JP2019524083A5

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Publication number: JP2019524083A5
Application number: JP2018569004A
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Filing date: 2017-06-23
Publication date: 2020-05-21
Anticipated expiration: 2037-06-23

Description

本発明は、逐次的な方法で、穀物突然変異体穀粒の収集物における特定の所定のヌクレオチド突然変異の同定を可能にする５つのワークストリーム（ＷＳ）で本明細書にさらに図示される。ＷＳ１の詳細は、伝統的に誘発された穀物植物の収集を確立するための手順を開示し；ＷＳ２の詳細は、複雑な穀物試料の構成方法を詳述し；ＷＳ３は、突然変異体を含む穀物試料を同定する方法を強調し；ＷＳ４関連の解析は、個々の変異した穀物を見つける方法を説明しており；ＷＳ５は、２つの異なるデジタルＰＣＲ器具をどのように組み合わせて使用すれば、穀粒に由来する非常に多数のｇＤＮＡ試料のスクリーニングが容易になるかに焦点を当てている。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
標的配列において、対象のヌクレオチド（複数可）［ＮＯＩ（複数可）］中に１つ以上の所定の突然変異（複数可）を保有している定義済みの種の生物の同定方法であって、
ａ）複数の遺伝子型を表す、前記種の生物、またはその生殖部分のプールを提供する工程と、
ｂ）前記プールを、生物、またはその生殖部分の１つ以上のサブプールに分割する工程と、
ｃ）前記サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、サブプール内の各遺伝子型から、それぞれゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を含む、ｇＤＮＡ試料を調製する工程と、
ｄ）それぞれが１つのサブプールからの前記ｇＤＮＡ試料を含む、複数のＰＣＲ増幅を実施し、これにより前記標的配列（複数可）を増幅させる工程であって、各ＰＣＲ増幅が、それぞれが前記ｇＤＮＡ試料の一部、各セットが標的配列に隣接するプライマーの１つ以上のセット（複数可）及びＰＣＲ試薬を含む複数の区画化ＰＣＲ増幅を含む、前記工程と、
ｅ）前記ＮＯＩ（複数可）において前記突然変異（複数可）を含む１つ以上の標的配列（複数可）を含むＰＣＲ増幅産物（複数可）を検出し、これにより、前記突然変異（複数可）を含むサブプール（複数可）を同定する工程と、
ｆ）前記同定したサブプールの前記生物、またはその生殖部分を、二次サブプールに分割する工程と、
ｇ）二次サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、それぞれが前記二次サブプール内の各遺伝子型からのｇＤＮＡを含むｇＤＮＡ試料を調製する工程と、
ｈ）それぞれが１つの二次サブプールからの前記ｇＤＮＡ試料、各セットが標的配列に隣接するプライマーの１つ以上のセット（複数可）及びＰＣＲ試薬を含む複数のＰＣＲ増幅を実施し、これにより前記標的配列（複数可）を増幅する工程と、
ｉ）前記ＮＯＩ（複数可）において前記所定の突然変異（複数可）を含む１つ以上の標的配列（複数可）を含むＰＣＲ増幅産物を検出し、これにより前記突然変異（複数可）を含む工程ｉ）下にある二次サブプールを同定する工程と、
ｊ）前記突然変異（複数可）を保有している前記二次サブプール内の生物またはその生殖部分を同定する工程と、を含む、前記方法。
（項目２）
工程ｄ）の前記ＰＣＲ増幅（複数可）が、以下の：
−前記ｇＤＮＡ試料、各セットが標的配列に隣接するプライマーの１つ以上のセット（複数可）及びＰＣＲ試薬を含む１つ以上のＰＣＲ増幅を準備する工程と、
−前記ＰＣＲ増幅（複数可）を複数の空間的に分離された区画に区分化する工程と、
−ＰＣＲ増幅（複数可）を実施する工程と、
−ＰＣＲ増幅産物を検出する工程と、を含む方法によって実施される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記空間的に分離された区画が、水−油エマルジョン液滴などの液滴である、項目２に記載の方法。
（項目４）
各液滴が、０．１〜１０ｎＬの範囲の平均容積を有する、項目３に記載の方法。
（項目５）
各ＰＣＲが、１０００〜１００，０００個の範囲の空間的に分離された区画に区画化される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記ＰＣＲ試薬が、１つ以上の突然変異検出プローブを含み、各突然変異検出プローブ（複数可）が、検出可能な手段に任意に連結したオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、前記ＮＯＩの所定の突然変異を含む標的配列に同一であるか、または相補的である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ＰＣＲ試薬が、１つ以上の参照検出プローブ（複数可）を含み、各参照検出プローブ（複数可）が、検出可能な手段に任意に連結したオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、参照ＮＯＩを含む標的配列に同一であるか、または相補的である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記突然変異体検出プローブ（複数可）が、フルオロフォア及びクエンチャーに連結されており、前記参照検出プローブが、異なるフルオロフォア及びクエンチャーに連結されている、項目５及び６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記ＰＣＲ試薬が、前記参照検出プローブ（複数可）を超えて、少なくとも２倍過剰の前記突然変異体検出プローブ（複数可）を含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記生物のプールが、前記種の前記生物、またはその生殖部分を、ランダム突然変異誘発にかけることによって調製される、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記生物プールが、異なる遺伝子型を有する、少なくとも１０，０００、好ましくは少なくとも１００，０００、さらにより好ましくは少なくとも５００，０００の生物、またはその生殖部分を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記方法が、前記プール内の生物、またはその生殖部分の複製の工程を含み、前記生殖の工程が、前記生物をサブプールに分割する工程ｂ）と同時に、またはそれに続いて実施されてもよい、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記種が、植物であり、前記方法の工程ａ）及びｂ）が、
−植物の複数の種子を提供する工程と、
−前記種子をランダム突然変異誘発にかけて、これにより、Ｍ０世代の種子を得る工程と、
−前記Ｍ０世代の種子を成熟植物に生育させて、前記成熟植物から種子を得る工程であって、前記種子がＭ１世代の種子である、前記工程と、
−任意に、先の工程をＸ回繰り返し、Ｍ（１＋Ｘ）世代の種子を含む植物を得る工程と、−前記成熟植物からＭ１世代またはＭ（１＋Ｘ）のいずれかの種子を得て、これにより種子のプールを得る工程と、
−様々な工程の前記プールをサブプールに分割する工程であって、所与の成熟植物からの全ての種子が、同じサブプール中に配置される、前記工程と、を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
少なくとも１００，０００個の、例えば少なくとも５００，０００個の種子が提供される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記種が、単細胞生物であり、前記方法の工程ａ）及びｂ）が、
−複数の単細胞生物を提供する工程と、
−前記生物をランダム突然変異誘発にかける工程と、
−前記突然変異誘発された生物をサブプールに分割する工程と、
−各サブプールを複製の工程にかける工程と、を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
１つ以上のサブプール（複数可）が、それぞれが少なくとも１０個、好ましくは少なくとも９０個の二次サブプールに分けられた状態で、前記突然変異を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記種が、単細胞種であり、工程ｆ）が、以下の：
−１つまたはいくつかのＮＯＩ（複数可）において前記突然変異（複数可）を含むサブプールを提供する工程と、
−前記サブプールの前記生物の一部または全てをクローン方式で複製して、クローン培養を得る工程と、
−複数の前記クローン培養からの生物の分画を組み合わせて、二次サブプールを得る工程と、を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
各二次サブプールが、１０〜１００個のクローン培養の範囲の分画を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記種が、植物であり、工程ｆ）及びｇ）が、以下の：
−植物の複数の種子を含むサブプールを提供する工程であって、前記サブプールが、前記ＮＯＩ（複数可）の１つまたはいくつかの突然変異（複数可）を含む、前記工程と、
−前記サブプールの前記種子を、それぞれが１〜１００個の範囲の種子を含む二次サブプールに分割する工程と、
−植物に生育するのに十分に完全な状態で前記種子を保つ方法で、前記二次サブプールの各種子から試料を得て、各二次サブプールの全ての種子からの全ての試料を組み合わせる工程と、
−ｇＤＮＡ試料を前記組み合わせた試料から調製する工程と、を含む、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記試料が、前記種子に穴をあけて、その後得られた細粉を収集することによって得られる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
工程ｈ）の前記ＰＣＲ増幅（複数可）が、複数の区画化ＰＣＲ増幅を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
工程ｈ）の前記ＰＣＲ増幅（複数可）が、項目２〜５のいずれか一項に定義されたものである、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記種が、単細胞種であり、前記生物を同定する工程ｊ）が、
−前記ＮＯＩにおいて前記突然変異を含む二次サブプールを提供する工程と、
−前記サブプールの前記生物の一部または全てを、クローン方式で複製する工程と、
−どのクローン（複数可）が前記ＮＯＩにおいて前記突然変異を含む生物を含むかを決定する工程と、を含む、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記種が植物であり、前記生物を同定する工程ｊ）が、
−前記ＮＯＩにおいて前記突然変異を含む、生物、またはその生殖部分を含む二次サブプールを提供する工程と、
−前記二次サブプール内の全ての種子を栽培して発芽を可能にし、任意に各種子から植物を発育させる工程と、
−各発芽した種子から試料を得る工程と、
−前記試料を、前記ＮＯＩにおける前記突然変異の存在について試験し、これにより、前記ＮＯＩにおいて前記突然変異を保有する植物を同定する工程と、
−任意に前記植物を成熟まで生育させる工程と、を含む、項目１〜１４及び１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記方法が、前記ＮＯＩ（複数可）において１つ以上の突然変異（複数可）を含むスーパープールを同定する工程をさらに含み、前記スーパープールが、サブプールの一群である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記方法が、工程ｃ）の後に実施される以下の：
−各サブプールからの各ｇＤＮＡ試料の分画を得る工程と、
−複数の分画をスーパープール中に組み合わせて、これにより、複数のサブプールからのｇＤＮＡ試料を含むｇＤＮＡスーパープールを得る工程であって、各サブプールからのｇＤＮＡが、１つのスーパープール中にのみ存在する、前記工程と、
−それぞれがｇＤＮＡ試料のスーパープールを含む複数のＰＣＲ増幅を実施して、これにより前記標的配列（複数可）を増幅する工程であって、各ＰＣＲ増幅が、それぞれが前記ｇＤＮＡ試料の一部、各セットが標的配列に隣接するプライマーの１つ以上のセット（複数可）及びＰＣＲ試薬を含む複数の区画化ＰＣＲ増幅を含む、前記工程と、
−前記ＮＯＩ（複数可）における前記突然変異（複数可）を含む１つ以上の標的配列（複数可）を含むＰＣＲ増幅産物（複数可）を検出し、これにより、前記突然変異を含むスーパープール（複数可）を同定する工程と、をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記方法が、前記区画化ＰＣＲを実施する前に実施される前記ｇＤＮＡスーパープールの富化の工程をさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記富化の工程が、ｇＤＮＡスーパープールでＰＣＲ増幅を実施することを含み、各ＰＣＲ増幅が、前記標的配列に隣接するプライマーのセット、ブロッキングプローブ及びＰＣＲ試薬を含み、前記ブロッキングプローブが、前記参照ＮＯＩを含む前記標的配列の増幅を阻害するように設計されている、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
ＰＣＲ増幅を実施する工程ｄ）が、前記突然変異（複数可）のうちの１つを含むサブプール（複数可）からのｇＤＮＡの試料でのみ実施される、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
５〜１００個の範囲のスーパープールが調製される、項目２５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
ｇＤＮＡ試料のスーパープールを含む前記ＰＣＲ増幅（複数可）が、以下の：
−前記ｇＤＮＡ試料、各セットが標的配列に隣接するプライマー（複数可）の１つ以上のセット（複数可）及びＰＣＲ試薬を含むＰＣＲ増幅を準備する工程と、
−前記ＰＣＲ増幅（複数可）を複数の空間的に分離された区画に区分化する工程であって、各区画が、０．１〜１０ｐＬの範囲の平均容積を有する、前記工程と、
−ＰＣＲ増幅を実施する工程と、
−ＰＣＲ増幅産物を検出する工程と、を含む方法によって実施される、項目２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
各ＰＣＲが、空間的に分離された区画などの少なくとも１，０００，０００個の区画に区画化される、項目２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記空間的に分離された区画が、水−油エマルジョン液滴などの液滴である、項目３１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記種が、単細胞生物、例えば酵母である、項目１〜１２、１５〜１８、２１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記種が、植物、例えば顕花植物である、項目１〜１４、１４、１７〜２０、及び２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記種が、穀物、例えばオオムギである、項目１〜１２、１６、１９〜２２、及び２４〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記突然変異が、単一ヌクレオチドの置換である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記方法が、２つ以上の所定の突然変異の同定する方法である、先行項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記ＰＣＲ試薬が、各所定の突然変異に特異的な、１つの突然変異体検出プローブを含む、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記方法が、標的配列における１つの所定の突然変異を同定する方法であり、前記方法が、前記標的配列に隣接するプライマーの１つのセットのみを使用する、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記ＰＣＲ試薬が、１つのみの突然変異検出プローブを含む、項目４０に記載の方法。

Claims

標的配列において、対象のヌクレオチド（複数可）［ＮＯＩ（複数可）］中に１つ以上の所定の突然変異（複数可）を保有している定義済みの種の生物の同定方法であって、
ａ）複数の遺伝子型を表す、前記種の生物、またはその生殖部分のプールを提供する工程と、
ｂ）前記プールを、生物、またはその生殖部分の１つ以上のサブプールに分割する工程と、
ｃ）前記サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、サブプール内の各遺伝子型から、それぞれｇＤＮＡを含む、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料を調製する工程と、
ｄ）それぞれが１つのサブプールからの前記ｇＤＮＡ試料を含む、複数のＰＣＲ増幅を実施し、これにより前記標的配列（複数可）を増幅させる工程であって、各ＰＣＲ増幅が、それぞれの区画化ＰＣＲ増幅が前記ｇＤＮＡ試料の一部、各セットが標的配列に隣接するプライマーの１つ以上のセット（複数可）及びＰＣＲ試薬を含む複数の区画化ＰＣＲ増幅を含む、前記工程と、
ｅ）前記ＮＯＩ（複数可）において前記突然変異（複数可）を含む１つ以上の標的配列（複数可）を含むＰＣＲ増幅産物（複数可）を検出し、これにより、前記突然変異（複数可）を含むサブプール（複数可）を同定する工程と、
ｆ）前記同定したサブプールの前記生物、またはその生殖部分を、二次サブプールに分割する工程と、
ｇ）二次サブプール内の各遺伝子型の生物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、それぞれが前記二次サブプール内の各遺伝子型からのｇＤＮＡを含むｇＤＮＡ試料を調製する工程と、
ｈ）それぞれが１つの二次サブプールからの前記ｇＤＮＡ試料、各セットが標的配列に隣接するプライマーの１つ以上のセット（複数可）及びＰＣＲ試薬を含む複数のＰＣＲ増幅を実施し、これにより前記標的配列（複数可）を増幅する工程と、
ｉ）前記ＮＯＩ（複数可）において前記所定の突然変異（複数可）を含む１つ以上の標的配列（複数可）を含むＰＣＲ増幅産物を検出し、これにより前記突然変異（複数可）を含む工程ｉ）下にある二次サブプールを同定する工程と、
ｊ）前記突然変異（複数可）を保有している前記二次サブプール内の生物またはその生殖部分を同定する工程と、を含む、前記方法。
工程ｄ）の前記ＰＣＲ増幅（複数可）が、以下の：
−前記ｇＤＮＡ試料、各セットが標的配列に隣接するプライマーの１つ以上のセット（複数可）及びＰＣＲ試薬を含む１つ以上のＰＣＲ増幅を準備する工程と、
−前記ＰＣＲ増幅（複数可）を複数の空間的に分離された区画に区分化する工程と、
−ＰＣＲ増幅（複数可）を実施する工程と、
−ＰＣＲ増幅産物を検出する工程と、を含む方法によって実施される、請求項１に記載の方法。
前記空間的に分離された区画が、水−油エマルジョン液滴などの液滴である、請求項２に記載の方法。
各ＰＣＲが、１０００〜１００，０００個の範囲の空間的に分離された区画に区画化される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記生物のプールが、前記種の前記生物、またはその生殖部分を、ランダム突然変異誘発にかけることによって調製される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
前記生物プールが、異なる遺伝子型を有する、少なくとも１０，０００、好ましくは少なくとも５０，０００、好ましくは少なくとも１００，０００の生物、またはその生殖部分を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、前記プール内の生物、またはその生殖部分の複製の工程を含み、前記生殖の工程が、前記生物をサブプールに分割する工程ｂ）と同時に、またはそれに続いて実施される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
前記種が、植物であり、前記方法の工程ａ）及びｂ）が、
−植物の複数の種子を提供する工程と、
−前記種子をランダム突然変異誘発にかけて、これにより、Ｍ０世代の種子を得る工程と、
−前記Ｍ０世代の種子を成熟植物に生育させて、前記成熟植物から種子を得る工程であって、前記種子がＭ１世代の種子である、前記工程と、
−任意に、先の工程をＸ回繰り返し、Ｍ（１＋Ｘ）世代の種子を含む植物を得る工程と、−前記成熟植物からＭ１世代またはＭ（１＋Ｘ）のいずれかの種子を得て、これにより種子のプールを得る工程と、
−様々な工程の前記プールをサブプールに分割する工程であって、所与の成熟植物からの全ての種子が、同じサブプール中に配置される、前記工程と、を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
少なくとも５０，０００個の種子、例えば、少なくとも１００，０００個の種子が提供される、請求項８に記載の方法。
前記種が、単細胞生物であり、前記方法の工程ａ）及びｂ）が、
−複数の単細胞生物を提供する工程と、
−前記生物をランダム突然変異誘発にかける工程と、
−前記突然変異誘発された生物をサブプールに分割する工程と、
−各サブプールを複製の工程にかける工程と、を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
前記種が、単細胞種であり、工程ｆ）が、以下の：
−１つまたはいくつかのＮＯＩ（複数可）において前記突然変異（複数可）を含むサブプールを提供する工程と、
−前記サブプールの前記生物の一部または全てをクローン方式で複製して、クローン培養を得る工程と、
−複数の前記クローン培養からの生物の分画を組み合わせて、二次サブプールを得る工程と、を含む、請求項１〜７および１０のいずれか一項に記載の方法。
前記種が、植物であり、工程ｆ）及びｇ）が、以下の：
−植物の複数の種子を含むサブプールを提供する工程であって、前記サブプールが、前記ＮＯＩ（複数可）の１つまたはいくつかの突然変異（複数可）を含む、前記工程と、
−前記サブプールの前記種子を、それぞれが１〜１００個の範囲の種子を含む二次サブプールに分割する工程と、
−植物に生育するのに十分に完全な状態で前記種子を保つ方法で、前記二次サブプールの各種子から試料を得て、各二次サブプールの全ての種子からの全ての試料を組み合わせる工程と、
−ｇＤＮＡ試料を前記組み合わせた試料から調製する工程と、を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
前記試料が、前記種子に穴をあけて、その後得られた細粉を収集することによって得られる、請求項１２に記載の方法。
前記方法が、前記ＮＯＩ（複数可）において１つ以上の突然変異（複数可）を含むスーパープールを同定する工程をさらに含み、前記スーパープールが、サブプールの一群である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、工程ｃ）の後に実施される以下の：
−各サブプールからの各ｇＤＮＡ試料の分画を得る工程と、
−ｇＤＮＡ試料の複数の分画をスーパープール中に組み合わせて、これにより、複数のサブプールからのｇＤＮＡ試料を含むｇＤＮＡスーパープールを得る工程と、
−それぞれがｇＤＮＡ試料のスーパープールを含む複数のＰＣＲ増幅を実施して、これにより前記標的配列（複数可）を増幅する工程であって、各ＰＣＲ増幅が、それぞれが前記ｇＤＮＡ試料の一部、各セットが標的配列に隣接するプライマーの１つ以上のセット（複数可）及びＰＣＲ試薬を含む複数の区画化ＰＣＲ増幅を含む、前記工程と、
−前記ＮＯＩ（複数可）における前記突然変異（複数可）を含む１つ以上の標的配列（複数可）を含むＰＣＲ増幅産物（複数可）を検出し、これにより、前記突然変異を含むスーパープール（複数可）を同定する工程と、をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
前記種が、単細胞生物、例えば酵母である、請求項１〜７、１０〜１１、１４〜１５のいずれか一項に記載の方法。
前記種が、植物、例えば顕花植物である、請求項１〜９、及び１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
前記種が、穀物、例えばオオムギである、請求項１〜９、１２〜１５、及び１７のいずれか一項に記載の方法。
前記突然変異が、単一ヌクレオチドの置換である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、２つ以上の所定の突然変異の同定する方法である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
標的配列において、定義済みの種の生物、またはその生殖部分のサブプールの同定方法であって、前記サブプールは、対象のヌクレオチド（複数可）［ＮＯＩ（複数可）］中に１つ以上の所定の突然変異（複数可）を保有している定義済みの種の生物を含み、前記方法は、
ａ）複数の遺伝子型を表す、前記種の生物、またはその生殖部分のプールを提供する工程と、
ｂ）前記プールを、生物、またはその生殖部分の１つ以上のサブプールに分割する工程であって、各サブプールは、各遺伝子型の２つ以上の個々の生物またはその生殖部分を含み、前記プールからの１つの生物またはその生殖部分のすべての子孫は、１つのサブプール内に含まれる、工程と、
ｃ）理論的には、各部分が前記サブプールの各遺伝子型を表す生物またはその生殖部分を含むように、各サブプールを部分にランダムに分割する工程と、
ｄ）各サブプールの前記部分のうちの１つからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料を調製し、そして残余の生物またはその生殖部分を生殖能を維持する条件下で保存する工程と、
ｅ）それぞれが１つのサブプールからの前記ｇＤＮＡ試料、各セットが標的配列に隣接する１つ以上のプライマーセット（複数可）、及びＰＣＲ試薬を含む複数のＰＣＲ増幅を実施し、これにより前記標的配列（複数可）を増幅する工程、
ｆ）前記ＮＯＩ（複数可）において前記突然変異（複数可）を含む１つ以上の標的配列（複数可）を含むＰＣＲ増幅産物（複数可）を検出し、これにより、前記突然変異（複数可）を含むサブプール（複数可）を同定する工程と、
を含む、前記方法。
各サブプールの前記生物またはその部分の１０〜５０％の範囲が、前記ｇＤＮＡ試料を調製するために使用される、請求項２１に記載の方法。
標的配列において、定義済みの植物種の植物、またはその生殖部分のサブプールの同定方法であって、前記サブプールは、対象のヌクレオチド（複数可）［ＮＯＩ（複数可）］中に１つ以上の所定の突然変異（複数可）を保有している植物を含み、前記方法は、
ａ）植物の複数の生殖部分を提供する工程であって、異なる遺伝子型を有する少なくとも１００個の生殖部分を提供する工程と、
ｂ）前記生殖部分をランダム突然変異誘発にかけて、これにより、Ｍ０世代の生殖部分を得る工程と、
ｃ）前記Ｍ０世代の生殖部分を成熟植物に生育させて、前記成熟植物から生殖部分を得る工程であって、前記生殖部分がＭ１世代の生殖部分である、前記工程と、
ｄ）前記成熟植物からＭ１世代の生殖部分を得て、これにより生殖部分のプールを得る工程と、
ｅ）Ｍ１世代の生殖部分の前記プールをサブプールに分割する工程であって、所与の成熟Ｍ０植物からの全ての生殖部分が、同じサブプール中に配置され、各サブプールが、複数の遺伝子型を含む、前記工程と、
ｆ）前記サブプール内の各遺伝子型の植物の繁殖のための潜在能力を維持しながら、サブプール内の各遺伝子型から、それぞれｇＤＮＡを含む、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料を調製する工程と、
ｇ）それぞれが１つのサブプールからの前記ｇＤＮＡ試料、各セットが標的配列に隣接する１つ以上のプライマーセット（複数可）、及びＰＣＲ試薬を含む複数のＰＣＲ増幅を実施し、これにより前記標的配列（複数可）を増幅する工程、
ｈ）前記ＮＯＩ（複数可）において前記突然変異（複数可）を含む１つ以上の標的配列（複数可）を含むＰＣＲ増幅産物（複数可）を検出し、これにより、前記突然変異（複数可）を含むサブプール（複数可）を同定する工程と、
を含む、前記方法。
前記生殖部分が種子である、請求項２３に記載の方法。