基板上の複数のスポットに、上記醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイ上で、上記２種の標識ｃＤＮＡ又は２種の標識ｍＲＮＡを競合ハイブリダイズさせるステップと、（ｅ）上記スポットのそれぞれにおいて、上記第１及び第２の蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、（ｆ）上記第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、上記第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、（ｇ）蛍光の強度に差の見られたスポットに結合しているプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列を解析するステップと、を備える方法を提供する。

すなわち、本発明は、アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、比較対照となる１対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、この１対の発酵途中醸造用酵母を比較して、ｍＲＮＡの発現量に差のある遺伝子（Ｇ１）を同定するステップと、を含む、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、Ｇ１の同定は、（１）この１対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータルＲＮＡを抽出するステップと、（２）一方のトータルＲＮＡから第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得、他方のトータルＲＮＡから第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップと、（３）基板上の複数のスポットに、醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイ上で、第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ、又は、第１の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ、を競合ハイブリダイズさせるステップと、（４）このスポットのそれぞれにおいて、第１の蛍光色素が発する蛍光と、第２の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（５）第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、（６）蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列からＧ１を同定するステップと、を備える方法により実施される方法を提供する。

この遺伝子同定方法であれば、酵母の種類又は発酵条件を変えた発酵途中の酵母の遺伝子の発現状態を比較し、差異が見られた遺伝子のみを解析するため、あらかじめ酵母の全ゲノム塩基配列の情報を取得しておく必要がない。そして、この方法によれば、香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定でき、その情報に基づいてアルコール飲料の香味を制御することが可能となる。

また、本発明は、アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、１対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、この１対の発酵途中醸造用酵母を比較して、ｍＲＮＡの発現量に差のある遺伝子（Ｇ１）とタンパク質の発現量に差のある遺伝子（Ｇ２）とを同定するステップと、同定したＧ１とＧ２のうち共通の遺伝子を選択するステップと、を含む、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、Ｇ１の同定は、（１）この１対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータルＲＮＡを抽出するステップと、（２）一方のトータルＲＮＡから第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得、他方のトータルＲＮＡから第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップと、（３）基板上の複数のスポットに、醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイ上で、第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ、又は、第１の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ、を競合ハイブリダイズさせるステップと、（４）このスポットのそれぞれにおいて、第１の蛍光色素が発する蛍光と、第２の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（５）第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、（６）蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列からＧ１を同定するステップと、を備える方法により実施され、Ｇ２の同定は、（ｉ）この１対の発酵途中醸造用酵母の双方から粗タンパク質を抽出するステップと、（ｉｉ）一方の粗タンパク質から第３の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得、他方の粗タンパク質から第４の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得るステップと、（ｉｉｉ）第３の蛍光色素で標識した粗タンパク質と第４の蛍光色素で標識した粗タンパク質とを混合した混合物を、二次元電気泳動で分画するステップと、（ｉｖ）分画したタンパク質に結合する第３の蛍光色素が発する蛍光と、第４の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（ｖ）第３の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第４の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、（ｖｉ）蛍光の強度に差のあるタンパク質を解析して、このタンパク質をコードするＧ２を同定するステップと、を備える方法により実施される方法を提供する。

この遺伝子同定方法であれば、ｍＲＮＡの発現量のみが変化してタンパク質の発現量が変化しない遺伝子を排除し、ｍＲＮＡの転写レベルとタンパク質の翻訳レベルで正の相関関係を持って香味を制御する遺伝子を同定できる。ｍＲＮＡの発現量とタンパク質の発現量に正の相関関係のある遺伝子は、単一の遺伝子のみを人為的に制御することで、醸造用酵母細胞の形質を変えることが可能となる。このため、香味に関連するタンパク質をコードする遺伝子を同定した後には、容易かつ効率的にアルコール飲料の香味を制御できる。

ステップ（３）において、ＤＮＡアレイを構成するプラスミドに含まれる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片としては、ビール醸造において最も広く用いられる下面ビール酵母由来のものが好適である。

上記ＤＮＡアレイは、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子（以下、場合により、「既知遺伝子」という。）が結合した他のスポットが更に存在することが好ましい。

このようなＤＮＡアレイを用いれば、既知遺伝子が結合したスポットと類似又は同調する蛍光強度のパターン（蛍光色素の蛍光強度の比率）を示したスポットのゲノムＤＮＡ断片の配列を解析することによって、そのＤＮＡ断片に含まれる遺伝子を同定し、その機能を推定することが可能になる。例えば、醸造上重要な既知遺伝子と機能的に類似し、一方でその既知遺伝子と塩基配列が異なる遺伝子がゲノムＤＮＡ中に存在する場合、蛍光強度のパターン、すなわち２種の酵母間における遺伝子発現状態の差が上記既知遺伝子と類似又は同調しているゲノムＤＮＡ断片の配列を解析することにより、上記遺伝子を同定できる。すなわち、醸造上重要な既知遺伝子と発酵中の発現パターンが同調しており機能的に類似しているが、遺伝子配列やアミノ酸配列が異なる既知又は新規の遺伝子を見出すことができる。

上記構成のＤＮＡアレイではまた、既知遺伝子が醸造用酵母の種類又は状態に関わらず構成的に発現しているものである場合に、既知遺伝子のスポットにおける蛍光強度を指標として、その周辺（例えば、そのスポットが含まれるブロック内）のスポットにおけるハイブリダイゼーション実験の良否を容易に判定できる。

既知遺伝子が結合した他のスポットが更に存在するＤＮＡアレイとしては、醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合した複数のスポットと、既知遺伝子が結合したスポットとから構成されるブロックが、基板上に複数配列しているタイプが使用に適している。このようなタイプのＤＮＡアレイを用いれば、ブロックごとに、既知遺伝子を指標として、ゲノムＤＮＡ断片中の遺伝子の機能を推定し、又はハイブリダイゼーション実験の良否を判定することが可能になる。上記のようなタイプの中でも、ブロックが等しい形状を有しており、それぞれのブロックの同じ位置に、既知遺伝子が結合したスポットが存在するタイプは、プラスミド又は既知遺伝子が結合したスポットの位置が判別しやすく、特に好適である。

本発明はまた、上記方法により同定されたアルコール飲料の香味に関与する遺伝子が基板上の複数のスポットに結合したＤＮＡアレイを提供する。このＤＮＡアレイを用いることにより、香味基準の醸造用酵母を選抜することが可能である。すなわち、本発明は、香味基準の醸造用酵母の選抜方法であって、（ａ）発酵途中の醸造用酵母から、トータルＲＮＡを抽出するステップと、（ｂ）上記トータルＲＮＡから蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップと、（ｃ）上記のＤＮＡアレイ上で、蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをハイブリダイズさせるステップと、（ｄ）上記ＤＮＡアレイのスポットのそれぞれにおいて、蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、（ｅ）各スポットにおける蛍光色素の蛍光の強度に基づいて、発酵途中の醸造用酵母の遺伝子の発現状態を評価するステップと、を備える方法を提供する。この方法によれば、例えば（ｅ）ステップにおいて、香味に関与する遺伝子が存在するスポットで蛍光の強度が高い醸造用酵母を選別することで、好ましい香味を備えるアルコール飲料の製造に適した酵母を選抜することが可能である。

本発明は更に、上記の酵母の選抜方法で選抜された醸造用酵母を使用するアルコール飲料の製造方法及びその方法で製造されたアルコール飲料をも提供する。

本発明によれば、香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定でき、その情報に基づいて望ましい醸造特性を備える酵母を選抜することが可能であり、したがって、望ましい香味を備えるアルコール飲料の製造が可能となる。

第１実施形態に係るＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。 第２実施形態に係るＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。 実施例１で作製したＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。 実施例１で作製したＤＮＡアレイのブロックの一つを拡大して模式的に示した平面図である。 浮遊酵母数の経時変化を示すグラフである。 抽出したトータルＲＮＡの純度をバイオアナライザーで分析した結果を示すチャートである。 ＤＮＡアレイの短辺方向の最端の一列を構成する４ブロックについて検出された蛍光を示す写真に対応する図である。 ＤＮＡアレイ上の蛍光パターンに基づいて行ったクラスタリングの結果を示す図である。 サッカロミセス・セレビシエのゲノムＤＮＡ中におけるＳＢｃ３３Ｐ17の領域の位置を示す図である。 二次元電気泳動で分画したタンパク質のスポットのうち、メチオニンの添加でダウンレギュレートしたタンパク質のスポットを示す図である。

符号の説明

１…基板、２…プラスミド、３…既知遺伝子、４…ブロック、１０…ＤＮＡアレイ、２０…ＤＮＡアレイ、３０…ＤＮＡアレイ。

（アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法）
本発明の第１実施形態に係る、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法は、アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、比較対照となる1対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、この1対の発酵途中醸造用酵母を比較して、ｍＲＮＡの発現量に差のある遺伝子（Ｇ１）を同定するステップとを備える。

アルコール飲料の香味に影響を与える発酵条件としては、培地、培地への通気量、発酵温度、発酵時間等が挙げられ、これらを変化させることにより、香味に差があるアルコール飲料を製造できる。香味の差は、完成したビールをパネリストが試飲し評価できる。香味の差は、例えば、芳香性、果実臭、穀物臭、ダイアセチル、酸味、甘味、塩味、苦味、口当たりなどの差である。

Ｇ１の同定は、（１）１対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータルＲＮＡを抽出するステップと、（２）一方のトータルＲＮＡから第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得（以下、蛍光色素で標識したｃＤＮＡを「標識ｃＤＮＡ」、蛍光色素で標識したｃＲＮＡを「標識ｃＲＮＡ」と呼ぶことがある）、他方のトータルＲＮＡから第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップと、（３）基板上の複数のスポットに、醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイ上で、第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ、又は、第１の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ、を競合ハイブリダイズさせるステップと、（４）このスポットのそれぞれにおいて、第１の蛍光色素が発する蛍光と、第２の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（５）第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、（６）蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列からＧ１を同定するステップとを備える方法により実施される。

ステップ（１）におけるトータルＲＮＡの抽出は、例えば、ホットフェノール法（加温したフェノールとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で酵母を溶解しながらＲＮＡを抽出する方法）に従って行うことができるが、分解度の低い高純度ＲＮＡを得るために、酵母株を液体窒素で凍結した後、磨砕機で磨砕し、ＲＮＡ抽出試薬でＲＮＡを抽出する方法で行うのが好ましい。ここで、磨砕機としてはクライオプレス（マイクロテック・ニチオン社製）が、ＲＮＡ抽出試薬としてはＩｓｏｇｅｎ^ＴＭ（ニッポンジーン社製）が挙げられる。

ステップ（２）における標識ｃＤＮＡ又は標識ｃＲＮＡは、例えば、標識ｃＤＮＡは、上記の醸造用酵母から抽出したトータルＲＮＡにオリゴｄＴプライマーをアニールさせた後、蛍光色素が結合したｄＮＴＰの存在下で逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、未反応の基質をスピンカラムで取り除くことにより調製できる。その際、オリゴｄＴカラムを用いて、トータルＲＮＡからポリＡ^＋ＲＮＡを単離精製し、逆転写反応を行ってもよい。

また、標識ｃＲＮＡは、上記のトータルＲＮＡ又はポリＡ^＋ＲＮＡにＴ７プロモーターの配列が付いたオリゴｄＴプライマーを用いて、逆転写反応で未標識のｃＤＮＡを合成し、蛍光色素が結合したＮＴＰの存在下で、このｃＤＮＡにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを反応させてｃＲＮＡを合成し、未反応の基質をスピンカラムで取り除くことにより調製できる。

ここで、標識ｃＤＮＡ又は標識ｃＲＮＡを得るために用いる標識は、Cyanine色素が好ましく、醸造用酵母の種類又は発酵条件ごとに色（蛍光波長）を明確に区別するには、第１の蛍光色素及び第２の蛍光色素の一方はＣｙ３（緑色色素）、他方はＣｙ５（赤色色素）であるのがより好ましい。

ステップ（３）で用いるＤＮＡアレイについて以下説明する。

図１は、第１実施形態に係るＤＮＡアレイを示す平面図である。第１実施形態に係るＤＮＡアレイ１０は、基板１と、基板１上の複数のスポットに結合したプラスミド２とから構成されている。ＤＮＡアレイ１０では、プラスミド２が結合した複数のスポットが基板１上に格子状に配列している。

図２は、第２実施形態に係るＤＮＡアレイを示す平面図である。第２実施形態に係るＤＮＡアレイ２０は、基板１と、基板１上の複数のスポットに結合したプラスミド２と、基板１上の他のスポットに結合した、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子３とから構成されている。ＤＮＡアレイ２０では、プラスミド２が結合した複数のスポットと、既知遺伝子３が結合したスポットとから構成されるブロック４が、基板１上に複数配列している。また、複数のブロック４が等しい形状を有しており、それぞれのブロック４の同じ位置に、既知遺伝子３が結合したスポットが存在する。ブロック４は格子状に配列したスポットから構成され、かつ、ブロック４は基板１上に格子状に配列している。

ＤＮＡアレイ１０又は２０を構成する基板１の材料は、プラスミド２を安定して結合させることができるものであればよく、例えば、ガラス及び合成樹脂（ポリカーボネートやその他プラスチック等）が挙げられる。また、基板１の形状としては、板状又はフィルム状が好ましい。

プラスミド２は、醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含んでいる。醸造用酵母としては、下面ビール酵母が好ましく、その中でも更に、ビール醸造において最も広く用いられているサッカロマイセス・パストリアヌス・ヴァイヘンステファン（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ Ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎ）３４／７０が好ましい。

プラスミド２に含まれるゲノムＤＮＡ断片のサイズは、好ましくは１．５〜３．０ｋｂｐである。１．５ｋｂｐより短いと、醸造用酵母のゲノムＤＮＡが網羅されるようにＤＮＡアレイを作製しようとした場合に、必要なゲノムＤＮＡ断片数が多くなり、ＤＮＡアレイの作製コストが高くなる傾向がある。他方、３．０ｋｂｐより長いと、一個のＤＮＡ断片に含まれる遺伝子又はエキソンの数が多くなり、遺伝子発現解析の過程が煩雑になる傾向がある。

ＤＮＡアレイの実質的な冗長度（ＤＮＡアレイ上のゲノムＤＮＡ断片の長さの合計を、ＤＮＡアレイの作製に用いた醸造用酵母のゲノムサイズで除した値）が１．５以上２．０以下のものが好ましい。実質的な冗長度が１．５未満であると、ＤＮＡアレイ上のゲノムＤＮＡ断片が全体としてカバーするゲノム領域が小さくなる傾向があり、実質的な冗長度が２．０を超えると、異なるスポットのゲノムＤＮＡ断片間で重複する領域が大きくなり、遺伝子発現解析が煩雑になる傾向がある。

なお、プラスミド２の代わりに、そのインサートである醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を上記のＤＮＡアレイに直接結合させてもよい。この場合においても、ゲノムＤＮＡ断片のサイズ及び冗長度は、上記したプラスミド２を用いる場合と同じであることが好ましい。

ＤＮＡアレイ２０を構成する既知遺伝子３は、実験者がその目的に応じて選択できる。既知遺伝子３は、サッカロマイセス・セレビシェ由来の遺伝子が好適であり、その配列情報は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ ＤａｔａＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）より入手できる。

ＤＮＡアレイ２０においては、プラスミド２はブロックによって異なっている方がよい。また、既知遺伝子３は、各ブロックの同じ位置に同じ既知遺伝子が結合しているのが好ましい。

各ブロック４に複数種類の既知遺伝子３が存在する場合、少なくとも一種は醸造用酵母の種類又は状態に関わらず構成的に発現しているものであることが好ましい。このような遺伝子がブロックごとに存在していれば、各ブロックにおけるハイブリダイゼーション実験の良否を容易に判定できる。そのような遺伝子として、サッカロマイセス・セレビシェ由来のＡＣＴ１遺伝子が挙げられる。

なお、ＤＮＡアレイ１０又は２０のように、プラスミド又は既知遺伝子が結合した複数のスポットが格子状に配列していれば、スポットの位置を座標で表すことができるので、スポットの位置を特定しやすく、遺伝子発現解析に好都合である。また、ＤＮＡアレイ２０においては、各スポットの同じ位置に同じ既知遺伝子が結合しているのが好ましい。

本発明のＤＮＡアレイの作製は、醸造用酵母のランダムゲノムライブラリーから無作為に選んだプラスミドを基板表面に結合させることにより行う。

醸造用酵母のランダムゲノムライブラリーの作製は下記の操作１）〜６）により行うことができる。各操作は、特に断らない限り、公知の方法に従えばよい。
１）醸造用酵母からゲノムＤＮＡを抽出、精製する。
２）抽出、精製したゲノムＤＮＡを断片化する。ゲノムＤＮＡの断片化は、ランダムなＤＮＡ断片を得るために、ＤＮＡ断片化装置を用いて行うのが好ましい。
３）得られたＤＮＡ断片から、電気泳動により一定のサイズのＤＮＡ断片を回収する。
４）得られたＤＮＡ断片を平滑末端化し、適当なプラスミドベクターに連結する。
５）得られた組換えベクターを適当な宿主細胞に導入する。
６）宿主細胞を適当な培地上で培養し、形質転換細胞を選択する。

プラスミドの基板表面への結合は、例えば、ゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドを溶解した固定液を、表面処理（ポリリジン処理等）を施した基板上にスポッターでスポッティングし、プラスミドを基板表面に固定化する方法を用いることができる。ここで、固定液として、アルカリ性固定液を用いれば、二本鎖プラスミドは固定液中で２個の一本鎖プラスミドに分離される。アルカリ性ではない固定液を用いる場合は、加熱処理等によって二本鎖を一本鎖にすればよい。

また、ステップ（３）における競合ハイブリダイゼーションでは、標識ｃＤＮＡ又は標識ｃＲＮＡをハイブリダイズさせる前に加熱処理等によって変性させる。ハイブリダイゼーションは、例えば、「ＤＮＡアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）に記載の方法に従って行えばよい。

ステップ（４）における蛍光強度の測定は、ＣＣＤカメラやスキャナで画像データを取得し、これをソフトウェアで数値化することにより行うことができる。

ステップ（５）における蛍光強度の比較は、ステップ（４）で測定された第１及び第２の蛍光色素の蛍光強度の比を求めることにより行うことができる。

ステップ（６）におけるＤＮＡ断片の配列解析では、ゲノムＤＮＡ断片の塩基配列を決定した後、そのＤＮＡ断片に含まれる遺伝子を同定し、アルコール飲料の香味に影響を与える機能を予測する。具体的には、測定された蛍光強度に差の見られたゲノムＤＮＡ断片について、その塩基配列を決定した後、酵母株の種類又は状態と関連付け、また、データベースリサーチ(相同性検索等)を行うことにより遺伝子を同定し、ＤＮＡ断片中の遺伝子の機能を予測する。ここで、蛍光強度に差の見られたＤＮＡ断片の検出は、ステップ（１）〜（５）を複数回繰り返し、その結果を発現比率パターンの類似度に基づいてクラスタリングすることにより行うのが好ましい。なお、配列解析は、解析対象のゲノムＤＮＡ断片に対応する、ライブラリー中のプラスミドを用いて行えばよい。

ステップ（３）でＤＮＡアレイ２０を用いた場合は、ステップ（４）において、既知遺伝子と類似又は同調する蛍光強度のパターン（第１及び第２の蛍光色素の蛍光強度の比率）を示したゲノムＤＮＡ断片の配列を解析することによって、そのＤＮＡ断片に含まれる遺伝子を同定し、その機能を推定できる。この場合、その遺伝子の塩基配列を同定した後、既知遺伝子の機能と関連付け、また、データベースリサーチ(相同性検索等)を行うことにより、ＤＮＡ断片中の遺伝子の機能を予測する。ここで、既知遺伝子と類似又は同調する蛍光強度のパターンを示すＤＮＡ断片の検出は、ステップ（１）〜（５）を複数回繰り返し、その結果を発現比率パターンの類似度に基づいてクラスタリングすることにより行うのが好ましい。

本発明では、ステップ（６）に至る前までに、ＤＮＡアレイ上のゲノムＤＮＡ断片中の、リボソームＲＮＡの遺伝子領域を特定するステップを備えていることが好ましい。リボソームＲＮＡの遺伝子領域が特定されていれば、配列解析においてそのような領域を除外して、より精度の高い解析を行うことが可能になる。

本発明の第２実施形態に係る、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法は、アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、１対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、この１対の発酵途中醸造用酵母を比較して、ｍＲＮＡの発現量に差のある遺伝子（Ｇ１）とタンパク質の発現量に差のある遺伝子（Ｇ２）とを同定するステップと、同定したＧ１とＧ２のうち共通の遺伝子を選択するステップとを備える。

アルコール飲料の香味に影響を与える発酵条件及びＧ１を同定する方法は、上述した第１実施形態で示した通りである。

同定したＧ１とＧ２のうち共通の遺伝子を選択するステップは、Ｇ１とＧ２の間で共通する遺伝子の有無を調べ、双方で認められた遺伝子をアルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子であると同定するステップである。

Ｇ２の同定は、（ｉ）１対の発酵途中醸造用酵母の双方から粗タンパク質を抽出するステップと、（ｉｉ）一方の粗タンパク質から第３の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得、他方の粗タンパク質から第４の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得るステップと、（ｉｉｉ）第３の蛍光色素で標識した粗タンパク質と第４の蛍光色素で標識した粗タンパク質とを混合した混合物を、二次元電気泳動で分画するステップと、（ｉｖ）分画したタンパク質に結合する第３の蛍光色素が発する蛍光と、第４の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（ｖ）第３の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第４の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、（ｖｉ）蛍光の強度に差のあるタンパク質を解析して、このタンパク質をコードするＧ２を同定するステップとを備える方法により実施される。

ステップ（ｉ）における粗タンパク質の抽出は、例えば、遠心分離して集めた酵母細胞に、界面活性剤（ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ、Ｔｗｅｅｎ−２０等）、還元剤（ＤＴＴ、２−メルカプトエタノール等）、タンパク質分解阻害剤、尿素、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ^ＴＭ等を含む細胞溶解用緩衝液を添加し、撹拌することによって酵母細胞を可溶化する。可溶化が不十分な場合には、撹拌後、酵母細胞を氷浴中で超音波破砕してもよい。酵母細胞が可溶化した後は、遠心分離を行い、その上清を粗タンパク質の抽出液として使用できる。

ステップ（ｉｉ）における蛍光色素での標識は、例えば、可溶化した粗タンパク質抽出液に、Cyanine色素（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）を加えて撹拌し、氷浴で一定時間インキュベーションすれば、粗タンパク質を蛍光標識できる。蛍光色素は、酵母の種類又は発酵条件ごとに色（蛍光波長）が区別し得るものであればよく、第３の蛍光色素及び第４の蛍光色素の一方はＣｙ３（緑色色素）、他方はＣｙ５（赤色色素）であるのがより好ましい。

ステップ（ｉｉｉ）における二次元電気泳動は、公知の方法に従って行うことができる。ここで、二次元電気泳動とは、一次元目の分離を等電点電気泳動法で行い、続く二次元目の分離をＳＤＳ−ＰＡＧＥで行うもので、構成アミノ酸の数・種類のわずかな違いでも検出可能な鋭敏な手法である。Ｇ２の同定には、異なる２種類の蛍光色素で標識した粗タンパク質を混合した混合物を、ｐＨ４〜７の等電点ゲルで分離した後に、１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行うのが好ましい。

ステップ（ｉｖ）及び（ｖ）における蛍光強度は、ＣＣＤカメラやスキャナ等を搭載したイメージアナライザーで測定し、ステップ（ｉｖ）及び（ｖ）における蛍光強度の比較は、二次元電気泳動後のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分離したタンパク質の各スポットにおける第３及び第４の蛍光色素の蛍光強度を数値化し、両者の比を求めることによって行うことができる。

ステップ（ｖｉ）におけるタンパク質の解析は、二次元電気泳動後のＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で分離したタンパク質の各スポットからタンパク質を抽出し、得られた微量タンパク質を質量分析装置、プロテインシーケンサー、アミノ酸分析装置等で分析することにより行うことができるが、質量分析装置による分析が好ましい。発現に差異の認められたタンパク質のスポットをゲルから切り出し、トリプシン消化したサンプルを質量分析計で分析すれば、短時間でタンパク質を同定し、これをコードする遺伝子についても同定できる。

（ＤＮＡアレイ）
本発明のＤＮＡアレイは、上記の遺伝子同定方法により同定された、アルコール飲料の香味に関与する遺伝子が基板上の複数のスポットに結合している。ＤＮＡアレイの製造方法については、上記の通りである。このＤＮＡアレイは、香味に関与する遺伝子が結合しているため、以下に述べるように、本発明の醸造用酵母の選抜方法に利用できる。

（香味基準の醸造用酵母の選抜方法）
本発明の香味基準の醸造用酵母の選抜方法は、以下のステップ（ａ）〜（ｅ）を備える。
（ａ）発酵途中の醸造用酵母から、トータルＲＮＡを抽出するステップ。
（ｂ）上記トータルＲＮＡから蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップ。
（ｃ）上記本発明のＤＮＡアレイ上で、蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡをハイブリダイズさせるステップ。
（ｄ）上記ＤＮＡアレイのスポットのそれぞれにおいて、蛍光色素が発する蛍光を測定するステップ。
（ｅ）各スポットにおける蛍光色素の蛍光の強度に基づいて、発酵途中の醸造用酵母の遺伝子の発現状態を評価するステップ。

各ステップにおける、トータルＲＮＡの抽出、蛍光標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、蛍光測定等は上記の通りである。本発明の選抜方法で用いるＤＮＡアレイは上記の通り、アルコール飲料の香味に関与する遺伝子が基板上の複数のスポットに結合している。したがって、これらの遺伝子と評価対象の酵母に由来するｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションの程度を蛍光色素の蛍光強度に基づいて測定できる。そして、ハイブリダイゼーションの強弱（蛍光強度の強弱）に応じて、評価対象の酵母の香味に関与する遺伝子の発現状態を評価でき、この評価結果に基づいて、アルコール飲料に望ましい香味を与える酵母を選抜できる。

（目標とする香味のアルコール飲料を与える醸造用酵母の選抜方法）
上記の醸造用酵母の選抜方法のほか、以下の醸造用酵母の選抜方法によって醸造用酵母を選抜することも可能である。すなわち、本発明の目標とする香味のアルコール飲料を与える醸造用酵母の選抜方法は、以下のステップ（ａ）〜（ｃ）を備える。
（ａ）以下の３種の標識ｃＤＮＡ又は３種の標識ｃＲＮＡを得るステップ。
（ａ１）目標とする香味のアルコール飲料を与える発酵中の醸造用酵母から、トータルＲＮＡを抽出し、得られたトータルＲＮＡから合成された第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ
（ａ２）目標とする香味とは異なるアルコール飲料を与える発酵中の醸造用酵母から、トータルＲＮＡを抽出し、得られたトータルＲＮＡから合成された第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ
（ａ３）発酵中の評価対象醸造用酵母から、トータルＲＮＡを抽出し、得られたトータルＲＮＡから合成された第３の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡ
（ｂ）基板上の複数のスポットに、基準となる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイ上で、以下の２つの組で別々に競合ハイブリダイズさせ、各スポットにおいてそれぞれの蛍光色素が発する蛍光の強度差を測定するステップ。
（ｂ１）第１の標識ｃＤＮＡと第３の標識ｃＤＮＡの組、又は第１の標識ｃＲＮＡと第３の標識ｃＲＮＡの組
（ｂ２）第２の標識ｃＤＮＡと第３の標識ｃＤＮＡの組、又は第２の標識ｃＲＮＡと第３の標識ｃＲＮＡの組
（ｃ）（ｂ１）における蛍光の強度差が（ｂ２）における蛍光の強度差よりも少ないものを、目標とする香味のアルコールを与える醸造用酵母により近い評価対象醸造用酵母であると判断するステップ。

各ステップにおける、トータルＲＮＡの抽出、蛍光標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの調製、使用するＤＮＡアレイ、ハイブリダイゼーション、蛍光測定等は上記の通りである。

（ａ１）及び（ａ２）の酵母は、同一の条件で発酵させて製造したアルコール飲料をパネリストが試飲して、どのような香味をアルコール飲料に付与するのかが既に判明している酵母を使用する。（ａ１）、（ａ２）及び（ａ３）を標識する蛍光色素は全て異なっていてもよく、（ａ１）及び（ａ２）を標識する蛍光色素は同一であってもよい。

（ｂ１）における蛍光の強度差が（ｂ２）における蛍光の強度差よりも少ないほど、評価対象の酵母が目標とする香味のアルコール飲料を与える酵母に類似した遺伝子発現パターンを示すと考えられ、したがって、そのような酵母を目標とする香味のアルコール飲料を与える醸造用酵母として選抜できる。

（アルコール飲料の製造方法及びアルコール飲料）
本発明のアルコール飲料の製造方法は、上記方法で選抜された醸造用酵母を使用することを特徴とし、また、そのような方法で製造されたアルコール飲料も本発明に包含される。

上記方法で選抜された醸造用酵母は望ましい醸造特性を備える酵母であり、この酵母を使用してアルコール飲料を製造すると、望ましい香味を備えたアルコール飲料が得られる。

アルコール飲料の製造方法は特に限定されず、使用する酵母が本発明の方法で選抜された醸造用酵母であることを除き、一般的に使用されているアルコール飲料の製造方法を使用できる。例えば、ビールの製造方法は、通常、仕込工程、発酵工程、ろ過工程等を備えている。仕込工程では、麦芽及び副原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽及び副原料を糖化させ、糖化された麦芽及び副原料から麦汁を採取する。発酵工程では、仕込工程で得られた麦汁に酵母を添加して発酵させ、麦芽アルコール飲料中間品を得る。この発酵工程において、本発明の方法で選抜された醸造用酵母を使用する。ろ過工程では、発酵工程で得られたビール中間品をろ過しビールを得る。なお、ろ過工程は必ずしも必要な工程ではない。

アルコール飲料としては、ビール又はその他雑酒であることが好ましい。ここで、ビールとは、麦芽を原料とし、発酵工程を経て製造されるアルコール飲料をいい、原料である麦芽の使用比率やアルコール濃度は問わない。すなわち、ビールには、麦芽の使用比率が６６．７％未満である、いわゆる発泡酒も含まれる。その他雑種とは、原料に麦芽を使用せずに、ビールと同様の製造方法で得られるアルコール飲料であり、例えば、麦芽の代わりにエンドウタンパク質を原料としたアルコール飲料などが挙げられる。

以下、本発明の実施例を説明する。なお、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。

（実施例１：ＤＮＡアレイの作製）
（１）ランダムゲノムライブラリーの作製：
醸造用酵母としてサッカロマイセス・パストリアヌス・ヴァイヘンステファン３４／７０を用いて、醸造用酵母のランダムゲノムライブラリーを作製した。

醸造用酵母からのゲノムＤＮＡの抽出及び精製は、公知の方法（例えば、「酵母遺伝子実験マニュアル（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ）」（大矢禎一監修、丸善株式会社、ｐ．１１３−１１９）に記載の方法）に準じて行った。

ランダムゲノムライブラリーの作製は、次のように行った。１）ＤＮＡ断片化装置（ＨｙｄｒｏＳｈｅａｒ）によってゲノムＤＮＡを断片化した。２）得られたＤＮＡ断片を電気泳動したアガロースゲルから、約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出した。３）ＤＮＡ断片の末端を平滑化した後、ｐＵＣ１９ベクターに連結した。４）得られた組換えベクターを大腸菌に導入し、得られたコロニーよりグリセロールストックを作製した。５）グリセロールストックよりＬＢ培地（１０ｇ／Ｌバクトトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）（液体培地）に大腸菌を移植し、約２００００のプラスミドクローンを抽出した。各プラスミドクローンは約２．５ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を含むので、抽出したプラスミドクローン全体は約５０Ｍｂｐ（２．５ｋｂｐ×２００００クローン）のゲノム断片を含み、ゲノムサイズ２４〜２６Ｍｂｐの下面ビール酵母ゲノムを約２．０の冗長度で保有していたと推定される。

（２）ランダムゲノムライブラリーの評価：
ランダムゲノムライブラリーの評価は、次のように行った。１）プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行った。２）９６穴プレート８枚に分注されたプラスミドＤＮＡを鋳型として、ベクタープライマーによる塩基配列解析を行った。その結果、約９０％のクローンは、ゲノムＤＮＡの挿入断片を有することが確認された。すなわち、作製されるＤＮＡアレイの実質的な冗長度は約１．８（２．０×０．９）になると推定される。

（３）ＤＮＡアレイの作製：
図３は、実施例１で作製したＤＮＡアレイを模式的に示す平面図である。図３に示されるように、実施例１で作製したＤＮＡアレイ３０では、１２行×４列（計４８個）のブロック４が基板１上に配列している。図４は、ＤＮＡアレイ３０のブロック４の一つを拡大して模式的に示した平面図である。ブロック４はプラスミド２又は既知遺伝子３が結合した２１×２１個のスポットから構成されている。既知遺伝子３が結合した２１個のスポットは、各ブロック４において、ＤＮＡアレイ３０の短辺方向の最端の一列を構成している。なお、図４では、ブランクは便宜上、既知遺伝子３として示している。異なるスポットに結合している既知遺伝子３は、互いに種類が異なっていてもよい。

ＤＮＡアレイ３０の作製は、プラスミド２を各ブロック４の２〜２１行目のスポットに、既知遺伝子３を各ブロック４の１行目のスポットに固定化することにより行った。基板１としてはガラス基板を用い、固定化は、アルカリが含有されている固定液に溶解したプラスミド２又は既知遺伝子３を、表面処理（ポリリジン処理）を施したガラス基板上にスポッティングすることにより行った。

既知遺伝子３としてはサッカロマイセス・セレビシェ由来のものを用い、これをＰＣＲで増幅させたＤＮＡを固定化した。ＤＮＡアレイに固定化した既知遺伝子の遺伝子名、機能、及びＰＣＲ増幅において使用したプライマーの種類は下記１）〜１０）のとおりである。
１）遺伝子名：ＡＣＴ１、機能：アクチン生成、プライマー：（５’−ＴＣＧＧＴＡＧＡＣＣＡＡＧＡＣＡＣＣＡＡ−３’、５’−ＣＣＴＴＡＣＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡ−３’）
２）遺伝子名：ＡＴＦ１、機能：酢酸エステル合成、プライマー：（５’−ＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＴＧＡＴＴ−３’、５’−ＴＡＧＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＣＡＡＴＣＴＧ−３’）
３）遺伝子名：ＡＴＦ２、機能：酢酸エステル合成、プライマー：（５’−ＣＧＡＡＧＡＧＧＣＣＴＡＡＴＴＧＧＡＧＡ−３’、５’−ＴＣＡＣＣＧＴＴＧＴＣＧＴＡＣＧＡＴＴＣ−３’）
４）遺伝子名：Ｌｇ−ＡＴＦ１、機能：酢酸エステル合成、プライマー：（５’−ＧＧＴＧＴＧＡＴＴＣＴＣＡＡＣＧＡＧＣＡ−３’、５’−ＡＡＣＧＧＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＴ−３’）
５）遺伝子名：ＥＨＴ１、機能：脂質代謝、プライマー：（５’−ＴＡＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＴＧＣＡＣＧＴＴ−３’、５’−ＴＣＴＧＣＡＡＴＴＧＣＣＴＴＧＧＴＡＧＣ−３’）
６）遺伝子名：ＩＡＨ１、機能：エステラーゼ活性、プライマー：（５’−ＧＡＴＣＡＧＴＡＴＧＣＴＣＴＴＧＧＡＧＣ−３’、５’−ＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡ−３’）
７）遺伝子名：ＬＥＵ４、機能：イソプロピルマレート合成、プライマー：（５’−ＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＴＴＡＡＣＡＧＧ−３’、５’−ＧＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＣＡＡＧＴＡＴＧＧ−３’）
８）遺伝子名：ＯＬＥ１、機能：脂肪酸の不飽和化、プライマー：（５’−ＣＴＣＣＧＴＴＴＴＣＴＡＣＴＡＣＧＣＴＧ−３’、５’−ＧＴＴＧＧＧＴＣＧＴＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡ−３’）
９）遺伝子名：ＳＳＵ１、機能：亜硫酸塩の輸送、プライマー：（５’−ＴＧＣＴＣＴＴＡＣＧＡＧＧＣＡＧＴＴＴＧ−３’、５’−ＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＧＣＣＡＣＧＴＴＡＡ−３’）
１０）遺伝子名：Ｌｇ−ＦＬＯ１、機能：凝集性遺伝子、プライマー：（５’−ＣＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＡＣＣＡＡＧＧＧＧ−３’、５’−ＴＴＡＣＣＡＴＡＣＧＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡ−３’）

各ブロック４において、ＤＮＡアレイ３０の短辺方向の最端の一列を構成するスポットには、１：ＡＣＴ１、２：ＡＴＦ１、３：ＡＴＦ２、４：Ｌｇ−ＡＴＦ１、５：ＥＨＴ１、６：ＩＡＨ１、７：ＬＥＵ４、８：ＯＬＥ１、９〜１８：ブランク、１９：ｐＵＣ１９（コントロール）、２０：ＳＳＵ１、２１：Ｌｇ−ＦＬＯ１を順に固定化した。すなわち、ＤＮＡアレイ３０には、５２８個（１１×４列×１２行）の既知遺伝子（コントロールを含む）と、２０１６０個（２０×２１×４列×１２行）個のプラスミドとがガラス基板表面に固定化されている。なお、ＡＣＴ１遺伝子は、醸造用酵母の種類又は状態に関わらず構成的に発現している遺伝子である。

（４）リボソームＲＮＡ遺伝子領域の特定：
上記ＤＮＡアレイ上のゲノムＤＮＡ断片中に重複して存在するリボソームＲＮＡ遺伝子領域を特定するために、下記に示した配列を有するＤＮＡ断片を１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子及び２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子用のプライマーとして、また、下面ビール酵母のゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、下面ビール酵母のゲノムＤＮＡ中の１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域及び２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子領域に相補的なＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅させた。
１）１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子用プライマー：
（５’−ＣＴＧＧＴＴＧＡＴＹＣＴＧＣＣＡＧＴ−３’、５’−ＣＹＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣＲＧ−３’）
２）２８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子用プライマー：
（５’−ＲＣＡＴＣＧＡＴＧＡＡＧＡＡＣＧＹＷＧ−３’、５’−ＭＲＧＧＣＴＫＡＡＴＣＴＣＡＲＹＲＧＡＴＣＧ−３’）

得られたＤＮＡ断片をＣｙ５で標識してプローブとし、このプローブを用いて上記ＤＮＡアレイ上でハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、公知の方法（例えば、「ＤＮＡアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）に記載の方法）に従って、６２℃の恒温槽で１４時間行った。

その結果、基板に固定化したＤＮＡ断片２０１６０個の内、１１２９個（約６％）のＤＮＡ断片をリボソームＲＮＡ遺伝子領域であると判断し、以降の解析ではマスクすることにした。

（実施例２：下面ビール酵母の発酵途中の遺伝子発現解析）
（１）トータルＲＮＡの抽出：
下面ビール酵母を用いた発酵試験を以下の条件で行った。
・麦汁エキス濃度： 約１１％
・麦汁容量： ２．５Ｌ
・麦汁溶存酸素濃度： 約５〜１０ｐｐｍ
・発酵温度： 約１３℃
・酵母投入量： １０〜１２ｇ湿酵母菌体
・発酵回数： ３回

発酵液を経時的にサンプリングし、浮遊酵母数（酵母増殖量）の経時変化を調べた。発酵初期、中期及び後期に浮遊している酵母をサンプリングした。具体的には、発酵開始から４７、９５及び１４３時間が経過した時点でサンプリングを行った。図５は、浮遊酵母数の経時変化を示すグラフである。

上記の３種の発酵途中の酵母のそれぞれから、次のようにトータルＲＮＡを抽出した。１）発酵液より回収した酵母（約１ｇ）を遠心チューブごと液体窒素で凍結させた。２）凍結している状態の酵母をクライオプレス（マイクロテック・ニチオン社製）で磨砕した（３０秒間の磨砕を３回行った）。３）磨砕物を約１０ｍｌのＩｓｏｇｅｎ^ＴＭ（ニッポンジーン社製）に溶解し、付属のマニュアルに従ってトータルＲＮＡを精製した。

発酵後期の酵母から抽出したトータルＲＮＡについて、吸光度測定によってその濃度を、また、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）によってその品質をチェックした。濃度は、２３１．７９ｎｇ／μＬであった。図６は、抽出したトータルＲＮＡの純度をバイオアナライザーで分析した結果を示すチャートである。図６に示されるように、抽出したトータルＲＮＡ中の１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡの比率は１：１．６であり、かつ、２８ＳリボソームＲＮＡ由来の分解産物は検出されなかった。これらの結果より、高純度のトータルＲＮＡが抽出されたことが分かる。

（２）蛍光色素による標識：
上記トータルＲＮＡに対し、オリゴｄＴプライマーをアニールさせた後、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ存在下で逆転写酵素反応を行い、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰが導入されたｃＤＮＡを調製した。カップリング反応を用いてｃＤＮＡをＣｙａｎｉｎｅ色素（Ｃｙ３又はＣｙ５）で標識した。一個のＤＮＡアレイ上のプラスミド及び既知遺伝子にハイブリダイズさせる２種のｃＤＮＡの一方をＣｙ３（緑色色素）で、他方をＣｙ５（赤色色素）で標識した。

ハイブリダイゼーション：
一個のＤＮＡアレイにつき２種の蛍光色素標識ｃＤＮＡを、ＤＮＡアレイ上のプラスミド及び既知遺伝子に競合的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、公知の方法（例えば、「ＤＮＡアレイと最新ＰＣＲ法」（秀潤社）に記載の方法）に従って、６２℃の恒温槽で１４時間行った。

（３）蛍光強度の測定：
ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡアレイを洗浄し、スライドスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｃａｎｎｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）でシグナルを取り込んだ。得られたシグナルの画像データは、専用ソフトＦｅａｔｕｒｅＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて数値データに変換した。バックグラウンドにはネガティブコントロールの蛍光値を用い、各スポットの蛍光値から差し引いた。サンプルとコントロール（ｐＵＣ１９）間のノーマライゼーションは、グローバルノーマライゼーション法（全体のスポットを用いて正規化する方法）によって行った。

上記ハイブリダイゼーション実験の良否の確認は、スキャニング後の画像におけるＡＣＴ１遺伝子の４８個（４列×１２行）分の蛍光強度から判断した。図７は、ＤＮＡアレイの短辺方向の最端の一列を構成する４ブロックについて検出された蛍光を示す写真に対応する図である。図７において、既知遺伝子（ブランクを含む。）が結合したスポットは、各ブロック内で、ＤＮＡアレイの短辺側の最端の一列を構成している。図７に示されるように、構成的に発現しているＡＣＴ１遺伝子（図中、白色の丸枠でその位置を示している。）の蛍光強度がどのブロックにおいてもほぼ一定であることから、ハイブリダイゼーション実験の結果が良であると判断した。

（４）配列解析：
３回の発酵試験で得られたＤＮＡアレイ上の蛍光パターンに基づいて、クラスタリングを行った。既知遺伝子として、アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ＡＴＦ１を固定化したスポットと蛍光パターンが同調する７つのスポットが選ばれた。これらのスポットについて、ランダムゲノムライブラリー中の相当するＤＮＡ断片の配列解析を行い、ＢＬＡＳＴ等を用いたデータベースリサーチから遺伝子の機能を推定した。その結果、６つのゲノム断片（ＳＢｃ４０Ｉ１３、ＳＢｃ４８Ｉ０２、ＳＢｃ１４Ｍ０４、ＳＢｃ４３Ｍ１３、ＳＢｃ２７E１０及びＳＢｃ２２M０６）からは、表１の１０個の遺伝子がアノテーションされたが、1つのゲノム断片（ＳＢｃ１７A１４）は非サッカロミセス・セレビシェタイプであった。図８は、ＤＮＡアレイ上の蛍光パターンに基づいて行ったクラスタリングの結果を示す図である。図８において、ｃｏｎｔｒｏｌ０２はＡＴＦ１遺伝子を表す。

また、クラスタリングにより、発酵工程中に遺伝子発現が上昇し続けるスポットが５つ選ばれた。これらのスポットに対応する５つのゲノム断片（ＳＢｃ２５Ｊ１８、ＳＢｃ３５Ｏ２０、ＳＢｃ４２Ｎ０４、ＳＢｃ３２Ｎ１６及びＳＢｃ３３Ｐ１７）は、配列解析により、サッカロミセス・セレビシエに同等するＤＮＡ断片であることが明らかとなった。図９は、サッカロミセス・セレビシエのゲノムＤＮＡ中におけるＳＢｃ３３Ｐ１７の領域の位置を示す図である。図９に示されるように、ＳＢｃ３３Ｐ１７は、サッカロミセス・セレビシエの第ＸＶ染色体の３２２５０ｂｐ〜３４４９２ｂｐの領域に相当するが、本領域にはオープン・リーディング・フレームが存在せず、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ領域であった。

（実施例３：蛍光標識二次元ディファレンス電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）による、下面ビール酵母の発酵途中で発現するビールの香味に関与する遺伝子の同定）

下面ビール酵母にメチオニンを添加して発酵させると、酵母の生産する硫化水素の量が減少し、望ましいビールの香味が得られることが知られている。そこで、下面ビール酵母の発酵途中にメチオニンを添加することにより発現量が上昇するタンパク質を蛍光標識二次元ディファレンス電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）で解析し、ビールの香味に関与する醸造用酵母の遺伝子の同定を試みた。

（１）粗タンパク質の抽出：
メチオニン（１０ｐｐｍ）の添加又は無添加における下面ビール酵母を用いた発酵試験を、以下の条件で行った。
・麦汁エキス濃度： 約１１％
・麦汁容量： ２．５Ｌ
・麦汁溶存酸素濃度： 約５〜１０ｐｐｍ
・発酵温度： １５℃
・酵母投入量：２０〜２４ｇ湿酵母菌体

発酵開始から２３時間が経過した時点で、メチオニンの添加（１０ｐｐｍ）又は無添加状態で発酵に用いた酵母細胞をそれぞれ回収し、以下の粗タンパク質の抽出に用いた。まず、回収した各１０ｍｇ（乾燥重量）の酵母細胞に、２００μＬの可溶化バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、１％ＤＴＴ、０．５％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ^ＴＭ）を加え、室温で５分間撹拌（ボルテックス）した後、酵母細胞を氷浴中で超音波破砕（１秒×１０回）した。更に、室温で３０分間振とうした後、遠心分離（５分×１０，０００ｇ）を行い、上清のタンパク質可溶化画分を粗タンパク質とした。上清中のタンパク質の含量はＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量した。

（２）二次元電気泳動用サンプルの調製（粗タンパク質の蛍光標識）：
可溶化した各粗タンパク質（５０μｇ）には、ＤＩＧＥ用に開発された４００ｐｍｏｌの蛍光色素ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ ｆｌｏｕｒｓ（アマシャムバイオサイエンス社）を加えて撹拌し、３０分間氷浴で反応させることによって蛍光標識した。

このＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ ｆｌｏｕｒｓには、励起／蛍光波長の異なる３種類の色素（Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５）があり、これらは分子量及び電荷が等しくなるように開発されている。このため、いずれの蛍光色素で標識しても同一のタンパク質であれば二次元電気泳動におけるゲル中での移動度が一致する。

本実験では、１０ｐｐｍのメチオニンを添加した発酵群における粗タンパク質をＣｙ３で標識し、メチオニン無添加の発酵群における粗タンパク質をＣｙ５で標識した。標識反応は、１μＬのＬ−リジンを加えて、１０分間氷浴で反応させることによって停止させた。こうして得られた２種類の標識粗タンパク質は、等量ずつ混合し、この標識粗タンパク質混合サンプルを１枚のゲルで同時に二次元電気泳動した。

（２）二次元電気泳動
二次元電気泳動は、以下の条件で３回繰返して行った。二次元電気泳動の一次元目は、pH４〜７の固定化ｐＨ勾配等電点ゲル（以下、等電点ゲル；アマシャムバイオサイエンス社）を用い、１５０μｇの標識粗タンパク質混合サンプルを二次元電気泳動システム（ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩ；アマシャムバイオサイエンス社）で分画した。

一次元目の泳動後、等電点ゲルはＤＴＴで平衡化し、引き続きヨードアセトアミドとＳＤＳとでアセチル化を行い、二次元目の泳動に用いた。二次元目の電気泳動は、１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを用いて、２１００Ｖｈで泳動した。泳動終了後、ゲルをイメージアナライザー（Ｔｙｐｈｏｏｎ９４００；アマシャムバイオサイエンス社）で直ちにスキャンし、メチオニンの添加・不添加で発現量に影響が生じたタンパク質を専用のソフトウエアで解析した。図１０は、二次元電気泳動で分画したタンパク質のスポットを表す図であり、矢印で示したスポットはメチオニンの添加でダウンレギュレートしたタンパク質である。

（３）メチオニンの添加でダウンレギュレートしたタンパク質の解析
二次元電気泳動で分画したタンパク質が蛍光を発するゲル中の領域（スポット）の中で、Ｃｙ３（１０ｐｐｍのメチオニンを添加した発酵群の標識）の蛍光強度がＣｙ５（メチオニン無添加の発酵群の標識）の蛍光強度に比べて有意に減少するスポットに着目した。尚、統計的有意差有りの判定は、i)サンプル間（繰り返し３回の試験）のスポットの標準偏差が３０％未満であり、ii)Ｔ検定でｐ＜５％の有意差があり、iii)対照に対するスポット強度比率が０．６７％未満であること、を条件とした。

蛍光強度を解析した上記ゲルから、Ｃｙ３の蛍光強度がＣｙ５の蛍光強度に比べて有意に減少するスポットについては、そのスポットのゲル断片を切り出し、トリプシン消化後に質量分析した後に、Ｍａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）でサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対して検索を行い、タンパク質の同定を行った。表２は、メチオニンの添加で統計的有意にダウンレギュレートしたタンパク質を示す。

その結果、メチオニン代謝に関連するメチオニンシンターゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）とＳ−アデノシルメチオニンシンターゼ（Ｓ−ａｄｅｎｏｓｙｌ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の２種類のタンパク質が同定された。この結果は、ＭＥＴ６遺伝子の発現後、翻訳後修飾により２つのアイソザイムが生成したと推察された。当該現象は、パン酵母（サッカロマイセス・セルビシエ）では報告がなく、醸造用酵母に特有の現象であることが判明した。

本発明の醸造用酵母の遺伝子を同定する方法、ＤＮＡアレイ、醸造用酵母の選抜方法、アルコール飲料の製造方法は、酵母の発酵を用いる酒類の製造に利用できる。

Claims (10)

1. アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、比較対照となる１対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、前記１対の発酵途中醸造用酵母を比較して、ｍＲＮＡの発現量に差のある遺伝子（Ｇ１）を同定するステップと、を含む、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、
   前記Ｇ１の同定は、
   （１）前記１対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータルＲＮＡを抽出するステップと、
   （２）一方の前記トータルＲＮＡから第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得、他方の前記トータルＲＮＡから第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップと、
   （３）基板上の複数のスポットに、前記醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイ上で、前記第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ、又は、前記第１の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ、を競合ハイブリダイズさせるステップと、
   （４）前記スポットのそれぞれにおいて、前記第１の蛍光色素が発する蛍光と、前記第２の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、
   （５）前記第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、
   （６）蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列から前記Ｇ１を同定するステップと、を備える方法により実施される、方法。
2. アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、１対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、前記１対の発酵途中醸造用酵母を比較して、ｍＲＮＡの発現量に差のある遺伝子（Ｇ１）とタンパク質の発現量に差のある遺伝子（Ｇ２）とを同定するステップと、同定した前記Ｇ１とＧ２のうち共通の遺伝子を選択するステップと、を含む、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、
   前記Ｇ１の同定は、
   （１）前記１対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータルＲＮＡを抽出するステップと、
   （２）一方の前記トータルＲＮＡから第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得、他方の前記トータルＲＮＡから第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップと、
   （３）基板上の複数のスポットに、前記醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合したＤＮＡアレイ上で、前記第１の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＤＮＡ、又は、前記第１の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ及び第２の蛍光色素で標識したｃＲＮＡ、を競合ハイブリダイズさせるステップと、
   （４）前記スポットのそれぞれにおいて、前記第１の蛍光色素が発する蛍光と、前記第２の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、
   （５）前記第１の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第２の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、
   （６）蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノムＤＮＡ断片の配列から前記Ｇ１を同定するステップと、を備える方法により実施され、
   前記Ｇ２の同定は、
   （ｉ）前記１対の発酵途中醸造用酵母の双方から粗タンパク質を抽出するステップと、
   （ｉｉ）一方の前記粗タンパク質から第３の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得、他方の前記粗タンパク質から第４の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得るステップと、
   （ｉｉｉ）前記第３の蛍光色素で標識した粗タンパク質と前記第４の蛍光色素で標識した粗タンパク質とを混合した混合物を、二次元電気泳動で分画するステップと、
   （ｉｖ）分画したタンパク質に結合する前記第３の蛍光色素が発する蛍光と、前記第４の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、
   （ｖ）前記第３の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第４の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、
   （ｖｉ）蛍光の強度に差のあるタンパク質を解析して、該タンパク質をコードする前記Ｇ２を同定するステップと、を備える方法により実施される、方法。
3. ステップ（３）で用いるＤＮＡアレイにおいて、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子が結合した他のスポットが更に存在する、請求項１又は２に記載の方法。
4. ステップ（３）で用いるＤＮＡアレイにおいて、醸造用酵母のゲノムＤＮＡ断片を含むプラスミドが結合した複数のスポットと、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子が結合したスポットとから構成されるブロックが、基板上に複数配列している、請求項３に記載の方法。
5. ステップ（３）で用いるＤＮＡアレイにおいて、前記ブロックが等しい形状を有しており、それぞれのブロックの同じ位置に、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子が結合したスポットが存在する、請求項４に記載の方法。
6. ステップ（３）の醸造用酵母が、下面ビール酵母である請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により同定された、アルコール飲料の香味に関与する遺伝子が、基板上の複数のスポットに結合したＤＮＡアレイ。
8. 香味基準の醸造用酵母の選抜方法であって、
   （ａ）発酵途中の醸造用酵母から、トータルＲＮＡを抽出するステップと、
   （ｂ）前記トータルＲＮＡから蛍光色素で標識したｃＤＮＡ又はｃＲＮＡを得るステップと、
   （ｃ）請求項７に記載のＤＮＡアレイ上で、蛍光色素で標識した前記ｃＤＮＡ又は前記ｃＲＮＡをハイブリダイズさせるステップと、
   （ｄ）前記ＤＮＡアレイのスポットのそれぞれにおいて、蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、
   （ｅ）各スポットにおける蛍光色素の蛍光の強度に基づいて、発酵途中の醸造用酵母の遺伝子の発現状態を評価するステップと、を備える方法。
9. 請求項８に記載の方法で選抜された醸造用酵母を使用するアルコール飲料の製造方法。
10. 請求項９に記載の方法で製造されたアルコール飲料。

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