JP5158944B2 - 酵母ゲノム解析による酵母菌株判定法 - Google Patents
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Description
また、ビール酵母のゲノム解析によりS.cerevisiae(サッカロミセス・セレビシアエ(SC))型と非S.cerevisiae型(サッカロミセス・バヤナス(S.bayanus)(SB))型の配列が混在するキメラ染色体の存在を示しているが(特許文献1、非特許文献1、4、5、6)、しかし第XVI染色体以外は、どの領域で混在が生じているか明らかにされていない。また、DNAマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション実験の結果、ビール酵母菌株間で染色体の構造が異なることが報告されている(非特許文献2)しかし、各遺伝子のハイブリダイズする強度に変化がなかった場合には、検出することはできないと考えられる。
ビール酵母のゲノム解析によりDNAマイクロアレイを作製し、DNA-DNAハイブリダイゼーションを行ったことが報告されている(特許文献1、非特許文献1)。この結果、高いプローブ輝度を示した遺伝子はコピー数が高くなっている可能性があることを示しているが(特許文献1、非特許文献4、5、6)、染色体上のどの部位がそれに該当するのかは明らかになっていない。またビール酵母のゲノムのSNPを利用して好気成分産生量の違いを検出したことが報告されているが(特許文献2、3)、ゲノム構造の相違と好気成分産生量との関係は明らかになっていない。
従って、ビール酵母の各菌株に固有のゲノム配列や染色体構造については依然として不明な部分が多く、またビール酵母の菌株、特に下面ビール酵母の菌株を明確、簡便かつ迅速に判別できる方法も求められている。
また、本発明の目的は、ビール酵母の菌株判別方法に有用な、各菌株に固有のゲノム配列及び/又は染色体構造を有する領域を特異的に増幅することができるプライマーを提供することである。
さらに、本発明の目的は、ビール酵母、特に下面ビール酵母のビール醸造特性を予測する方法を提供することでもある。
好ましくは、プライマー対が、下面ビール酵母の第III染色体、第VII染色体、第VIII染色体、第X染色体及び第XIV染色体からなる群より選択される染色体DNA由来の塩基配列を有する。
より好ましくは、プライマー対が、下面ビール酵母の第X染色体DNA由来の塩基配列を有する。
また好ましくは、プライマー対として、配列番号10、11、20、22及び23のいずれかの塩基配列を有するヌクレオチドと、配列番号12、13、14、15、21及び24のいずれかの塩基配列を有するヌクレオチドとを組合せて用いる。
より好ましくは、配列番号10のヌクレオチドと配列番号12のヌクレオチドとの組合せ、配列番号10のヌクレオチドと配列番号13のヌクレオチドとの組合せ、配列番号11のヌクレオチドと配列番号12のヌクレオチドとの組合せ、及び配列番号11のヌクレオチドと配列番号13のヌクレオチドとの組合せを用いる。
また、本発発明は、ビール酵母のゲノムDNA由来の塩基配列を有するヌクレオチドを固定したDNAマイクロアレイを用いて、複数の下面ビール酵母DNAのシグナルと対照ビール酵母菌株DNAのシグナルを測定する工程、複数の下面ビール酵母DNAのシグナルと対照ビール酵母菌株DNAのシグナルの強度比を算出する工程、および、前記強度比を用いて系統樹を作成する工程、を含む、下面ビール酵母の菌株を分類する方法を提供する。
さらに、本発明は、複数の下面ビール酵母に予めビール醸造特性の分かっている下面ビール酵母を含む上記方法である。また、本発明は上記方法によって分類された下面ビール酵母菌株のビール醸造特性を予測する方法でもある。
また、本発明により、ビール酵母の菌株、特に下面ビール酵母の菌株を明確、簡便かつ迅速に判別するための指標を提供することができる。
さらに本発明により、特定が十分に知られていない下面ビール酵母の醸造特性を予測することができる。
歴史的には、「上面ビール酵母」と「下面ビール酵母」との区別は、ビール醸造過程で発酵後に見られるビール酵母の動態(表面付近に浮き上がる又は凝集して沈む)により区別されてきたが、今現在、当業者間では、下面ビール酵母と上面ビール酵母とは生物学的分類において異なる種であり、上面ビール酵母は主としてサッカロミセス・セレビシアエ(S. cerevisiae)に分類され、下面ビール酵母はサッカロミセス・セレビシアエとサッカロミセス・バヤナス(S. bayanus)との交雑体であってサッカロミセス・パストリアヌス(S. pastorianus)に分類されるという見解が一般的となっている。よって、本明細書において「ビール酵母のゲノムDNA」とは、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)及びサッカロミセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)のゲノムDNAに加えて、サッカロミセス・バヤナス(S. bayanus)のゲノムDNAをも含むものとする。
本発明では、ビール酵母の菌株によっては特定の染色体がS.cerevisiae型染色体、S. bayanus型染色体あるいはキメラ染色体(S.cerevisiae型塩基配列とS. bayanus型塩基配列が同一染色体上で見られる染色体)となっていることを利用して菌株を判別する。
酵母からのゲノムDNA抽出は、公知の方法のいずれを用いて行ってもよい。例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, P130(1990)などに記載の方法が挙げられる。また、DNA抽出用のキットやカラム等、例えばQiagen社のQiagen Genomic-tip 500/G等を用いて行うこともできる。本発明では、抽出したゲノムDNAをそのまま、核酸増幅反応の鋳型として用いることができる。例えば、PCR法により増幅する場合には約1 ng/mlの濃度で用いることができる。
本発明の判別方法において行う核酸増幅反応は、本技術分野で公知の核酸増幅反応のいずれかを用いることができ、PCR(Polymerase Chain Reaction)法を用いるのが好ましい。核酸増幅反応に用いる緩衝液、酵素、反応条件その他については、各核酸増幅反応について当業者が通常用いるものを選択することができる。本発明の判別方法では、PCR法により核酸増幅反応を行うことが特に好ましく、例えばSaikiらが開発した方法(Science 230, 1350(1985))を参考にして実施することもできる。
適切な増幅対象領域としては、キメラ染色体(S.cerevisiae型塩基配列とS. bayanus型塩基配列が同一染色体上で見られる染色体)の存在が推定される染色体が好ましく、例えば下面ビール酵母の第III染色体、第VII染色体、第VIII染色体、第X染色体、第XIV染色体などの染色体上でS. cerevisiae型塩基配列とS. bayanus型塩基配列との組換えが起こっている箇所を含む領域が好ましい。より好ましい増幅対象領域は第X染色体上でS. cerevisiae型塩基配列とS. bayanus型塩基配列との組換えが起こっている箇所を含む領域、最も好ましくは第X染色体右腕の領域である。
本発明において「S.cerevisiae型(SC型)塩基配列」とは、FASTA、BLASTといった配列比較アルゴリズムを用いて、Saccharomyces Genome Database(SGD)(http://www.yeastgenome.org/)に公開されているS.cerevisiaeのゲノム塩基配列と比較した場合に95%以上の相同性を示す塩基配列を指し、「非S.cerevisiae型塩基配列」又は「S. bayanus型(SB型)塩基配列」とは、同様にS.cerevisiaeのゲノム塩基配列と比較した場合に95%未満の相同性を示す塩基配列を指す。
当業者であれば、Saccharomyces Genome Database(SGD)(http://www.yeastgenome.org/)やワシントン大学のGenome Sequencing Centerのホームページ(http://genomeold.wustl.edu/projects/yeast/)等で公開されているS.cerevisiaeやS.bayanus等のゲノム塩基配列に基づいて適切なSC型又はSB型塩基配列特異的なプライマー対を設計することができるであろう。本技術分野で通常用いられるプライマー設計用プログラムを用いて設計してもよい。
PCRプライマーとしての適当な長さは、一般的には、15merから50merといわれているが、通常は、20merから35merのものが使用される。これらのプライマーの5'末端側に1 bp〜10 bpの任意の塩基配列が付加されていても、又は標識(ビオチンなど)が付加されていても、本発明の方法のためのプライマーとして用いることができる。
本発明のプライマー対を構成するSC型塩基配列特異的なプライマーとしては、例えば配列番号10(F)、配列番号12(R)、配列番号14(R)、配列番号20(F)、配列番号21(R)などの塩基配列を有するものが挙げられ、SB型塩基配列特異的なプライマーとしては、例えば配列番号11(F)、配列番号13(R)、配列番号15(R)、配列番号22(F)、配列番号23(F)、配列番号24(R)などの塩基配列を有するものが挙げられる。
PCR反応条件は、一般的な条件に従って行うことができる。また、使用するプライマーのGC含量や長さ及び使用する酵素(ポリメラーゼ)の性質などを考慮して、最適な条件(温度、時間、サイクル数)を決定してもよい。キットを用いる場合には、その供給元が提供する使用説明書に沿って行ってもよい。具体的には、熱変性過程92℃〜99℃にて1秒間〜120秒間;アニーリング過程42℃〜65℃にて1秒間〜2分間;伸長過程50℃〜75℃にて1秒間〜20分間のサイクルを1〜50回といったPCR条件を用いることができる。また、アニ−リング過程と伸長過程は、同一温度で行うこともできる。
アガロース電気泳動によって分離したポリヌクレオチドの大きさの違いは、一般に用いられる方法によって検出することができる。例えば、エチジウムブロマイド等を用いて増幅産物のバンドを可視化することによって検出することができる。
DNAマイクロアレイは、あらかじめ調製したヌクレオチドを共有結合などによって基板上に固定化したスポット法によるものであってもよく、又はフォトリソグラフィー技術やコンビナトリアル合成技術を利用してin situ合成法により基板上でヌクレオチドを直接合成したものであってもよい。基板の素材は、ヌクレオチドを安定して固定できるものであればよく、通常用いられる合成樹脂やガラス等でもよい。また基板の形状、ヌクレオチドと基板との固定化方法などは、常法で用いられるものを任意に選択することができる。
DNAマイクロアレイは、アフィメトリクス社やアジレント社等の市販S. cerevisiae用マイクロアレイを用いることもでき、あるいは、Saccharomyces Genome Database(SGD)(http://www.yeastgenome.org/)やワシントン大学のGenome Sequencing Centerのホームページ(http://genomeold.wustl.edu/projects/yeast/)等で公開されているS.cerevisiaeやS.bayanus等の酵母のゲノム塩基配列や下面ビール酵母の判別対象の菌株のゲノム解析を行って決定したゲノム塩基配列に基づいて固定化するオリゴヌクレオチド鎖を設計して作製したカスタムアレイを用いることもできる。
DNAマイクロアレイに固定化するヌクレオチドは、上述するようなビール酵母のゲノムDNAの塩基配列に由来する長さが10b〜50kb、好ましくは20b〜100bのヌクレオチド鎖又は前記ヌクレオチド鎖に相補的なヌクレオチドである。固定化するヌクレオチドは、既知の遺伝子特異的な塩基配列に基づいて設計してもよいが、菌株固有の染色体構造を識別するという観点からは、例えば図13に示すように、1以上の染色体の一部領域又は全領域の塩基配列を一定の長さに分割して網羅するように設計するのが好ましい。本発明のDNAマイクロアレイに固定化するヌクレオチドとしては、例えば、ビール酵母の全染色体ゲノムDNA由来の塩基配列を網羅的に有するものが挙げられる。
マイクロアレイへのプローブのハイブリダイゼーション及び輝度の検出、シグナル値の抽出及び移動平均の計算は、例えばアフィメトリクス社製Gene Chip Operating Software及びTiling Analysis Softwareを用いて行うことができる。
あるいは、特定の菌株(対照株)のゲノム由来のヌクレオチドを固定化したDNAマイクロアレイを用いた場合、対照株と相同性が高い塩基配列を有するプローブは高い輝度を示し、対照株と相同性が低い塩基配列を有するプローブは低い輝度を示す。よって、特定の染色体についてプローブ輝度のシグナル値に差異がある場合は(図14〜16)、判別対象の菌株の該染色体又はその一部のコピー数が異なることを意味する。その場合、プローブ輝度のシグナル値が大きく変化する部位は、対照株の塩基配列に対して相同性が高い塩基配列と相同性が低い塩基配列との切り替えが起こっている部位である可能性がある。
このようなデータの解析は、一般的な解析ソフト、例えば表計算ソフト(マイクロソフト社EXCEL 2000)やマイクロアレイ用データ解析ソフト(アジレント社 ジーンスプリングver7.3)を用いて行うことができる。
さらに、判別対象の複数の菌株から2株を選択し、各プローブ単独のシグナル値またはシグナル値の移動平均から、基準とする株を1とした変化倍率を求め、染色体毎に整列させた散布図とし、該2株の比較・判別を行うこともできる。
具体的には以下のようにして下面ビール酵母の分類およびそのビール醸造特性の予測を行うことができる。
以下の実施例によって、本発明の態様をより具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。
(1)下面ビール酵母ゲノムDNAの分離
出願人保有の下面ビール酵母BF1株から、ゲノムDNAを抽出し、制限酵素あるいは超音波処理することで、低分子化し、約40kbpのDNA断片をショ糖密度勾配遠心法等によって分離した。酵母のゲノムDNAの分離は、Qiagen社のQiagen Genomic-tip500/G(Cat. No. 10262) を用いて、QIAGEN Genomic DNA Handbook (August 2001) p44-47に記載されている手順でおこなった。
(2)コスミドライブラリーの作製
分離した下面ビール酵母由来の約40kbpのDNA断片をEPICENTRE社製のコスミドCopyControlpCC1FOSTM(EPICENTRE社Cat. No. CCFOS110)にライゲーションし、さらにin vitro packaging kitを用いて、ラムダファージ粒子にパッケージングした。下面ビール酵母由来DNAが挿入された各コスミドを、大腸菌EPI300-T1R株に形質導入し、下面ビール酵母のコスミドライブラリーを作製した。形質導入された大腸菌は、クロラムフェニコール耐性菌として選択した。
(3)プラスミドライブラリーの作製
分離した下面ビール酵母由来の約1〜3 kbpのDNA断片を、プラスミドpUC18 Sma I/BAP等とライゲーションさせ、ライゲーション反応物を、大腸菌 JM109等に形質転換させた。形質転換させた大腸菌はアンピシリン耐性等によって選択し、プラスミドライブラリーを作製した。
(1)コスミドDNAの分離
コスミドクローンを有する形質導入された大腸菌は、20μg/mlのクロラムフェニコール含有LB培地(1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 1% NaCl)で培養し、キアゲン社のQIAGEN-tip20(Cat. No. 10023) 等を用いて、QIAGEN Plasmid MiniHandbook (October 2001) p13に記載されている手順で、コスミドのDNAを分離した。
(2)プラスミドDNAの分離
プラスミドクローンを有する形質導入された大腸菌は、20μg/mlアンピシリン含有LB培地(1% Tryptone, 0.5% Yeast extract, 1% NaCl)で培養し、キアゲン社QIAGEN-tip20(Cat. No. 10023) 等を用いて、QIAGEN Plasmid MiniHandbook (October 2001) p10-12に記載されている手順で、プラスミドのDNAを分離した。
(3)DNA塩基配列の決定
分離されたコスミドDNAの末端DNA塩基配列は、pCC1TM/pEpiFOSTM Forward Sequencing Primer (EPICENTRE社Cat. No. F5FP010)あるいは、pCC1TM/pEpiFOSTM Reverse Sequencing Primer (EPICENTRE社Cat. No. F5RP010)をシークエンスプライマーとして用いて決定した。ジデオキシ反応はBeckmannCoulter社のGenomeLabTM Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit(Cat. No. P/N608120)等を用いた。シークエンサーは、BeckmannCoulter社のCEQ2000等を用いた。分離したプラスミドDNAの末端DNA塩基配列は、M13 forward プライマー(タカラバイオ Cat. No. 3887)あるいは、M13 Reverse プライマー (タカラバイオ Cat. No. 3830A) をシークエンスプライマーとして用いて決定した。
上記〔実験2〕で得られたDNAシークエンスデータから、下面ビール酵母ゲノムDNAの構築をおこなった。アセンブリ(DNA塩基配列断片を整列し、重ね合わせ、連結する作業)は、コンピューターソフトウエアであるArachneを用いておこなった。その結果、一連の塩基配列であるコンティグ(contig)を形成することができた。また、各コンティグ間の塩基配列が未定であっても、解析に用いた各プラスミド、各コスミドのクローンの情報をあわせることで、各コンティグを連結するスーパーコンティグ(supercontig)あるいは、スキャホールド(scaffold)を作製することができる。今回の結果、36個のスーパーコンティグを作製することができた(図1、表1)。
作製したスーパーコンティグから下面ビール酵母のゲノム構造を推定するため、まず、各スーパーコンティグからORF(オープンリーティングフレーム)を予測した。各スーパーコンティグの塩基配列中、翻訳開始コドンであるATGから翻訳終了コドンであるTAA、TAG、TACまでを各ORFとし、予測した各ORFには、ORFナンバー(IDナンバー)を付した。スーパーコンティグNo.33のORFとその相同性について表2に、スーパーコンティグNo.31のORFとその相同性について表3に示した。
スーパーコンティグによる下面ビール酵母の推定染色体の構築の作業をおこなう中で、S. cerevisiae型のDNA塩基配列とS. bayanus型のDNA塩基配列が同一染色体上で見られる場合があった。S. bayanus型第III染色体の右腕の途中から、S. cerevisiae型のDNA配列が挿入された例を、図2に示す。図2には、上段には、実験室酵母S. cerevisiaeのMATa1遺伝子のDNA塩基配列(配列番号1、Genbank accession number V01313)を示した。下段には、解析した下面ビール酵母BF1株のSB型第III染色体右腕末端のDNA塩基配列を示した(配列番号2)。図2上段の塩基番号700周辺までは、両段の塩基配列は類似してはいるものの相違が見られていたが、図2上段の塩基番号700以降は、両段の塩基配列には、ほとんど差異が認められなかった。実験室酵母S. cerevisiaeでは、接合型を決定するMAT遺伝子は、第III染色体に座乗しているが、類似したHML遺伝子が第III染色体左腕に、HMR遺伝子が第III染色体右腕に座乗していることが知られている。従って、解析した下面ビール酵母BF1株のSB型第III染色体の右腕末端配列(配列番号2)は、実験室酵母のMAT遺伝子と相同性があったことより、SB型第III染色体右腕に座乗しているHMR遺伝子と考えられた。しかし、下面ビール酵母のSB型第III染色体は、図3に見られるような構造になっており、SB型HMR遺伝子の途中の塩基配列より、SC型のHMR遺伝子の配列が挿入された構造になっていると考えられた。このように、S. cerevisiae型のDNA塩基配列とS. bayanus型のDNA塩基配列が同一染色体上で見られる染色体(キメラ染色体)は、SB型第III番染色体以外にも存在した(図1、第VII染色体、第VIII染色体、第X染色体、第XVI染色体)。
スーパーコンティグによる下面ビール酵母の推定染色体の構築の作業をおこなう中で、第X染色体は、アセンブリの結果を詳細に見ると、図4に見られるスーパーコンティグからなることが見出された。Supercontig12内のcontig1054のYJR009Cの翻訳開始点周辺のDNA塩基配列(配列番号3)を、実験室酵母S. cerevisiaeのDNA塩基配列のデータベース(SGD, Saccharomyces Genome Database http://www.yeastgenome.org/)上の第X染色体塩基配列番号453,213から455,181までのものと比較したものを図5に示す。contig1054内のYJR009CのORFのDNA塩基配列(下段の塩基番号で1400周辺まで)は、SGDのものとほとんど一致していたことより、SC型のDNA配列であると考えられた。しかし、その5'非翻訳領域(下段の塩基番号で1400以降)では、SGDの配列とのidentityが低くなっていた。さらに、contig1054内のYJR010Wの配列(配列番号4)は、SGDのYJR010Wの配列(SGDでは、第X染色体塩基配列番号456232から457767まで)と比べるとそのidentityは、1546塩基中1314塩基一致の85%であり、ORFとしては比較的低いものであった(図6)。一方、contig1612内のYJR010Wの配列(配列番号5)は、SGDのYJR010Wの配列(第X染色体塩基配列番号456232から457767まで)とのidentityはきわめて高いものであり(1246塩基中1242塩基一致の99.7%)、SC型YJR010Wであると考えられた(図7)。以上より、contig1054では、YJR009CのORFまではSC型塩基配列、それ以降は、SB型塩基配列であるキメラ構造をとっていると考えられた。
これらの結果から考察すると、解析に用いた下面ビール酵母BF1株の第X染色体の構造は、YJR009Cより、左腕側がSC型塩基配列で、右腕側がSB型塩基配列であるSupercontig 12と、左腕末端から、YJR008Wまで、SB型塩基配列であるSupercontig 23と、YJR010Wから右腕側がSC型塩基配列であるSupercontig30からなると思われた(図4)。しかし、下面ビール酵母の第X染色体の実際の構造がこのようなものであるとは考えにくい。
そこで、contig 1053内にあるSC型YJR008Wの翻訳開始点周辺のDNA塩基配列(配列番号6)と、contig 1809内にあるSB型YJR008Wの翻訳開始点周辺のDNA塩基配列(配列番号7)の比較をおこなった。結果は、図8に示した。また、contig 1612内にあるSC型YJR010Wの翻訳開始点周辺のDNA塩基配列(配列番号8)と、contig 1054内にあるSB型YJR010Wの翻訳開始点周辺のDNA塩基配列(配列番号9)の比較をおこなった。結果は、図9に示した。その結果、SC型YJR008Wの翻訳開始点周辺からは、SC型塩基配列に特異的なPCR Primer 1 SCYJR008WF(配列番号10)と、SB型YJR008Wの翻訳開始点周辺からは、SB型塩基配列に特異的なPCR Primer 2 SBYJR008WF(配列番号11)を選定した。また、SC型YJR010Wの翻訳開始点周辺からは、SC型塩基配列に特異的なPCR Primer 3 SCYJR010WR(配列番号12)を選定した。SB型YJR010Wの翻訳開始点周辺からは、SB型塩基配列に特異的なPCR Primer 4 SBYJR010WR(配列番号13)を選定した。
そこで、この領域のゲノムDNAのDNA塩基配列の決定をおこなった。具体的には、SC-SC型第X染色体は、PCR Primer 1 SCYJR008WF(配列番号10)とPCR Primer 5 SCYJR010WR2 (配列番号13)を用いて、PCR増幅をおこない、DNA塩基配列を決定した。PCR Primer 5 SCYJR010WR2 (配列番号14)の塩基配列は、SGDにあるYJR010W翻訳終了点周辺の配列より、SC型塩基配列特異的になるように選択した。SC-SB型型第X染色体は、PCR Primer 1 SCYJR008WF(配列番号10)とPCR Primer 6 SBYJR010WR2(配列番号15)を用いて、PCR増幅をおこない、DNA塩基配列を決定した。PCR Primer 6 SBYJR010WR2(配列番号15)の塩基配列は、contig1054内にあるSB型YJR010W翻訳終了点周辺の配列より、SB型塩基配列特異的になるように選択した。SB-SC型型第X染色体は、PCR Primer 2 SBYJR008WF(配列番号12)とPCR Primer 5 SCYJR010WR2(配列番号14)を用いて、PCR増幅をおこない、DNA塩基配列を決定した。SB-SB型型第X染色体は、PCR Primer 2 SBYJR008WF(配列番号11)とPCR Primer 6 SBYJR010WR2(配列番号15)を用いて、PCR増幅をおこない、DNA塩基配列を決定した。決定した各染色体のDNA塩基配列は、SC-SC型第X染色体(配列番号16)、SC-SB型第X染色体(配列番号17)、SB-SC型第X染色体(配列番号18)、SB-SB型第X染色体(配列番号19)の各配列表に示すとおりであった。
今回のゲノム解析に用いたBF1株は、第X染色体が図11に見られるheterogenousな構造である。このような構造が、他の下面ビール酵母菌株間にも見られるかどうかを検討した。SC型DNA塩基配列特異的なPCR Primer 1 SCYJR008WF(配列番号10)とPCR Primer 3 SCYJR010WR(配列番号12)、SB型DNA塩基配列特異的なPCR Primer 2 SBYJR008WF(配列番号11)とPCR Primer 4 SBYJR010WR(配列番号13)を用い、SC-SC型第X染色体、SC-SB型第X染色体、SB-SC型第X染色体、SB-SB型第X染色体の増幅をおこなった。これらのプライマーを用いて、各種下面ビール酵母菌株のゲノムDNAをテンプレートにして、PCRをおこなった結果を図12に示す。この結果、この領域が異なる下面ビール酵母菌株を判別することができた。
ビール酵母菌株の染色体構造がマイクロアレイを用いた方法で推定できるか検討した。
醸造用酵母又は実験室酵母からのゲノムDNAの抽出はQiagen Genomic Tip500/Gを用い、Qiagen社のマニュアルに従って行った。マイクロアレイは、SGD(Saccharomyces Genome Database)等で公開されている酵母ゲノム塩基配列を利用したアフィメトリクス社製カスタムアレイを利用した。下面ビール酵母BF1株から抽出したゲノムDNA10μgをWinzelarらの方法(Genetics Vol.163, p79-89 (2003))に従ってDnase Iで消化し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TAKARA社製)でビオチン化してDNAマイクロアレイにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション及び輝度の検出、シグナル値の抽出及び移動平均の計算は、アフィメトリクス社製Gene Chip Operating Software及びTiling Analysis Softwareを用いて行った。
得られたデータの解析は、表計算ソフト(マイクロソフト社EXCEL 2000)またはデータ解析ソフト(アジレント社 ジーンスプリングver7.3)を用いて行い、各プローブ輝度を染色体毎に整列させて散布図で表した。図13に下面ビール酵母BF1株のS. cerevisiae型ゲノム第III染色体の一部の結果を示した。この図中の右腕部分は、左腕部分よりも各プローブ輝度が高いことから、この右腕部分断片は、BF1株中に左腕部分より多く存在する(すなわち、コピー数が多い)と考えられた。BF1株のS. cerevisiae型(SC型)第III染色体の右腕末端部分は、図3に示されるように、S. bayanus(SB)型第III染色体右腕の途中、図2上段で表記している塩基番号700周辺よりSC型第III染色体右腕に切り替わっていることにより、コピー数の変動が見られたものと考えられる(図3)。図13に示した輝度の上昇位置は、図2の切り替わり部分(図2上段の塩基番号700周辺)に対応していたことから、ビール酵母菌株の染色体構造がマイクロアレイを用いた方法で判別できることがわかった。なお、図13、X軸に記載されている番号は、SGDの第III染色体の塩基番号を示している。配列番号1は、SGDの第III染色体の塩基番号198659から199947に該当する。従って、図13において、輝度に変化がある第III染色体の塩基番号198816周辺は、図2上段の塩基番号700にほぼ一致する。
ビール酵母菌株間の染色体構造の差異がマイクロアレイを用いた方法で識別できるか検討した。
各種ビール酵母菌株のシグナル値及び移動平均の算出は、〔実験9〕に記載の方法で行った。得られたデータの解析は、表計算ソフト(マイクロソフト社EXCEL 2000)またはデータ解析ソフト(アジレント社 ジーンスプリングver7.3)を用いて行った。2株の各プローブ単独のシグナル値またはシグナル値の移動平均から、基準とする株を1とした変化倍率を求め、染色体毎に整列させ散布図で表した。
アジレント社製マイクロアレイ(G4486A)を用いS. cerevisiae型ゲノムにつき、下面ビール酵母同士を比較した図を図14、図15、図16に示した。識別する試料の調製は、アジレント社のOligonucleotide Array-Based CGH for Genomic DNA Analysis手順書に従って行った。
BY2株とBF1株の比較では、第VI、XII、XIV染色体の全域及び第I、V、VIII染色体の一部で、BN3株とBF1株の比較では、第I、III、VI染色体の全域及び第V、XII染色体の一部で、B0104株とBF1株の比較では、第XIV染色体の全域で、染色体量比に差異が認められた。
マイクロアレイを用いて識別したビール酵母菌株の染色体構造の差異が遺伝子発現量から推定される染色体構造の差異と一致するか否か、下面ビール酵母のBF1株とB0104株について検討した。
ビール酵母は、YPD液体培地100mlを用い25℃振とう培養で対数増殖期まで増殖させた後、遠心分離で集菌し、冷水により2回洗浄を行った。菌体1gにTES(10mM Tris-HCl:pH7.4、5mM EDTA、1% SDS)1mlを添加混合後、フェノールクロロホルム1mlを加え混合した。10分毎に攪拌を行いながら65℃で1時間保温後、5000rpmで5分遠心し、上清を別の容器に移した。これをさらにフェノールクロロホルム、続いてクロロホルムイソアミルアルコールで抽出した上清400μlに4M LiCl 40ulとエタノール1mlを添加し遠心した沈殿を乾燥後、TEで溶解し、トータルRNA画分を得た。
マイクロアレイの測定は、アフィメトリクス社製のYeast Genome S98 Arrayを用い、GeneChip Expression Analysis Technical Manualに従い、データを、アフィメトリクス社製Gene Chip Operating Softwareで抽出した。データの解析は、表計算ソフト(マイクロソフト社EXCEL 2000)またはデータ解析ソフト(アジレント社 ジーンスプリングver7.3)を用いて行い、2株の各プローブ単独のシグナル値またはシグナル値の移動平均から、基準とする株を1とした変化倍率を求め、染色体毎に整列させ散布図で表した。
分母を下面ビール酵母BF1株、分子を下面ビール酵母B0104株とした散布図を図17に示す。第XIV染色体の発現が、全般的にB0104株の方がBF1株よりも高かった。B0104株のS. cerevisiae型ゲノム第XIV染色体量(すなわち、コピー数)は、BF1株よりも高くなっており(〔実験10〕、図16)、発現量の差異と染色体量の差異は一致していた。
実験10の結果に基づき、染色体構造の相違を指標として下面ビール酵母菌株の菌株判定が可能であることが明らかになったので、さらにDNAマクロアレイを用いて下面ビール酵母菌株間の類縁を調べた。
53株の下面ビール酵母菌株から、実験9に記載したのと同様な方法によりゲノムDNAを抽出し、その10μgをWinzelarらの方法(Genetics Vol.163, p79-89 (2003))に従ってDnase Iで消化して断片化した。対照酵母菌株をCy3で標識し、各試験株のDNAをCy5で標識してプローブとした。DNAマイクロアレイは以下のように設計し、Agilent社にカスタムDNAマイクロアレイの作製を依頼した。実験2で決定したDNA塩基配列に基づき、約1200bp間隔で50merの長さの配列を選択し、それらの配列からなる約44000個のオリゴヌクレオチドを合成してマイクロアレイ上に固定した。このDNAマイクロアレイに調製した各試験株プローブと対照株プローブを競合的にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション及び輝度の検出、シグナル値のデータを得た。これらのデータを、データ解析ソフト(Agilent社、ジーンスプリングVer.7.3)を用いて解析した。蛍光強度の低いものおよびシグナル比(Cy5/Cy3)が低いプローブ由来のデータを除外し、残りのプローブについてのシグナル比(Cy5/Cy3)に基づいてジーンスプリングのcondition tree作成機能を使用して系統樹を作成した(図18)。
図18に示したように、染色体構造の相違に基づいて系統樹を作成することにより、下面ビール酵母を分類することができ、さらに類縁関係を推定することができることが示された。なお、図18中の株番号は便宜的に通し番号を付けなおした。
分類された各グループに属するいくつかの下面ビール酵母菌株と通常用いられる成分の麦汁を用いて、200Lの発酵タンクパイロット設備により発酵を行い、試験ビールを作製した。作製されたビールを、外観エキス、製品エキス差、香気成分(イソアミルアルコールおよびβ-フェネチルアルコール等)について分析し、官能評価も行い、これらの結果に基づいて評価した。その結果を表4に示す。分析は「BCOビール分析法」(日本醸造協会)に記載された方法に従って行った。株番号は図18に対応する。
Claims (1)
- 判別対象のビール酵母由来のDNAを鋳型として、下面ビール酵母の同一染色体上でS. ce
revisiae型塩基配列とS. bayanus型塩基配列との組換えが起こっている箇所を含む領域を特異的に増幅するプライマー対を用いて核酸増幅反応を行うこと、及び、増幅されたポリヌクレオチドを検出することを含む、下面ビール酵母の菌株判別方法であって、前記プライマー対として、配列番号10のヌクレオチドと配列番号12のヌクレオチドとの組合せ、配列番号10のヌクレオチドと配列番号13のヌクレオチドとの組合せ、配列番号11のヌクレオチドと配列番号12のヌクレオチドとの組合せ、及び配列番号11のヌクレオチドと配列番号13のヌクレオチドとの組合せを用いる、前記方法。
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