WO2006093104A1

WO2006093104A1 - アルコール飲料の香味を制御する方法

Info

Publication number: WO2006093104A1
Application number: PCT/JP2006/303646
Authority: WO
Inventors: Naoyuki Kobayashi; Masahide Sato; Syunsuke Fukuhara; Shigehisa Yokoi
Original assignee: Sapporo Breweries Limited
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-02-27
Publication date: 2006-09-08
Also published as: US20090186122A1; JPWO2006093104A1; EP1865072A4; CA2599866A1; EP1865072A1

Abstract

本発明は、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法を提供し、同定された遺伝子の発現を制御することにより望ましい香味を備えるアルコール飲料の製造を可能とすることを目的とする。上記目的を達成するために、ＤＮＡアレイ又はＤＮＡアレイと二次元電気泳動による遺伝子解析手段を用いた醸造用酵母の遺伝子を同定する方法、同定された遺伝子が結合したＤＮＡアレイ、当該ＤＮＡアレイを利用した醸造用酵母の選抜方法を提供する。

Description

明細書

アルコール飲料の香味を制御する方法

技術分野

[0001] 本発明は、アルコール飲料の香味を制御する方法に関するものであり、特に、醸造用酵母の遺伝子を同定する方法、 DNAアレイ、醸造用酵母の選抜方法、アルコール飲料の製造方法及びアルコール飲料に関する。

背景技術

[0002] 酵母を使用して得られる発酵飲食品において、香味はその品質を位置付ける重要な因子である。例えば、アルコール飲料 (ビール、ワイン、清酒など）、発酵調味料（味噌、醤油、酢など)及びパンは、使用される酵母の香気成分 (エステル類、アルコール類など）によりその特性が決定される側面がある。

[0003] ビール酵母などの有用な醸造酵母を選抜する方法としては、これまではビール醸造所で用いられて、る優良なビール酵母を選択すると!、う方法が伝統的に行われてきた。この方法では、酵母細胞集団の中力も多数の単一細胞を取得した後に発酵試験を行い、ガスクロマトグラフィーによる香気成分の分析や官能検査などを行うことにより、優良な酵母を選択する必要があつたため、多くの手間と時間がかかっていた。

[0004] 最近では、遺伝子工学的な手法を用いて、目的とする遺伝子を醸造用遺伝子に導入'発現させることが可能であり、遺伝子の機能解析や解析された遺伝子を利用することにより、望ましい形質を備える酵母を育種することが可能である。

[0005] 例えば、ビール酵母や清酒酵母のエステル合成に関する遺伝子を操作した酵母株として以下のものが作製されてヽる：酢酸イソアミル生成酵素の構造遺伝子 (ATF1) の高発現により酢酸イソアミル生産を増大させた株 (特許文献 1) ;分岐鎖アミノ酸のアミノ基転移酵素の構造遺伝子の発現を制御（阻止又は高発現)することにより、イソァミルアルコール、イソブタノール及び酢酸イソァミルの生産量を改変させた株（特許文献 2)；酢酸エステルを分解するエステラーゼ遺伝子を破壊することにより、酢酸イソアミル生産量を増大させた株 (特許文献 3)。

[0006] 特許文献 1 :特開平 6— 062849号公報特許文献 2 :特開平 11 235176号公報

特許文献 3：特開平 9 - 234077号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] し力しながら、既に全ゲノム塩基配列が知られているパン酵母サッカロミセス 'セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae)と比べて、下面発酵酵母では全ゲノム塩基配列が公開されておらず、下面発酵酵母の醸造特性に関する遺伝子及びビール醸造におけるそれらの遺伝子の働きについての知見は非常に少ない。また、ある特定の遺伝子の発現レベルの差異にのみ着目して醸造用酵母を育種しても、その遺伝子が望ましい形質を表現するには、複数の遺伝子の発現を網羅的に解析し、他の要因で変動する遺伝子ではな、ことを調べておく必要があり、従来の手法では多検体における複数遺伝子の発現を同時に調べることは困難であった。更に、醸造アルコールの香味に関連する遺伝子が見出された場合であっても、 mRNAの発現量のみが変化してタンパク質の発現量が変化しなヽ遺伝子を排除し、 mRNAの転写レベルとタンパク質の翻訳レベルで正の相関関係を持って香味を制御する遺伝子を同定することは困難であった。

[0008] そこで、本発明は、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法を提供し、醸造特性に関する遺伝子の情報が不明であっても、アルコール飲料の香味を制御することにより、望ましい香味を備えるアルコール飲料の製造を可能とすることを目的とする。また、本発明は、望ましい香味を備える醸造用酵母を選抜する方法及びこれに用いる DNAアレイを提供することも目的とする。

課題を解決するための手段

[0009] 上記目的を達成するために、本発明は、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、 (a) 2種類の醸造用酵母を用いて同一の発酵条件で発酵させることにより、又は同一種類の酵母を用いて 2種類の発酵条件で発酵させることにより、香味に差がある 2種類のアルコール飲料を製造するステップと、（b)ステップ (a)における発酵途中の醸造用酵母から、それぞれトータル RNAを抽出するステップと、（c)上記トータル RNAから 2種の cDNA又は 2種の mRNAを調製し、一方の種の cDNA又は mRNAを第 1の蛍光色素で、他方の種の cDNA又は m RNAを第 2の蛍光色素で標識して 2種の標識 cDNA又は 2種の標識 mRNAを得るステップと、（d)基板上の複数のスポットに、上記醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノム DNA断片を含むプラスミドが結合した DNAアレイ上で、上記 2種の標識 cDNA又は 2種の標識 mRNAを競合ノヽイブリダィズさせるステップと、 (e)上記スポットのそれぞれにおいて、上記第 1及び第 2の蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、（f)上記第 1の蛍光色素が発する蛍光の強度と、上記第 2の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、（g)蛍光の強度に差の見られたスポットに結合してヽるプラスミド中のゲノム DNA断片の配列を解析するステップと、を備える方法を提供する。

すなわち、本発明は、アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、比較対照となる 1対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、この 1対の発酵途中醸造用酵母を比較して、 mRNAの発現量に差のある遺伝子 (G1)を同定するステップと、を含む、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、 G1の同定は、（1)この 1対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータル RNA を抽出するステップと、 (2)一方のトータル RNAから第 1の蛍光色素で標識した cDN A又は cRNAを得、他方のトータル RNAから第 2の蛍光色素で標識した cDNA又は cRNAを得るステップと、（3)基板上の複数のスポットに、醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノム DNA断片を含むプラスミドが結合した DNAアレイ上で、第 1の蛍光色素で標識した cDNA及び第 2の蛍光色素で標識した cDNA、又は、第 1 の蛍光色素で標識した cRNA及び第 2の蛍光色素で標識した cRNA、を競合ハイブリダィズさせるステップと、（4)このスポットのそれぞれにおいて、第 1の蛍光色素が発する蛍光と、第 2の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（5)第 1の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第 2の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステツプと、（6)蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノム DNA断片の配列力 G1を同定するステップと、を備える方法により実施される方法を提供する。 [0011] この遺伝子同定方法であれば、酵母の種類又は発酵条件を変えた発酵途中の酵母の遺伝子の発現状態を比較し、差異が見られた遺伝子のみを解析するため、あら力じめ酵母の全ゲノム塩基配列の情報を取得しておく必要がない。そして、この方法によれば、香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定でき、その情報に基づいてァルコール飲料の香味を制御することが可能となる。

[0012] また、本発明は、アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、 1対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、この 1対の発酵途中醸造用酵母を比較して、 mRNAの発現量に差のある遺伝子 (G1)とタンパク質の発現量に差のある遺伝子（ G2)とを同定するステップと、同定した G1と G2のうち共通の遺伝子を選択するステツプと、を含む、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、 G1の同定は、（1)この 1対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータル R NAを抽出するステップと、 (2)一方のトータル RNAから第 1の蛍光色素で標識した c DNA又は cRNAを得、他方のトータル RNAから第 2の蛍光色素で標識した cDNA 又は cRNAを得るステップと、（3)基板上の複数のスポットに、醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノム DNA断片を含むプラスミドが結合した DNAアレイ上で、第 1の蛍光色素で標識した cDNA及び第 2の蛍光色素で標識した cDNA、又は、第 1の蛍光色素で標識した cRNA及び第 2の蛍光色素で標識した cRNA、を競合ハイブリダィズさせるステップと、（4)このスポットのそれぞれにおいて、第 1の蛍光色素が発する蛍光と、第 2の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（5)第 1の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第 2の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステツプと、（6)蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノム DN A断片の配列力 G1を同定するステップと、を備える方法により実施され、 G2の同定は、（i)この 1対の発酵途中醸造用酵母の双方力も粗タンパク質を抽出するステツプと、（ii)一方の粗タンパク質力も第 3の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得、他方の粗タンパク質力ゝら第 4の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得るステップと、 (iii) 第 3の蛍光色素で標識した粗タンパク質と第 4の蛍光色素で標識した粗タンパク質とを混合した混合物を、二次元電気泳動で分画するステップと、（iv)分画したタンパク質に結合する第 3の蛍光色素が発する蛍光と、第 4の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（V)第 3の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第 4の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、 (vi)蛍光の強度に差のあるタンパク質を解祈して、このタンパク質をコードする G2を同定するステップと、を備える方法により実施される方法を提供する。

[0013] この遺伝子同定方法であれば、 mRNAの発現量のみが変化してタンパク質の発現量が変化しな、遺伝子を排除し、 mRNAの転写レベルとタンパク質の翻訳レベルで正の相関関係を持って香味を制御する遺伝子を同定できる。 mRNAの発現量とタンノク質の発現量に正の相関関係のある遺伝子は、単一の遺伝子のみを人為的に制御することで、醸造用酵母細胞の形質を変えることが可能となる。このため、香味に関連するタンパク質をコードする遺伝子を同定した後には、容易かつ効率的にアルコール飲料の香味を制御できる。

[0014] ステップ（3)にお、て、 DNAアレイを構成するプラスミドに含まれる醸造用酵母のゲノム DNA断片としては、ビール醸造において最も広く用いられる下面ビール酵母由来のものが好適である。

[0015] 上記 DNAアレイは、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子 (以下、場合により、「既知遺伝子」と、う。）が結合した他のスポットが更に存在することが好ま、。

[0016] このような DNAアレイを用いれば、既知遺伝子が結合したスポットと類似又は同調する蛍光強度のパターン (蛍光色素の蛍光強度の比率)を示したスポットのゲノム DN A断片の配列を解析することによって、その DNA断片に含まれる遺伝子を同定し、その機能を推定することが可能になる。例えば、醸造上重要な既知遺伝子と機能的に類似し、一方でその既知遺伝子と塩基配列が異なる遺伝子がゲノム DNA中に存在する場合、蛍光強度のパターン、すなわち 2種の酵母間における遺伝子発現状態の差が上記既知遺伝子と類似又は同調しているゲノム DNA断片の配列を解析することにより、上記遺伝子を同定できる。すなわち、醸造上重要な既知遺伝子と発酵中の発現パターンが同調しており機能的に類似している力 S、遺伝子配列やアミノ酸配列が異なる既知又は新規の遺伝子を見出すことができる。

[0017] 上記構成の DNAアレイではまた、既知遺伝子が醸造用酵母の種類又は状態に関わらず構成的に発現しているものである場合に、既知遺伝子のスポットにおける蛍光強度を指標として、その周辺（例えば、そのスポットが含まれるブロック内）のスポットにおけるハイブリダィゼーシヨン実験の良否を容易に判定できる。

[0018] 既知遺伝子が結合した他のスポットが更に存在する DNAアレイとしては、醸造用酵母のゲノム DNA断片を含むプラスミドが結合した複数のスポットと、既知遺伝子が結合したスポットとから構成されるブロックが、基板上に複数配列して、るタイプが使用に適している。このようなタイプの DNAアレイを用いれば、ブロックごとに、既知遺伝子を指標として、ゲノム DNA断片中の遺伝子の機能を推定し、又はハイブリダィゼーシヨン実験の良否を判定することが可能になる。上記のようなタイプの中でも、ブロックが等しい形状を有しており、それぞれのブロックの同じ位置に、既知遺伝子が結合したスポットが存在するタイプは、プラスミド又は既知遺伝子が結合したスポットの位置が判別しやすぐ特に好適である。

[0019] 本発明はまた、上記方法により同定されたアルコール飲料の香味に関与する遺伝子が基板上の複数のスポットに結合した DNAアレイを提供する。この DNAアレイを用いることにより、香味基準の醸造用酵母を選抜することが可能である。すなわち、本発明は、香味基準の醸造用酵母の選抜方法であって、（a)発酵途中の醸造用酵母から、トータル RNAを抽出するステップと、（b)上記トータル RNAから蛍光色素で標識した cDNA又は cRNAを得るステップと、（c)上記の DNAアレイ上で、蛍光色素で標識した cDNA又は cRN Aをハイブリダィズさせるステップと、 (d)上記 DNAアレイのスポットのそれぞれにおいて、蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、 (e) 各スポットにおける蛍光色素の蛍光の強度に基づいて、発酵途中の醸造用酵母の遺伝子の発現状態を評価するステップと、を備える方法を提供する。この方法によれば、例えば (e)ステップにおいて、香味に関与する遺伝子が存在するスポットで蛍光の強度が高ヽ醸造用酵母を選別することで、好まヽ香味を備えるアルコール飲料の製造に適した酵母を選抜することが可能である。

[0020] 本発明は更に、上記の酵母の選抜方法で選抜された醸造用酵母を使用するアルコール飲料の製造方法及びその方法で製造されたアルコール飲料をも提供する。発明の効果 [0021] 本発明によれば、香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定でき、その情報に基づいて望ましい醸造特性を備える酵母を選抜することが可能であり、したがって、望ましい香味を備えるアルコール飲料の製造が可能となる。

図面の簡単な説明

[0022] [図 1]第 1実施形態に係る DNAアレイを模式的に示す平面図である。

[図 2]第 2実施形態に係る DNAアレイを模式的に示す平面図である。

[図 3]実施例 1で作製した DNAアレイを模式的に示す平面図である。

[図 4]実施例 1で作製した DNAアレイのブロックの一つを拡大して模式的に示した平面図である。

[図 5]浮遊酵母数の経時変化を示すグラフである。

[図 6]抽出したトータル RNAの純度をバイオアナライザーで分析した結果を示すチヤートである。

[図 7]DNAアレイの短辺方向の最端の一列を構成する 4ブロックについて検出された蛍光を示す写真に対応する図である。

[図 8]DNAアレイ上の蛍光パターンに基づいて行ったクラスタリングの結果を示す図である。

[図 9]サッカロミセス ·セレピシェのゲノム DNA中における SBc33P17の領域の位置を示す図である。

[図 10]二次元電気泳動で分画したタンパク質のスポットのうち、メチォニンの添加でダゥンレギュレートしたタンパク質のスポットを示す図である。

符号の説明

[0023] 1· ··基板、 2· "プラスミド、 3· ··既知遺伝子、 4· "ブロック、 10- DNAアレイ、 20- --D NAアレイ、 30 'DNAアレイ。

発明を実施するための最良の形態

[0024] (アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法）

本発明の第 1実施形態に係る、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法は、アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、比較対照となる 1対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、この 1対の発酵途中醸造用酵母を比較して、 mRNAの発現量に差のある遺伝子 (G1)を同定するステップとを備える。

[0025] アルコール飲料の香味に影響を与える発酵条件としては、培地、培地への通気量、発酵温度、発酵時間等が挙げられ、これらを変化させることにより、香味に差があるアルコール飲料を製造できる。香味の差は、完成したビールをパネリストが試飲し評価できる。香味の差は、例えば、芳香性、果実臭、穀物臭、ダイァセチル、酸味、甘味、塩味、苦味、口当たりなどの差である。

[0026] G1の同定は、（1) 1対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータル RNAを抽出するステップと、（2)—方のトータル RNA力ゝら第 1の蛍光色素で標識した cDNA又は cR NAを得 (以下、蛍光色素で標識した cDNAを「標識 cDNA」、蛍光色素で標識した c RNAを「標識 cRNA」と呼ぶことがある）、他方のトータル RNA力第 2の蛍光色素で標識した cDNA又は cRNAを得るステップと、（3)基板上の複数のスポットに、醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノム DNA断片を含むプラスミドが結合した DNAアレイ上で、第 1の蛍光色素で標識した cDNA及び第 2の蛍光色素で標識した cDNA、又は、第 1の蛍光色素で標識した cRNA及び第 2の蛍光色素で標識した cR NA、を競合ハイブリダィズさせるステップと、（4)このスポットのそれぞれにおいて、第 1の蛍光色素が発する蛍光と、第 2の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（5)第 1の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第 2の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、（6)蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノム DNA断片の配列力 G1を同定するステップとを備える方法により実施される。

[0027] ステップ（1)におけるトータル RN Aの抽出は、例えば、ホットフエノール法 (加温したフエノールとドデシル硫酸ナトリウム（SDS)で酵母を溶解しながら RNAを抽出する方法）に従って行うことができる力分解度の低い高純度 RNAを得るために、酵母株を液体窒素で凍結した後、磨砕機で磨砕し、 RNA抽出試薬で RNAを抽出する方法で行うのが好ましい。ここで、磨砕機としてはクライオプレス (マイクロテック' -チオン社製）力 RNA抽出試薬としては Isogen™ (二ツボンジーン社製）が挙げられる。 [0028] ステップ（2)における標識 cDNA又は標識 cRNAは、例えば、標識 cDNAは、上記の醸造用酵母力抽出したトータル RNAにオリゴ dTプライマーをァニールさせた後、蛍光色素が結合した dNTPの存在下で逆転写酵素を用いて cDNAを合成し、未反応の基質をスピンカラムで取り除くことにより調製できる。その際、オリゴ dTカラムを用いて、トータル RNAからポリ A+RNAを単離精製し、逆転写反応を行ってもよい

[0029] また、標識 cRNAは、上記のトータル RNA又はポリ A+RNAに T7プロモーターの配列が付、たオリゴ dTプライマーを用いて、逆転写反応で未標識の cDNAを合成し、蛍光色素が結合した NTPの存在下で、この cDNAに T7 RNAポリメラーゼを反応させて cRNAを合成し、未反応の基質をスピンカラムで取り除くことにより調製できる。

[0030] ここで、標識 cDNA又は標識 cRNAを得るために用いる標識は、 Cyanine色素が好ましぐ醸造用酵母の種類又は発酵条件ごとに色 (蛍光波長）を明確に区別するには、第 1の蛍光色素及び第 2の蛍光色素の一方は Cy3 (緑色色素）、他方は Cy5 (赤色色素）であるのがより好ましい。

[0031] ステップ（3)で用いる DN Aアレイについて以下説明する。

[0032] 図 1は、第 1実施形態に係る DNAアレイを示す平面図である。第 1実施形態に係る DNAアレイ 10は、基板 1と、基板 1上の複数のスポットに結合したプラスミド 2とから構成されている。 DNAアレイ 10では、プラスミド 2が結合した複数のスポットが基板 1上に格子状に配列している。

[0033] 図 2は、第 2実施形態に係る DNAアレイを示す平面図である。第 2実施形態に係る DNAアレイ 20は、基板 1と、基板 1上の複数のスポットに結合したプラスミド 2と、基板 1上の他のスポットに結合した、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子 3とから構成されている。 DNAアレイ 20では、プラスミド 2が結合した複数のスポットと、既知遺伝子 3 が結合したスポットとから構成されるブロック 4が、基板 1上に複数配列している。また、複数のブロック 4が等しい形状を有しており、それぞれのブロック 4の同じ位置に、既知遺伝子 3が結合したスポットが存在する。ブロック 4は格子状に配列したスポットから構成され、かつ、ブロック 4は基板 1上に格子状に配列している。

[0034] DNAアレイ 10又は 20を構成する基板 1の材料は、プラスミド 2を安定して結合させることができるものであればよく、例えば、ガラス及び合成樹脂（ポリカーボネートやその他プラスチック等）が挙げられる。また、基板 1の形状としては、板状又はフィルム状が好ましい。

[0035] プラスミド 2は、醸造用酵母のゲノム DNA断片を含んでいる。醸造用酵母としては、下面ビール酵母が好ましぐその中でも更に、ビール醸造において最も広く用いられて!、るサッカロマイセス ·パストリアヌス ·ヴアイへンステフアン（Saccharomyces past orianus Weihenstephan) 34/70が好ましい。

[0036] プラスミド 2に含まれるゲノム DNA断片のサイズは、好ましくは 1. 5〜3. Okbpである。 1. 5kbpより短いと、醸造用酵母のゲノム DNAが網羅されるように DNAアレイを作製しょうとした場合に、必要なゲノム DNA断片数が多くなり、 DNAアレイの作製コストが高くなる傾向がある。他方、 3. Okbpより長いと、一個の DNA断片に含まれる遺伝子又はェキソンの数が多くなり、遺伝子発現解析の過程が煩雑になる傾向がある。

[0037] DNAアレイの実質的な冗長度（DNAアレイ上のゲノム DNA断片の長さの合計を、 DNAアレイの作製に用いた醸造用酵母のゲノムサイズで除した値）が 1. 5以上 2. 0以下のものが好ましい。実質的な冗長度が 1. 5未満であると、 DNAアレイ上のゲノム DNA断片が全体としてカバーするゲノム領域が小さくなる傾向があり、実質的な冗長度が 2. 0を超えると、異なるスポットのゲノム DNA断片間で重複する領域が大きくなり、遺伝子発現解析が煩雑になる傾向がある。

[0038] なお、プラスミド 2の代わりに、そのインサートである醸造用酵母のゲノム DNA断片を上記の DNAアレイに直接結合させてもよい。この場合においても、ゲノム DNA断片のサイズ及び冗長度は、上記したプラスミド 2を用いる場合と同じであることが好ましい。

[0039] DNAアレイ 20を構成する既知遺伝子 3は、実験者がその目的に応じて選択できる。既知遺伝子 3は、サッカロマイセス 'セレピシェ由来の遺伝子が好適であり、その配列情報は、 Saccharomyces enome DataBase (http： / Z www. yeastgeno me. orgZ)より入手できる。

[0040] DNAアレイ 20においては、プラスミド 2はブロックによって異なつている方がよい。また、既知遺伝子 3は、各ブロックの同じ位置に同じ既知遺伝子が結合しているのが好ましい。

[0041] 各ブロック 4に複数種類の既知遺伝子 3が存在する場合、少なくとも一種は醸造用酵母の種類又は状態に関わらず構成的に発現しているものであることが好ましい。このような遺伝子がブロックごとに存在して、れば、各ブロックにおけるノ、イブリダィゼーシヨン実験の良否を容易に判定できる。そのような遺伝子として、サッカロマイセス' セレビシヱ由来の ACT1遺伝子が挙げられる。

[0042] なお、 DNAアレイ 10又は 20のように、プラスミド又は既知遺伝子が結合した複数のスポットが格子状に配列してヽれば、スポットの位置を座標で表すことができるので、スポットの位置を特定しやすぐ遺伝子発現解析に好都合である。また、 DNAァレィ 20においては、各スポットの同じ位置に同じ既知遺伝子が結合しているのが好ましい。

[0043] 本発明の DNAアレイの作製は、醸造用酵母のランダムゲノムライブラリーから無作為に選んだプラスミドを基板表面に結合させることにより行う。

[0044] 醸造用酵母のランダムゲノムライブラリーの作製は下記の操作 1)〜6)により行うことができる。各操作は、特に断らない限り、公知の方法に従えばよい。

1)醸造用酵母からゲノム DNAを抽出、精製する。

2)抽出、精製したゲノム DNAを断片化する。ゲノム DNAの断片化は、ランダムな D NA断片を得るために、 DNA断片化装置を用いて行うのが好まヽ。

3)得られた DNA断片から、電気泳動により一定のサイズの DNA断片を回収する。

4)得られた DNA断片を平滑末端ィ匕し、適当なプラスミドベクターに連結する。

5)得られた組換えベクターを適当な宿主細胞に導入する。

6)宿主細胞を適当な培地上で培養し、形質転換細胞を選択する。

[0045] プラスミドの基板表面への結合は、例えば、ゲノム DNA断片を含むプラスミドを溶解した固定液を、表面処理 (ポリリジン処理等）を施した基板上にスポッターでスポッティングし、プラスミドを基板表面に固定ィ匕する方法を用いることができる。ここで、固定液として、アルカリ性固定液を用いれば、二本鎖プラスミドは固定液中で 2個の一本鎖プラスミドに分離される。アルカリ性ではない固定液を用いる場合は、加熱処理等によって二本鎖を一本鎖にすればょ、。

[0046] また、ステップ（3)における競合ノヽイブリダィゼーシヨンでは、標識 cDNA又は標識 cRNAをハイブリダィズさせる前に加熱処理等によって変性させる。ハイブリダィゼーシヨンは、例えば、「DNAアレイと最新 PCR法」（秀潤社）に記載の方法に従って行えばよい。

[0047] ステップ (4)における蛍光強度の測定は、 CCDカメラやスキャナで画像データを取得し、これをソフトウェアで数値ィ匕することにより行うことができる。

[0048] ステップ（5)における蛍光強度の比較は、ステップ (4)で測定された第 1及び第 2の蛍光色素の蛍光強度の比を求めることにより行うことができる。

[0049] ステップ（6)における DNA断片の配列解析では、ゲノム DNA断片の塩基配列を決定した後、その DNA断片に含まれる遺伝子を同定し、アルコール飲料の香味に影響を与える機能を予測する。具体的には、測定された蛍光強度に差の見られたゲノム DNA断片について、その塩基配列を決定した後、酵母株の種類又は状態と関連付け、また、データベースリサーチ湘同性検索等)を行うことにより遺伝子を同定し、 DNA断片中の遺伝子の機能を予測する。ここで、蛍光強度に差の見られた DNA 断片の検出は、ステップ（1)〜（5)を複数回繰り返し、その結果を発現比率パターンの類似度に基づいてクラスタリングすることにより行うのが好ましい。なお、配列解析は、解析対象のゲノム DNA断片に対応する、ライブラリ一中のプラスミドを用いて行えばよい。

[0050] ステップ（3)で DNAアレイ 20を用いた場合は、ステップ (4)にお!/、て、既知遺伝子と類似又は同調する蛍光強度のパターン (第 1及び第 2の蛍光色素の蛍光強度の比率)を示したゲノム DNA断片の配列を解析することによって、その DNA断片に含まれる遺伝子を同定し、その機能を推定できる。この場合、その遺伝子の塩基配列を同定した後、既知遺伝子の機能と関連付け、また、データベースリサーチ湘同性検索等)を行うことにより、 DNA断片中の遺伝子の機能を予測する。ここで、既知遺伝子と類似又は同調する蛍光強度のパターンを示す DNA断片の検出は、ステップ（1) 〜（5)を複数回繰り返し、その結果を発現比率パターンの類似度に基づヽてクラスタリングすることにより行うのが好ましい。 [0051] 本発明では、ステップ（6)に至る前までに、 DNAアレイ上のゲノム DNA断片中の、リボソーム RNAの遺伝子領域を特定するステップを備えて、ることが好ま、。リボソーム RNAの遺伝子領域が特定されてヽれば、配列解析にぉヽてそのような領域を除外して、より精度の高い解析を行うことが可能になる。

[0052] 本発明の第 2実施形態に係る、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法は、アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、 1 対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、この 1対の発酵途中醸造用酵母を比較して、 mRNAの発現量に差のある遺伝子 (G1)とタンパク質の発現量に差のある遺伝子 (G2)とを同定するステップと、同定した G1と G2のうち共通の遺伝子を選択するステップとを備える。

[0053] アルコール飲料の香味に影響を与える発酵条件及び G1を同定する方法は、上述した第 1実施形態で示した通りである。

[0054] 同定した G1と G2のうち共通の遺伝子を選択するステップは、 G1と G2の間で共通する遺伝子の有無を調べ、双方で認められた遺伝子をアルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子であると同定するステップである。

[0055] G2の同定は、 (i) 1対の発酵途中醸造用酵母の双方から粗タンパク質を抽出するステップと、（ii)一方の粗タンパク質力も第 3の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得、他方の粗タンパク質力第 4の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得るステップと、 (iii)第 3の蛍光色素で標識した粗タンパク質と第 4の蛍光色素で標識した粗タンパク質とを混合した混合物を、二次元電気泳動で分画するステップと、（iv)分画したタンパク質に結合する第 3の蛍光色素が発する蛍光と、第 4の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、（V)第 3の蛍光色素が発する蛍光の強度と、第 4の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、 (vi)蛍光の強度に差のあるタンパク質を解析して、このタンパク質をコードする G2を同定するステップとを備える方法により実施される。

[0056] ステップ (i)における粗タンパク質の抽出は、例えば、遠心分離して集めた酵母細胞に、界面活性剤（SDS、 Triton X、 Tween— 20等）、還元剤（DTT、 2—メルカブトエタノール等）、タンパク質分解阻害剤、尿素、 Pharmalyte™等を含む細胞溶解用緩衝液を添加し、撹拌することによって酵母細胞を可溶ィ匕する。可溶化が不十分な場合には、撹拌後、酵母細胞を氷浴中で超音波破砕してもよい。酵母細胞が可溶ィ匕した後は、遠心分離を行い、その上清を粗タンパク質の抽出液として使用できる

[0057] ステップ (ii)における蛍光色素での標識は、例えば、可溶化した粗タンパク質抽出液に、 Cyanine色素（Cy2、 Cy3、 Cy5)をカ卩えて撹拌し、氷浴で一定時間インキュべーシヨンすれば、粗タンパク質を蛍光標識できる。蛍光色素は、酵母の種類又は発酵条件ごとに色 (蛍光波長）が区別し得るものであればよぐ第 3の蛍光色素及び第 4 の蛍光色素の一方は Cy3 (緑色色素）、他方は Cy5 (赤色色素）であるのがより好ましい。

[0058] ステップ (iii)における二次元電気泳動は、公知の方法に従って行うことができる。ここで、二次元電気泳動とは、一次元目の分離を等電点電気泳動法で行い、続く二次元目の分離を SDS— PAGEで行うもので、構成アミノ酸の数'種類のわずかな違いでも検出可能な鋭敏な手法である。 G2の同定には、異なる 2種類の蛍光色素で標識した粗タンパク質を混合した混合物を、 pH4〜7の等電点ゲルで分離した後に、 12 %の SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行うのが好ましい。

[0059] ステップ (iv)及び (V)における蛍光強度は、 CCDカメラやスキャナ等を搭載したィメージアナライザーで測定し、ステップ (iv)及び (V)における蛍光強度の比較は、二次元電気泳動後の SDSポリアクリルアミドゲル中で分離したタンパク質の各スポットにおける第 3及び第 4の蛍光色素の蛍光強度を数値化し、両者の比を求めることによつて行うことができる。

[0060] ステップ (vi)におけるタンパク質の解析は、二次元電気泳動後の SDSポリアクリルアミドゲル中で分離したタンパク質の各スポットからタンパク質を抽出し、得られた微量タンパク質を質量分析装置、プロテインシーケンサー、アミノ酸分析装置等で分析することにより行うことができるが、質量分析装置による分析が好ましい。発現に差異の認められたタンパク質のスポットをゲル力切り出し、トリプシン消化したサンプルを質量分析計で分析すれば、短時間でタンパク質を同定し、これをコードする遺伝子についても同定できる。

[0061] (DNAアレイ）

本発明の DNAアレイは、上記の遺伝子同定方法により同定された、アルコール飲料の香味に関与する遺伝子が基板上の複数のスポットに結合している。 DNAアレイの製造方法については、上記の通りである。この DNAアレイは、香味に関与する遺伝子が結合しているため、以下に述べるように、本発明の醸造用酵母の選抜方法に利用できる。

[0062] (香味基準の醸造用酵母の選抜方法）

本発明の香味基準の醸造用酵母の選抜方法は、以下のステップ (a)〜 (e)を備える。

(a)発酵途中の醸造用酵母から、トータル RNAを抽出するステップ。

(b)上記トータル RNAから蛍光色素で標識した cDNA又は cRNAを得るステップ。

(c)上記本発明の DNAアレイ上で、蛍光色素で標識した cDNA又は cRN Aをハイブリダィズさせるステップ。

(d)上記 DNAアレイのスポットのそれぞれにおいて、蛍光色素が発する蛍光を測定するステップ。

(e)各スポットにおける蛍光色素の蛍光の強度に基づいて、発酵途中の醸造用酵母の遺伝子の発現状態を評価するステップ。

[0063] 各ステップにおける、トータル RN Aの抽出、蛍光標識した cDNA又は cRNAの調製、ノ、イブリダィゼーシヨン、蛍光測定等は上記の通りである。本発明の選抜方法で用いる DNAアレイは上記の通り、アルコール飲料の香味に関与する遺伝子が基板上の複数のスポットに結合している。したがって、これらの遺伝子と評価対象の酵母に由来する cDNAとのハイブリダィゼーシヨンの程度を蛍光色素の蛍光強度に基づいて測定できる。そして、ハイブリダィゼーシヨンの強弱（蛍光強度の強弱）に応じて、評価対象の酵母の香味に関与する遺伝子の発現状態を評価でき、この評価結果に基づ、て、アルコール飲料に望ま、香味を与える酵母を選抜できる。

[0064] (目標とする香味のアルコール飲料を与える醸造用酵母の選抜方法）

上記の醸造用酵母の選抜方法のほか、以下の醸造用酵母の選抜方法によって醸造用酵母を選抜することも可能である。すなわち、本発明の目標とする香味のアルコール飲料を与える醸造用酵母の選抜方法は、以下のステップ (a)〜（c)を備える。

(a)以下の 3種の標識 cDN A又は 3種の標識 cRN Aを得るステップ。

(al)目標とする香味のアルコール飲料を与える発酵中の醸造用酵母から、トータル RNAを抽出し、得られたトータル RNAカゝら合成された第 1の蛍光色素で標識した cDNA又は cRNA

(a2)目標とする香味とは異なるアルコール飲料を与える発酵中の醸造用酵母から、トータル RNAを抽出し、得られたトータル RNA力合成された第 2の蛍光色素で標識した cDN A又は cRN A

(a3)発酵中の評価対象醸造用酵母から、トータル RNAを抽出し、得られたトータル RNA力合成された第 3の蛍光色素で標識した cDNA又は cRNA

(b)基板上の複数のスポットに、基準となる醸造用酵母のゲノム DNA断片を含むプラスミドが結合した DNAアレイ上で、以下の 2つの組で別々に競合ハイブリダィズさせ、各スポットにおいてそれぞれの蛍光色素が発する蛍光の強度差を測定するステップ。

(bl)第 1の標識 cDNAと第 3の標識 cDNAの組、又は第 1の標識 cRNAと第 3の標識 cRNAの組

(b2)第 2の標識 cDNAと第 3の標識 cDNAの組、又は第 2の標識 cRNAと第 3の標識 cRNAの組

(c) (bl)における蛍光の強度差が（b2)における蛍光の強度差よりも少ないものを、目標とする香味のアルコールを与える醸造用酵母により近い評価対象醸造用酵母であると判断するステップ。

[0065] 各ステップにおける、トータル RN Aの抽出、蛍光標識した cDNA又は cRNAの調製、使用する DNAアレイ、ハイブリダィゼーシヨン、蛍光測定等は上記の通りである。

[0066] (al)及び (a2)の酵母は、同一の条件で発酵させて製造したアルコール飲料をパネリストが試飲して、どのような香味をアルコール飲料に付与するのかが既に判明している酵母を使用する。 (al) , (a2)及び (a3)を標識する蛍光色素は全て異なって V、てもよく、（al)及び (a2)を標識する蛍光色素は同一であってもよ!/、。 [0067] (bl)における蛍光の強度差が (b2)における蛍光の強度差よりも少ないほど、評価対象の酵母が目標とする香味のアルコール飲料を与える酵母に類似した遺伝子発現パターンを示すと考えられ、したがって、そのような酵母を目標とする香味のアルコール飲料を与える醸造用酵母として選抜できる。

[0068] (アルコール飲料の製造方法及びアルコール飲料）

本発明のアルコール飲料の製造方法は、上記方法で選抜された醸造用酵母を使用することを特徴とし、また、そのような方法で製造されたアルコール飲料も本発明に包含される。

[0069] 上記方法で選抜された醸造用酵母は望ましい醸造特性を備える酵母であり、この酵母を使用してアルコール飲料を製造すると、望まし!/ゝ香味を備えたアルコール飲料が得られる。

[0070] アルコール飲料の製造方法は特に限定されず、使用する酵母が本発明の方法で選抜された醸造用酵母であることを除き、一般的に使用されているアルコール飲料の製造方法を使用できる。例えば、ビールの製造方法は、通常、仕込工程、発酵工程、ろ過工程等を備えている。仕込工程では、麦芽及び副原料と仕込用水とを混合し、得られた混合物を加温することにより麦芽及び副原料を糖化させ、糖化された麦芽及び副原料力ゝら麦汁を採取する。発酵工程では、仕込工程で得られた麦汁に酵母を添加して発酵させ、麦芽アルコール飲料中間品を得る。この発酵工程において、本発明の方法で選抜された醸造用酵母を使用する。ろ過工程では、発酵工程で得られたビール中間品をろ過しビールを得る。なお、ろ過工程は必ずしも必要な工程ではない。

[0071] アルコール飲料としては、ビール又はその他雑酒であることが好ましい。ここで、ビールとは、麦芽を原料とし、発酵工程を経て製造されるアルコール飲料をいい、原料である麦芽の使用比率やアルコール濃度は問わない。すなわち、ビールには、麦芽の使用比率が 66. 7%未満である、いわゆる発泡酒も含まれる。その他雑種とは、原料に麦芽を使用せずに、ビールと同様の製造方法で得られるアルコール飲料であり、例えば、麦芽の代わりにエンドウタンパク質を原料としたアルコール飲料などが挙げられる。実施例

[0072] 以下、本発明の実施例を説明する。なお、本発明は、これらの実施例により限定されるものではない。

[0073] (実施例 1： DNAアレイの作製）

醸造用酵母としてサッカロマイセス 'パストリアヌス'ヴアイへンステフアン 34/70を用いて、醸造用酵母のランダムゲノムライブラリーを作製した。

[0074] 醸造用酵母力のゲノム DNAの抽出及び精製は、公知の方法 (例えば、「酵母遺伝子実験マ-ユアノレ（Method in Yeast Genetics A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual)」（大矢禎ー監修、丸善株式会社、 p. 113— 11 9)に記載の方法）に準じて行った。

[0075] ランダムゲノムライブラリーの作製は、次のように行った。 1) DNA断片化装置 (Hyd roShear)によってゲノム DNAを断片化した。 2)得られた DNA断片を電気泳動したァガロースゲルから、約 2. 5kbpの DNA断片を切り出した。 3) DNA断片の末端を平滑ィ匕した後、 pUC 19ベクターに連結した。 4)得られた組換えベクターを大腸菌に導入し、得られたコロニーよりグリセロールストックを作製した。 5)グリセロールストックより LB培地（lOgZLバタトトリプトン、 5gZL酵母エキス、 lOgZL塩ィ匕ナトリウム、 pH7. 0) (液体培地）に大腸菌を移植し、約 20000のプラスミドクローンを抽出した。各ブラスミドクローンは約 2. 5kbpのゲノム DNA断片を含むので、抽出したプラスミドクローン全体は約 50Mbp (2. 5kbp X 20000クローン）のゲノム断片を含み、ゲノムサイズ 24〜26Mbpの下面ビール酵母ゲノムを約 2. 0の冗長度で保有して!/、たと推定される。

[0076] (2)ランダムゲノムライブラリーの評価：

ランダムゲノムライブラリーの評価は、次のように行った。 1)プラスミド DNAを制限酵素 BamHIで消化した後、ァガロースゲル電気泳動を行った。 2) 96穴プレート 8枚に分注されたプラスミド DNAを铸型として、ベクタープライマーによる塩基配列解析を行った。その結果、約 90%のクローンは、ゲノム DNAの挿入断片を有することが確認された。すなわち、作製される DNAアレイの実質的な冗長度は約 1. 8 (2. 0 X 0 . 9)になると推定される。

[0077] (3) DNAアレイの作製：

図 3は、実施例 1で作製した DNAアレイを模式的に示す平面図である。図 3に示されるように、実施例 1で作製した DNAアレイ 30では、 12行 X 4列（計 48個）のブロック 4が基板 1上に配列している。図 4は、 DNAアレイ 30のブロック 4の一つを拡大して模式的に示した平面図である。ブロック 4はプラスミド 2又は既知遺伝子 3が結合した 21 X 21個のスポットから構成されている。既知遺伝子 3が結合した 21個のスポットは、各ブロック 4において、 DNAアレイ 30の短辺方向の最端の一列を構成している。なお、図 4では、ブランクは便宜上、既知遺伝子 3として示している。異なるスポットに結合して、る既知遺伝子 3は、互、に種類が異なって、てもよ!/、。

[0078] DNAアレイ 30の作製は、プラスミド 2を各ブロック 4の 2〜21行目のスポットに、既知遺伝子 3を各ブロック 4の 1行目のスポットに固定ィ匕することにより行った。基板 1としてはガラス基板を用い、固定ィ匕は、アルカリが含有されている固定液に溶解したプラスミド 2又は既知遺伝子 3を、表面処理 (ポリリジン処理)を施したガラス基板上にスポッティングすることにより行った。

[0079] 既知遺伝子 3としてはサッカロマイセス'セレビシェ由来のものを用い、これを PCR で増幅させた DNAを固定ィ匕した。 DNAアレイに固定ィ匕した既知遺伝子の遺伝子名、機能、及び PCR増幅において使用したプライマーの種類は下記 1)〜10)のとおりである。

1)遺伝子名： ACT1、機能：ァクチン生成、プライマー：（5， - TCGGTAG ACC AA GACACCAA一 3，、 5，一 CCTTACGG AC ATCG AC ATC A— 3，）

2)遺伝子名： ATF1、機能：酢酸エステル合成、プライマー：（5， -GCCACATCC AGTGCATGATT- 3，、 5， - TAGTTGTG AGCGGC AATCTG 3，）

3)遺伝子名： ATF2、機能：酢酸エステル合成、プライマー：（5， -CGAAGAGGC CTAATTGGAGA- 3，、 5， - TC ACCGTTGTCGTACG ATTC 3，）

4)遺伝子名： Lg— ATF1、機能:酢酸エステル合成、プライマー：（5， -GGTGTG ATTCTCAACGAGCA- 3，、 5， - AACGG AGTG ATGGTGC ACTT - 3， )

5)遺伝子名： EHT1、機能：脂質代謝、プライマー： (5' - TACC AG AGGTTGTG CACGTT- 3，、 5， - TCTGC AATTGCCTTGGTAGC 3，）

6)遺伝子名：IAH1、機能：エステラーゼ活性、プライマー：（5，— GATCAGTATG CTCTTGGAGC一 3，、 5，一 GTTGTTGCCAAGCATCACCA一 3，）

7)遺伝子名： LEU4、機能:イソプロピルマレート合成、プライマー：（5， -ACGGT GGAAGCATTAACAGG一 3，、 5，一 GGATCCAATGGCAAGTATGG一 3，）

8)遺伝子名：OLEl、機能:脂肪酸の不飽和化、プライマー： (5' -CTCCGTTTT CTACTACGCTG一 3，、 5，一 GTTGGGTCGTATTGGTACCA- 3， )

9)遺伝子名： SSU1、機能：亜硫酸塩の輸送、プライマー：（5， -TGCTCTTACG AGGCAGTTTG 3，、 5， - ATGGC ATGC AGCC ACGTTAA - 3， )

10)遺伝子名： Lg— FL01、機能:凝集性遺伝子、プライマー：（5， -CAACAAA GCAAACCAAGGGG— 3，、 5， - TTACCATACGATTGCC AGCA - 3 ' )

[0080] 各ブロック 4において、 DNAアレイ 30の短辺方向の最端の一列を構成するスポットに ίま、 1 :ACT1、 2 :ATF1、 3 :ATF2、 4 :Lg— ATF1、 5 :EHT1、 6 :IAH1、 7 :L EU4、 8 : OLEl、 9〜18 :ブランク、 19 :pUC19 (コントロール）、 20 : SSU1、 21 :Lg — FLO 1を順に固定化した。すなわち、 DNAアレイ 30には、 528個（11 X 4列 X 12 行）の既知遺伝子（コントロールを含む）と、 20160個（20 X 21 X 4列 X 12行）個のプラスミドとがガラス基板表面に固定ィ匕されている。なお、 ACT1遺伝子は、醸造用酵母の種類又は状態に関わらず構成的に発現している遺伝子である。

[0081] (4)リボソーム RNA遺伝子領域の特定：

上記 DNAアレイ上のゲノム DNA断片中に重複して存在するリボソーム RN A遺伝子領域を特定するために、下記に示した配列を有する DNA断片を 18Sリボソーム R NA遺伝子及び 28Sリボソーム RNA遺伝子用のプライマーとして、また、下面ビール酵母のゲノム DNAを铸型として用いて、下面ビール酵母のゲノム DNA中の 18Sリボソーム RNA遺伝子領域及び 28Sリボソーム RNA遺伝子領域に相補的な DNA断片を PCRで増幅させた。

1) 18Sリボソーム RNA遺伝子用プライマー：

(5' - CTGGTTGATYCTGCCAGT- 3 \ 5 ' - CYGCAGGTTCACCTACR G— 3，） 2) 28Sリボソーム RN A遺伝子用プライマー：

(5' RCATCGATGAAGAACGYWG— 3，、 5， - MRGGCTKAATCTCAR YRGATCG— 3，）

[0082] 得られた DNA断片を Cy5で標識してプローブとし、このプローブを用いて上記 DN Aアレイ上でハイブリダィゼーシヨンを行った。ハイブリダィゼーシヨンは、公知の方法 (例えば、「DNAアレイと最新 PCR法」（秀潤社）に記載の方法）に従って、 62°Cの恒温槽で 14時間行った。

[0083] その結果、基板に固定化した DNA断片 20160個の内、 1129個（約 6%)の DNA 断片をリボソーム RNA遺伝子領域であると判断し、以降の解析ではマスクすることにした。

[0084] (実施例 2：下面ビール酵母の発酵途中の遺伝子発現解析）

(1)トータル RNAの抽出：

下面ビール酵母を用いた発酵試験を以下の条件で行った。

，麦汁エキス濃度：約 11%

•麦汁容量： 2. 5L

，麦汁溶存酸素濃度：約 5〜： LOppm

•発酵温度：約 13°C

•酵母投入量： 10〜12g湿酵母菌体

•発酵回数： 3回

[0085] 発酵液を経時的にサンプリングし、浮遊酵母数 (酵母増殖量)の経時変化を調べた。発酵初期、中期及び後期に浮遊している酵母をサンプリングした。具体的には、発酵開始力も 47、 95及び 143時間が経過した時点でサンプリングを行った。図 5は、浮遊酵母数の経時変化を示すグラフである。

[0086] 上記の 3種の発酵途中の酵母のそれぞれから、次のようにトータル RN Aを抽出した。 1)発酵液より回収した酵母 (約 lg)を遠心チューブごと液体窒素で凍結させた。 2) 凍結して!/ヽる状態の酵母をクライオプレス (マイクロテック · -チオン社製)で磨砕した (30秒間の磨砕を 3回行った）。 3)磨砕物を約 10mlの Isogen™ (二ツボンジーン社製）に溶解し、付属のマニュアルに従ってトータル RNAを精製した。 [0087] 発酵後期の酵母力抽出したトータル RNAについて、吸光度測定によってその濃度を、また、バイオアナライザー（Agilent 2100 Bioanalyzer)によってその品質をチェックした。濃度は、 231. 79ngZ であった。図 6は、抽出したトータル RNA の純度をバイオアナライザーで分析した結果を示すチャートである。図 6に示されるように、抽出したトータル RNA中の 18S及び 28Sリボソーム RNAの比率は 1 : 1. 6であり、かつ、 28Sリボソーム RNA由来の分解産物は検出されなかった。これらの結果より、高純度のトータル RNAが抽出されたことが分かる。

[0088] (2)蛍光色素による標識：

上記トータル RNAに対し、オリゴ dTプライマーをァニールさせた後、 aminoallyl- dUTP存在下で逆転写酵素反応を行!、、 aminoallyl— dUTPが導入された cDNA を調製した。カップリング反応を用いて cDNAを Cyanine色素（Cy3又は Cy5)で標識した。一個の DNAアレイ上のプラスミド及び既知遺伝子にハイブリダィズさせる 2 種の cDNAの一方を Cy3 (緑色色素）で、他方を Cy5 (赤色色素）で標識した。

[0089] ハイブリダィゼーシヨン：

一個の DNAアレイにつき 2種の蛍光色素標識 cDNAを、 DNAアレイ上のプラスミド及び既知遺伝子に競合的にハイブリダィズさせた。ノ、イブリダィゼーシヨンは、公知の方法 (例えば、「DNAアレイと最新 PCR法」（秀潤社）に記載の方法）に従って、 62 °Cの恒温槽で 14時間行った。

[0090] (3)蛍光強度の測定：

ノヽイブリダィゼーシヨン後、 DNAアレイを洗浄し、スライドスキャナー（Agilent Sea nner、 Agilent社製）でシグナルを取り込んだ。得られたシグナルの画像データは、専用ソフト FeatureExtraction(Agilent社製）を用いて数値データに変換した。ノックグラウンドにはネガティブコントロールの蛍光値を用い、各スポットの蛍光値力差し引いた。サンプルとコントロール（pUC19)間のノーマライゼーシヨンは、グローバルノーマライゼーシヨン法 (全体のスポットを用いて正規化する方法）によって行った。

[0091] 上記ノ、イブリダィゼーシヨン実験の良否の確認は、スキャニング後の画像における ACT1遺伝子の 48個（4列 X I 2行)分の蛍光強度力も判断した。図 7は、 DNAァレィの短辺方向の最端の一列を構成する 4ブロックについて検出された蛍光を示す写真に対応する図である。図 7において、既知遺伝子 (ブランクを含む。）が結合したスポットは、各ブロック内で、 DNAアレイの短辺側の最端の一列を構成している。図 7 に示されるように、構成的に発現している ACT1遺伝子（図中、白色の丸枠でその位置を示している。）の蛍光強度がどのブロックにおいてもほぼ一定であることから、ノヽイブリダィゼーシヨン実験の結果が良であると判断した。

[0092] (4)配列解析：

3回の発酵試験で得られた DNAアレイ上の蛍光パターンに基づ、て、クラスタリングを行った。既知遺伝子として、アルコールァセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子 ATF1を固定ィ匕したスポットと蛍光パターンが同調する 7つのスポットが選ばれた。これらのスポットについて、ランダムゲノムライブラリ一中の相当する DNA断片の配列解析を行ヽ、 BLAST等を用いたデータベースリサーチカゝら遺伝子の機能を推定した。その結果、 6つのゲノム断片（SBc40I13、 SBc48I02、 SBcl4M04、 SB c43M13、 SBc27E10及び SBc22M06)力らは、表 1の 10個の遺伝子がァノテーシヨンされたが、 1つのゲノム断片（SBcl7A14)は非サッカロミセス'セレピシェタイプであった。図 8は、 DNAアレイ上の蛍光パターンに基づいて行ったクラスタリングの結果を示す図である。図 8において、 control02は ATF1遺伝子を表す。

[0093] [表 1]

また、クラスタリングにより、発酵工程中に遺伝子発現が上昇し続けるスポットが 5つ選ばれた。これらのスポットに対応する 5つのゲノム断片（SBc25J18、 SBc35O20、 SBc42N04、 SBc32N16及び SBc33P17) ίま、酉己歹 U解析により、サッカロミセス 'セレピシェに同等する DNA断片であることが明ら力となった。図 9は、サッカロミセス'セレピシェのゲノム DNA中における SBc33P17の領域の位置を示す図である。図 9に示されるように、 SBc33P17は、サッカロミセス'セレピシェの第 XV染色体の 32250 bp〜34492bpの領域に相当する力本領域にはオープン 'リーディング 'フレームが存在せず、 non— coding領域であった。 [0095] (実施例 3 :蛍光標識二次元ディファレンス電気泳動（2D— DIGE)による、下面ビール酵母の発酵途中で発現するビールの香味に関与する遺伝子の同定）

[0096] 下面ビール酵母にメチォニンを添加して発酵させると、酵母の生産する硫化水素の量が減少し、望ましいビールの香味が得られることが知られている。そこで、下面ビール酵母の発酵途中にメチォニンを添加することにより発現量が上昇するタンパク質を蛍光標識二次元ディファレンス電気泳動（2D— DIGE)で解析し、ビールの香味に関与する醸造用酵母の遺伝子の同定を試みた。

[0097] (1)粗タンパク質の抽出：

メチォニン（lOppm)の添加又は無添カ卩における下面ビール酵母を用いた発酵試験を、以下の条件で行った。

，麦汁エキス濃度：約 11%

•麦汁容量： 2. 5L

，麦汁溶存酸素濃度：約 5〜： LOppm

'発酵温度： 15°C

•酵母投入量： 20〜24g湿酵母菌体

[0098] 発酵開始から 23時間が経過した時点で、メチォニンの添加（lOppm)又は無添カロ状態で発酵に用いた酵母細胞をそれぞれ回収し、以下の粗タンパク質の抽出に用いた。まず、回収した各 lOmg (乾燥重量）の酵母細胞に、 200 Lの可溶化バッファ一（7M尿素、 2Mチォ尿素、 4%CHAPS、 1%DTT、 O. 5%Pharmalyte™)をカロえ、室温で 5分間撹拌 (ボルテックス)した後、酵母細胞を氷浴中で超音波破砕（1秒 X 10回）した。更に、室温で 30分間振とうした後、遠心分離 (5分 X 10, OOOg)を行い、上清のタンパク質可溶ィ匕画分を粗タンパク質とした。上清中のタンパク質の含量は Bradford法で定量した。

[0099] (2)二次元電気泳動用サンプルの調製 (粗タンパク質の蛍光標識）：

可溶ィ匕した各粗タンパク質（50 g)には、 DIGE用に開発された 400pmolの蛍光色素 CyDye DIGE flours (アマシャムバイオサイエンス社）をカ卩えて撹拌し、 30分間氷浴で反応させることによって蛍光標識した。

[0100] この CyDye DIGE floursには、励起 Z蛍光波長の異なる 3種類の色素（Cy2、 Cy3、 Cy5)があり、これらは分子量及び電荷が等しくなるように開発されている。このため、いずれの蛍光色素で標識しても同一のタンパク質であれば二次元電気泳動におけるゲル中での移動度が一致する。

[0101] 本実験では、 lOppmのメチォニンを添加した発酵群における粗タンパク質を Cy3 で標識し、メチォニン無添加の発酵群における粗タンパク質を Cy5で標識した。標識反応は、 1 Lの L—リジンをカ卩えて、 10分間氷浴で反応させることによって停止させた。こうして得られた 2種類の標識粗タンパク質は、等量ずつ混合し、この標識粗タンノク質混合サンプルを 1枚のゲルで同時に二次元電気泳動した。

[0102] (2)二次元電気泳動

二次元電気泳動は、以下の条件で 3回繰返して行った。二次元電気泳動の一次元目は、 pH4〜7の固定化 pH勾配等電点ゲル（以下、等電点ゲル；アマシャムバイオサイエンス社)を用い、 150 gの標識粗タンパク質混合サンプルを二次元電気泳動システム（multiphor II；アマシャムバイオサイエンス社）で分画した。

[0103] 一次元目の泳動後、等電点ゲルは DTTで平衡ィ匕し、引き続きョードアセトアミドと S DSとでァセチル化を行い、二次元目の泳動に用いた。二次元目の電気泳動は、 12 %の SDSポリアクリルアミドゲルを用いて、 2100Vhで泳動した。泳動終了後、ゲルをイメージアナライザー（Typhoon9400；アマシャムバイオサイエンス社）で直ちにスキャンし、メチォニンの添加'不添加で発現量に影響が生じたタンパク質を専用のソフトウェアで解析した。図 10は、二次元電気泳動で分画したタンパク質のスポットを表す図であり、矢印で示したスポットはメチォニンの添加でダウンレギュレートしたタンノク質である。

[0104] (3)メチォニンの添カ卩でダウンレギュレートしたタンパク質の解析

二次元電気泳動で分画したタンパク質が蛍光を発するゲル中の領域 (スポット）の中で、 Cy3 (lOppmのメチォニンを添加した発酵群の標識)の蛍光強度が Cy5 (メチォニン無添加の発酵群の標識)の蛍光強度に比べて有意に減少するスポットに着目した。尚、統計的有意差有りの判定は、 0サンプル間（繰り返し 3回の試験）のスポットの標準偏差が 30%未満であり、 ii)T検定で p< 5%の有意差があり、 iii)対照に対するスポット強度比率が 0. 67%未満であること、を条件とした。 [0105] 蛍光強度を解析した上記ゲルから、 Cy3の蛍光強度が Cy5の蛍光強度に比べて有意に減少するスポットについては、そのスポットのゲル断片を切り出し、トリプシン消ィ匕後に質量分析した後に、 Mascot (http : ZZwww. Matrixscience. com)でサッカロミセス ·セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)に対して検索を行ヽ、タンパク質の同定を行った。表 2は、メチォニンの添加で統計的有意にダウンレギュレートしたタンパク質を示す。

[0106] [表 2] タンパク質名遺伝子名シノニム

メチォニンシンターゼ MET6 YER091 C

S-アデノシルメチォニンシンタ一ゼ SAM 1 YLR1 80W

[0107] その結果、メチォニン代謝に関連するメチォニンシンターゼ（methionine syntha se)と S—アデノシノレメチォニンシンターゼ (S— adenosyl methionine synthase )の 2種類のタンパク質が同定された。この結果は、 MET6遺伝子の発現後、翻訳後修飾により 2つのアイソザィムが生成したと推察された。当該現象は、パン酵母 (サッカロマイセス'セルピシェ)では報告がなぐ醸造用酵母に特有の現象であることが判明した。

産業上の利用可能性

[0108] 本発明の醸造用酵母の遺伝子を同定する方法、 DNAアレイ、醸造用酵母の選抜方法、アルコール飲料の製造方法は、酵母の発酵を用いる酒類の製造に利用できる

Claims

請求の範囲 [1] アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、比較対照となる 1対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、前記 1対の発酵途中醸造用酵母を比較して、 mR NAの発現量に差のある遺伝子（G1)を同定するステップと、を含む、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、前記 G1の同定は、 (1)前記 1対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータル RNAを抽出するステップと (2)—方の前記トータル RNAから第 1の蛍光色素で標識した cDNA又は cRNAを得、他方の前記トータル RNAから第 2の蛍光色素で標識した cDNA又は cRNAを得るステップと、 (3)基板上の複数のスポットに、前記醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノム DNA断片を含むプラスミドが結合した DNAアレイ上で、前記第 1の蛍光色素で標識した cDNA及び第 2の蛍光色素で標識した cDNA、又は、前記第 1の蛍光色素で標識した cRNA及び第 2の蛍光色素で標識した cRNA、を競合ハイブリダィズさせるステップと、 (4)前記スポットのそれぞれにおいて、前記第 1の蛍光色素が発する蛍光と、前記第 2の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、 (5)前記第 1の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第 2の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、 (6)蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノム DNA断片の配列から前記 G1を同定するステップと、を備える方法により実施される、方法。 [2] アルコール飲料の香味に影響を与え得る要因を、醸造用酵母種又は発酵条件から選択し、選択された要因に基づいて発酵を行うことにより、 1対の発酵途中醸造用酵母を得るステップと、前記 1対の発酵途中醸造用酵母を比較して、 mRNAの発現量に差のある遺伝子 (G1)とタンパク質の発現量に差のある遺伝子 (G2)とを同定するステップと、同定した前記 G1と G2のうち共通の遺伝子を選択するステップと、を含む、アルコール飲料の香味に関与する醸造用酵母の遺伝子を同定する方法であって、前記 G1の同定は、

(1)前記 1対の発酵途中醸造用酵母の双方からトータル RNAを抽出するステップと

(2)—方の前記トータル RNAから第 1の蛍光色素で標識した cDNA又は cRNAを得、他方の前記トータル RNAから第 2の蛍光色素で標識した cDNA又は cRNAを得るステップと、

(3)基板上の複数のスポットに、前記醸造用酵母と同一又は異なる醸造用酵母のゲノム DNA断片を含むプラスミドが結合した DNAアレイ上で、前記第 1の蛍光色素で標識した cDNA及び第 2の蛍光色素で標識した cDNA、又は、前記第 1の蛍光色素で標識した cRNA及び第 2の蛍光色素で標識した cRNA、を競合ハイブリダィズさせるステップと、

(4)前記スポットのそれぞれにおいて、前記第 1の蛍光色素が発する蛍光と、前記第 2の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、

(5)前記第 1の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第 2の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、

(6)蛍光の強度に差のあるスポットに結合しているプラスミド中のゲノム DNA断片の配列から前記 G1を同定するステップと、を備える方法により実施され、

前記 G2の同定は、

(i)前記 1対の発酵途中醸造用酵母の双方から粗タンパク質を抽出するステップと、

(ii)一方の前記粗タンパク質から第 3の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得、他方の前記粗タンパク質力ゝら第 4の蛍光色素で標識した粗タンパク質を得るステップと、

(iii)前記第 3の蛍光色素で標識した粗タンパク質と前記第 4の蛍光色素で標識した粗タンパク質とを混合した混合物を、二次元電気泳動で分画するステップと、

(iv)分画したタンパク質に結合する前記第 3の蛍光色素が発する蛍光と、前記第 4の蛍光色素が発する蛍光とを測定するステップと、

(V)前記第 3の蛍光色素が発する蛍光の強度と、前記第 4の蛍光色素が発する蛍光の強度とを比較するステップと、 (vi)蛍光の強度に差のあるタンパク質を解析して、該タンパク質をコードする前記 G2 を同定するステップと、を備える方法により実施される、方法。

[3] ステップ（3)で用いる DNAアレイにおいて、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子が結合した他のスポットが更に存在する、請求項 1又は 2に記載の方法。

[4] ステップ（3)で用いる DNAアレイにおいて、醸造用酵母のゲノム DNA断片を含むプラスミドが結合した複数のスポットと、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子が結合したスポットとから構成されるブロックが、基板上に複数配列している、請求項 3に記載の方法。

[5] ステップ（3)で用いる DNAアレイにぉ、て、前記ブロックが等し、形状を有しており、それぞれのブロックの同じ位置に、機能が既知の醸造用酵母の遺伝子が結合したスポットが存在する、請求項 4に記載の方法。

[6] ステップ（3)の醸造用酵母が、下面ビール酵母である請求項 1〜5のいずれか一項に記載の方法。

[7] 請求項 1〜6のいずれか一項に記載の方法により同定された、アルコール飲料の香味に関与する遺伝子力 S、基板上の複数のスポットに結合した DNAアレイ。

[8] 香味基準の醸造用酵母の選抜方法であって、

(a)発酵途中の醸造用酵母から、トータル RNAを抽出するステップと、

(b)前記トータル RNAから蛍光色素で標識した cDNA又は cRNAを得るステップと、

(c)請求項 7に記載の DNAアレイ上で、蛍光色素で標識した前記 cDNA又は前記 c RNAをハイブリダィズさせるステップと、

(d)前記 DNAアレイのスポットのそれぞれにお、て、蛍光色素が発する蛍光を測定するステップと、

(e)各スポットにおける蛍光色素の蛍光の強度に基づいて、発酵途中の醸造用酵母の遺伝子の発現状態を評価するステップと、を備える方法。

[9] 請求項 8に記載の方法で選抜された醸造用酵母を使用するアルコール飲料の製造方法。

[10] 請求項 9に記載の方法で製造されたアルコール飲料。