KR20230029635A - 저 디아세틸 효모 - Google Patents

저 디아세틸 효모 Download PDF

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KR20230029635A
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클라우스 렌젤러
마이클 카츠
요헨 포어스터
로스 펜네시
클레스 기예르만센
안나 세일얀
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칼스버그 에이/에스
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Abstract

본 발명은 발효 동안 낮은 수준의 디아세틸을 생성하는 유용한 특성을 갖는 사카로마이세스 파스토리아누스 종의 효모 균주에 관한 것이다. 또한 이러한 균주를 사용하여 맥아 및/또는 곡물 기반 음료를 생산하는 방법 및 이 방법으로 생성된 음료가 제공된다.

Description

저 디아세틸 효모
본 발명은 맥주 생성 분야에 관한 것으로, 특히 라거 맥주 생성 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 특히 라거 맥주의 생성에서 맥주 생성 동안 빠르고 효율적인 발효에 특히 유용한 저 디아세틸 효모를 제공한다.
라거 맥주(Lager beer)는 종종 신선하고 깨끗한 향미 특성이 특징이다. 디아세틸은 많은 발효 산물의 향미 특성에 관여한다. 그러나 이의 통상적인 지방질 향미는 라거 스타일 맥주에서 이취로 고려되며 이 화합물의 제거는 양조장에서 시간과 에너지 소모에 큰 영향을 미친다.
라거 맥주는 보통 탄수화물이 농축된 액체인 맥아즙(wort)을 라거 효모로 발효시켜 제조한다. 일반적으로 라거 효모는 여러 면에서 에일 효모와 다르다. 라거 효모는 일반적으로 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus) 종에 속한다. 흔히 라거 효모는 발효 중에 바닥에 가라앉기 때문에 "하면 발효 효모(bottom-fermenting yeast)"라고도 한다. 효모의 침전 또는 응집도 처리 시간에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 효모는 다음 양조 라운드를 위해 수확할 수 있을 만큼 충분히 침전되어야 하기 때문이다. 응집력이 높지 않은(천천히 침전됨) 라거 효모의 경우 냉각이 필요하므로 추가 처리 시간이 필요하다. 또한 라거 효모 균주(yeast strain)는 일반적으로 7℃ 내지 18℃ 범위의 온도에서 가장 잘 사용된다. 일반적으로 사카로마이세스 세레비시아에 종에 속하는 에일 효모와 달리 라거 효모는 멜리비오스(melibiose)를 유일한 탄소원(carbon source)으로 사용할 수 있으며 일반적으로 37℃에서 성장할 수 없다.
발효 동안 디아세틸은 효모 세포에 의해 배출된 아세토락테이트의 비효소적 산화에 의해 형성되지만, 숙성(Maturation) 기간 동안 디아세틸은 다시 효모 세포에 흡수되어 대사된다. 발효 관리의 일부는 완성된 맥주에 설정된 임계값 미만의 디아세틸이 포함되도록 하기 위해 수행된다. 완성된 맥주에서 디아세틸 함량을 줄이는 문제는 발효가 더 낮은 온도에서 이루어지기 때문에 라거 맥주에서 특히 두드러지며 이로 인해 라거 효모에 의한 디아세틸의 재흡수 및 대사가 더 느려진다.
맥주에서 디아세틸의 미각 하한은 일반적으로 디아세틸 50ppb로 고려되며, 완성된 맥주에서 디아세틸 농도를 이 수준으로 감소시켜야 하는 필요성은 통상적으로 양조 과정이 완료되기 전에 라거 맥주의 숙성에 필요한 상당한 양의 추가 시간을 추가한다.
위에서 약술한 바와 같이, 7℃ 내지 18℃의 온도에서 통상적인 사카로마이세스 파스토리아누스 라거 효모 균주를 이용한 맥아즙의 발효는 맥아즙의 디아세틸 수준이 50ppb의 미각 한계를 훨씬 넘는 결과를 낳는다. 결과적으로, 완성된 맥주의 디아세틸 함량이 설정된 임계값 미만이 되도록 이러한 수준을 감소시키기 위해 이전에는 효모에 의한 추가 숙성 기간이 며칠 더 필요했다.
흥미롭게도, 본 발명은 낮은 수준의 디아세틸을 생성하고/거나 18℃ 이하에서 발효하는 동안 상기 디아세틸을 빠르게 소모하고 결과적으로 이들 균주에 의해 생성된 맥주에서 거의 숙성 시간이 필요하지 않는 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주의 신규한 혼성체 변이체를 제공한다. 특히, 본 발명의 효모 균주로 맥아즙을 발효시키는 경우, 총 디아세틸 수준은 당 발효가 완료될 때, 즉 발효 동안 당 수준이 다소 안정적일 때 60ppb 이하, 바람직하게는 50ppb 이하이다. 일반적으로 현재의 라거 균주와 비교할 때 적어도 1일 또는 적어도 2일의 발효 시간 감소가 관찰된다.
또한, 본 발명은 S. 파스토리아누스 효모 균주를 이용하여 맥주를 18℃ 이하에서 발효시킨 후 숙성시키는데 시간이 거의 필요하지 않고 맛이 우수한 음료를 제조하는 방법을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 발효된 수성 추출물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 맥아(malt) 및/또는 곡물(cereal)의 수성 추출물을 제공하는 단계;
ii) 사카로마이세스 파스토리아누스 종의 효모 균주를 제공하는 단계로서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션(incubation) 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물(apparent extract)을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 발효된 시험 용액은 이전 24시간에서 상기 발효된 시험 용액의 겉보기 추출물이 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 바람직하게는 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 18℃ 이하, 바람직하게는 12 내지 16℃의 온도에서 이루어지는 단계; 및
iii) 단계 i)에서 제공된 수성 추출물을 단계 ii)의 상기 효모 균주로 발효시켜 발효된 수성 추출물을 획득하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "수성 추출물"이라는 용어는 예를 들어 음료 제조에 사용되는 맥아 및/또는 곡물 낟알의 수성 추출물, 예컨대 맥아즙을 나타내는데 사용되고, "시험 용액"이라는 용어는 발효에 사용되는 미생물의 특성을 평가하는데 사용되는 보다 엄격하게 정의된 조성을 가진 용액을 나타내는데 사용된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 음료를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
i. 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물을 제공하는 단계;
ii. 사카로마이세스 파스토리아누스 종의 효모 균주를 제공하는 단계로서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 바람직하게는 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는 단계;
iii. 단계 i)에서 제공된 수성 추출물을 상기 효모 균주로 발효시켜 발효된 수성 추출물을 획득하는 단계; 및
iv. 상기 발효된 수성 추출물을 음료로 가공하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 음료를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
i. 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물을 제공하는 단계;
ii. 사카로마이세스 파스토리아누스 종의 효모 균주를 제공하는 단계로서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 바람직하게는 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는 단계;
iii. 단계 i)에서 제공된 수성 추출물을 상기 효모 균주로 발효시켜 발효된 수성 추출물을 획득하는 단계; 및
iv. 상기 발효된 수성 추출물을 음료로 가공하는 단계로서, 가공 단계는
1. 여과,
2. 탄산화(Carbonation),
3. 숙성(Maturation), 또는
4. 병입(Bottling)
중 하나 이상을 포함하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 효모 균주를 제공하고, 상기 효모 균주는 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 시험 용액에서 상기 효모 균주의 인큐베이션 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 추출물에서 상기 효모 균주의 인큐베이션 후 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 바람직하게는 최대 50 ppb 디아세틸을 포함한다.
도 1은 (A) 16℃ 및 (B) 18℃에서 50L 시험으로부터 혼성체 효모 균주 ZDA1 및 대조군 효모 균주 혼성체 효모 7과 함께 인큐베이션된 맥아즙의 디아세틸 및 °Plato 수준을 나타낸다. 도 1c는 도 1b와 동일한 그래프이지만 균주 ZDA1 단독 및 총 디아세틸 18℃에 대해 다른 축을 갖는다. 결과는 실시예 1에 기재되어 있다.
도 2는 16°에서 10 HL 시험으로부터 혼성체 효모 균주 ZDA1 및 대조군 효모 균주 혼성체 효모 7과 함께 인큐베이션된 맥아즙의 디아세틸 수준을 나타낸다(도 2a). °Plato는 혼성체 효모 균주 ZDA1에 대해 추가로 표시된다(도 2b). 결과는 실시예 4에 기재되어 있다.
도 3은 본 발명에 따른 효모 균주 ZDA2(89-84393 ZDA F1)에 의해 제조된 맥주와 비교하여 9종의 상이한 시판 맥주에서 프로판올/이소부탄올의 비율을 나타낸다. 모든 맥주는 ABV가 5%에 가깝다.
도 4a 내지 도 4f: WS34-78, cer(사카로마이세스 세레비시아에), eub(사카로마이세스 에우바야누스), 혼성체7(혼성체 효모 7), ZDA1 및 ZDA2 사이의 ILV2 단백질 서열의 정렬을 보여준다.
도 5a 내지 도 5c: WS34-78, cer(사카로마이세스 세레비시아에), eub(사카로마이세스 에우바야누스), 혼성체7(혼성체 효모 7), ZDA1 및 ZDA2 사이의 ILV6 단백질 서열의 정렬을 보여준다.
도 6a 내지 도 6e: WS34-78, cer(사카로마이세스 세레비시아에), eub(사카로마이세스 에우바야누스), 혼성체7(혼성체 효모 7), ZDA1 및 ZDA2 사이의 ILV3 단백질 서열의 정렬을 보여준다.
도 7a 내지 도 7d: WS34-78, cer(사카로마이세스 세레비시아에), eub(사카로마이세스 에우바야누스), 혼성체7(혼성체 효모 7), ZDA1 및 ZDA2 사이의 ILV5 단백질 서열의 정렬을 보여준다.
도 8a 내지 도 8e: WS34-78, cer(사카로마이세스 세레비시아에), eub(사카로마이세스 에우바야누스), 혼성체7(혼성체 효모 7), ZDA1 및 ZDA2 사이의 BAT1 단백질 서열의 정렬을 보여준다.
도 9a 내지 도 9d: WS34-78, cer(사카로마이세스 세레비시아에), eub(사카로마이세스 에우바야누스), 혼성체7(혼성체 효모 7), ZDA1 및 ZDA2 사이의 BAT2 단백질 서열의 정렬을 보여준다.
도 10: 16℃에서 상업적 규모 시험으로부터의 효모 균주 ZDA2 및 대조군 효모 균주 혼성체 효모 7과 함께 인큐베이션된 맥아즙의 °Plato 및 디아세틸 수준을 나타낸다. 결과는 실시예 8에 기재되어 있다.
정의
본 명세서에서 사용되는 단수형("a")은 이것이 사용되는 문맥에 따라 하나 이상을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대략"은 ±10%, 바람직하게는 ±5%, 더욱 바람직하게는 ±2%를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "맥주"는 맥아즙을 발효시켜 제조된 음료를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 발효는 효모에 의해 수행된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생 맥주(green beer)"는 맥아즙, 바람직하게는 효모에 의한 발효 후에 직접적으로 획득되는 용액을 지칭한다. 따라서 "생 맥주"는 라거링(lagering) 전에 획득된다. 즉, 생 맥주는 당 발효가 완료된 직후에 획득되는 용액이다. 일반적으로 맥주는 맛과 향이 완전히 숙성되면 더 이상 "생"으로 고려되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "디아세틸"은 하기 화학식의 화합물을 지칭한다:
Figure pct00001
.
샘플 중 디아세틸의 농도는 총 디아세틸을 결정하기 위해 60℃에서 90분 동안 샘플의 인큐베이션 기간을 포함하는 유럽 양조 협약 방법 EBC 9.24.2에 따른 기체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있으며, 이는 전구체 아세토락테이트와 유리 디아세틸의 총합을 반영한다. 본 개시내용 전체에서, 본 명세서에 개시된 효모 균주에 의해 생성되는 디아세틸을 기재할 때, "디아세틸"이라는 용어는 달리 언급하지 않는 한 "총 디아세틸"을 지칭한다. 따라서 샘플의 디아세틸 농도는 총 디아세틸 농도, 즉 전구체 아세토락테이트와 유리 디아세틸의 총합을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "곡물"은 밀, 기장, 쌀, 보리, 귀리, 호밀, 라이밀, 수수 및 옥수수와 같은 식용 알곡을 산출하는 풀과의 임의의 식물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "알곡"이라는 용어는 내부 종자로도 표시되는 곡물 영과를 포함하는 곡물의 종자를 지칭한다. 또한, 알곡은 외화영(lemma) 및 내화영(palea)을 포함할 수 있다. 대부분의 보리 품종에서 외화영 및 내화영은 영과에 부착되어 탈곡 후 알곡의 일부이다. 그러나 완전히 노출된 보리 품종도 발생한다. 이들에서 영과는 외화영 및 내화영이 없으며 밀에서처럼 타작되어 유리된다. "알곡" 및 "낟알"이라는 용어는 본 명세서에서 상호 혼용된다.
용어 "맥아즙"은 맥아 및/또는 곡물 알곡의 액체 추출물 및 선택적으로 추가 부가물을 의미한다. 맥아즙은 일반적으로 고온의 물로 으깬 후 사용된 알곡에서 잔류 당 및 기타 화합물을 추출하는 과정에서 으깬 다음 선택적으로 "스파징(Sparging)"하여 획득한다. 스파징는 일반적으로 라우터 통(lauter tun), 매쉬 필터(mash filter) 또는 사용된 알곡에서 추출된 물을 분리할 수 있는 다른 장치에서 수행된다. 으깬 후 획득한 맥아즙은 일반적으로 "제1 맥아즙"으로 지칭되고 스파징 후 획득된 맥아즙은 일반적으로 "제2 맥아즙"으로 지칭된다. 명시되지 않은 경우, 맥아즙이라는 용어는 제1 맥아즙, 제2 맥아즙 또는 이 둘의 조합일 수 있다. 기존의 맥주 생성 과정에서 맥아즙을 홉과 함께 끓인다. 홉이 없는 맥아즙은 "달콤한 맥아즙"이라고도 지칭되며, 홉과 함께 끓인 맥아즙은 "끓인 맥아즙" 또는 간단히 맥아즙으로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "수성 추출물"이라는 용어는 맥아 및/또는 곡물 낟알의 임의의 수성 추출물을 지칭한다. 따라서, 본 명세서의 비제한적 예는 소정의 양의 발효가능한 당을 갖는 맥아즙이 될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발효된 수성 추출물"은 당 발효가 완료된 효모 균주와 같은 미생물과 인큐베이션된 임의의 수성 추출물을 지칭한다. °Plato에 의해 측정된 당 수준이 더 이상 현저하게 감소하지 않는 발효 동안의 시점에서 당 발효가 완료된 것으로 고려된다. 바람직하게는, 당 수준이 24시간 동안 0.5°Plato 초과하여 변화하지 않거나 12시간 동안 당 수준이 0.25°Plato 초과하여 변화하지 않으면 당 발효가 완료된 것으로 고려될 수 있다. 발효된 수성 추출물은 예를 들어 발효된 맥아 및/또는 곡물 기반 추출물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시험 용액"은 임의의 수성 액체 또는 용액을 지칭한다. 시험 용액은 소정의 수준의 특정 화합물을 포함할 수 있다. 따라서, 본 명세서의 비제한적 예는 특정 당 함량을 갖는 맥아즙일 수 있다.
본 명세서에서 "발효된 시험 용액"은 효모 균주와 같은 미생물과 인큐베이션되어 당 발효가 완료된 임의의 시험 용액을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "°Plato"는 Plato 척도로 측정된 밀도를 지칭한다. Plato 척도는 경험적으로 파생된 비중계 척도로 맥주 또는 맥아즙의 밀도를 중량 기준으로 추출물의 백분율로 측정한다. 척도는 추출물 g/100 g 맥아즙으로 밀도를 나타낸다. 예를 들어 Plato는 Alcolyzer 또는 Anton Paar의 휴대용 장치로 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "겉보기 추출물"은 °Plato로 측정된 소정의 맥주 또는 맥아즙의 밀도를 지칭한다. 밀도는 주로 당 함량에 의해 결정되기 때문에 겉보기 추출물은 용액 또는 추출물의 당 함량을 나타낸다. 용액의 겉보기 추출물은 예를 들어 휴대용 Anton-PAAR 일련 번호 DM으로 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부피 기준 알코올(ABV)"은 알코올 음료의 소정의 부피 중 알코올(에탄올)의 양(부피 백분율로 표시됨)을 지칭한다. 이는 20℃에서 100mL의 용액에 존재하는 순수한 에탄올의 밀리리터 수로 정의된다. ABV는 Alcolyzer로 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "RDF" 또는 "실 발효 정도"는 맥아즙의 당이 맥주의 알코올로 발효되는 정도를 지칭하며, 희박화(attenuation)라고도 한다. RDF는 발효된 추출물의 백분율을 나타낸다. 50 내지 60% 사이의 RDF는 원래 추출물의 40% 이상이 발효되지 않은 풀바디(full-bodied) 맥주를 나타내고, 80% 이상의 RDF는 원래 추출물의 20% 미만이 발효되지 않은 고도로 희박화된 맥주를 나타낸다. 식감은 주로 RDF 백분율에 의해 결정되며; RDF 비율이 높을수록 맥주가 더 가볍고 드라이(dry)하다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "응집"은 효모 세포와 같은 미세 입자가 응집물로 함께 뭉치는 과정을 지칭한다. 그런 다음 응집물은 액체의 상부로 떠오르거나(거품), 액체의 하부에 가라앉거나(침전), 액체에서 쉽게 여과될 수 있다. 효모 전문가와 양조업자는 종종 발효 과정에서 효모 균주에 대해 관찰된 응집 정도에 따라 효모 응집 거동을 "높음", "중간" 또는 "낮음"으로 분류한다. 응집력이 높은 균주는 부유 효모가 적은 더 밝은 맥주를 생성할 수 있어 여과가 더 쉬워진다. 더 낮은 온도로 인해 응집이 증가할 수 있으므로 응집력이 낮은 효모의 경우 발효가 완료된 후 추가 냉각 단계가 필요할 수 있다. 따라서 응집력이 높은 효모는 응집력이 낮은 효모와 비교하여 처리 시간이 단축될 가능성이 있으며, 이는 더 밝고 쉽게 여과되는 맥주를 획득하기 위해 냉각이 필요하지 않기 때문이다. 응집은 예를 들어 발효 후 용액에서 효모 세포의 수를 계수하여, 예를 들어, 발효된 수성 추출물 또는 시험 용액을 포함하는 용기의 상부 3/4 부분에서 채취한 샘플에서 효모 세포의 수를 계수함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발효"는 수성 추출물 또는 시험 용액을 효모 균주와 같은 미생물과 인큐베이션하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "맥아"라는 용어는 맥아화된 곡물 낟알를 지칭한다. "생 맥아(green malt)"라는 용어는 가마 건조 단계를 거치지 않은 발아된 곡물 낟알을 지칭한다. 일부 실시형태에서 생 맥아는 제분된 생 맥아이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가마 건조 맥아"는 가마 건조에 의해 건조된 발아된 곡물 낟알을 지칭한다. 일부 실시형태에서 가마 건조 맥아는 분쇄된 가마 건조 맥아이다. 일반적으로 상기 곡물 낟알은 통제된 환경 조건에서 발아되었다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "탄소원"은 효모에 에너지를 제공하고 세포 생합성을 위한 탄소를 제공할 수 있는 임의의 유기 분자를 지칭한다. 특히, 상기 탄소원은 탄수화물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 탄소원은 단당류, 이당류 삼당류, 사당류 및/또는 짧은 올리고당류일 수 있다. 효모에 의해 발효될 수 있는 탄소원은 다음에 제한되는 것은 아니나, 글루코스, 프룩토스, 말토스, 말토트리오스 및 수크로스를 포함하여 종종 발효 가능한 당으로 언급된다.
아미노산은 IUPAC 1문자 및 3문자 코드를 사용하여 본 명세서에서 명명될 수 있다. 달리 표시되지 않는 한 "아미노산"이라는 용어는 표준 아미노산을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기능성 유전자(functional gene)"는 전사 및 번역될 때 유전자가 내인성인 야생형 균주의 상응하는 유전자에 의해 인코딩(encoding)된 단백질에 대해 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 99%, 예컨대 100% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 단백질을 발현한다. 기능성 유전자에 의해 발현되는 단백질은 유전자가 내인성인 야생형 균주의 상응하는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 기능성 상동체(functional homologue)여야 하고, 즉, 동일한 유형의 효소 활성을 가져야 하며 상기 활성은 유전자가 내인성인 야생형 균주의 상응하는 유전자에 의해 인코딩되는 단백질에 유사한 수준이어야 한다. 특히, "기능성 유전자"라는 용어는 효소 활성이 거의 또는 전혀 없는 절단 단백질 산물을 인코딩하는 유전자는 포함하지 않는다. 바람직하게는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 기능성 유전자를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기능성 카피 수"는 효모 균주 내의 기능성 유전자의 총 수를 지칭한다. "기능성 카피 수"는 본 명세서에서 "활성 카피 수"와 상호 혼용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기능성 상동체"는 참조 폴리펩타이드와 적어도 하나의 생물학적 기능을 공유하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 일반적으로 상기 기능성 상동체는 또한 참조 폴리펩타이드와 상당한 서열 동일성을 공유한다. 바람직하게는 참조 폴리펩타이드의 기능성 상동체는 참조 단백질과 동일한 생물학적 기능을 갖고 참조 폴리펩타이드와 높은 수준의 서열 동일성을 공유하는 폴리펩타이드이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "천연 프로모터(native promoter)"는 뉴클레오타이드 서열이 유전자가 내인성인 야생형 균주의 프로모터와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90% 예컨대 적어도 95", 예컨대 적어도 99%, 예컨대 100% 서열 동일성을 갖는 프로모터를 지칭한다. 따라서 천연 프로모터 아래에서 발현되는 유전자는 일반적으로 내인성 수준에서 발현된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성"은 쌍 정렬을 기반으로 하여 2개의 아미노산 서열 사이 또는 2개의 뉴클레오타이드 서열, 즉 후보 서열(예를 들어 돌연변이 서열) 및 참조 서열(예를 들어 야생형 서열) 사이의 관계를 기재한다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열 간의 서열 동일성은 Needleman-Wunsch 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970, J. Mo/. Biol. 48: 443-453])을 사용하여 결정되며, 이는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: 문헌[The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277]), 바람직하게는 버전 5.0.0 이상(https://www.ebi. ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/에서 이용 가능함)의 Needle 프로그램에서 구현되는 바와 같다. 사용된 매개변수는 10의 갭 개방 페널티, 0.5의 갭 확장 페널티 및 EBLOSUM62(30 BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 대체 행렬이다. Needle 표지된 "가장 긴 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 얻음)의 출력은 동일성 백분율로 사용되며 다음과 같이 계산된다: (동일한 잔기 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 내 갭의 총 수). Needleman-Wunsch 알고리즘은 참조 서열 이외의 서열에서 소정의 아미노산이 참조 서열의 소정의 위치에 상응하는지를 결정하는 데에도 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 동일성은 Needleman-Wunsch 알고리즘(문헌[Needleman and Wunsch, 1970, supra])을 사용하여 결정되며, 이는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: 문헌[The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277]), 바람직하게는 버전 5.0.0 이상의 Needle 프로그램에서 구현되는 바와 같다. 사용된 매개변수는 10의 갭 개방 페널티, 0.5의 갭 확장 페널티 및 DNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 대체 행렬이다. Needle 표지된 "가장 긴 동일성"(-nobrief 옵션을 사용하여 얻음)의 출력은 동일성 백분율로 사용되며 다음과 같이 계산된다: (동일한 데옥시리보누클레오타이드 x 100)/(정렬의 길이 - 정렬 내 갭의 총 수). 서열 동일성은 항상 전장 참조 서열과 비교하여 측정되고, 즉, 갭이나 미스매칭이 없는 절단 단백질은 참조 서열과 100% 동일한 서열로 고려되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "돌연변이"는 유전자의 코딩 및 비코딩 영역에서의 삽입, 결실(deletion), 치환, 전환 및 점 돌연변이를 포함한다. 점 돌연변이는 한 염기쌍의 변화와 관련될 수 있으며 조기 종결 코돈, 프레임시프트(frameshift) 돌연변이, 스플라이싱 부위의 돌연변이 또는 아미노산 치환을 초래할 수 있다. 돌연변이를 포함하는 유전자는 "돌연변이 유전자"로 지칭될 수 있다. 상기 돌연변이 유전자가 야생형과 상이한 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 경우, 상기 폴리펩타이드는 "돌연변이 폴리펩타이드" 및/또는 "돌연변이 단백질"로 지칭될 수 있다. 돌연변이 폴리펩타이드는 야생형 서열과 다른 아미노산 서열을 포함할 때 돌연변이를 수반하는 것으로 기재될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "결실"은 전체 유전자, 또는 유전자의 단지 일부 또는 염색체의 일부의 결실일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종결 코돈"은 mRNA 내에서 번역의 종결을 초래하는 유전자 코드의 뉴클레오타이드 삼중체를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종결 코돈"은 또한 mRNA에서 종결 코돈을 인코딩하는 유전자 내의 뉴클레오타이드 삼중체를 지칭한다. DNA의 종결 코돈은 일반적으로 TAG, TAA 또는 TGA와 같은 서열 중 하나를 가진다.
효모와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "성장"은 효모 세포가 증식하는 과정을 지칭한다. 따라서 효모 세포가 성장할 때 효모 세포의 수가 증가한다. 효모 세포의 수는 임의의 유용한 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이용할 수 있는"은 세포 생합성을 위한 탄소 및/또는 질소원으로서 특정 화합물을 사용하는 효모의 기능을 의미한다.
효모 균주
본 개시내용은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물에서 인큐베이션 시 놀랍게도 낮은 수준의 총 디아세틸을 생성하고/거나 18℃ 이하에서 발효 동안 디아세틸을 빠르게 소모하는 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주와 같은 효모 균주에 관한 것이다.
다양한 유형의 효모가 맥주 생성에 사용되며 가장 주목할만한 것은 사카로마이세스 파스토리아누스 및 사카로마이세스 세레비시아에이다. 라거 맥주는 일반적으로 사카로마이세스 파스토리아누스 종의 효모를 사용하여 발효된다. 따라서, 본 발명에 따른 사카로마이세스 파스토리아누스는 예를 들어 라거 맥주의 생성에 유용한 임의의 효모일 수 있다. 특히, 사카로마이세스 파스토리아누스는 하면 발효 효모 균주일 수 있다. 사카로마이세스 파스토리아누스는 S. 세레비시아에 및 S. 에우바야누스 간의 혼성체인 것이 바람직하다. 또한 상기 사카로마이세스 파스토리아누스가 말토스 및 멜리비오스를 이용할 수 있는 것이 바람직하다. 따라서 바람직하게는 사카로마이세스 파스토리아누스는 S. 세레비시아에와 S. 에우바야누스 간의 혼성체인 효모 균주이다. 또한 상기 사카로마이세스 파스토리아누스가 말토스 및 멜리비오스를 이용할 수 있는 것이 바람직하다.
일 양상에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 추출물에서 상기 효모 균주의 인큐베이션 후 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 바람직하게는 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어진다.
따라서, 본 발명에 따른 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 바람직하게는 다음 단계를 포함하는 방법에서 시험될 때, 발효된 시험 용액을 생성할 수 있다:
a) 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물인 시험 용액을 제공하는 단계,
b) 18℃ 이하, 바람직하게는 12 내지 18℃, 더욱 바람직하게는 16℃의 온도에서 상기 시험 용액으로 상기 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주를 인큐베이션하는 단계,
c) 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 인큐베이션 동안 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점을 결정하는 단계, 및
d) 상기 가장 빠른 시점에 디아세틸의 수준을 결정하는 단계,
상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 바람직하게는 최대 50 ppb 디아세틸을 포함한다.
일부 실시형태에서 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 하기에 기재된 시험 용액 중 임의의 것일 수 있고, 바람직하게는 시험 용액은 적어도 10° Plato"의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 시험 용액에서 상기 효모 균주와 인큐베이션 후 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.40° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.30° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.20° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 하기 기재된 바와 같은 최고 수준의 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 하기에 명시된 바와 같은 온도에서 이루어진다. 특히, 상기 시험 용액의 겉보기 추출물은 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않는다.
상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 언급된 ° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 상기 최고 수준의 디아세틸은 바람직하게는 최대 60 ppb, 예컨대 최대 55 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 50 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 45 ppb 디아세틸이다. 특히, 상기 가장 빠른 시점에 상기 수준의 디아세틸은 최대 45 ppb일 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 효모의 특성을 확인하는 경우, 인큐베이션은 바람직하게는 최대 18℃의 온도, 예컨대 12℃ 내지 18℃의 범위의 온도 또는 14 내지 16℃의 범위의 온도에서 수행된다. 특히, 상기 인큐베이션은 대략 16℃의 온도에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 시험 용액에서 상기 효모 균주의 인큐베이션 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 상기 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 추출물에서 상기 효모 균주를 인큐베이션한 후 이전 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 바람직하게는 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어진다.
따라서, 본 발명에 따른 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 바람직하게는 다음 단계를 포함하는 방법에서 시험되는 경우, 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고:
a) 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물인 시험 용액을 제공하는 단계,
b) 최대 18°의 온도에서 상기 시험 용액으로 상기 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주를 인큐베이션하는 단계,
c) 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 인큐베이션 동안 이전 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점을 결정하는 단계, 및
d) 상기 가장 빠른 시점에 디아세틸 수준을 결정하는 단계,
상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 바람직하게는 최대 50 ppb 디아세틸을 포함한다.
일부 실시형태에서 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 하기에 기재된 시험 용액 중 임의의 것일 수 있고, 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 추출물에서 상기 효모 균주의 인큐베이션 후 이전 24시간에서 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.20° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.15° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.10° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 하기 기재된 바와 같은 최고 수준의 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 하기에 명시된 바와 같은 온도에서 이루어진다. 특히, 상기 시험 용액의 겉보기 추출물은 이전 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않았다.
상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 언급된 ° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 상기 최고 수준의 디아세틸은 바람직하게는 최대 60 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 55 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 50 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 45 ppb 디아세틸이다. 특히, 상기 가장 빠른 시점에 상기 최고 수준의 디아세틸은 50 ppb일 수 있다.
상기 언급된 인큐베이션은 바람직하게는 최대 18℃의 온도, 예컨대 12℃ 내지 18℃의 범위의 온도에서 수행된다. 특히, 상기 인큐베이션은 대략 16℃의 온도에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 24시간 동안 0.5° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어진다.
따라서, 본 발명에 따른 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 바람직하게는 다음 단계를 포함하는 방법에서 시험되는 경우, 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고:
a) 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물인 시험 용액을 제공하는 단계,
b) 최대 18°의 온도에서 상기 시험 용액으로 상기 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주를 인큐베이션하는 단계,
c) 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 인큐베이션 동안 다음 24시간 동안 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점을 결정하는 단계, 및
d) 상기 가장 빠른 시점에 디아세틸 수준을 결정하는 단계,
상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 60 ppb 디아세틸을 포함한다.
일부 실시형태에서 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 하기에 기재된 시험 용액 중 임의의 것일 수 있고, 상기 추출물에서 상기 효모 균주의 인큐베이션 후 다음 24시간 동안 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.40° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.30° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.20° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 발효된 시험 용액은 하기 기재된 바와 같은 최고 수준의 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 하기에 명시된 바와 같은 온도에서 이루어진다. 특히, 상기 시험 용액의 겉보기 추출물은 다음 24시간 동안 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않는다.
상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 언급된 ° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 상기 최고 수준의 디아세틸은 바람직하게는 최대 120 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 115 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 110 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 60 ppb 디아세틸이다. 특히, 상기 가장 빠른 시점에 상기 최고 수준의 디아세틸은 110 ppb일 수 있다. 특히, 상기 가장 빠른 시점에 상기 최고 수준의 디아세틸은 55 ppb일 수 있다.
상기 언급된 인큐베이션은 바람직하게는 최대 18℃의 온도, 예컨대 12℃ 내지 18℃의 범위의 온도에서 수행된다. 특히, 상기 인큐베이션은 대략 16℃의 온도에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 65 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어진다.
따라서, 본 발명에 따른 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 다음 단계를 포함하는 방법에서 시험되는 경우, 바람직하게는 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고:
a) 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물인 시험 용액을 제공하는 단계,
b) 최대 18°의 온도에서 상기 시험 용액으로 상기 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주를 인큐베이션하는 단계,
c) 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 인큐베이션 동안 다음 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점을 결정하는 단계, 및
d) 상기 가장 빠른 시점에 디아세틸 수준을 결정하는 단계,
상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 65 ppb 디아세틸을 포함한다.
일부 실시형태에서 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 하기에 기재된 시험 용액 중 임의의 것일 수 있고, 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.20° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.15° Plato 초과만큼 감소하지 않고, 예컨대 0.10° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 발효된 시험 용액은 하기 기재된 바와 같은 최고 수준의 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 하기 명시된 온도에서 이루어진다. 특히, 상기 시험 용액의 겉보기 추출물은 다음 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않는다.
상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 언급된 ° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 상기 최고 수준의 디아세틸은 바람직하게는 최대 120 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 115 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 110 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 105 ppb 디아세틸이다. 특히, 상기 가장 빠른 시점에 상기 최고 수준의 디아세틸은 110 ppb, 예컨대 최대 55 ppb 디아세틸일 수 있다.
상기 언급된 인큐베이션은 바람직하게는 최대 18℃의 온도, 예컨대 12℃ 내지 18℃의 범위의 온도에서 수행된다. 특히, 상기 인큐베이션은 대략 16℃의 온도에서 수행될 수 있다.
일부 실시형태에서 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 효모와의 인큐베이션 개시 후 5일 이내의 임의의 시점에 최대 265 ppb 디아세틸을 포함하고, 인큐베이션은 최대 18℃의 온도에서 수행되고, 7 내지 1,500만개 생존 효모 세포/ml의 범위는 상기 시험 용액에 첨가된다.
일부 실시형태에서 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 최대 6일 동안 상기 효모 균주로 인큐베이션 후 상기 발효된 시험 용액은 최대 50 ppb 디아세틸을 포함한다. 특히, 최대 5일 동안 상기 효모 균주로 인큐베이션 후 상기 발효된 시험 용액은 최대 50 ppb 디아세틸을 포함할 수 있다. 특히, 최대 4일 동안 상기 효모 균주로 인큐베이션 후 상기 발효된 시험 용액은 최대 50 ppb 디아세틸을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 최대 5일 동안 최대 16℃의 온도에서 상기 시험 용액으로 인큐베이션 후 상기 시험 용액은 최대 50 ppb 디아세틸을 포함한다. 특히, 최대 4일 동안 최대 16℃의 온도에서 상기 효모 균주로 인큐베이션 후 상기 발효된 시험 용액은 최대 50 ppb 디아세틸을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 효모 균주는 상기 효모 균주를 상기 시험 용액에서 인큐베이션하는 경우 적어도 4.0 mL/L 에탄올/°Plato를 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 효모 균주는 상기 효모 균주를 4 내지 6일의 범위 동안 상기 시험 용액에서 인큐베이션하는 경우 적어도 4.0 mL/L 에탄올/°Plato를 생성할 수 있다. 특히, 상기 효모 균주는 대략 4일 동안 상기 시험 용액에서 인큐베이션될 수 있다.
매우 바람직한 실시형태에서 효모 균주는 다음이 가능한 효모 균주이다:
- 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액의 생성;
- 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 발효된 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 바람직하게는 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액의 생성;
- 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 24시간 동안 0.5° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액의 생성; 및
- 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액의 생성;
발효는 본 명세서에서 실시예 6에 기재된 바와 같이 이루어진다.
일부 실시형태에서, 효모 균주는 높은 응집을 나타낸다. 응집은 예를 들어 발효 후 현탁액 중의 세포로서 결정될 수 있다. "현탁액 내 세포"는 일반적으로 발효된 시험 용액을 포함하는 용기의 상부 3/4, 예를 들어 상부 2/3, 예를 들어 상부 절반으로부터 취한 샘플 내의 효모 세포를 계수함으로써 결정된다. 발효가 원추형 원통형 탱크에서 수행되는 경우, 상기 샘플은 바람직하게는 원뿔 위에서 채취된다. 발효 후 용액의 적은 수의 세포는 높은 응집을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 효모 균주를 시험 용액에서 인큐베이션한 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 1,000만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백 50만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 8백 50만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 8백만개 세포/밀리리터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 멜리비오스를 유일한 탄소원으로 하는 배지에서 성장할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 효모 균주는 비-GMO 유기체이다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 상기 효모 균주는 유전자 조작 단계를 거치지 않는다.
시험 용액
일부 실시형태에서, 시험 용액은 대략 16° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아즙이다. 일부 실시형태에서, 시험 용액은 적어도 40 g/kg 말토스를 포함한다.
시험 용액은 일반적으로 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이다. 따라서 시험 용액은 특히 맥아즙일 수 있다. 시험 용액은 바람직하게는 12 내지 18°Plato의 범위의 겉보기 추출물, 및 더욱 바람직하게는 대략 16° Plato의 겉보기 추출물을 가질 수 있다. 시험 용액은 0.20 mg/L 내지 0.40 mg/L의 범위의 아연을 추가로 포함할 수 있고, pH는 4.0 내지 6.0의 범위로 조정될 수 있다.
시험 용액의 한 예는 12 내지 25g/L 범위의 글루코스, 60 내지 80g/L 범위의 말토스, 15 내지 20g/L 범위의 말토트리오스, 0.20 mg/L 내지 0.40 mg/L 범위의 아연, 110 내지 250 mg/L 범위의 유리 알파 아미노 질소(FAN) 및 0.6 내지 0.8의 발린/FAN 비율을 포함한다.
일부 실시형태에서 시험 용액은 잠재적으로 보리 부가물을 첨가하여 필스너(pilsner) 맥아로부터 제조된다.
유전자형
본 발명에 따른 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 상기 "효모 균주"라는 제목의 섹션에 기재된 바와 같이 낮은 디아세틸 수준을 갖는 발효된 시험 용액을 생성할 수 있는 표현형을 갖는다.
상기 표현형 특성에 더하여, 본 발명에 따른 효모 균주는 바람직하게는 하기 본 명세서에 기재된 유전자형 중 하나 이상을 가질 수 있다.
ILV2, ILV6, ILV5, ILV3, BAT1 및 BAT2는 피루베이트로부터 L-발린을 합성하는데 관여한다. 이 과정에서 디아세틸이 자발적으로 생성될 수 있다.
아세토락테이트 합성효소 소 하위단위(ILV6) 및 아세토락테이트 합성효소 촉매 하위단위(ILV2)는 피루베이트를 알파-아세토락테이트로 전환시킨다.
케톨산 리덕토아이소머라제(ILV5)는 알파-아세토락테이트에서 2,3 하이드록시-아이소발레레이트로의 전환을 촉매한다.
디하이드록시-산 탈수효소(ILV3)는 2,3 하이드록시-아이소발레레이트에서 2-케토 아이솔레이트로의 전환을 촉매한다.
분지쇄 아미노산 아미노전이효소(BAT1)는 미토콘드리아에서 2-케토 단리물에서 L-발린으로의 전환을 촉매하고 분지쇄 아미노산 아미노전이효소(BAT2)는 세포질에서 상기 반응을 촉매한다.
염색체 위치:
Figure pct00002
단백질 유사성 S. 세레비시아에 및 S. 에우바야누스 (단백질 서열)
Figure pct00003
효모 세포가 정확한 수의 유전자를 "가질" 때, 상기 세포는 표시된 수보다 더 많은 유전자를 포함하지 않는 것으로 이해된다. 유사하게, 효모 세포가 XX에서 YY 유전자 범위에 "있다"면, 상기 효모 세포는 YY 유전자 이상을 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 ILV2를 인코딩하는 최대 5개의 유전자, 예를 들어 기능성 ILV2를 인코딩하는 최대 4 유전자, 예컨대 기능성 ILV2를 인코딩하는 1 내지 5개의 범위의 유전자, 예컨대 기능성 ILV2를 인코딩하는 1 내지 4개의 범위의 유전자로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하거나, 서열번호 38의 SeILV2 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는다. 본 발명의 효모 균주는 ILV2를 인코딩하는 최대 2개의 기능성 유전자를 갖고, 예를 들어 효모 균주는 ILV2를 인코딩하는 1 또는 2개의 범위, 예컨대 정확하게 2개의 기능성 유전자를 가질 수 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 상기 기능성 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 서열번호 38의 SeILV2 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성을 공유하는 전술한 것 중 임의의 것의 기능성 상동체를 인코딩한다. 일 실시형태에서 상기 기능성 유전자는 서열번호 32의 ScILV2, 바람직하게는 ScILV를 인코딩한다. 일 실시형태에서 상기 기능성 유전자는 ZDA1, ZDA2 및/또는 ZDA3의 ILV2를 인코딩하고, ZDA1, ZDA2 및/또는 ZDA3의 ILV2의 서열은 도 4에 제공되어 있다.
일부 실시형태에서, 효모 균주는 ILV2를 인코딩하는 최대 2개의 기능성 유전자로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 서열번호 38의 SeILV2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자; ILV3을 인코딩하는 적어도 4개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 적어도 5개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 적어도 6개의 기능성 유전자로서, ILV3를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 35의 ScILV3 또는 서열번호 41의 SeILV3, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체 유전자를 인코딩하는 유전자; 및 ILV5를 인코딩하는 적어도 3개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 적어도 4개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 적어도 5개의 기능성 유전자로서, ILV5를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 34의 ScILV5 또는 서열번호 40의 SeILV5, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩한다.
일부 실시형태에서, 효모 균주는 ILV2를 인코딩하는 최대 2개의 기능성 유전자로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 서열번호 38의 SeILV2 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성을 공유하는 전술한 것 중 임의의 것의 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자; 및 ILV3을 인코딩하는 5 내지 9개의 범위의 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 5 내지 7의 범위, 예컨대 6개의 기능성 유전자로서, ILV3를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 35의 ScILV3 또는 서열번호 41의 SeILV3 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성을 공유하는 전술한 것 중 임의의 것의 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자; 및 ILV5를 인코딩하는 4 내지 8개의 범위의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 4 내지 6개의 범위, 예컨대 5개의 기능성 유전자로서, ILV5를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 34의 ScILV5 또는 서열번호 40의 SeILV5 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성을 공유하는 전술한 것 중 임의의 것의 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 ILV6을 인코딩하는 최대 4개의 유전자, 예를 들어 기능성 ILV6을 인코딩하는 2 내지 4개의 범위의 유전자로서, ILV6을 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 33의 ScILV6 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하거나, 서열번호 39의 SeILV6 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 ILV5를 인코딩하는 적어도 2개의 유전자, 예컨대 기능성 ILV5를 인코딩하는 적어도 4개의 유전자, 예컨대 기능성 ILV5를 인코딩하는 적어도 5개의 유전자로서, ILV5를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 34의 ScILV5 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98 최대 99% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하거나, 서열번호 40의 SeILV5 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 최대 99% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 ILV5를 인코딩하는 최대 20개의 유전자, 예컨대 최대 15개의 유전자, 예컨대 최대 10개의 대립유전자로서, 기능성 ILV5를 인코딩하는 유전자는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있는 유전자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 ILV5를 인코딩하는 5 내지 20개의 대립유전자, 예컨대 5 내지 15개의 범위의 대립유전자, 예컨대 5 내지 10개의 유전자로서, 기능성 ILV5를 인코딩하는 유전자는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있는 유전자를 갖는다.
일 실시형태에서, 효모 균주는 ILV5를 인코딩하는 4 내지 8개의 범위의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 4 내지 6개의 범위, 예컨대 5개의 기능성 유전자로서, ILV5를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 34의 ScILV5 또는 서열번호 40의 SeILV5 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성을 공유하는 전술한 것 중 임의의 것의 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는다. 일 실시형태에서, 효모 균주는 ILV5를 인코딩하는 4 내지 8개의 범위의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 4 내지 6개의 범위, 예컨대 5개의 기능성 유전자로서, 각각의 유전자는 ZDA1, ZDA2 및/또는 ZDA3의 ILV5를 인코딩하는 유전자를 갖고, ZDA1, ZDA2 및/또는 ZDA3의 ILV5의 서열은 도 7에 제공되어 있다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 ILV3을 인코딩하는 적어도 3개의 유전자, 예컨대 기능성 ILV3을 인코딩하는 적어도 4개의 유전자, 예를 들어 기능성 ILV3을 인코딩하는 적어도 6개의 유전자로서, 기능성 ILV3을 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 35의 ScILV3 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 최대 99% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하거나, 서열번호 41의 SeILV3 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 최대 99% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 ILV3을 인코딩하는 최대 20개의 대립유전자, 예컨대 최대 15개의 대립유전자, 예컨대 최대 10개의 대립유전자로서, 기능성 ILV3을 인코딩하는 각각의 유전자는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있는 유전자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 ILV3을 인코딩하는 5 내지 20개의 대립유전자, 예컨대 5 내지 15개의 대립유전자, 예컨대 5 내지 10개의 범위의 유전자로서, 기능성 ILV3을 인코딩하는 유전자는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있는 유전자를 갖는다.
일 실시형태에서 본 발명의 효모는 ILV3을 인코딩하는 5 내지 9개의 범위의 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 5 내지 7개의 범위, 예컨대 6개의 기능성 유전자로서, ILV3를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 35의 ScILV3 또는 서열번호 41의 SeILV3 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 서열 상동성을 공유하는 전술한 것 중 임의의 것의 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는다. 일 실시형태에서 본 발명의 효모은 ILV3을 인코딩하는 5 내지 9개의 범위의 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 5 내지 7개의 범위, 예컨대 6개의 기능성 유전자로서, 각각의 유전자는 ZDA1, ZDA2 및/또는 ZDA3의 ILV3을 인코딩하는 유전자를 갖고, ZDA1, ZDA2 및/또는 ZDA3의 ILV3의 서열은 도 6에 제공되어 있다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 BAT1을 인코딩하는 적어도 3개의 유전자, 예컨대 기능성 BAT1을 인코딩하는 적어도 4개의 유전자, 예를 들어 기능성 BAT1을 인코딩하는 적어도 5개의 유전자로서, 기능성 BAT1을 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 36의 ScBAT1 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 최대 99% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하거나, 서열번호 42의 SeBAT1 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 최대 99% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 BAT1을 인코딩하는 최대 20개의 유전자, 예컨대 최대 15개의 유전자, 예컨대 최대 10개의 유전자로서, BAT1을 인코딩하는 각각의 유전자는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있는 유전자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 BAT1을 인코딩하는 5 내지 20개의 대립유전자, 예컨대 5 내지 15개의 대립유전자, 예컨대 5 내지 10개의 범위의 대립유전자로서, 기능성 BAT1을 인코딩하는 각각의 대립유전자는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있는 유전자를 갖는다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 BAT2를 인코딩하는 적어도 4개의 유전자, 예컨대 기능성 BAT2를 인코딩하는 적어도 5개의 유전자, 예를 들어 기능성 BAT2를 인코딩하는 적어도 6개의 유전자로서, 기능성 BAT2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 37의 ScBAT2 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 최대 99% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하거나, 서열번호 43의 SeBAT2 또는 이와 적어도 80%, 예컨대 적어도 85%, 예컨대 적어도 90%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 98% 최대 99% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 BAT2를 인코딩하는 최대 20개의 유전자, 예컨대 최대 15개의 유전자, 예컨대 최대 10개의 유전자로서, 기능성 BAT2를 인코딩하는 유전자는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있는 유전자를 갖는다. 일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 기능성 BAT2를 인코딩하는 5 내지 20개의 유전자, 예컨대 5 내지 15개의 유전자, 예컨대 5 내지 10개의 범위의 유전자로서, 기능성 BAT2를 인코딩하는 각각의 유전자는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있는 유전자를 갖는다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 하나 이상의 ILV2 유전자의 돌연변이 또는 결실을 보유한다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 하나 이상의 ILV2 유전자 내의 프레임시프트 돌연변이를 보유한다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 하나 이상의 ILV2 유전자의 낮은 발현(lower expression) 또는 비발현(no expression)을 야기하는 돌연변이를 보유한다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 하나 이상의 ILV6 유전자의 돌연변이 또는 결실을 보유한다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 하나 이상의 ILV6 유전자 내의 프레임시프트 돌연변이를 보유한다.
일부 실시형태에서, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주는 하나 이상의 ILV6 유전자의 낮은 발현 또는 비발현을 야기하는 돌연변이를 보유한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 기능성 ILV2 및 기능성 ILV6을 인코딩하는 유전자의 합은 기능성 ILV5 및 기능성 ILV3을 인코딩하는 유전자의 합 미만이고, 상기 기능성 ILV2, ILV6, ILV3 및 ILV5는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 기능성 ILV2를 인코딩하는 유전자의 합은 기능성 ILV5 및 기능성 ILV3을 인코딩하는 유전자의 합 미만이고, 상기 기능성 ILV2, ILV5 및 ILV3은 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있다. 일 실시형태에서, 기능성 ILV2 및 기능성 ILV6을 인코딩하는 유전자의 합은 기능성 ILV5, 기능성 ILV3, 기능성 BAT1 및 기능성 BAT2를 인코딩하는 유전자의 합 미만이고, 상기 기능성 ILV2, ILV6, ILV3, ILV5; BAT1 및 BAT2는 상기 언급된 것 중 임의의 것일 수 있다. 즉, 일부 실시형태에서 ILV5 및 ILV3을 인코딩하는 유전자의 합은 ILV2 및 ILV6을 인코딩하는 유전자의 합 초과이다. 따라서, 일부 실시형태에서, ILV5 및 ILV3을 인코딩하는 유전자의 합은 ILV2, ILV6, BAT1 및 BAT2를 인코딩하는 유전자의 합 초과이다.
일부 실시형태에서, ILV5 및 ILV3 유전자 대 ILV2 유전자의 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.5, 예컨대 적어도 2, 예컨대 적어도 2.5, 예컨대 적어도 3이고, 상기 ILV2, ILV5 및 ILV3 유전자는 각각 상기 언급된 기능성 ILV2, ILV5 및 ILV3 중 임의의 것을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, ILV5 및 ILV3 유전자 대 ILV2 및 ILV6 유전자의 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.2, 예컨대 적어도 1.4, 예컨대 적어도 1.6, 예컨대 적어도 1.8 또는 예컨대 적어도 2이고, 상기 ILV2, ILV6, ILV5 및 ILV3 유전자는 각각 상기 언급된 기능성 ILV2, ILV6, ILV5 및 ILV3 중 임의의 것을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, ILV5, ILV3, BAT1 및 BAT2 대 ILV2의 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.5, 예컨대 적어도 2, 예컨대 적어도 2.5, 예컨대 적어도 3, 예컨대 적어도 4, 예컨대 적어도 5, 예컨대 적어도 6이고, 상기 ILV2, ILV5, ILV3, BAT1 및 BAT2 유전자는 각각 상기 언급된 기능성 ILV2, ILV5, ILV3, BAT1 및 BAT2 중 임의의 것을 인코딩한다.
일부 실시형태에서, ILV5, ILV3, BAT1 및 BAT2 대 ILV2 및 ILV6의 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.5, 예컨대 적어도 2, 예컨대 적어도 2.5, 예컨대 적어도 3, 예컨대 적어도 4이고, 상기 ILV2, ILV6, ILV5, ILV3, BAT1 및 BAT2 유전자는 각각 상기 언급된 기능성 ILV2, ILV6, ILV5, ILV3, BAT1 및 BAT2 중 임의의 것을 인코딩한다.
맥아 및/또는 곡물 기반 발효된 수성 추출물 및 이의 생성 방법
본 발명은 상기 효모 균주를 사용하여 맥아 및/또는 곡물 기반 발효된 수성 추출물을 제조하는 방법뿐만 아니라 상기 "효모 균주"라는 제목의 섹션에 기재된 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주를 제공한다.
발효된 수성 추출물을 생산하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 양상이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
i) 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물을 제공하는 단계;
ii) 효모 균주를 제공하는 단계로서, 상기 효모 균주는 본 명세서의 "효모 균주" 섹션에서 상기 기재된 임의의 효모 균주일 수 있는 단계; 및
iii) 단계 i)에서 제공된 수성 추출물을 단계 ii)의 상기 효모 균주로 발효시켜 발효된 수성 추출물을 획득하는 단계.
수성 추출물은 맥아 및/또는 곡물 낟알의 임의의 수성 추출물일 수 있다. 따라서, 이의 비제한적 예는 맥아즙이다. 수성 추출물은 예를 들어 아래의 이 섹션에 기재된 바와 같이 으깸 및 선택적으로 스파징에 의해 맥아 추출물을 제조함으로써 제조될 수 있다.
맥아는 맥아화된 보리 낟알과 같은 곡물 낟알이다. 용어 "맥아화"는 제어된 환경 조건 하에서 발생하는 과정에서 낟알의 침지 및 발아, 선택적으로 이 후의 건조 단계를 포함하는 과정으로 이해되어야 한다. 상기 건조 단계는 바람직하게는 상승된 온도에서 발아된 낟알의 가마 건조일 수 있다. 가마 처리되지 않은 생 맥아, 특히 WO 2018/001882에 기재된 과정에 의해 얻어진 맥아도 사용될 수 있다.
발아는 낟알 변형을 유발하는 수많은 효소의 합성, 즉 죽은 배유의 전분과 세포벽을 주로 해중합하여 낟알 영양분을 모으고 다른 해중합효소를 활성화시키는 과정에 중요하다. 후속 건조 과정에서 적어도 부분적으로는 화학적 갈변 반응으로 인해 향미와 색상이 생성된다.
침지는 당업자에게 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 하나의 비제한적 예는 교대로 건식 및 습식 조건으로 10℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서 침지하는 것을 포함한다. 발아는 당업자에게 공지된 임의의 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 하나의 비제한적 예는 10 내지 25℃ 범위의 온도에서, 선택적으로 1 내지 4시간 범위의 온도 변화에 의한 발아를 포함한다. 침지 및 발아는 예를 들어, 국제 특허 출원 WO 2018/001882에 기재된 바와 같은 조합된 방법으로 수행될 수도 있다.
가마 건조는 예컨대 적어도 75℃, 예를 들어 80 내지 90℃의 범위, 예컨대 80 내지 85℃의 범위의 통상적인 온도에서 수행될 수 있다. 따라서 맥아는 예를 들어 문헌[Briggs et al. (1981) 및 Hough et al. (1982)]에 기재된 방법 중 임의의 것에 의해 생성될 수 있다. 그러나, 다음에 제한되는 것은 아니나, 맥아를 볶는 방법을 포함하는 특수 맥아의 생성 방법과 같은 맥아를 생성하기 위한 임의의 다른 적합한 방법이 또한 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
맥아는 예를 들어 제분에 의해 추가로 처리될 수 있다. 제분은 건조 상태에서 수행할 수 있고, 즉, 맥아는 건조 상태에서 제분되거나 생맥아를 사용하는 경우 습식 상태에서 제분된다.
맥아, 예를 들어 제분된 맥아를 매싱(mashing)하여 상기 맥아의 수성 추출물을 제조할 수 있다. 음료를 제조하기 위한 출발 액체는 맥아의 수성 추출물, 예를 들어 매싱하여 제조된 맥아의 수성 추출물일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 맥아 및/또는 곡물 기반 발효된 수성 추출물을 제조하는 방법은 맥아 및 선택적으로 추가 부가물을 매싱하여 맥아즙과 같은 수성 추출물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 매싱 단계는 또한 선택적으로 스파징를 포함할 수 있고, 따라서 상기 매싱 단계는 스파징 단계를 포함하는 매싱 단계 또는 스파징 단계를 제외한 매싱 단계일 수 있다.
일반적으로, 수성 추출물의 생성은 맥아 및/또는 낟알의 제분에 의해 개시된다. 추가 부가물이 추가되는 경우 특성에 따라 이들도 제분될 수 있다. 부가물이 곡물인 경우 이는 예를 들어 제분될 수 있고, 시럽, 당 등은 일반적으로 제분하지 않는다. 제분은 매싱 단계에서 낟알 입자에 대한 물 접근을 용이하게 한다. 매싱 동안 맥아화 동안 개시된 기질의 효소적 해중합이 계속될 수 있다.
일반적으로, 수성 추출물은 제분된 맥아와 물을 조합하고 인큐베이션함으로써, 즉 매싱 과정에서 제조된다. 매싱 동안, 맥아/액체 조성물은 추가의 탄수화물이 농축된 부가물 조성물, 예를 들어 제분된 보리, 옥수수 또는 쌀 부가물로 보충될 수 있다. 비맥아화 곡물 부가물은 일반적으로 활성 효소를 거의 또는 전혀 포함하지 않으므로 다당류 해중합 등에 필요한 효소를 제공하기 위해 맥아 또는 외인성 효소를 보충하는 것이 중요하다.
매싱 동안, 제분 맥아 및/또는 제분 낟알 및 선택적으로 추가 부가물은 물과 같은 액체 분획과 함께 인큐베이션된다. 인큐베이션 온도는 일반적으로 일정하게 유지되거나(등온 매싱) 점진적으로 증가하고, 예를 들어, 순차적 방식으로 증가한다. 두 경우 모두, 맥아/낟알/부가물에 있는 용해성 물질이 상기 액체 분획으로 방출된다. 후속 여과는 수성 추출물과 잔류 고체 입자의 분리를 부여하며, 후자는 또한 "사용된 낟알"로 표시된다. 이렇게 얻어진 수성 추출물은 또한 "제1 맥아즙"으로 표시될 수 있다. 물과 같은 추가 액체는 스파징라고도 하는 과정 동안 사용된 낟알에 추가될 수 있다. 스파징 및 여과 후 "제2 맥아즙"을 얻을 수 있다. 절차를 반복하여 추가 맥아즙을 제조할 수 있다. 맥아즙 제조에 적합한 절차의 비제한적 예는 문헌[Briggs et al. (1981) 및 Hough et al. (1982)]에 기재되어 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 수성 추출물은 맥아화되지 않은 낟알만을 매싱하여 제조할 수도 있다. 맥아화되지 않은 낟알은 세포벽을 분해할 수 있는 효소나 전분을 당으로 해중합할 수 있는 효소와 같이 맥아즙 생성에 유익한 효소가 없거나 제한되어 있다. 따라서, 보리 낟알과 같은 맥아화되지 않은 낟알의 최대 80%, 예를 들어 90% 또는 예를 들어 100%가 매싱에 사용되는 본 발명의 실시형태에서, 하나 이상의 적합한 외부 양조 효소가 매쉬에 첨가되는 것이 바람직하다. 적합한 효소는 리파아제, 전분 분해 효소(예를 들어, 아밀라제), 글루카나제[바람직하게는 (1-4)- 및/또는 (1-3,1-4)-β-글루카나아제] 및/또는 자일라나제(예를 들어, 아라비노자일라나제), 및/또는 프로테아제, 또는 전술한 효소 중 하나 이상을 포함하는 효소 혼합물, 예를 들어 Cereflo, Ultraflo 또는 Ondea Pro(Novozymes)일 수 있다.
수성 추출물은 또한 맥아화 및 비맥아화 낟알의 혼합물을 사용하여 제조할 수 있으며, 이 경우 하나 이상의 적합한 효소를 제조 중에 첨가할 수 있다. 맥아가 사용되는 실시형태에서도 효소가 첨가될 수 있다. 보다 구체적으로, 낟알은 외부 양조 효소의 존재 또는 부재 하에 다음에 제한되는 것은 아니나, 낟알:맥아의 비율 = 대략 100:0, 또는 대략 75:25, 또는 대략 50:50, 또는 대략 25:75로 매싱을 위한 임의의 조합으로 맥아와 함께 사용할 수 있다.
으깬 후 획득한 수성 추출물은 "스위트 맥아즙(sweet wort)"이라고도 한다. 통상적인 방법에서, 스위트 맥아즙은 홉(hop)을 사용하거나 사용하지 않고 끓인 후 이를 끓인 맥아즙이라고 한다.
수성 추출물은 본 발명의 효모로 발효시키기 전에 가열하거나 끓일 수 있다. 본 발명의 일 양상에서, 제2 및 추가 맥아즙을 조합한 후 가열 또는 끓일 수 있다. 수성 추출물은 임의의 적절한 시간 동안, 예를 들어 60분 내지 120분의 범위의 시간 동안 가열하거나 끓일 수 있다.
맥아 및/또는 곡물 기반 발효된 수성 추출물의 결과는 맥아 및/또는 곡물 낟알의 수성 추출물에 존재하는 발효 가능한 당의 양 및 유형뿐만 아니라 발효 동안 사용된 효모 균주의 특성에 크게 좌우된다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 상기 수성 추출물은 적어도 12° Plato, 예컨대 적어도 15° Plato, 예컨대 5 내지 15°Plato의 범위, 예컨대 10-20°Plato의 범위, 예컨대 15 내지 25°Plato의 범위의 겉보기 추출물을 갖는다.
일부 실시형태에서, 상기 수성 추출물은 최대 6일, 예컨대 최대 5일, 예컨대 최대 4일, 예컨대 최대 3일 동안 상기 효모 균주와 발효된다.
본 발명의 효모 균주의 추가적인 이점은 낮은 수준의 아미노산을 갖는 맥아즙의 발효에 유용하다는 것일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 상기 수성 추출물은 최대 3500 mg/L, 예컨대 최대 3000 mg/L, 예를 들어 최대 2500 mg/L 아미노산을 포함한다.
따라서, 수성 추출물, 예를 들어 맥아즙은 상기 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 맥아 및/또는 곡물 기반 발효된 수성 추출물은 본 발명에 따른 상기 효모 균주로 상기 수성 추출물을 발효시켜 제조할 수 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 상기 발효된 수성 추출물은 생맥주이다.
일반적으로, 맥주와 같은 알코올성 발효된 수성 추출물은 맥아화 및/또는 비맥아화 낟알로부터 제조될 수 있다. 맥아는 홉과 효모 외에도 맥주와 같은 음료의 향미와 색상에 관여한다. 또한 맥아는 발효 가능한 당과 효소의 공급원 역할을 한다. 맥아화 및 양조에 적합한 방법의 예에 대한 비제한적인 설명은 예를 들어 문헌[Briggs et al. (1981) 및 Hough et al. (1982)]의 간행물에서 찾을 수 있다. 낟알, 맥아 및 맥주 산물의 분석을 위해 정기적으로 업데이트되는 수많은 방법, 예를 들어, 다음에 제한되는 것은 아니나, 문헌[American Association of Cereal Chemists (1995), American Society of Brewing Chemists (1992), European Brewery Convention (1998), and Institute of Brewing (1997)]이 이용 가능하다. 지역 소모자 선호도와 관련된 가장 중요한 변화와 함께 소정의 양조에 대해 많은 특정 절차가 사용된다는 것이 이해된다. 임의의 이러한 맥주 생성 방법이 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
맥아즙으로부터 맥주를 생성하는 제1 단계는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같이 상기 맥아즙을 가열하는 단계, 이어서 맥아즙 냉각 및 선택적으로 월풀 레스트(whirlpool rest)의 후속 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물을 본 발명에 따른 효모 균주로 발효시키는 단계를 포함한다. 상기 발효는 효모를 위한 발효 가능한 당을 여전히 포함하는 발효된 수성 추출물 또는 발효되지 않은 수성 추출물의 발효일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서 상기 발효는 필수적으로 매싱 완료 직후 또는 맥아즙 가열 직후에 수행될 수 있다.
발효는 본 발명에 따른 효모, 즉 상기 본 명세서에 기재된 특성 중 하나 이상을 갖는 효모를 포함하는 발효 탱크에서 수행될 수 있다.
며칠 동안의 발효 과정 동안 향미 물질이 발생한다. 효모 균주가 특정 화합물을 전환할 수 없는 경우, 이는 발효 단계 iii) 후에도 여전히 존재할 것이다.
일부 실시형태에서, 발효 단계 iii)은 아래에 명시된 임의의 온도에서 이루어지고, 수성 추출물은 아래에 기재된 임의의 수의 효모 세포와 함께 인큐베이션되었으며, 발효된 수성 추출물은 최대 수준의 하기에 기재된 바와 같은 디아세틸을 포함하고, 발효는 최대 5일, 예컨대 최대 4일, 최대 3일 후에 완료된다. 특히 최대 4일 후 발효가 완료된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 효모 균주를 사용하는 발효는 완료되고 디아세틸은 동일한 조건 하에 W-34/78 효모 균주로 수행된 발효보다 적어도 12시간, 예컨대 적어도 24시간 전에 60ppb 미만, 예컨대 50ppb이다.
상기 언급된 발효는 바람직하게는 최대 18℃의 온도, 예컨대 12℃ 내지 18℃의 범위의 온도에서 수행된다. 특히, 상기 발효는 대략 16℃의 온도에서 수행될 수 있다.
발효가 완료되는 경우, 상기 최고 수준의 디아세틸은 바람직하게는 최대 60 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 55 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 50 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 45 ppb 디아세틸이다. 특히, 발효 완료 시 상기 수준의 디아세틸은 최대 60 ppb이다.
전술한 발효는 바람직하게는 적어도 6백만개 생존 효모 세포/밀리리터, 예컨대 적어도 1,000만개 생존 효모 세포/밀리리터, 예컨대 적어도 1,400만개 생존 효모 세포/밀리리터, 예컨대 7 내지 8백만개 생존 효모 세포/밀리리터의 범위, 예를 들어 14 내지 1,600만개 생존 효모 세포/밀리리터의 범위의 수성 추출물을 인큐베이션함으로써 수행된다. 특히, 상기 발효는 대략 1,500만개 효모 세포/밀리리터의 수성 추출물을 인큐베이션함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 상기 발효된 수성 추출물은 적어도 4% ABV, 예컨대 적어도 5% ABV, 예컨대 적어도 6% ABV, 예컨대 적어도 7% ABV의 알코올 함량을 갖는다.
일부 실시형태에서, 상기 발효된 수성 추출물은 적어도 25 mg/L 프로판올, 예컨대 적어도 30 mg/L 프로판올을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발효된 수성 추출물은 최대 8 mg/L 이소부탄올, 예컨대 최대 7 mg/L 이소부탄올, 예컨대 최대 6 mg/L 이소부탄올을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발효된 수성 추출물은 유리한 프로판올:이소부탄올 비율을 포함한다. 특히, 프로판올:이소부탄올 비율은 적어도 1.5, 예컨대 적어도 2.0, 예컨대 적어도 2.5, 예컨대 적어도 3.0, 예컨대 적어도 3.5, 예컨대 적어도 4.0, 예컨대 적어도 4.5, 예컨대 적어도 5.0, 예컨대 적어도 5.5, 예컨대 적어도 6.0, 예컨대 적어도 6.5일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 효모로 획득한 발효된 수성 추출물은 동일한 조건 하에 W-34/78 효모 균주 또는 효모 균주 혼성체 효모 7로 수행된 발효보다 동일한 % ABV에서 적어도 1.5%, 예컨대 2% 더 낮은 실 발효 정도(RDF)를 갖는다.
맥아 및/또는 곡물 기반 음료 및 이의 생성 방법
본 명세서에서 상기에 기재된 맥아 및/또는 곡물 기반 발효된 수성 추출물은 추가로 음료로 가공될 수 있다.
맥아 및/또는 곡물 기반 음료를 생산하는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 양상이며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
i. "맥아 및/또는 곡물 기반 발효된 수성 추출물 및 이의 생성 방법" 섹션에서 상기 본 명세서에 기재된 바와 같이 발효된 수성 추출물을 제조하는 단계, 및
ii. 상기 발효된 수성 추출물을 음료로 추가로 가공하는 단계.
본 발명의 일부 실시형태에서, 맥아 및/또는 곡물 기반 음료는 물과 같은 액체로 희석된다.
선택적으로, 맥아 및/또는 곡물 기반 음료를 희석하기 위해 물을 사용할 수 있으며, 이에 따라 예를 들어 에탄올 함량을 조절할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서 물:맥아 및/또는 곡물 기반 음료의 비율은 맥아 및/또는 곡물 기반 음료 1부에 대해 물 0.1 내지 5부의 범위일 수 있다.
추가 과정은 또한 예를 들어 맥아 및/또는 곡물 기반 음료의 냉각 및/또는 여과를 포함할 수 있다. 또한 첨가제가 첨가될 수 있다. 또한, CO2가 첨가될 수 있다. 마지막으로, 맥주와 같은 맥아 및/또는 곡물 기반 음료는 포장(예를 들어, 병 또는 캔)되기 전에 저온 살균 및/또는 여과될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 음료는 맥주이다.
본 발명의 일 양상에서, 본 발명에 따른 상기 효모 균주로 수성 추출물을 발효시켜 생성된 맥아 및/또는 곡물 기반 음료는 맛이 우수하다.
본 발명에 따른 효모를 사용한 발효에 의해 생성된 맥아 및/또는 곡물 기반 음료의 맛은 예를 들어 전문 맥주 테이스트 패널(taste panel)에 의해 분석될 수 있다. 바람직하게는, 상기 패널은 알데하이드, 종이 같은 맛, 오래된 맛, 에스테르, 고급 알코올, 지방산 및 유황 성분에 특별히 초점을 두고 맥주 맛을 맛보고 기재하는 훈련을 받은 자이다.
일반적으로, 테이스트 패널은 3 내지 30명 범위의 구성원, 예를 들어 5 내지 15명 범위의 구성원, 바람직하게는 8 내지 12명 범위의 구성원으로 구성될 것이다. 테이스트 패널은 에스테르, 고급 알코올, 황 성분 및 맥주 바디의 향미뿐만 아니라 종이, 산화, 숙성 및 빵 같은 이취와 같은 다양한 향미의 존재를 평가할 수 있다. 맥주의 전반적인 맛은 일반적으로 테이스트 패널에서 1 내지 9의 척도로 여러 가지 다른 특성으로 평가되며, 평균 등급이 5 이상인 것은 맥주가 허용 가능한 맛을 가지고 있음을 의미한다.
본 발명은 또한 상기 기재된 방법에 의해 제조된 맥아 및/또는 곡물 기반 음료를 제공한다.
일부 실시예에서, 음료는 적어도 25 mg/L 프로판올, 예컨대 적어도 30 mg/L 프로판올을 포함한다.
일부 실시형태에서, 음료는 최대 8 mg/L 이소부탄올, 예컨대 최대 6 mg/L 이소부탄올을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 효모 균주를 사용하여 제조된 발효된 수성 추출물 또는 음료는 프로판올:이소부탄올의 특정한 비율, 예를 들어 도 2에 도시된 비율과 유사한 비율을 가질 것이다. 발효된 수성 추출물 또는음료가 프로판올:이소부탄올의 특정 비율을 갖는 경우, 이는 발효된 수성 추출물 또는 음료가 본 발명의 효모 균주를 사용한 발효에 의해 생성되었다는 표시이다. 특히, 상기 프로판올:이소부탄올 비율은 적어도 1.5, 예컨대 적어도 2.0, 예컨대 적어도 2.5, 예컨대 적어도 3.0, 예컨대 적어도 3.5, 예컨대 적어도 4.0, 예컨대 적어도 4.5, 예컨대 적어도 5.0, 예컨대 적어도 5.1, 예컨대 적어도 5.2, 예컨대 적어도 5.3, 예컨대 적어도 5.4, 예컨대 적어도 5.5, 예컨대 적어도 6.0, 예컨대 적어도 6.5일 수 있다.
항목
본 발명은 다음 항목에 의해 추가로 정의될 수 있다:
1. 발효된 수성 추출물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물을 제공하는 단계;
ii) 사카로마이세스 파스토리아누스 종의 효모 균주를 제공하는 단계로서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는 단계; 및
iii) 단계 i)에서 제공된 수성 추출물을 단계 ii)의 상기 효모 균주로 발효시켜 발효된 수성 추출물을 획득하는 단계
를 포함하는, 방법.
2. a. ILV2를 인코딩하는 최대 2개의 기능성 유전자로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 서열번호 38의 SeILV2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자; 및
b. ILV3을 인코딩하는 적어도 5개의 기능성 유전자, 예컨대 적어도 6개의 기능성 유전자로서, ILV3를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 35의 ScILV3 또는 서열번호 41의 SeILV3, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자
를 이의 게놈(genome) 내에서 인코딩하는 효모 균주.
3. 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물에서 인큐베이션 시 발효된 수성 추출물을 생성할 수 있는 효모 균주로서, 상기 발효된 수성 추출물은 적어도 2.0의 프로판올:이소부탄올 비율을 포함하는, 효모 균주.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 총 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 시점은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.40° Plato, 예컨대 0.30° Plato, 예컨대 0.20° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점인, 방법 또는 효모 균주.
6. 제1항 및 4항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 55 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 50 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 45 ppb 디아세틸을 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
7. 발효된 수성 추출물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물을 제공하는 단계;
ii) 사카로마이세스 파스토리아누스 종의 효모 균주를 제공하는 단계로서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하며, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는 단계; 및
iii) 단계 i)에서 제공된 수성 추출물을 상기 효모 균주로 발효시켜 발효된 수성 추출물을 획득하는 단계
를 포함하는, 방법.
8. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 총 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 시점은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 12시간 동안 0.20° Plato, 예컨대 0.15° Plato, 예컨대 0.10° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점인, 방법 또는 효모 균주.
10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 55 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 50 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 45 ppb 디아세틸을 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
11. 발효된 수성 추출물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물을 제공하는 단계;
ii) 사카로마이세스 파스토리아누스 종의 효모 균주를 제공하는 단계로서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 24시간 동안 0.5° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는 단계; 및
iii) 단계 i)에서 제공된 수성 추출물을 상기 효모 균주로 발효시켜 발효된 수성 추출물을 획득하는 단계
를 포함하는, 방법.
12. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 24시간 동안 0.5° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 총 디아세틸, 예를 들어 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 시점은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 24시간 동안 0.40° Plato, 예컨대 0.30° Plato, 예컨대 0.20° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점인, 방법 또는 효모 균주.
14. 발효된 수성 추출물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
i) 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물을 제공하는 단계;
ii) 사카로마이세스 파스토리아누스 종의 효모 균주를 제공하는 단계로서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 65 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는 단계; 및
iii) 단계 i)에서 제공된 수성 추출물을 상기 효모 균주로 발효시켜 발효된 수성 추출물을 획득하는 단계
를 포함하는, 방법.
15. 제2항 내지 제6항, 제8항 내지 제10항 및 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 65 ppb 총 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 시점은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 12시간 동안 0.20° Plato, 예컨대 0.15° Plato, 예컨대 0.10° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점인, 방법 또는 효모 균주.
17. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 115 ppb 디아세틸을 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
18. 제1항 및 제4항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 용액 중에 최대 1,000만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백 50만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 8백 50만개 세포/밀리리터를 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)의 시험 용액 또는 시험 용액은 대략 16° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아즙인, 방법 또는 효모 균주.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)의 시험 용액 또는 시험 용액은 적어도 40 g/kg 말토스를 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)의 상기 발효 또는 상기 발효는 12℃ 내지 18℃의 범위의 온도에서 이루어지는, 방법 또는 효모 균주.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)의 상기 발효 또는 상기 발효는 최대 16℃의 온도에서 이루어지는, 방법 또는 효모 균주.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 ii)의 상기 발효 또는 상기 발효는 7,000,000 내지 20,000,000 생존 효모 세포/mL 시험 용액의 범위의 접종 후 발생하는, 방법 또는 효모 균주.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 추출물은 최대 6일, 예컨대 최대 5일, 예컨대 최대 4일 동안 상기 효모 균주와 발효되는, 방법 또는 효모 균주.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 추출물은 적어도 12° Plato, 예컨대 적어도 15° Plato의 겉보기 추출물을 갖는, 방법 또는 효모 균주.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 추출물은 맥아즙인, 방법 또는 효모 균주.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 추출물은 최대 3500 mg/L, 예컨대 최대 3000 mg/L, 예컨대 최대 2500 mg/L 아미노산을 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 최대 60 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 55 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 50 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 45 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 40 ppb 디아세틸을 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 상기 가장 빠른 시점에 용액 중에 최대 1,000만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백 50만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 8백 50만개 세포/밀리리터를 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 적어도 4% ABV, 예컨대 적어도 5% ABV의 알코올 함량을 갖는, 방법 또는 효모 균주.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 적어도 25 mg/L 프로판올, 예컨대 적어도 30 mg/L 프로판올을 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 최대 8 mg/L 이소부탄올, 예컨대 최대 6 mg/L 이소부탄올을 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 적어도 2.0, 예컨대 적어도 2.5, 예컨대 적어도 3.0, 예컨대 적어도 4.0, 예컨대 적어도 5.0, 예컨대 적어도 5.5의 프로판올:이소부탄올 비율을 포함하는, 방법 또는 효모 균주.
34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 상기 시험 용액은 인큐베이션 개시 후 5일 이내의 임의의 시점에 최대 265 ppb 디아세틸을 포함하고, 7 내지 8백만개의 범위의 효모 세포는 상기 시험 용액에 첨가되는, 방법 또는 효모 균주.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 최대 6일, 예컨대 최대 5일, 예컨대 최대 4일 동안 상기 시험 용액에서 인큐베이션 후 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하는 발효된 시험 용액을 생성할 수 있는, 방법 또는 효모 균주.
36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 최대 5일, 예컨대 최대 4일 동안 최대 16℃의 온도에서 상기 시험 용액에서 인큐베이션 후 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하는 발효된 시험 용액을 생성할 수 있는, 방법 또는 효모 균주.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 소정의 시간 동안 상기 시험 용액에서 인큐베이션 후 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하는 제1 발효 시험 용액을 생성할 수 있고, 상기 소정의 시간은 상기 시험 용액에서 인큐베이션 후 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하는 제2 발효된 시험 용액을 생성하기 위해 동일한 조건 하에 W-34/78 효모 균주를 인큐베이션하는데 필요한 시간보다적어도 12시간, 예컨대 적어도 24시간 적은, 방법 또는 효모 균주.
38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 상기 효모 균주를 상기 시험 용액에서 인큐베이션하는 경우 적어도 4.0, 예컨대 적어도 4.7 mL/L 에탄올/°Plato를 생성할 수 있는, 방법 또는 효모 균주.
39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 상기 효모 균주를 4 내지 6일의 범위 동안, 예컨대 대략 4일 동안 상기 시험 용액에서 인큐베이션하는 경우 적어도 4.0, 예컨대 적어도 4.7 mL/L 에탄올/°Plato를 생성할 수 있는, 방법 또는 효모 균주.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 멜리비오스를 유일한 탄소원으로 하는 배지에서 성장할 수 있는, 방법 또는 효모 균주.
41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV2를 인코딩하는 최대 5개의 대립유전자로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 서열번호 38의 SeILV2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV2를 인코딩하는 최대 4개의 유전자로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 서열번호 38의 SeILV2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV2를 인코딩하는 최대 2개의 유전자로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 서열번호 38의 SeILV2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV2를 인코딩하는 1 또는 2개의 범위, 예컨대 정확하게 2 기능성 유전자로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 서열번호 38의 SeILV2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV2를 인코딩하는 1 또는 2개의 범위, 예컨대 정확하게 2 기능성 유전자로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV6을 인코딩하는 최대 4개의 유전자로서, ILV6을 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 33의 ScILV6 또는 서열번호 39의 SeILV6, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV6을 인코딩하는 최대 4개의 기능성 유전자로서, ILV6을 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 33의 ScILV6 또는 서열번호 39의 SeILV6, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV5를 인코딩하는 적어도 4개의 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 적어도 5개의 유전자로서, ILV5를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 34의 ScILV5 또는 서열번호 40의 SeILV5, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 이의 게놈 내에서 ILV5를 인코딩하는 적어도 4개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 적어도 5개의 기능성 유전자로서, ILV5를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 34의 ScILV5 또는 서열번호 40의 SeILV5, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 인코딩하는, 방법 또는 효모 균주.
50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV5를 인코딩하는 최대 기능성 15개의 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 4 내지 10개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 4 또는 5개의 기능성 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV5를 인코딩하는 4 내지 8개의 범위의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 4 내지 6개의 범위, 예컨대 5개의 기능성 유전자로서, ILV5를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 34의 ScILV5 또는 서열번호 40의 SeILV5 또는 이와 적어도 80% 서열 상동성을 공유하는 전술한 것 중 임의의 것의 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV3을 인코딩하는 적어도 3개의 유전자, 예컨대 적어도 4개의 유전자로서, ILV3를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 35의 ScILV3 또는 서열번호 41의 SeILV3, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV3을 인코딩하는 최대 15개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 5 내지 10개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 5 또는 6개의 기능성 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV3을 인코딩하는 5 내지 9개의 범위 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 5 내지 7개의 범위, 예컨대 6개의 기능성 유전자로서, ILV3를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 35의 ScILV3 또는 서열번호 41의 SeILV3 또는 이와 적어도 80% 서열 상동성을 공유하는 전술한 것 중 임의의 것의 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 BAT1을 인코딩하는 적어도 3개의 유전자, 예컨대 적어도 4개의 유전자로서, BAT1을 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 36의 ScBAT1 또는 서열번호 42의 SeBAT1, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 BAT1을 인코딩하는 적어도 3개의 기능성 유전자, 예컨대 적어도 4개의 기능성 유전자로서, BAT1을 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 36의 ScBAT1 또는 서열번호 42의 SeBAT1, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 BAT2를 인코딩하는 적어도 4개의 유전자, 예컨대 적어도 5개의 유전자로서, BAT2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 37의 ScBAT2 또는 서열번호 43의 SeBAT2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 BAT2를 인코딩하는 적어도 4개의 기능성 유전자, 예컨대 적어도 5개의 기능성 유전자로서, BAT2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 37의 ScBAT2 또는 서열번호 43의 SeBAT2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 방법 또는 효모 균주.
59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, ILV2 및 ILV6을 인코딩하는 상기 효모 균주의 유전자의 합은 ILV5 및 ILV3을 인코딩하는 유전자의 합 미만인, 방법 또는 효모 균주.
60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, ILV2를 인코딩하는 상기 효모 균주의 유전자의 합은 ILV5 및 ILV3을 인코딩하는 유전자의 합 미만인, 방법 또는 효모 균주.
61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, ILV5 및 ILV3 대 ILV2의 상기 효모 균주의 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.5, 예컨대 적어도 2, 예컨대 적어도 2.5 또는 예컨대 적어도 3인, 방법 또는 효모 균주.
62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, ILV5 및 ILV3 대 ILV2의 상기 효모 균주 내의 기능성 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.5, 예컨대 적어도 2, 예컨대 적어도 2.5, 예컨대 적어도 3인, 방법 또는 효모 균주.
63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, ILV5 및 ILV3 대 ILV2 및 ILV6의 상기 효모 균주의 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.2, 예컨대 적어도 1.4, 예컨대 적어도 1.6, 예컨대 적어도 1.8 또는 예컨대 적어도 2인, 방법 또는 효모 균주.
64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, ILV5 및 ILV3 대 ILV2 및 ILV6의 상기 효모 균주 내의 기능성 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.2, 예컨대 적어도 1.4, 예컨대 적어도 1.6, 예컨대 적어도 1.8 또는 예컨대 적어도 2인, 방법 또는 효모 균주.
65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, ILV2, ILV3 및/또는 ILV5를 인코딩하는 유전자는 이의 천연 프로모터로부터 발현되는, 방법 또는 효모 균주.
66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, ILV2, ILV3, ILV5, ILV6, BAT1 및/또는 BAT2를 인코딩하는 유전자는 이의 천연 프로모터로부터 발현되는, 방법 또는 효모 균주.
67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV2 유전자의 돌연변이 또는 결실을 보유하는, 방법 또는 효모 균주.
68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV2 유전자 내의 프레임시프트 돌연변이를 보유하는, 방법 또는 효모 균주.
69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV2 유전자의 낮은 발현 또는 비발현을 야기하는 돌연변이를 보유하는, 방법 또는 효모 균주.
70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV6 유전자의 돌연변이 또는 결실을 보유하는, 방법 또는 효모 균주.
71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV6 유전자 내의 프레임시프트 돌연변이를 보유하는, 방법 또는 효모 균주.
72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV6 유전자의 낮은 발현 또는 비발현을 야기하는 돌연변이를 보유하는, 방법 또는 효모 균주.
73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 임의의 이종 DNA를 포함하지 않는, 방법 또는 효모 균주.
74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 유전자 조작 단계를 거치지 않는, 방법 또는 효모 균주.
75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조되는 발효된 수성 추출물.
76. 음료를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
i. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 따른 발효된 수성 추출물을 제조하는 단계, 및
ii. 상기 발효된 수성 추출물을 음료로 가공하는 단계
를 포함하는, 방법.
77. 제76항에 있어서, 가공 단계는
i. 여과,
ii. 탄산화,
iii. 숙성, 또는
iv. 병입
중 하나 이상을 포함하는, 방법.
78. 제76항 또는 제77항에 따른 방법에 의해 제조되는 음료.
79. 제78항에 있어서, 상기 음료는 적어도 25 mg/L 프로판올, 예컨대 적어도 30 mg/L 프로판올을 포함하는, 음료.
80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 음료는 최대 8 mg/L 이소부탄올, 예컨대 최대 6 mg/L 이소부탄올을 포함하는, 음료.
81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음료는 맥주인, 음료.
82. 제75항 또는 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물 또는 상기 음료는 적어도 3.0, 예컨대 적어도 4.0, 예컨대 적어도 5.0, 예컨대 적어도 5.5의 프로판올:이소부탄올 비율을 갖는, 발효된 수성 추출물 또는 음료.
83. 효모 균주로서, 상기 효모 균주는 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 시험 용액에서 상기 효모 균주의 인큐베이션 후 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 상기 추출물에서 상기 효모 균주의 인큐베이션 후 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하는, 효모 균주.
84. 제83항에 있어서, 효모 균주는 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 사카로마이세스 파스토리아누스 효모 균주.
실시예
재료 및 방법
맥아즙 제조
일반적으로, 하기 실험예에서 사용된 맥아즙은 2.7L의 물/kg 맥아에 70% 필스너 맥아 및 30% 보리 부가물을 매싱하여 제조하였다.
매싱 방식은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다:
맥아즙 제조를 위한 매싱 방식.
개시시 온도(℃) 종료시 온도(℃) 시간(min) 총 시간
(min)
매싱 52.0 52.0 5 5
Hold 52.0 15 20
온도 증가 52.0 65.0 13 33
Hold 65.0 50 83
온도 증가 65.0 72.0 7 90
Hold 72.0 20 100
온도 증가 72.0 78.0 6 106
Hold 78.0 10 116
이 매싱 방식의 변화는 여전히 발효에 적합한 맥아즙을 생성할 수 있다.
매싱 후, 맥아즙을 60분 동안 끓였다. 맥아즙이 발효에 적합한지 확인하려면 함량이 다음 범위 내에 있어야 한다:
· 글루코스 12 내지 25 g/L
· 말토스 60 내지 80 g/L
· 말토트리오스 15 내지 20 g/L
· 아연 0.16 내지 0.18 mg/L
· 유리 알파 아미노 질소(FAN) 110 내지 250 mg/L
· 발린/FAN 0.6 내지 0.8
가이드로서, 70% 필스너 맥아 및 30% 보리 부가물로 제조된 맥아즙의 평균 함량은 하기 표 2에 제시되어 있다. 아래 매개변수 중 일부를 벗어난 맥아즙은 여전히 좋은 맥주를 생성할 것으로 예상된다.
70% 필스너 맥아와 30% 보리 부가물로 제조된 맥아즙의 조성 예.
당 g/100 ml 맥아즙 STD 재료 mg/L STD
프룩토스 0.29 0.06 Ca 칼슘 46.15 9.28
글루코스 1.93 0.70 Mg 마그네슘 115.73 15.31
수크로스 0.35 0.09 Na 나트륨 21.03 10.63
말토스 7.84 0.52 K 칼륨 815.82 170.68
말토트리오스 1.69 0.55 Zn 아연 0.17 0.10
발효 가능한 당의 합계 12.10 0.95 Cu 구리 0.07 0.02
당 (단당류, 이당류) 10.59 0.45 Fe 철 0.12 0.08
환원당 BUR 미가공 FR 2.30 0.40 Al 알루미늄 0.01 0.01
Mn 망간 0.11 0.08
P 인 511.96 61.85
SI 규소 18.43 9.03
아미노산 mg/L STD
아스파르트산 (Asp) 89.53 16.66 FAN* mg/L 207.16 52.16
글루탐산 (Glu) 91.43 15.62
세린(Ser) 92.10 28.01 VAL/FAN 0.61 0.03
히스티딘(His) 59.09 15.86
글리신(Gly) 44.98 12.42
트레오닌(Thr) 81.00 25.22
아르기닌(Arg) 161.68 59.35
알라닌(Ala) 120.60 27.66
티로신(Tyr) 133.16 39.81
메티오닌(Met) 47.92 17.61
발린(Val) 141.48 34.78
페닐알라닌(Phe) 147.45 30.83
이소류신(Iso) 81.80 21.26
류신(Leu) 181.02 31.62
라이신(Lys) 115.49 36.49
아미노산 클래스 1 합계 410.67 90.89
아미노산 클래스 2 합계 681.55 148.43
아미노산 클래스 3 합계 532.18 113.77
* FAN= 유리 알파 아미노 질소
효모의 응집을 돕기 위해, 하기 실시예 중 일부에 기재된 바와 같이 발효 전에 추가적인 아연을 맥아즙에 첨가할 수 있다.
액적 PCR
Epicentre의 MasterPure 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 2배체 효모 균주 및 반수체 포자 클론으로부터 게놈 DNA를 제조하였다. Milli Q water를 사용하여 각 최종 DNA 제조물의 농도를 50 ng/마이크로리터 DNA로 조정했다. DNA를 NanoDrop 2000 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 정량화하였다.
Biorad 액적 PCR(QX200) 및 사카로마이세스 에우바야누스 및 사카로마이세스 세레비시아에 ILV2 유전자에 어닐링하도록 설계된 프로브를 사용한다. 이 프로브를 반수체 포자 클론 및 대조군 이배체 효모 균주에서 게놈 DNA를 표적화하기 위해 사용하였다. 본 발명자들은 이 방법을 사용하여 2개의 변이체 ILV2 유전자 사이의 비율을 정량적 방식으로 결정할 수 있었다. S. 에우바야누스 및 S. 세레비시아이에 ILV2 대립유전자를 구별하기 위해 TaqMan 분석에 기반한 종 특이적 디지털 PCR 반응을 설계했다. 이를 위해 표적 특이적 프라이머를 S. 에우바야누스 및 S. 세레비시아에에 대한 ILV2 유전자의 동종 영역에서 설계하였으며, 이는 동일한 정방향 및 역방향 프라이머가 두 ILV2 종 카피를 동시에 증폭할 수 있음을 의미한다. 종 특이적 프로브는 S. 에우바야누스와 S. 세레비시아에 유형의 ILV2 대립유전자를 구별할 수 있도록 단일 뉴클레오타이드를 제외하고는 동일하도록 설계하였다. S. 세레비시아에 대한 종 특이적 프로브는 S. 세레비시아에 ILV2 야생형 서열에서 뉴클레오타이드 위치 1515에 T가 있고, S. 에우바야누스에 대한 종-특이적 프로브는 S. 에우바야누스 ILV2 야생형 서열에서 뉴클레오타이드 위치 1515에 C를 갖는다. S. 에우바야누스 ILV2 대립유전자와 S. 세레비시아에 ILV2 대립유전자를 구별하기 위해 다음 프라이머 및 프로브를 개발하였다:
S. 세레비시아에 및 S. 에우바야누스 ILV2를 동시에 증폭할 표적 특이적 ILV2 프라이머:
표적 특이적 정방향 프라이머(5'- GCCAACGACACAGGAAGAC - 3') (서열번호 1)
표적 특이적 역방향 프라이머(5'- GTACCTAAACCACCTGATGT - 3') (서열번호 2)
S. 세레비시아에 및 S. 에우바야누스 ILV2 카피 사이를 구별하는 종 특이적 프로브:
S. 세레비시아에 ILV2 대립유전자 특이적 프로브(5'- TGGGCTGCTCAACAC - 3') (서열번호 : 3) - 5' FAM 및 3' BHQ1로 표지됨
S. 에우바야누스 ILV2 대립유전자 특이적 프로브(5'- ACGTACGGAATGTGGATT - 3') (서열번호 4) - 5' HEX 및 3' BHQ1로 표지됨
Droplet Digital PCR QX200 시스템(Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 제조업체에서 제공한 지침에 따라 ddPCR을 수행했다. 분석 목적을 위해 효모 균주의 정제된 gDNA(5ng/μl DNA 농도) 5μl를 프로브용 2x ddPCR Supermix 11μl(No. dUTP; Bio-Rad), 900nM 표적 특이적 PCR 정방향 프라이머, 900 nM 표적 특이적 PCR 역방향 프라이머, 250 nM S. 세레비시아에 ILV2 대립유전자 특이적 프로브 및 250 nM S. 에우바야누스 ILV2 대립유전자 특이적 프로브가 포함된 17μl PCR 혼합물에 첨가했다. 반응 혼합물을 AutoDG Droplet Generator(Bio-Rad Laboratories)에 부가하고 제조업체의 매뉴얼에 따라 액적 생성을 수행했다. 액적 유액을 표준 PCR 조건을 사용하여 열 순환하였다: 95℃에서 10분 동안 변성, 94℃에서 30초 및 55℃에서 1분 동안 40주기의 PCR, 및 98℃에서 10분 동안 최종 확장 8℃에서 미세역가 플레이트 저장. QX200 Droplet Reader(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 액적의 PCR 증폭을 확인하고 QuantaSoft(버전 v1.7, Bio-Rad Laboratories) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다.
총 ILV2 유전자 카피 수의 검출
제1 라운드에서, S. 에우바야누스와 S. 세레비시아에 ILV2 간의 비율을 각 단일 포자 클론의 정제된 게놈 DNA에서 직접 분석하였다. 동일한 부모 효모에서 유래했음에도 불구하고 일부 포자 클론은 서로 다른 ILV2 유전자 구성을 가졌다. 일부 포자 클론은 포자 클론에 100% S. 세레비시아에 ILV2 유전자만 있는 것으로 보인다. 대부분의 부모 라거 효모는 3배체 또는 4배체이기 때문에(문헌[Wahlter et al, 2014]) 100% S. 세레비시아에 ILV2 포자 클론은 1 내지 3개의 카피를 가질 수 있다고 가정할 수 있다. 50/50과 같은 두 가지 유형의 ILV2를 가진 포자 클론의 경우 포자 클론에서 각 유형의 1카피 또는 부모 효모에서 2 + 2로 가정된다. 비율이 67/33에 가까운 균주는 S. 세레비시아에 1개의 카피와 S. 에우바야누스 ILV2 2개의 카피를 의미한다.
100%에 가까운 S. 세레비시아에 ILV2를 갖는 포자 클론에서 카피 수의 보다 정확한 추정을 가능하게 하기 위해, 스파이크 후 S. 세레비시아에/S. 에우바야누스 분포를 얻기 위해 샘플에 순수한 외부 S. 에우바야누스 DNA를 첨가하거나 스파이킹하여 시험을 반복했다. 스파이크 후 S. 에우바야누스 쪽으로 강하게 이동하는 ScILV2/SeILV2 비율은 S. 세레비시아에 ILV2의 카피가 적음을 나타내며 비율이 S. 에우바야누스 DNA 쪽으로 약간만 이동하고 여전히 높은 S. 세레비시아에가 나타나는 경우 원래 포자 클론에 많은 S. 세레비시아에 ILV2 카피가 있음을 나타낸다.
50ng/마이크로리터 DNA의 각 샘플이 50/50 비율(10마이크로리터 샘플 + 10마이크로리터 S. 에우바야누스 DNA)로 동일한 농도 50ng/마이크로리터의 S. 에우바야누스 DNA와 혼합되도록 스파이킹을 수행했다.
액적 QPCR 추정 방법은 존재하는 총 ILV2 카피를 정량적으로 반영하지만 특정 SNP 또는 프레임 시프트 돌연변이의 존재로 인해 일부 불활성화된 ILV2 대립유전자가 있는지 나타낼 수는 없다. 이러한 돌연변이는 Sanger 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱에 의한 후속 게놈 DNA 시퀀싱에 의해 먼저 검출될 수 있다.
응집에 대한 스크리닝
효모 포자 클론의 응집 기능을 평가하기 위해, 먼저 며칠 동안 실온에서 일반 맥아즙에서 성장시켰다. 각 균주에 대해 2ml의 배양물을 2ml 반응 튜브로 옮기고, 완전히 교반시키고, 세포를 10분 동안 정치시켰다. 칼슘 의존성 응집을 결정하기 위해 앞서 언급한 배양액 2ml의 세포를 수확하고 50mM EDTA 용액으로 두 번 세척한 다음 칼슘의 부재 하에 2 ml 50 mM Tris, 50mM 숙신산 및 100mM KOH에 재현탁했다(문헌[Stratford 1996]). pH를 맥아즙 배양물의 최종 pH 값과 유사한 pH 4.0으로 조정하였다. 세포 현탁액을 다시 완전히 교반하고, 세포를 5분 동안 정치시켰다. 결과는 사진으로 기록하였다.
자기 교반 하의 실린더를 사용한 맥아즙 발효에서 포자 클론의 총 디아세틸 측정
포자 클론 및 대조군 효모를 Stuart SB2 회전 단위(www.stuart-equipment.com) 상의 2ml 액체 YPD에서 3일 동안 사전 성장시켰다. 16 Plato의 25ml 저온살균 표준 필스너 맥아즙의 비배플 진탕 플라스크에 2ml 전배양물을 접종하고 중간 진탕하면서 진탕 테이블에서 실온에서 5일 동안 성장시켜 조밀한 고정상 배양물에 도달시켰다.
이전에 기재된 바와 같이 유리 실린더에서 맥주 발효를 수행하였다(문헌[Guiterrez et al., 2018]). 필스너 맥아즙 200mL를 포함하는 250mL 높이의 유리 측정 실린더(331 X 39 X 39mm; Duran)에서 발효를 수행하고 실린더 상부에 뒤집힌 유리 비커(Duran)로 밀봉하여 이산화탄소를 쉽게 배출할 수 있도록 하고, 분석을 위한 샘플링 접근을 용이하게 했다. 발효를 냉장고(유형 TS 606-G/4-i의 인큐베이터 캐비닛) 내부의 16℃에서 교반 Variomag 교반 플랫폼에서 마그네틱 바를 사용하여 150rpm에서 연속 교반하면서 수행하였다. 효모 세포 수를 세포계수기(https://www.nexcelom.com/applications/cellometer)로 추정하고 1,500만개 세포/ml 맥아즙의 비율로 접종(피칭(pitching))하고 발효 수행성을 대사 CO2 방출로 인한 중량 손실을 측정하여 모니터링하였다. 디아세틸 분석을 위해 발효 2일, 3일 및 4일에 10 ml 샘플을 수집하였다. 샘플을 1900g에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 추가 사용 전까지 -20℃의 동결기에 저장했다. 발효 실린더의 추가 중량 손실을 측정할 수 없을 때 발효가 완료된 것으로 고려했다. 총 디아세틸을 결정하기 위해 60℃에서 90분 동안 샘플을 인큐베이션하는 기간을 포함하는 유럽 양조 협약 방법 EBC 9.24.2에 따라 기체 크로마토그래피로 총 디아세틸을 측정했으며, 이는 전구체 아세토락테이트 및 유리 디아세틸의 총 합을 반영할 것이다.
효모 균주
혼성체 효모 7 사카로마이세스 파스토리아누스는 라거 생성 균주이며 추가 냉각 없이 발효 종료 시 효모를 수집할 수 있는 높은 응집력을 나타낸다. 혼성체 효모 7을 본 발명의 효모에 대한 참조로 사용한다.
ZDA1은 본 발명의 효모이다.
ZDA2는 본 발명의 효모이다.
ZDA3은 본 발명의 효모이다.
W-34/78 사카로마이세스 파스토리아누스는 독일 Weihenstephan Hefebank(info@hefebank-weihenstephan.de)로부터 시판되는 라거 효모 균주이다. 이 효모는 디아세틸을 매우 효율적으로 환원시키는 것으로 알려져 있으며 높은 응집을 나타내지만, 위에서 기재한 맥아즙에서 발효할 때 혼성체 효모 7 균주보다 훨씬 적다. 이를 본 발명의 효모에 대한 참조로 사용한다. W-34/78은 본 명세서에서 WS34/78로도 지칭된다.
실시예 1 - 효모 균주 ZDA1 및 비교 균주 혼성체 효모 7에 의한 16 및 18℃에서의 50L 시험
대조군 효모 균주에 대한 신규한 혼성체 효모 균주의 발효 동안 디아세틸 수준의 차이를 시험하기 위해, 15 또는 16의 °Plato로 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 맥아즙으로부터 50L 맥주를 제조하였다. 발효 전에 맥아즙을 pH 4.9로 조정하고 아연을 최종 농도 0.30mg/L로 첨가했다. 맥아즙을 12-1,500만개 생존 효모 세포/mL 맥아즙으로 접종하였다. 발효를 16℃ 또는 18℃에서 수행하였다. 일반적으로 라거는 12℃ 내지 16℃에서 발효시킨다. 효모가 18℃를 견딘다면 이는 발효 과정을 가속화하는 역할을 할 수 있다. 하기 표에 나타낸 바와 같이 발효 동안 0일 및 다양한 시점에서 샘플을 획득하였다. 그 결과는 하기 표 3 및 표 4에 나타나 있고 도 1a 내지 도 1c에 그래프되어 있다.
18℃에서 50L 발효.
효모 일 온도
℃ 		°Plato 디아세틸
ppb 		pH 알코올
Vol%
ZDA1 0 15.79 4.90
1 18.3 13.61 87 4.33
3 3.33 54
4 18.0 3.23 26 4.16 6.95
혼성체 효모 7 0 15.78 4.90
1 17.9 13.6 489 4.45
3 3.06 137
4 17.7 3.01 56 4.05 7.02
16℃에서의 50 L 발효.
효모 일 온도
℃ 		°Plato 디아세틸
ppb 		pH 알코올
Vol%
ZDA1 0 15.27 4.89
4 15.8 3.52 93 4.11
5 15.7 3.38 50 4.15
6 15.7 3.38 31 4.15
7 15.7 19 4.15 6.55
혼성체 효모 7 0 15.27 4.89
4 16.2 3.39 4.04
5 16.3 3.28 4.09
6 16.3 3.26 77 4.09
7 16.3 42 4.09 6.59
맥주는 디아세틸 수준이 50ppb 미만이고 Plato가 안정할 때(발효 가능한 모든 당이 사용됨), spec.이라고 언급된다. 대조군 효모와 비교하여 적어도 유사한 양의 알코올을 생성하면서 가능한 가장 짧은 시간에 spec. 맥주를 얻는 것이 유리하다.
18℃에서 디아세틸 수준
표 3 및 도 1b 및 도 1c에서 볼 수 있는 바와 같이, 효모 균주 ZDA1은 18℃에서 발효되었을 때 디아세틸 수준이 50ppb에 가깝고 동시에 맥아즙에 존재하는 모든 발효 가능한 당이 사용되고(24시간 동안 °Plato의 강하가 0.50 미만인 것이 분명함) 3일 이내에 발효된 맥아즙(생맥주)을 생성할 수 있었다. 이와 달리, 대조군 효모 균주 혼성체 효모 7은 매우 높은 디아세틸 수준(도 1b)으로 개시하여 균주 ZDA1이 3일째에 가졌던 것과 유사한 수준의 디아세틸에 도달하는데 4일이 필요했다.
이전 24시간에서 겉보기 추출물이 0.50°Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점은 두 균주에 대해 4일째로 고려되었다. 4일째에 혼성체 효모 7로 획득한 생맥주는 약 56ppb 디아세틸이고, ZDA1으로 획득한 생맥주는 26ppb만 포함했다.
발효가 16℃에서 수행되었을 때(표 4 및 도 1a), 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점은 두 균주 모두 5일째였다. 그 당시 ZDA1 균주는 적절한 50ppm 디아세틸 수준에 도달하고, 대조군 효모 혼성체 효모 7은 50ppm 미만의 디아세틸 수준에 도달하기 위해 추가로 2일을 발효시켜야 했다.
16℃ 또는 18℃에서 발효 후 프로판올, 아이소부탄올 및 SO 2 수준
16℃18℃
디아세틸 및 Plato에 더하여, 프로판올 및 이소부탄올 수준을 50L 시험 맥주로 제조된 최종 맥주에서 측정하였다. 최종 맥주를 5.0부피%의 알코올 함량으로 조정하고, CO2를 5.1g/L로 조정하고 33cl 녹색 병에 병입하였다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 프로판올 및 아이소부탄올 이소부탄올리스는 분지쇄 아미노산 경로 내의 제한된 경로 플럭스, 특히 효모의 낮은 ILV2 활성의 지표로 여겨지며, 따라서 효모 균주가 저 디아세틸 생성자가 될 가능성을 갖는지를 평가하는 좋은 방법이다. 높은 프로판올:이소부탄올 비율은 저 디아세틸 생성 효모를 나타낸다. 결과는 아래 표 5에 나와 있다.
발효된 맥아즙(생맥주)의 프로판올 및 이소부탄올 함량
효모 온도
℃ 		프로판올 이소부탄올 프로판올: 이소부탄올비율 SO 2
ZDA1 16 35.09 4.93 7.73 7
18 42.18 6.39 6.60 6
혼성체 효모 7 16 15.53 17.50 0.89 4
18 19.3 19.57 0.97 2
표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 16℃ 및 18℃ 모두에서 혼성체 효모 균주 ZDA1로 발효하여 획득한 생맥주는 대조군 효모 균주 혼성체 효모 7로 획득한 생맥주와 비교하여 더 높은 수준의 프로판올을 나타냈다. 혼성체 효모 균주 ZDA1과 함께 인큐베이션된 맥아즙은 또한 혼성체 효모 7과 비교하여 더 낮은 수준의 이소부탄올을 나타냈고, 프로판올:아이소부탄올 비율에서 적어도 6.8배의 차이를 초래했다.
또한 효모 균주 ZDA1로 획득한 생맥주의 SO2 수준이 대조군 균주의 생맥주에서보다 더 높은 것으로 관찰되었다. 이는 최종 맥주의 보존 측면에서 이점을 제공할 수 있다.
도 3은 본 발명에 따른 ZDA2 효모 균주를 사용하여 생성된 "대조군 병 89-84393 ZDA2" 맥주와 비교한 시판 맥주의 프로판올/이소부탄올 비율을 나타낸다. "대조군 병 89-84393 ZDA2"를 50L 시험에서 생성하고 5%까지 양조한다. 모든 시판 맥주는 프로판올 대 아이소부탄올 비율이 더 낮다.
실시예 2 - 효모 균주 ZDA2 및 ZDA3을 사용하여 16℃에서 50L 시험
바람직한 디아세틸 특성을 갖는 2개의 추가 효모 혼성체 균주를 확인하고 실시예 1의 균주 ZDA1과 비교하였다. 50L 맥주를 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 °Plato 16으로 맥아즙으로부터 제조하였다. 발효 전에 맥아즙을 pH 4.9로 조정하고 아연을 0.30 mg/L의 최종 농도로 첨가하였다. 맥아즙을 1,400만개 생존 효모 세포/ml 맥아즙으로 접종하였다. 접종을 위한 효모를 50L 1차 발효에서 얻었고, 효모 세포을 발효 종료 시 수확하여 제2 50L 발효 시험을 다시 개시하는데 사용하였다. 이는 대규모 맥주 생성이 이루어지는 방식과 유사하다. 발효를 16℃에서 수행하였다. 아래 표에 표시된 대로 0일과 발효 중에 샘플을 획득하였다. 결과는 아래 표 6에 나와 있다.
16℃에서 50L 발효.
효모 일 온도
℃		 °Plato 디아세틸
ppb		 pH 알코올
Vol%
ZDA1 0 16.05 4.9
1 16.2 13.7 90 4.45
3 63
4 16.4 2.99 48 4.22
5 16.3 2.94 4.24 7.29
ZDA2 0 16.05 4.9
1 16.2 14.13 48 4.47
3 55
4 16.5 3.09 42 4.21
5 16.4 3.01 4.24 7.28
ZDA3 0 16.05 4.9
1 15.9 13.73 68 4.41
3 45
4 16.2 3.04 35 4.28
5 15.9 3 4.29 7.26
표 6에 나타낸 바와 같이, 3개의 후보(ZDA1, ZDA2 및 ZDA3) 모두는 4일째에 50ppb 미만의 디아세틸 수준을 나타냈고, 이는 겉보기 추출물이 안정기에 도달한 시간에 해당한다. 또한, ZDA3은 3일째에 이미 50ppb 미만의 디아세틸 수준을 나타내었다.
실시예 3 - 맛 결과
실시예 2에서 획득한 발효 맥아즙을 추가로 알코올 함량을 5부피%로, CO2를 5.1g/L로 조정하여 최종 맥주로 가공하고 표준 덴마크 녹색 33cl 병에 병입하였다. 맥주를 10명의 테이스터로 구성된 전문 맥주 테이스트 패널에 의해 평가하였다. 각 테이스트 패널 구성원은 광범위한 교육을 받았으며 특히 각 구성원은 에스테르, 고급 알코올, 황 성분 및 맥주 바디의 맛 특성을 평가하는 전문가이다. 각 테이스트 패널 구성원은 서로 다른 향미 요소를 평가했다. 특히, 전체적인 맛을 1부터 9까지의 척도로 평가하여 하기 표 7에 "주요 결과"로 제공하였다.
실시예 2의 50L 시험에서 획득한 맥주의 맛 결과.
샘플명 제1 발효
주요 결과
ZDA1 6.1 충분
ZDA2 5.7 충분
ZDA3 5.8 충분
표 7에 나타낸 바와 같이, 효모의 모든 균주에 의해 생성된 맥주 샘플은 적어도 5.7(충분)로 평가되었다.
실시예 4 - 효모 균주 ZDA1 및 비교 균주 혼성체 효모 7을 사용한 16℃에서의 10 HL 맥주 시험
이 실시예의 목적은 혼성체 효모 균주 ZDA1이 실시예 1에서 50L 규모에서 관찰된 것과 동일한 유리한 디아세틸 특성을 나타내는지를 조사하는 것이었다. 10 HL 맥주를 약 16 °Plato로 재료 및 방법 섹션에 기재된 대로 맥아즙에서 제조하였다. 발효 전에 맥아즙을 pH 4.95로 조정하고 아연을 최종 농도 0.8mg/L로 첨가했다. 맥아즙을 혼성체 효모 균주 ZDA1 또는 대조군 라거 효모 균주 혼성체 효모 7의 적어도 1,500만개 생존 효모 세포/mL 맥아즙으로 접종하고, 약 16℃에서 발효시켰다. 접종을 위한 효모를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제1 양조주로부터 획득하였다. 샘플을 0일 및 하기 결과 표 8에 표시된 날에 획득하였다. 결과는 표 8에 나와 있으며 도 2a 및 도 2b에 도시되어 있다.
16℃에서 10 HL 발효.
효모 일 온도
℃ 		°Plato 디아세틸
ppb 		pH 알코올
Vol%
ZDA1 0 15.7 16.05 4.73
1 15.9 14.24 239 4.49 0.92
4 15.7 2.87 55 4.11 7.15
5 15.9 2.73 28 4.19 7.28
6 15.9 2.65 14 4.13 7.43
혼성체 효모 7 0 15.8 16.1 4.72
1 15.8 14.41 868 4.54 0.87
4 16.0 3.34 509 4.07 6.84
5 15.7 2.67 205 4.06 7.32
6 15.8 2.56 91 4.05 7.48
7 15.0 2.53 36 4.11 7.48
효모 균주 ZDA1은 상당히 낮은 초기 수준의 디아세틸을 생성하고 혼성체 효모 균주 ZDA1로 획득한 생맥주는 4일째에 디아세틸의 맛 임계값(50ppb)에 근접했고 5일째에는 28ppb로 떨어졌다. 그러나 대조군 효모 균주 혼성체 효모 7로 획득한 생맥주는 7일째에 이 임계값에 처음 도달했다(도 2a). 도 2b는 효모 혼성체 ZDA1로 획득한 생맥주의 총 디아세틸 수준이 대략 발효 가능한 당이 완전한 발효에 가까워지는 것과 거의 동시에, 즉 4일째에 50ppb에 근접한다는 것을 보여준다.
실시예 5 - 맛 결과
실시예 4에서 획득한 발효 맥아즙을 알코올 함량을 4.6 부피%로, CO2를 5.4 g/L로 조정하여 최종 맥주로 추가 가공하고 33 cl 황색 병에 병입하였다. 맥주를 덴마크와 프랑스에서 온 10명의 테이스터로 구성된 전문 맥주 테이스트 패널에 의해 평가하였다. 각 테이스트 패널 구성원은 광범위한 교육을 받았으며 특히 각 구성원은 에스테르, 고급 알코올, 황 성분 및 맥주 바디의 맛 특성을 평가하는 전문가이다. 각 테이스트 패널 구성원은 서로 다른 향미 요소를 평가했다. 특히, 전체적인 맛을 1부터 9까지의 척도로 평가하여 하기 표 9에 "주요 결과"로 제공하였다.
실시예 4의 10 HL 실험에서 획득한 맥주의 맛 결과.
샘플명 주요 결과
ZDA1 6.6 충분
혼성체 효모 7 6.4 충분
표 9에 나타낸 바와 같이, 효모 균주 ZDA1에 의해 생성된 맥주 샘플은 6.6(충분)으로 평가되었으며, 이는 대조군 혼성체 효모 7로 생성된 맥주보다 약간 높다.
실시예 6 - 3개의 대조군 라거 효모 균주를 포함한 16℃에서의 시험
이 실험을 실시예 2의 3가지 신규한 효모 균주를 추가적인 상업적으로 입수 가능한 효모 균주 및 실시예 1, 2 및 4에서 사용된 대조군과 비교하기 위해 수행하였다. 40L 맥주를 52℃에서의 제1 유지 시간을 30분으로 약간 변경하여 재료 및 방법 섹션에 기재된 대로 맥아즙으로부터 제조하였다. 발효의 경우 °Plato는 15 또는 16이었다. 발효 전에 맥아즙의 pH를 4.9로 조정하고 아연을 최종 농도 0.30 mg/L로 첨가했다. 맥아즙에 7백 50만개 생존 효모 세포/ml 혼성체 효모 균주 ZDA1, ZDA2 및 ZDA3 및 대조군 라거 효모 균주 혼성체 효모 7, 및 독일의 Weihenstephan에서 시판되고 있는 대조군 라거 효모 균주 W-34/78로 접종했다. 맥아즙을 약 16℃에서 발효시켰다. 샘플을 1일 및 아래 결과 표에 표시된 날에 획득하였다. 결과는 표 10에 나와 있다.
16℃에서 40L 발효.
효모 일 온도
℃ 		% Plato 디아세틸
ppb 		pH 액체 중 세포
(x100만개/ml) 		알코올
Vol% 		프로판올 이소-프로판올
혼성체 효모 7 1 15.7 15.54 88 4.71
2 16.5 12.78 431 4.45
3 　 　 869 　
4 　 　 520 　
5 16.4 2.49 265 4.02
6 16.5 2.45 115 4.05 0.8
7 2.37 57 4.09
8 44 7.35 11.02 9.57
W-34/78 1 14.5 15.4 176 4.64
2 16.1 12.54 470 4.33
3 　 　 485 　
4 　 　 286 　
5 16.3 2.97 150 4.1
6 16.2 2.68 62 4.15
7 15.4 2.63 41 4.19 17
8 　 　 33 　 7.2 11.08 9.85
ZDA1 1 15.6 15.26 89 4.69
2 16.3 12.24 166 4.38
3 　 　 133 　
4 　 　 74 　
5 16.2 2.9 42 4.15
6 16.1 2.73 24 4.2 2.5
7 16.2 2.69 16 4.25
8 15.6 15.26 89 4.69 7.18 27.04 4.00
ZDA2 1 14.7 15.47 20 4.64
2 16.1 12.7 　 4.4
3 　 　 245 　
4 　 　 102 　
5 16.3 2.68 49 4.05
6 16.2 2.55 25 4.09 1.2
7 16.2 2.5 15 4.13 7.3 22.54 3.61
ZDA3 1 14.6 15.5 39 4.63
2 16.5 12.96 92 4.42
3 　 　 116 　
4 　 　 63 　
5 16.4 3.78 32 4.08
6 16.5 3.28 18 4.12 2.8
7 16.3 3.21 12 4.15 6.9 24.20 3.56
이 시험에서, 3개의 저 디아세틸 균주(ZDA1, ZDA2 및 ZDA3)는 모두 5일째에 50ppb 미만의 디아세틸 수준을 나타냈는데, 이는 시험된 모든 효모 균주에 대해 겉보기 추출물이 고원에 도달한 시간에 해당하고, 대조군 균주는 같은 날 110ppb 미만의 디아세틸 수준을 나타냈다. 이전 24시간에서 겉보기 추출물이 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점은 이러한 모든 시험에서 6일째로 고려된다. 6일째에, 모든 저 디아세틸 균주(ZDA1, ZDA2 및 ZDA3)는 45ppb(각각 24ppb, 25ppb 및 18ppb) 미만의 디아세틸 수준을 나타내고, 대조군 균주(혼성체 효모 7, W-34/ 70 및 W-34/78)은 더 높은 수준의 디아세틸을 나타내었다(각각 115ppb, 62ppb 및 62ppb).
이러한 결과는 Weihenstephan 효모가 혼성체 효모 7 균주 및 본 발명의 균주보다 덜 응집된다는 점을 고려하면 상당히 주목할 만하다. 발효 종료 시 액체(효모 펠릿 위) 중 세포 수는 응집의 적절한 척도이다. 이 데이터는 위의 표 10에 액체 중 세포로 표시된다(값이 낮을수록 효모가 응집력이 높아짐). 높은 응집은 맥주 생성을 위해 다음 맥아즙에 접종하기 위해 생성 탱크에서 효모를 수확해야 할 때 유리하다. 효모의 응집이 낮으면 이 과정에서 최대 24시간 동안 생맥주를 냉각시켜야 한다. 한편, 높은 응집은 발효 동안 효모와 맥아즙 사이의 접촉을 적게 할 수 있으며, 이는 효모가 디아세틸을 소모할 수 있는 속도를 감소시키고 발효 시간을 연장할 가능성이 있다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예는 발효 가능한 당이 소모되는 것과 거의 동시에(또는 심지어 그 이전에) 디아세틸을 50ppb 미만으로 감소시킬 수 있고 동시에 16℃에서 높은 응집으로 인해 다음 맥주 생성을 위해 효모를 수확하기 위해 생맥주의 임의의 추가적 냉각도 필요하지 않는 효모 균주를 제공한다.
또한 저 디아세틸 효모 균주는 프로판올/이소부탄올 비율을 통해 쉽게 확인할 수 있는데 이는 모두 6 이상이고 대조군 균주는 모두 1.4 미만이기 때문이다.
실시예 7 - 효모 균주의 유전자형 분석
게놈의 조립
5개의 게놈 중 4개(혼성체 효모 7, ZDA1, ZDA2 및 W 34-78)에 대해 Illumina 및 Pacbio 플랫폼의 NGS 데이터를 사용하는 직렬 분석 접근법을 진행하였다. 자체 설계 파이프라인에 따라 특질 관리, 필터링 및 조립을 수행하였다. 모든 게놈을 Pacbio 플랫폼에서 생성된 데이터를 사용하는 Canu 1.9 소프트웨어를 사용하여 새로 조립하였다. 이어서 초안 조립의 일치 정확도를 개선하기 위해 Illumina 플랫폼에서 생성된 판독을 Canu 1.9에서 생성된 조립에 대해 매핑(Pilon 1.22)했다. 게놈 ZDA3의 경우 Illumina 데이터가 없기 때문에 추가 조립 개선 없이 Canu 1.9만 사용하였다.
생성된 조립된 게놈을 BLAST 질의에 사용하였다.
적중의 블라스트(Blast) 및 정렬
각 유전자(ILV2, ILV3, ILV5, ILV6, BAT1, BAT2)에 대해 S. 세레비시아에 유전자의 상응하는 아미노산 서열을 TBLStN 알고리즘을 사용하여 5개 게놈 각각에 대한 질의 서열로 사용했다. 마지막으로, 적어도 65 내지 80% 서열 동일성을 갖는 것을 유지하거나 질의 서열 길이의 적어도 40%를 적용함으로써 적중을 필터링했다. WS34-78, cer(사카로마이세스 세레비시아에), eub(사카로마이세스 에우바야누스), 혼성체7(혼성체 효모 7), ZDA1 및 ZDA2 사이의 ILV2, ILV3, ILV5, ILV6, BAT1, BAT2의 아미노산 서열 정렬을 도 4 내지 도 9에 나타내었다.
BLAST 분석을 S. 에우바야누스 상응 유전자에 대해 반복되지 않았는데, 이는 필터링의 마지막 단계에서 적중이 65%의 낮은 서열 동일성을 나타낼 수 있었기 때문에, 이 설정에서 두 S. 세레비시아에 및 S. 에우바야누스로부터의 모든 적중이 그 사이에 높은 유사성으로 인해 포획되기 때문이다. MUSCLE(3.8) 다중 서열 정렬 도구를 사용하여 BLAST 분석을 통해 확인된 모든 적중을 정렬했다.
배수체 확인 분석
배수체 확인 분석을 변형된 버전의 sppIDer 알고리즘을 사용하여 수행하였다. 5개 게놈 중 4개에 대한 Illumina 플랫폼의 짧은 판독을 S. 세레비시아에 및 S. 에우바야누스의 조합 참조 게놈에 매핑하였으며 3 초과의 매핑 특질(MQ)의 판독은 유지되고 조합 참조 게놈 순서로 정렬되었고; 그런 다음 조합 참조 게놈에 걸친 적용 범위를 계산했다. 그런 다음 사용자 지정 서식을 각 종에 대한 평균 적용 범위와 창으로 분할된 조합 참조 게놈을 계산했다.
BLAST 분석의 기술적 단점
균주의 표현형에 대한 게놈 차이의 효과를 연구하기 위해 BLAST를 사용하는 것은 다양한 단점을 갖고 있으며, 가장 중요한 것은 다음과 같다:
i) 유전자 및/또는 염색체 수준에서 복제를 평가할 수 없음
ii) 조립의 오류 또는 모호성에 대한 민감도
모든 게놈 조립 방법은 배수성의 존재 하에서 의미 있는 조립을 생성하는데 문제가 있다. 이로 인해 서로 다른 염색체 카피의 여러 영역이 단일 스캐폴드로 축소되는 결과가 발생한다. 원칙적으로 유전자 복제 현상이 발생할 때 상황은 덜 심각하며, 이는 특정 조립 방법과 적절한 실험 설정을 사용하여 확인할 수 있기 때문이다. 그러나 유전자 복제, 특히 다른 카피에 게놈 차이가 없거나 제한된 경우 조립 단계에서 제대로 검출되지 않을 가능성이 여전히 높다.
제2 요점에 대해, BLAST에 의해 원칙적으로 기능성 SNP 및 비기능성 ORF와 같은 다양한 변형에 대한 더 자세한 정보를 확인할 수 있다. 그러나 조립의 오류 또는 모호성은 많은 수의 잘못된 결과 - 위 SNP 및 모호한 유전자 구조를 생성할 수 있다.
따라서 본 발명자들은 변이체의 간단한 BLAST 확인과 병행하여 시퀀싱 데이터에서 염색체 배수성 및 유전자 복제 또는 결실로 인한 결과인 각 게놈 영역의 관찰된 배수성의 추정치를 수행하기로 결정했다.
전체적으로 일배체형-분해 신규 조립의 생성은 현재 주요 과제로 남아 있다. NGS 기술(Pacbio 및 Illumina)은 엄청난 양의 데이터를 생성하지만 오류와 실제 서열 변이를 구별하는 것은 여전히 기술적으로 어렵다. 또한 샘플이 배수체일 때 다른 게놈 카피에 실제 변이체를 적용해야 한다. 이러한 분석의 조립을 일배체형 인식 알고리즘을 사용하여 수행하였으므로 최종 결과 조립은 붕괴된 일배체형 게놈을 나타낸다.
결과
결과는 하기 표 11에 나타내었다.
효모 균주 ZDA1, ZDA2, ZDA3, W-34/78 및 혼성체 효모 7에서 선택된 유전자의 확인된 대립유전자 카피.
유전자명 보유 염색체의 배수성을 기반으로 한 전체 n Blast 확인 카피
(전체 카피) 		관여 게놈 (blast 기반) 절단된 카피
ZDA1
ILV2 4 1 S.cer=1 1 (S.eub)
ILV6 4 2 S.cer=1 및 S.eub=1
ILV5 5 2 S.cer=1 및 S.eub=1
ILV3 6 4 S.cer=2 및 S.eub=2
BAT1
5 (6) 3
 S.cer=2 및 S.eub=1
BAT2 6 3 S.cer=2 및 S.eub=1
ZDA2
ILV2 5 1 S.cer=1 1 (S.eub)
ILV6 4 2 S.cer=1 및 S.eub=1
ILV5 5 2 S.cer=1 및 S.eub=1
ILV3 6 3 S.cer=1 및 S.eub=2
BAT1
5(6) 2
 S.cer=1 및 S.eub=1
 1 (S.cer)
BAT2 6 2
 S.cer=1 및 S.eub=1 1 (S.cer)
ZDA3
ILV2 1 S.cer=1 1 (S.Eub)
ILV6 4 S.cer=1 및 S.eub=3
ILV5 3 S.cer=2 및 S.eub=1
ILV3
2 S.cer=1 및 S.eub=1
BAT1 2
 S.cer=1 및 S.eub=1
BAT2 3 S.cer=2 및 S.eub=1
W-34/78
ILV2 3 2 S.cer=1 및 S.eub=1
ILV6 3 1 S.eub=1
ILV5 3 2 S.cer=1 및 S.eub=1
ILV3 4 2 S.cer=1 및 S.eub=1
BAT1
3 3
 S.cer=2 및 S.eub=1
BAT2 4 2 S.cer=1 및 S.eub=1
혼성체 효모 7
ILV2 5 1 S.cer=1
ILV6 5 1 S.cer=1
ILV5 4 1 S.cer=1 1 (S.Eub)
ILV3 4 1 S.eub=1
BAT1 4 1 S.cer=1
BAT2 4 1 S.eub=1
괄호 안의 숫자는 염색체의 모드 배수체이다. 괄호가 없는 숫자는 해당 염색체에서 유전자 위치의 배수성이다.
실시예 8 - 효모 균주 ZDA2 및 비교 균주 혼성체 효모 7을 사용한 상업적 규모 양조 시험
이 실시예의 목적은 혼성체 효모 균주 ZDA2가 효모를 수확하고 다시 피칭하는 상업적 규모 양조(약 1800 HL)에 적용될 때 이전 실시예에서 관찰된 것과 동일한 유리한 디아세틸 특성을 나타내는지를 조사하는 것이었다.
1800 HL 맥주를 맥아를 포함하는 맥아즙과 종래의 주입 매싱에 의해 획득한 부가물로부터 약 16°Plato로 제조하였다. 발효 전에 맥아즙을 pH 4.9 내지 5.0으로 조정했다. 맥아즙을 ZDA2 및 대조군 라거 효모 균주 혼성체 효모 7 모두의 8세대로 다시 피칭하고 약 16℃에서 발효하였다. 샘플을 0일과 아래 결과 표 12에 표시된 날에 얻었고 도 10에 기재되어 있다.
16℃에서 1800 HL 발효
효모 일 온도
℃ 		°Plato 디아세틸
ppb 		pH 알코올
Vol% 		RDF %
ZDA2 0 15.0 16.60 5.00
1 15.0 14.25 80.0 4.60
2 16.0 11.23 142.0 4.42
3 16.0 7.70 200.0 4.29
4 16.0 4.95 172.0 4.24
5 16.0 2.91 116.0 4.27
6 16.0 2.72 51.0 4.35
7 16.0 2.70 38.0 4.36 7.64 69.9
혼성체 효모 7 0 15.0 15.90 4.90
1 15.0 13.30 822.0 4.54
2 16.0 9.73 1387.0 4.37
3 16.0 6.85 1622.0 4.27
4 16.0 4.17 1469.0 4.23
5 16.0 2.39 713.0 4.25
6 16.0 2.18 429.0 4.29
7 16.0 2.18 148.0 4.28 7.52 71.9
효모 균주 ZDA2는 발효를 통해 상당히 낮은 수준의 디아세틸을 생성하고 혼성체 효모 균주 ZDA2로 획득한 생맥주는 6일째에 이미 디아세틸의 맛 임계값(50ppb)에 도달했다. 그 당시 plato는 지난 24시간 동안 0.5 초과만큼 감소하지 않았다. 대조군 효모 균주 혼성체 효모 7로 획득한 생맥주는 plato가 24시간 동안 0.5 초과만큼 감소하지 않은 2일 후인 7일째에 디아세틸에 대한 맛 임계값에 도달하지 못했다(도 10). 결과적으로, ZDA2 효모를 사용할 때 참조 효모 혼성체 효모 7과 비교하여 디아세틸 및 plato 측면에서 생맥주에 대한 적용이 적어도 2일 더 일찍 도달했다.
흥미롭게도, ZDA2 효모는 혼성체 효모 7보다 2% 더 낮은 실제 발효 정도(RDF)에 도달하고, 알코올 백분율은 2종의 생맥주에서 거의 유사하다. 결과적으로 ZDA 효모는 실제 발효 정도는 더 낮으면서 동일한 양의 알코올을 생성할 수 있으므로 더 우수한 미각을 제공하는 맥주를 생성할 수 있다. ZDA2 효모에 대해 동일한 알코올 수준에서 1.5 내지 2.5% 더 낮은 RDF의 이러한 경향은 이 실시예에서 보여지는 8세대 이전 발효의 모든 세대에 걸쳐 관찰되었다(표 13 참조).
8세대 발효에 걸친 RDF 및 ABV.
효모 유전자비율 1 2 3 4 5 6 7 8
ZDA2 RDF 68.2 69.5 69 69.5 68.9 69 70.4 69.9
ABV 7.2 7.5 7.31 7.38 7.43 7.43 7.58 7.64
혼성체 효모 7 RDF 70.1 70.6 71.1 71.1 71.3 71.3 72.1 71.9
ABV 7.4 7.28 7.36 7.48 7.47 7.58 7.6 7.52
실시예 9 - 관련 유전자의 카피 수를 계산하기 위한 혼성체 Nanopore - Illumina 시퀀싱 및 양조 균주의 생물정보학적 평가
전술한 바와 같이 Illumina 플랫폼을 사용하여 균주를 시퀀싱하였다.
Nanopore 시퀀싱을 위해, 초고분자량 DNA를 문헌[Denis et al]에 개괄된 방법을 사용하여 제조하였다.
시퀀싱을 위한 HMW gDNA를 제조하기 위해 Zymo Genomic Clean 및 Concentrator 컬럼을 사용하여 샘플을 처리한 후 deNovix dsDNA Broad Range 형광 측정 분석을 사용하여 특질과 양을 확인했다.
Oxford Nanopore Technologies의 SQK-LSK109 화학 및 천연 바코드 연장 팩 EXP-NBD104 및 EXP-NBD114를 사용하여 모든 샘플을 다중복합화하고 라이브러리를 생성했다. NGS용 Clean NA 자기 비드를 사용하여 필요한 모든 정리 단계를 수행했다. 게놈 시퀀싱을 MinIOn FlowCells FLO-MIN106D에서 48 내지 72시간 동안 수행하였다.
미가공 시퀀싱 데이터를 bonito(https://github.com/nanoporetech/bonito)를 사용하여 베이스콜링(basecalling)하고 guppy (https://nanoporetech.com/nanopore-sequencing-data-analysis)를 사용하여 역다중복합화하였다. 혼성체-게놈 조립을 Nanopore 및 Illumina fastq 파일과 조합하여 Marsurca(https://github.com/alekseyzimin/masurca)를 사용하여 수행하였으며 조립된 게놈을 prokka. (https://github.com/tseemann/prokka)로 주석 처리하였다. 해당 유전자의 시퀀싱 범위와 복제 수를 qualimap (http://qualimap.conesalab.org/)으로 계산하고 Integrative Genomics Viewer (https://software.broadinstitute.org/software/igv/)를 사용하여 시각화했다.
판독 맵핑 및 SNP 검출을 CLC Genomics work Bench(버전 11)에서 수행하였다. 간단히 말해서, 정리된 판독을 S. 에우바야누스(액세스: GCA_0012986.25.1) 및 S. 세레비시아에(GCA_000146045.2) 게놈의 연결을 포함하는 "인실리코(in silico)" 효모 혼성체 게놈에 매핑하였다. 기본 변이체 검출 도구를 사용하여 단일-뉴클레오타이드 다형태(SNP) 및 삽입/결실(indel)을 검출했다. 여기에서 ILV2 유전자의 기능성 카피 수를 ZDA 효모 내의 단일 대립유전자에 존재하는 진단 SNP를 기반으로 추정할 수 있다.
S. 세레비시아에 ILV2 유전자에는 이 코돈 내 T 뉴클레오타이드 삽입으로 인해 생성된 단백질(Leu575fs)을 불활성화시키는 C' 프레임시프트가 있다. 이 빈도에서 Illumina 판독 매핑의 %는 대략 33%였으며 이는 ILV2sc 카피 3개 중 1개가 불활성화되었음을 시사한다. 또한 에우바야누스 ILV2 대립유전자에서 T 뉴클레오타이드 결실로 인해 불활성화 절단(Leu304fs)을 초래하는 프레임시프트가 발생하는 것으로 관찰되었다. ILV2 세레비시아에 유전자의 카피 수(CN)를 확인하면 이전에 기재한 대로 판독 매핑을 기반으로 다른 유전자의 카피 수를 계산할 수 있다. WS34/78 CN의 추정은 또한 ILV2 카피 수가 매우 유사한 균주(WS34/70)가 동일한 S. 세레비시아에 및 S. 에우바야누스 게놈 함량을 가진 4배체 효모라는 이전 증거를 기반으로 하는 판독 매핑 기반 추정을 기반으로 했다(문헌[Walther et al.2014]). 또한, 실시예 10에서, ILV2 유바야누스 대립유전자를 제거할 때, WS34/78은 실제로 ILV2 유바야누스 대립유전자(세레비시아에 대립유전자를 포함하여 총 4개의 ILV2 대립유전자)의 2개 카피를 갖는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 표 14에 요약되어 있다.
해당 유전자의 계산된 기능성 카피 수. Cere는 세레비시아에 대립유전자를 지칭하고 Eub는 유바야누스 대립유전자를 지칭한다.
　 기능성 카피 수 - ZDA1 기능성 카피 수 - ZDA2 기능성 카피 수 - WS3478
ILV2_Cere 2 2 2
ILV2_Eub 0 0 2
ILV3_Cere 4 4 2
ILV3_Eub 2 2 2
ILV5_Cere 3 3 1
ILV5_Eub 2 2 2
ILV6_Cere 2 2 1
IlV6_Eub 2 2 3
BAT1_Cere 3 3 4
BAT1_Eub 2 2 2
BAT2_Cere 4 4 2
BAT2_Eub 2 2 3
참조 WS3478 균주는 ILV2 유전자의 4개의 기능성 카피를 갖고, ZDA1 및 ZDA2는 각각 이 유전자의 2개의 기능성 카피만을 갖는다. 또한 WS3478에는 ILV3의 4개의 기능성 카피와 ILV5의 3개의 기능성 카피를 가지며, ZDA1 및 ZDA2 균주의 경우 이 수는 각각 6개 및 5개이다.
실시예 10 - 모델 양조 효모 W-34/78에서 유전자 카피 수 적용
이 실험의 전반적인 목표는 ZDA1 및 ZDA2의 유전자형을 반영하기 위해 모델 효모 균주(사카로마이세스 파스토리아누스 아종 카를스버겐시스 균주(WS34/78)에서 관련 유전자의 카피 수를 조정하는 것이었다. WS34/78은 독일 Weihenstephan에서 시판되며 본 명세서에서 W-34/78로 지칭된다. 이를 위해 균주 WS34/78의 유전자를 표 15에 따라 불활성화시키거나 추가로 발현시켜야 했다.
해당 저 디아세틸 균주의 관련 유전자형을 반영하기 위해 균주 WS34/78의 유전자형에 필요한 변경
유전자 대립유전자 변이
ILV2 S. 에우바야누스 -2 카피
ILV3 S. 세레비시아에 +2 카피
ILV5 S. 세레비시아에 +2 카피
불활성화를 해당 유전자(즉, ILV2)의 코딩 서열을 표적화하는 항생제-카세트를 부여하는 저항성의 도움으로 수행하였다. 여기서, 코딩 DNA 서열(cds)을 유전자의 N-말단 영역의 99bp 및 C-말단 영역의 107bp만이 유지되도록 상동 재조합을 통해 고리를 형성시켰다. 유전자(즉, ILV3 및 ILV5)의 과발현을 실제 게놈 상황을 그대로 유지하는 방식으로 수행하였고, 즉, cds의 대략 1kbp 상류, cds, cds의 0.5kbp 하류로 구성된 카세트를 클로닝하였다. 따라서 카세트는 천연 프로모터 및 종결인자 서열을 포함하고, 추가 유전자 카피의 발현은 예상컨대 천연 제어 하에 있을 것이다. 또한 효모 단일 카피 플라스미드를 사용하여 카피 수를 제어했다.
WS34/78 세포의 형질전환
사카로마이세스 파스토리아누스 아종 카를스버겐시스 균주 WS34/78의 세포를 Gietz 및 Schiestel(DOI: 10.1038/nprot.2007.17)에 의해 기재된 방법에 따라 DNA 흡수에 적합하도록 제조하였다. 일반적으로 세포를 1 μg의 플라스미드 DNA 또는 PCR-앰플리콘으로 형질전환하였다. 열충격 처리 시간을 15분으로 단축시켰으며 온도는 42℃로 유지하였다.
발현 카세트의 생성
실시예 9로부터 균주 WS34/78의 DNA-서열 정보에 기반하여, cds의 대략 1000bp 상류 및 cds의 500bp 하류를 포함하여, 따라서 천연 프로모터 및 종결인자 서열을 포함하는 천연 WS34/78 DNA-서열의 PCR-증폭에 의해 발현 카세트를 생성하였다. 앰플리콘의 정확한 길이를 본 실시예에 제공된 각각의 프라이머 서열로부터 추론할 수 있다. 1000 bp 또는 500 bp의 cds-측접 영역은 해당 유전자의 실제/원래 제어를 가능하게 해야 한다. 클로닝된 PCR-앰플리콘(플라스미드 내/염색체 내 혼입)을 시퀀싱 반응을 위한 주형으로서 단리된 플라스미드 DNA를 사용하여 Sanger-DNA 시퀀싱에 의해 제어하였다.
발현 카세트의 염색체 혼입
제1 단계에서, 유전자 발현 모듈을 혼입 현상의 양성 선택을 가능하게 하는 항생제 저항성 모듈과 융합시켜 발현 카세트를 조립하였다. 이 카세트를 WS34/78 염색체와의 상동 재조합을 위해 DNA-가닥을 인코딩하는 PCR-앰플리콘에 융합시켰다. 혼입 부위는 WS34/78의 PAD1 유전자좌위였는데, 이 유전자는 이 효모에서 기능하지 않기 때문에 이 유전자의 대체는 향미 특성에 영향을 미치지 않는다. 상동 재조합에 사용된 측접 영역은 대략 500bp의 길이를 가졌다. 항생제 존재 하에 성장한 효모 클론을 PCR(즉, 콜로니 PCR)로 분석하여 카세트 삽입을 확인했다. 발현 모듈에서 돌연변이에 대해 양성 클론을 추가로 분석하였다. 발현 모듈을 포함하는 앰플리콘을 Sanger-DNA 시퀀싱에 의해 제어하였다.
플라스미드 pYESVIII에서 ILV-유전자의 클로닝
플라스미드 pYESVIII(BRAIN;)은 E. 콜라이에서 높은 카피 수로 복제되고 복제의 CEN6 ori로 인해 효모 세포에서 단일 카피 플라스미드로 유지되는 E. 콜라이 - 효모 셔틀 벡터이다. 발현 카세트를 Gibson-조립을 사용하여 다중 클로닝 부위에 통상적으로 삽입하였다.
동일한 대립유전자의 2개의 카피가 삽입되어야 하는 경우, 바람직하게는 해당 유전자(GOI)의 1개 카피는 실제 DNA-서열을 가지고 있고, 제2 카피의 cds는 천연 단백질 서열을 변이 없이 유지시키는 방식으로 변이시켰다. 이를 효모 세포에서 유전자 발현을 최적화하기 위한 알고리즘을 사용하는 화학적 유전자 합성(코돈 사용 최적화)에 의해 달성하였다. 이를 플라스미드가 효모 세포로 형질전환될 때 재조합 현상의 기회를 감소시키기 위해 수행하였다.
플라스미드로부터의 ILV3 유전자의 발현을 위해, 직렬 작제물을 조립할 것이다(바이-시스트론(bi-cistron) 발현). 여기에서 단일 프로모터가 2개의 ILV3 인코딩 서열(하나는 천연 cds, 하나는 합성 cds)의 발현을 제어한다. 2개의 코딩 서열을 리보솜 누락을 가능하게 하는 2A-펩타이드 링커에 의해 연결시켜, 두 cds가 천연 ILV3 프로모터의 제어하에 번역되도록 한다. 2A-펩타이드 기술은 3개의 아미노산 태그(NPG)를 추가하여 제1 단백질의 C-말단을 변이시키고 후속 단백질의 N-말단은 프롤린으로 개시한다(문헌[Liu, Z. et al., 2017; DOI: 10.1038/s41598-017-02460-2]).
E. 콜라이를 시험관 내에서 조립된 플라스미드로 형질전환시키고, 플라스미드를 형질전환체로부터 단리하였으며, 제한 분해 및 DNA-시퀀싱에 의해 제어한 후 적격 WS34/78 세포로 형질전환시켰다.
프로젝트에서 사용/작제된 균주 및 플라스미드. 아래 첨자 sc는 종간 혼성체 양조 효모 WS34/78에서 사카로마이세스 세레비시아에 유전자를 나타내고 eu는 사카로마이세스 에우바야누스 유전자를 나타낸다.
균주 ILV 유전자형 조작/ 조정 설명
#1 천연 없음(WT 균주) 사카로마이세스 파스토리아누스 아종 카를스버겐시스 균주 WS34/78
#2 △△ilv2eu WS34/78 [2x ILV2eu]:: Zeo R ShBle-카세트의 삽입에 의해 불활성화된 두 ILV2 대립유전자(S. 에우바야누스)
#3 △△ilv2eu; +1 ILV3eu 균주 #2; PAD1::ILV3eu PAD1 유전자좌위에서의 ILV3 (S. 에우바야누스) 발현 카세트 삽입
#4 천연 플라스미드 #0 플라스미드 pYESVIII W/O 삽입물에 의해 형질전환된 균주 #1
#5 △△ilv2eu; +1 ILV5sc 균주 #2, 플라스미드 #1 ILV5sc 대립유전자의 1개의 카피를 인코딩하는 pYESVIII 를 보유하는 균주 #2
#7 △△ilv2eu; +1 ILV5sc; +1 ILV3eu 균주 #3, 플라스미드 #1 ILV5sc 대립유전자의 1개의 카피를 인코딩하는 pYESVIII 를 보유하는 균주 #3
플라스미드
#0 G418R pYESVIII 기본 플라스미드; cen6-ori; KanMX-저항성 마커
#1 +1 ILV5sc pYESVIII, 1x ILV5sc 플라스미드 #0에 클로닝된 ILV5sc 대립유전자
실시예 / S. 파스토리아누스 WS34/78 재조합 균주의 돌연변이 변이체
균주 #2의 생성
PCR용 주형:
플라스미드 pYES5-Cen6-Sh.ble (sc) 2.0 (BRAIN), Sh.ble 카세트 인코딩
gDNA S. 파스토리아누스 WS34/78, 균주 #1 (표 16)
사용된 프라이머:
CPA43: 서열번호 44
CPA44: 서열번호 45
CPA49: 서열번호 46
CPA50: 서열번호 47
CPA51: 서열번호 48
CPA52: 서열번호 49
sh.ble-카세트(단편 1)를 프라이머 CPA43/44를 사용하여 플라스미드 pYES5-Cen6-Sh.ble(사카로마이세스 세레비시아에(sc)) 2.0(BRAIN Biotech AG)에서 증폭시켰다. 대립유전자 특이적 프라이머 CPA49/51(5'-측접 영역; 단편 2) 및 CPA50/52(3'- 측접 영역, 단편 3)로 gDNA 균주 #1로부터의 ILV2 (사카로마이세스 에우바야누스 (se)) 측접 영역의 증폭에 의해 상동성 아암(arm)을 생성하였다. HR 주형을 프라이머 CPA49/50 및 단편 1 + 2 + 3을 주형으로 사용하여 중첩 연장 PCR의 도움으로 생성하였다. 상동 재조합을 통한 ILV2(se)의 대립유전자 특이적 녹아웃을 BRAIN의 독점적인 NUCLEASE 기술에 의해 보조하였다. 이로 인해 ILV2(se) 유전자좌위에서 단일 또는 이중 혼입을 갖고 아가로스 겔에서 볼 수 있는 다수의 균주를 생성하였다. 하류 분석을 위해 ILV2(se)가 이중으로 결실된 균주를 선택했다.
ILV2 (se) 녹아웃 카세트의 서열: 서열번호 50
균주 #3의 생성
PCR용 주형:
gDNA S. 파스토리아누스 WS34/78, 균주 #1 (표 16)
NTC-DNA 카세트 (노우르세오트리신); BRAIN Biotech AG
사용된 프라이머:
CPA70: 서열번호 51
CPA71: 서열번호 52
CPA91: 서열번호 53
CPA96: 서열번호 54
CPA111: 서열번호 55
CPA112: 서열번호 56
CPA113: 서열번호 57
CPA114: 서열번호 58
CPA128: 서열번호 59
CPA129: 서열번호 60
대립유전자 특이적 프라이머 CPA70/71을 사용하여 gDNA 균주 #1로부터 ILV3(se) 발현 카세트(산물 1)를 증폭시켰다. 그런 다음 산물 1을 프라이머 CPA70/129로 추가 증폭하여 산물 2를 생성했다. NTC-발현 카세트(산물 3)의 증폭을 프라이머 CPA91/96 및 NTC-DNA-가닥을 주형으로 사용하여 수행하였다. 산물 4를 프라이머 CPA91/128로 산물 3을 증폭하여 생성하였다. 산물 3과 산물 4를 NEBuilder® HiFi DNA 조립 키트를 통해 조립하고 프라이머 CPA70/91로 증폭시켜 단편 1을 생성했다. 프라이머 CPA111/112(5'-측접 영역; 단편 2) 및 CPA113/114(3'-측접 영역; 단편 3)을 사용하여 gDNA 균주 #1로부터의 PAD1 측접 영역의 증폭에 의해 상동성 아암을 생성하였다. 최종 ILV3-NTC 혼입 카세트를 단편 1 + 2 + 3의 조립에 이어 프라이머 CPA111/114로 증폭하여 생성하였다. 균주 #3을 생성하기 위해 균주 #2를 최종 ILV3-NTC 혼입 카세트로 형질전환시켰다.
ILV3 (se)의 서열 - NTC 혼입 카세트: 서열번호 61
재조합 플라스미드
플라스미드 #1의 작제
벡터 제조
플라스미드 #0(pYESVIII, BRAIN Biotech AG)은 다중 클로닝 부위에 존재하는 PmeI를 사용하여 선형화하였다. 정제 전에 가수분해된 벡터를 탈인산화시켰다.
벡터 삽입물의 생성
PCR용 주형:
gDNA S. 파스토리아누스 WS34/78, 균주 #1 (표 16)
사용된 프라이머:
CPA74: 서열번호 62
CPA75: 서열번호 63
CPA86: 서열번호 64
CPA87: 서열번호 65
천연 ILV5-발현 카세트(sc)를 대립유전자 특이적 프라이머 CPA74/75를 사용하여 WS34/78 gDNA로부터 증폭시켰다. 그런 다음 프라이머 CPA86/87을 사용하여 생성된 PCR 산물을 증폭하여 벡터 삽입물을 생성했다.
ILV5-발현 벡터(플라스미드 #1)를 NEBuilder® HiFi DNA 조립을 통해 조립하고, E. 콜라이 DH10ß를 반응 산물로 형질전환시켰다.
플라스미드 제조 후 발현 카세트를 Sanger-DNA 시퀀싱으로 분석하였다.
ILV5(sc) 발현 카세트의 서열: 서열번호 66
실시예 11 - 모델 양조 효모 WS34/78에서 추가 유전자 카피 수 적용
이 실험의 목적은 실시예 10과 유사했는데, 즉 ZDA1 및 ZDA2의 유전자형을 반영하기 위해 관련 유전자의 카피 수를 조정하기 위해 추가의 유전자 변형된 WS34/78 효모 균주를 생성하는 것이었다.
천연 사카로마이세스 세레비시아에 유전자의 PCR
S. 세레비시아에 유전자 ILV3, BAT1, BAT2 및 ILV6을 이의 천연 프로모터 및 종결인자 영역과 함께 프라이머 서열번호 67 내지 서열번호 74 및 Phusion® High-Fidelity DNA 중합효소(New England BioLabs)를 사용하여 Weihenstephan 34/78(W34/78) 라거 효모로부터 증폭시켰다. 천연 프로모터 및 종결인자를 표적화하는 영역은 이전 문헌[Mumberg et al, 1995]에 따라 개시 코돈의 약 1000개 염기쌍 상류(프로모터) 및 종결 코돈의 400개 염기쌍 하류(종결인자)를 선택했다. PCR 반응을 위한 주형으로 사용된 게놈 DNA를 Lucigen의 MasterPure 효모 DNA 정제 키트 팩트 번호 MPY80200을 사용하여 W34/78 효모에서 추출하였다.
적절한 S. 세레비시아에 유전자의 상류 및 하류를 증폭하는데 사용되는 프라이머:
ScILV3_F: 서열번호 67
ScILV3_R: 서열번호 68
ScBAT1_F: 서열번호 69
ScBAT1_R: 서열번호 70
ScBAT2_F: 서열번호 71
ScBAT2_R: 서열번호 72
ScILV6_F: 서열번호 73
ScILV6_R: 서열번호 74
Gibson 조립에 의한 플라스미드 벡터로의 PCR 단편의 클로닝 및 E. 콜라이 세포로의 형질전환
순수 PCR 단편을 kanMX G418 저항성 마커를 포함하는 중심체 단일 카피 벡터로 클로닝하였다. 일부 경우에는 유전자를 조합하여 하나 초과의 유전자를 포함하는 플라스미드를 생성했다. Euroscarf (http://www.euroscarf.de/plasmid_details.php?accno=P30673)의 pSH67을 PvuII-HF(New England BioLabs)로 37℃에서 60분 동안 선형화하여 Cre-발현 작제물을 제거했다. 그런 다음 선형화된 플라스미드를 25℃에서 밤새 T7 DNA 리가제(New England BioLabs)로 결찰시켰다. 결찰된 플라스미드를 NEB 5α Escherichia 콜라이 적격 세포(New England BioLabs)로 형질전환하고 암피실린(ampicillin)(100 μg/mL)이 포함된 Lysogeny Broth(LB) 한천 플레이트에 플레이팅했다. 그런 다음 이 플라스미드를 해당 유전자 삽입을 위한 백본으로 사용했다.
PvuII-HF 분해 벡터 및 PCR 증폭 삽입물을 NEBuilder® HiFi DNA Assembly (New England BioLabs)를 사용하여 조립하였다. 삽입 대 벡터의 3:1 비율을 사용하고 반응을 50℃에서 60분 동안 인큐베이션했다. 그런 다음 반응을 NEB 5α E. 콜라이 적격 세포(New England BioLabs)로 형질전환하고 암피실린(100 μg/mL)이 포함된 LB 한천 플레이트에 플레이팅했다. 클론을 앰피실린(100μg/mL)이 포함된 LB 액체 배지에서 성장시키고 플라스미드를 Monarch 플라스미드 MiniPrep 키트(New England BioLabs)를 사용하여 추출했다.
본 연구에서 생성된 단일 카피 플라스미드는 다음과 같다:
1. pSH67-ScILV3
2. pSH67-ScILV3-ScBAT1
3. pSH67-ScILV3-ScBAT2
4. pSH67-ScILV6
5. pSH67-ScBAT2
벡터 및 작제된 효모를 사용한 효모 형질전환
Weihenstephan 34/78 및 실시예 10의 균주 #2(WS34/78[2x ILV2eu]:: Zeo R로도 불리는 2개의 S. 에우바야누스 ILV2 유전자 카피가 결실된 Weihenstephan 34/78) 효모를 문헌[Benatuil et al. 2010]에 개괄된 절차에 따라 전기천공을 통해 플라스미드로 형질전환시켰다. 약간의 변형이 이루어졌다: 효모를 25℃에서 성장시키고 전기천공 후 2 내지 3시간 동안 회수하고 세포를 제네티신(geneticin) G418(200μg/mL)이 포함된 YPD 한천 플레이트에 플레이팅했다.
본 연구에서 생성된 효모는 하기 표 17에 제시되어 있다.
단일 카피 플라스미드의 형질전환에 의해 생성된 효모
효모 균주명 효모 배경 삽입된 플라스미드
FGMO100 W34/78 pSH67-ScILV3-ScBAT2
FGMO101 W34/78 pSH67-ScILV6
FGMO102 W34/78 pSH67-ScBAT2
FGMO103 W34/78 pSH67-ScILV3
FGMO104 W34/78 pSH67-무-삽입물(비어 있음)
FGMO105 W34/78 pSH67-ScILV3-ScBAT1
FGMO0095 WS34/78 [2x ILV2eu]:: Zeo R pSH67-ScILV6
FGMO0096 WS34/78 [2x ILV2eu]:: Zeo R pSH67-ScILV3
FGMO0097 WS34/78 [2x ILV2eu]:: Zeo R pSH67-ScILV3-ScBAT2
FGMO0098 WS34/78 [2x ILV2eu]:: Zeo R pSH67-ScBAT2
FGMO0099 WS34/78 [2x ILV2eu]:: Zeo R pSH67-ScILV3-ScBAT1
실시예 12 - 변형된 WS34/78 균주의 발효 특성 평가
전술한 바와 같이 균주를 원통형 용기에서 발효시켰다. 세포를 25μg/ml의 겐타마이신(gentamicin)(G418)을 포함하는 10ml의 액체 YPD에서 밤새 성장시킨 후, 100μg/ml의 G418을 포함하는 이전에 기재된 20ml의 필스너 맥아즙으로 옮겼다. 100μg/ml의 G418을 포함하는 필스너 맥아즙에서 전술한 바와 같이 세포 피칭을 수행하였다. 발효 3일, 4일 및 5일째에 Plato, 디아세틸 및 휘발성 물질을 측정했다. 5일째에 탄수화물 특성과 에스테르 특성 샘플을 채취했다.
시험된 효모 균주의 유전자형은 하기 표 18에 제시되어 있다.
이 실시예에서 시험된 실시예 10 및 11에서 생성된 유전자 변형 효모.
균주 번호 저항성 특성 유전자형 공급원
FGMO
0092		 G418 저항성 WS34/78 플라스미드 0 (pYESVIII; 무 삽입물) 대조군 WS34/78
FGMO
0093		 G418 + 제오신 저항성 2x ILV2eu KO:제오신 삽입물, 1x ILV5cer pYESVIII 카피 실시예 10으로부터의 균주 #2
FGMO
0094		 G418 + 제오신 + 노우르세오트리신 저항성 2x ILV2eu KO:제오신 삽입물, 1x ILV5cer pYESVIII 카피, 1x ILV3eu 삽입물: KO PDC1 실시예 10으로부터의 균주 #2
FGMO
0095		 G418 + 제오신 저항성 △△ Seu ILV2 Sc ILV6-G418 실시예 10으로부터의 균주 #2
FGMO
0096		 G418 + 제오신 저항성 △△ Seu ILV2 Sc ILV3-G418 실시예 10으로부터의 균주 #2
FGMO
0100		 G418 저항성 WS34/78 Sc ILV3 - Sc BAT 2 -G418 WS34/78
FGMO
0101		 G418 저항성 WS34/78 Sc ILV 6 - G418 WS34/78
FGMO
0102		 G418 저항성 WS34/78 Sc BAT 2 - G418 WS34/78
FGMO
0103		 G418 저항성 WS34/78 Sc ILV 3 - G418 WS34/78
FGMO
0104		 G418 저항성 WS34/78 빈 벡터 G418 WS34/78
FGMO
0105		 G418 저항성 WS34/78 Sc ILV 3 - fBAT 1 - G418 WS34/78
각 효모 균주에 의한 발효 결과는 하기 표 19 및 표 20에 요약되어 있다.
실시예 10 및 11에서 생성된 유전자 변형된 효모를 사용한 발효 결과(총 디아세틸).
균주 번호 총 디아세틸 Plato
3일 4일 5일 3일 4일 5일
FGMO0092 319 216 170 10 7,6 5,5
FGMO0093 209 140 94 8,9 6,4 4,8
FGMO0094 184 123 87 9,2 6,4 4,9
FGMO0095 315 191 153 8,9 7,1 6,2
FGMO0096 201 121 97 8,6 5,5 4,4
FGMO0100 329 187 142 7,9 5,1 3,4
FGMO0101 293 167 153 7,6 4,4 3,3
FGMO0102 370 244 269 8 5,1 4,4
FGMO0103 396 234 197 7,8 4,4 4
FGMO0104 265 180 167 7,4 4 3,4
FGMO0105 279 203 154 8,1 4,7 3,5
실시예 10 및 11에서 생성된 유전자 변형된 효모를 사용한 발효 결과(프로판올/이소부탄올 비율). n.m. = 측정되지 않음.
균주 번호 프로판올/이소부탄올 비율 Plato
4일 5일 3일 4일 5일
FGMO0092 1,9 1,6 10 7,6 5,5
FGMO0093 3,04 3,3 8,9 6,4 4,8
FGMO0094 2,92 n.m. 9,2 6,4 4,9
FGMO0095 2,97 2,77 8,9 7,1 6,2
FGMO0096 2,71 2,93 8,6 5,5 4,4
FGMO0100 1,55 1,44 7,9 5,1 3,4
FGMO0101 1,85 1,87 7,6 4,4 3,3
FGMO0102 1,32 1,37 8 5,1 4,4
FGMO0103 1,76 1,68 7,8 4,4 4
FGMO0104 1,69 1,64 7,4 4 3,4
FGMO0105 1,64 1,64 8,1 4,7 3,5
이 실시예의 유전자 조작된 균주를 항생제의 존재 하에 발효시키고, 따라서 상기 균주가 항생제의 부재 하에 산업적으로 발효될 때 상기 결과는 약간 다를 수 있음을 주목해야 한다. 특히 균주는 더 빠른 성장 속도를 가질 가능성이 높으며 따라서 발효가 더 빨리 진행된다. 유사하게, 초기에 생성된 디아세틸의 감소도 더 빠르게 진행될 것으로 예상된다.
5일째에 시험 용액에서 총 디아세틸의 양이 가장 적은 균주는 ILV2 유전자의 2개 카피가 결실되고, ILV3의 여분의 카피가 게놈에 혼입되고, ILV5의 여분의 카피가 단일 카피 플라스미드(FGMO0094)로부터 발현되는 균주였다.
서열목록
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
참조문헌
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15 Gln His Ile Ala Tyr Arg Asn Thr Pro Ala Met Arg Ser Val Ala Leu 20 25 30 Ala Gln Arg Phe Tyr Ser Ser Ser Ser Arg Tyr Tyr Ser Ala Ser Pro 35 40 45 Leu Pro Ala Ser Lys Arg Pro Glu Pro Ala Pro Ser Phe Asn Val Asp 50 55 60 Pro Leu Glu Gln Pro Ala Glu Pro Ser Lys Leu Ala Lys Lys Leu Arg 65 70 75 80 Ala Glu Pro Asp Met Asp Thr Ser Phe Val Gly Leu Thr Gly Gly Gln 85 90 95 Ile Phe Asn Glu Met Met Ser Arg Gln Asn Val Asp Thr Val Phe Gly 100 105 110 Tyr Pro Gly Gly Ala Ile Leu Pro Val Tyr Asp Ala Ile His Asn Ser 115 120 125 Asp Lys Phe Asn Phe Val Leu Pro Lys His Glu Gln Gly Ala Gly His 130 135 140 Met Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ala Ser Gly Lys Pro Gly Val Val Leu 145 150 155 160 Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Val Val Thr Pro Met Ala Asp 165 170 175 Ala Phe Ala Asp Gly Ile Pro Met Val Val Phe Thr Gly Gln Val Pro 180 185 190 Thr Ser Ala Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Ala Asp Val Val Gly 195 200 205 Ile Ser Arg Ser Cys Thr Lys Trp Asn Val Met Val Lys Ser Val Glu 210 215 220 Glu Leu Pro Leu Arg Ile Asn Glu Ala Phe Glu Ile Ala Thr Ser Gly 225 230 235 240 Arg Pro Gly Pro Val Leu Val Asp Leu Pro Lys Asp Val Thr Ala Ala 245 250 255 Ile Leu Arg Asn Pro Ile Pro Thr Lys Thr Thr Leu Pro Ser Asn Ala 260 265 270 Leu Asn Gln Leu Thr Ser Arg Ala Gln Asp Glu Phe Val Met Gln Ser 275 280 285 Ile Asn Lys Ala Ala Asp Leu Ile Asn Leu Ala Lys Lys Pro Val Leu 290 295 300 Tyr Val Gly Ala Gly Ile Leu Asn His Ala Asp Gly Pro Arg Leu Leu 305 310 315 320 Lys Glu Leu Ser Asp Arg Ala Gln Ile Pro Val Thr Thr Thr Leu Gln 325 330 335 Gly Leu Gly Ser Phe Asp Gln Glu Asp Pro Lys Ser Leu Asp Met Phe 340 345 350 Gly Met His Gly Cys Ala Thr Ala Asn Leu Ala Val Gln Asn Ala Asp 355 360 365 Leu Ile Ile Ala Val Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Asn 370 375 380 Ile Ser Lys Phe Ala Pro Glu Ala Arg Arg Ala Ala Ala Glu Gly Arg 385 390 395 400 Gly Gly Ile Ile His Phe Glu Val Ser Pro Lys Asn Ile Asn Lys Val 405 410 415 Val Gln Thr Gln Ile Ala Val Glu Gly Asp Ala Thr Thr Asn Leu Gly 420 425 430 Lys Met Met Ser Lys Ile Phe Pro Val Lys Glu Arg Ser Glu Trp Phe 435 440 445 Ala Gln Ile Asn Lys Trp Lys Lys Glu Tyr Pro Tyr Ala Tyr Met Glu 450 455 460 Glu Thr Pro Gly Ser Lys Ile Lys Pro Gln Thr Val Ile Lys Lys Leu 465 470 475 480 Ser Lys Val Ala Asn Asp Thr Gly Arg His Val Ile Val Thr Thr Gly 485 490 495 Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Trp Thr Trp Arg Asn 500 505 510 Pro His Thr Phe Ile Thr Ser Gly Gly Leu Gly Thr Met Gly Tyr Gly 515 520 525 Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Gln Val Ala Lys Pro Glu Ser Leu Val 530 535 540 Ile Asp Ile Asp Gly Asp Ala Ser Phe Asn Met Thr Leu Thr Glu Leu 545 550 555 560 Ser Ser Ala Val Gln Ala Gly Thr Pro Val Lys Ile Leu Ile Leu Asn 565 570 575 Asn Glu Glu Gln Gly Met Val Thr Gln Trp Gln Ser Leu Phe Tyr Glu 580 585 590 His Arg Tyr Ser His Thr His Gln Leu Asn Pro Asp Phe Ile Lys Leu 595 600 605 Ala Glu Ala Met Gly Leu Lys Gly Leu Arg Val Lys Lys Gln Glu Glu 610 615 620 Leu Asp Ala Lys Leu Lys Glu Phe Val Ser Thr Lys Gly Pro Val Leu 625 630 635 640 Leu Glu Val Glu Val Asp Lys Lys Val Pro Val Leu Pro Met Val Ala 645 650 655 Gly Gly Ser Gly Leu Asp Glu Phe Ile Asn Phe Asp Pro Glu Val Glu 660 665 670 Arg Gln Gln Thr Glu Leu Arg His Lys Arg Thr Gly Gly Lys His 675 680 685 <210> 6 <211> 309 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 Met Leu Arg Ser Leu Leu Gln Ser Gly His Arg Arg Val Val Ala Ser 1 5 10 15 Ser Cys Ala Thr Met Val Arg Cys Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ala Leu 20 25 30 Ala Tyr Lys Gln Met His Arg His Ala Thr Arg Pro Pro Leu Pro Thr 35 40 45 Leu Asp Thr Pro Ser Trp Asn Ala Asn Ser Ala Val Ser Ser Ile Ile 50 55 60 Tyr Glu Thr Pro Ala Pro Ser Arg Gln Pro Arg Lys Gln His Val Leu 65 70 75 80 Asn Cys Leu Val Gln Asn Glu Pro Gly Val Leu Ser Arg Val Ser Gly 85 90 95 Thr Leu Ala Ala Arg Gly Phe Asn Ile Asp Ser Leu Val Val Cys Asn 100 105 110 Thr Glu Val Lys Asp Leu Ser Arg Met Thr Ile Val Leu Gln Gly Gln 115 120 125 Asp Gly Val Ile Glu Gln Ala Arg Arg Gln Ile Glu Asp Leu Val Pro 130 135 140 Val Tyr Ala Val Leu Asp Tyr Thr Asn Ser Glu Ile Val Lys Arg Glu 145 150 155 160 Leu Val Met Ala Arg Ile Ser Leu Leu Gly Thr Glu Tyr Phe Glu Asp 165 170 175 Leu Leu Leu His His His Thr Ser Thr Asn Ala Gly Ala Ala Asp Ser 180 185 190 Gln Glu Leu Val Ala Glu Ile Arg Glu Lys Gln Phe His Pro Ala Asn 195 200 205 Leu Pro Ala Ser Glu Val Leu Arg Leu Lys His Glu His Leu Asn Asp 210 215 220 Ile Thr Asn Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Arg Val Val Asp Ile Ser 225 230 235 240 Glu Thr Ser Cys Ile Val Glu Leu Ser Ala Lys Pro Thr Arg Ile Ser 245 250 255 Ala Phe Leu Lys Leu Val Glu Pro Phe Gly Val Leu Glu Cys Ala Arg 260 265 270 Ser Gly Met Met Ala Leu Pro Arg Thr Pro Leu Lys Thr Ser Thr Glu 275 280 285 Glu Ala Ala Asp Glu Asp Glu Lys Ile Ser Glu Ile Val Asp Ile Ser 290 295 300 Gln Leu Pro Pro Gly 305 <210> 7 <211> 309 <212> PRT <213> Saccharomyces eubayanus <400> 7 Met Leu Arg Ser Leu Leu Gln Ser Gly His Arg Arg Val Ala Ala Ser 1 5 10 15 Ser Cys Ala Thr Met Val Arg Cys Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ala Leu 20 25 30 Ala Tyr Lys Gln Met His Arg His Ala Ala Arg Pro Pro Leu Pro Thr 35 40 45 Leu Asp Thr Pro Ser Trp Asn Ala Asn Ser Ala Val Ser Ser Ile Ile 50 55 60 Tyr Glu Thr Pro Ala Pro Ser Arg Gln Pro Arg Lys Gln His Val Leu 65 70 75 80 Asn Cys Leu Val Gln Asn Glu Pro Gly Val Leu Ser Arg Ile Ser Gly 85 90 95 Thr Leu Ala Ala Arg Gly Phe Asn Ile Asp Ser Leu Val Val Cys Asn 100 105 110 Thr Glu Val Lys Asp Leu Ser Arg Met Thr Ile Val Leu Gln Gly Gln 115 120 125 Asp Gly Val Ile Glu Gln Ala Arg Arg Gln Ile Glu Asp Leu Val Pro 130 135 140 Val Tyr Ala Val Leu Asp Tyr Thr Asn Ser Glu Ile Ile Lys Arg Glu 145 150 155 160 Leu Val Met Ala Arg Ile Ser Leu Leu Gly Thr Glu Tyr Phe Glu Asp 165 170 175 Leu Leu Leu His His His Thr Ser Thr Ser Ser Gly Gly Ala Asp Ala 180 185 190 Asn Glu Leu Val Ala Glu Ile Arg Glu Lys Gln Phe His Pro Ala Asn 195 200 205 Leu Pro Ala Ser Glu Ile Leu Arg Leu Lys His Glu His Leu Asn Asp 210 215 220 Val Thr Asn Leu Thr Asn Asn Phe Gly Gly Arg Val Val Asp Ile Ser 225 230 235 240 Glu Thr Ser Cys Ile Val Glu Leu Ser Ala Lys Pro Thr Arg Ile Ser 245 250 255 Ala Phe Leu Lys Leu Val Glu Pro Phe Gly Val Leu Glu Cys Ala Arg 260 265 270 Ser Gly Met Met Ala Leu Pro Arg Thr Pro Leu Lys Thr Ser Ile Glu 275 280 285 Glu Ala Ala Asp Glu Asp Glu Lys Ile Asn Glu Ile Val Asp Ile Ser 290 295 300 Gln Leu Pro Pro Gly 305 <210> 8 <211> 395 <212> PRT <213> Saccharomyces Cerevisiae <400> 8 Met Leu Arg Thr Gln Ala Ala Arg Leu Ile Cys Asn Ser Arg Val Ile 1 5 10 15 Thr Ala Lys Arg Thr Phe Ala Leu Ala Thr Arg Ala Ala Ala Tyr Ser 20 25 30 Arg Pro Ala Ala Arg Phe Val Lys Pro Met Ile Thr Thr Arg Gly Leu 35 40 45 Lys Gln Ile Asn Phe Gly Gly Thr Val Glu Thr Val Tyr Glu Arg Ala 50 55 60 Asp Trp Pro Arg Glu Lys Leu Leu Asp Tyr Phe Lys Asn Asp Thr Phe 65 70 75 80 Ala Leu Ile Gly Tyr Gly Ser Gln Gly Tyr Gly Gln Gly Leu Asn Leu 85 90 95 Arg Asp Asn Gly Leu Asn Val Ile Ile Gly Val Arg Lys Asp Gly Ala 100 105 110 Ser Trp Lys Ala Ala Ile Glu Asp Gly Trp Val Pro Gly Lys Asn Leu 115 120 125 Phe Thr Val Glu Asp Ala Ile Lys Arg Gly Cys Tyr Val Met Asn Leu 130 135 140 Leu Ser Asp Ala Ala Gln Ser Glu Thr Trp Pro Ala Ile Lys Pro Leu 145 150 155 160 Leu Thr Lys Gly Lys Thr Leu Tyr Phe Ser His Gly Phe Ser Pro Val 165 170 175 Phe Lys Asp Leu Thr His Val Glu Pro Pro Lys Asp Leu Asp Val Ile 180 185 190 Leu Val Ala Pro Lys Gly Ser Gly Arg Thr Val Arg Ser Leu Phe Lys 195 200 205 Glu Gly Arg Gly Ile Asn Ser Ser Tyr Ala Val Trp Asn Asp Val Thr 210 215 220 Gly Lys Ala His Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Val Ala Ile Gly Ser 225 230 235 240 Gly Tyr Val Tyr Gln Thr Thr Phe Glu Arg Glu Val Asn Ser Asp Leu 245 250 255 Tyr Gly Glu Arg Gly Cys Leu Met Gly Gly Ile His Gly Met Phe Leu 260 265 270 Ala Gln Tyr Asp Val Leu Arg Glu Asn Gly His Ser Pro Ser Glu Ala 275 280 285 Phe Asn Glu Thr Val Glu Glu Ala Thr Gln Ser Leu Tyr Pro Leu Ile 290 295 300 Gly Lys Tyr Gly Met Asp Tyr Met Tyr Asp Ala Cys Ser Thr Thr Ala 305 310 315 320 Arg Arg Gly Ala Leu Asp Trp Tyr Pro Ile Phe Lys Asn Ala Leu Lys 325 330 335 Pro Val Phe Gln Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Lys Asn Gly Thr Glu Thr 340 345 350 Lys Arg Ser Leu Glu Phe Asn Ser Gln Pro Asp Tyr Arg Glu Lys Leu 355 360 365 Glu Lys Glu Leu Asp Thr Ile Arg Asn Met Glu Ile Trp Lys Val Gly 370 375 380 Lys Glu Val Arg Lys Leu Arg Pro Glu Asn Gln 385 390 395 <210> 9 <211> 395 <212> PRT <213> Saccharomyces eubayanus <400> 9 Met Leu Arg Thr Gln Ala Ala Arg Leu Ile Cys Asn Ser Arg Val Val 1 5 10 15 Thr Ala Lys Arg Thr Phe Ala Leu Ala Thr Arg Ala Ala Ala Tyr Ser 20 25 30 Arg Pro Ala Ala Arg Phe Val Lys Pro Met Val Ala Thr Arg Gly Leu 35 40 45 Lys Gln Ile Asn Phe Gly Gly Thr Val Glu Thr Val Tyr Glu Arg Ala 50 55 60 Asp Trp Pro Arg Glu Lys Leu Leu Asn Tyr Phe Lys Asp Asp Thr Phe 65 70 75 80 Ala Leu Ile Gly Tyr Gly Ser Gln Gly Tyr Gly Gln Gly Leu Asn Leu 85 90 95 Arg Asp Asn Gly Leu Asn Val Ile Ile Gly Val Arg Lys Asp Gly Ala 100 105 110 Ser Trp Lys Ala Ala Ile Glu Asp Gly Trp Val Pro Gly Gln Asn Leu 115 120 125 Phe Ser Val Glu Asp Ala Ile Lys Lys Gly Asn Tyr Val Met Asn Leu 130 135 140 Leu Ser Asp Ala Ala Gln Ser Glu Thr Trp Pro Thr Ile Lys Pro Leu 145 150 155 160 Leu Thr Lys Gly Lys Thr Leu Tyr Phe Ser His Gly Phe Ser Pro Val 165 170 175 Phe Lys Asp Leu Thr His Val Glu Pro Pro Lys Asp Leu Asp Val Ile 180 185 190 Leu Val Ala Pro Lys Gly Ser Gly Arg Thr Val Arg Ser Leu Phe Lys 195 200 205 Glu Gly Arg Gly Ile Asn Ser Ser Tyr Ala Val Trp Asn Asp Val Thr 210 215 220 Gly Lys Ala His Glu Lys Ala Gln Ala Leu Ala Val Ala Ile Gly Ser 225 230 235 240 Gly Tyr Val Tyr Gln Thr Thr Phe Glu Arg Glu Val Asn Ser Asp Leu 245 250 255 Tyr Gly Glu Arg Gly Cys Leu Met Gly Gly Ile His Gly Met Phe Leu 260 265 270 Ala Gln Tyr Asp Val Leu Arg Glu Asn Gly His Ser Pro Ser Glu Ala 275 280 285 Phe Asn Glu Thr Val Glu Glu Ala Thr Gln Ser Leu Tyr Pro Leu Ile 290 295 300 Gly Lys Tyr Gly Met Asp Tyr Met Tyr Asp Ala Cys Ser Thr Thr Ala 305 310 315 320 Arg Arg Gly Ala Leu Asp Trp Tyr Pro Ile Phe Lys Asn Ala Leu Lys 325 330 335 Pro Val Phe Gln Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Lys Asn Gly Thr Glu Thr 340 345 350 Lys Arg Ser Leu Glu Phe Asn Ser Gln Pro Asp Tyr Arg Glu 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accggttctg ccacctccaa tagagctcag taggagtcag 720 aacctctgcg gtggctgtca gtgactcatc cgcgtttcgt aagttgtgcg cgtgcacatt 780 tcgcccgttc ccgctcatct tgcagcaggc gaaattttca tcacgcggta ggacgcaaaa 840 aaaaaataat taatcgtaca agaatcttgg aaaaaaaatt gaaaaatttt gtataaaagg 900 gatgacctaa cttgactcaa tggcttttac acccagtatt ttccctttcc ttgtttgtta 960 caattataga agcaagacaa aaacatatag acaacctatt cctaggagtt atattttttt 1020 accctaccag caatataagt aaaaaataaa acatgttgag aactcaagcc gccagattga 1080 tctgcaactc ccgtgtcatc actgctaaga gaacctttgc tttggccacc cgtgctgctg 1140 cttacagcag accagctgcc cgtttcgtta agccaatgat cactacccgt ggtttgaagc 1200 aaatcaactt cggtggtact gttgaaaccg tctacgaaag agctgactgg ccaagagaaa 1260 agttgttgga ctacttcaag aacgacactt ttgctttgat cggttacggt tcccaaggtt 1320 acggtcaagg tttgaacttg agagacaacg gtttgaacgt tatcattggt gtccgtaaag 1380 atggtgcttc ttggaaggct gccatcgaag acggttgggt tccaggcaag aacttgttca 1440 ctgttgaaga tgctatcaag agaggttgtt acgttatgaa cttgttgtcc gatgccgctc 1500 aatcagaaac ctggcctgct atcaagccat 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actaggaagc cctgtttttc tgaagcagct 2400 tcaaatatat atatttttta catatttatt atgattcaat gaacaatcta attaaatcga 2460 aaacaagaac cgaaacgcga ataaataatt tatttagatg gtgacaagtg tataagtcct 2520 catcgggaca gctacgattt ctctttcggt tttggctgag ctactggttg ctgtgacgca 2580 aactggccaa gtgag 2595 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> ScILV3_F <400> 67 tatgttctta ttccctcttg 20 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> ScILV3_R <400> 68 atgtttatcc attcaatgga c 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> ScBAT1_F <400> 69 atgttgcaga gacattcctt g 21 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> ScBAT1_R <400> 70 aggtcaacaa tttcaaagag c 21 <210> 71 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> ScBAT2_F <400> 71 gaccgcacta caccaaagtt taatg 25 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> ScBAT2_R <400> 72 gataggccag cactagatga caag 24 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> ScILV6_F <400> 73 ctaacaagaa cggggaatgg 20 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> ScILV6_R <400> 74 cacttagaga agccaccaag g 21

Claims (63)

  1. a. ILV2를 인코딩(encoding)하는 최대 2개의 기능성 유전자(functional gene)로서, ILV2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 32의 ScILV2 또는 서열번호 38의 SeILV2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성(sequence identity)을 공유하는 기능성 상동체(functional homologue)를 인코딩하는 유전자; 및
    b. ILV3을 인코딩하는 적어도 5개의 기능성 유전자, 예컨대 적어도 6개의 기능성 유전자로서, ILV3를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 35의 ScILV3 또는 서열번호 41의 SeILV3, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는 유전자
    를 이의 게놈(genome) 내에서 인코딩하는 효모 균주(yeast strain).
  2. 제1항에 있어서, 상기 효모 균주는 이의 게놈 내에서 ILV5를 인코딩하는 적어도 4개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 적어도 5개의 기능성 유전자로서, ILV5를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 34의 ScILV5 또는 서열번호 40의 SeILV5, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 기능성 상동체를 인코딩하는, 효모 균주.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, ILV2, ILV3 및/또는 ILV5를 인코딩하는 유전자는 이의 천연 프로모터(native promoter)로부터 발현되는, 효모 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, ILV2, ILV3, ILV5, ILV6, BAT1 및/또는 BAT2를 인코딩하는 유전자는 이의 천연 프로모터로부터 발현되는, 효모 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 임의의 이종 DNA를 포함하지 않는, 효모 균주.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 유전자 조작 단계를 거치지 않는, 효모 균주.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV3을 인코딩하는 최대 15개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 5 내지 10개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV3을 인코딩하는 5 또는 6개의 기능성 유전자를 갖는, 효모 균주.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV5를 인코딩하는 최대 기능성 15개의 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 4 내지 10개의 기능성 유전자, 예컨대 ILV5를 인코딩하는 4 또는 5개의 기능성 유전자를 갖는, 효모 균주.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 ILV6을 인코딩하는 최대 4개의 기능성 유전자로서, ILV6을 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 33의 ScILV6 또는 서열번호 39의 SeILV6, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 효모 균주.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 BAT1을 인코딩하는 적어도 3개의 기능성 유전자, 예컨대 적어도 4개의 기능성 유전자로서, BAT1을 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 36의 ScBAT1 또는 서열번호 42의 SeBAT1, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 효모 균주.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 BAT2를 인코딩하는 적어도 4개의 기능성 유전자, 예컨대 적어도 5개의 기능성 유전자로서, BAT2를 인코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 37의 ScBAT2 또는 서열번호 43의 SeBAT2, 또는 이와 적어도 80% 서열 동일성을 공유하는 상동체를 인코딩하는 유전자를 갖는, 효모 균주.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, ILV2 및 ILV6을 인코딩하는 상기 효모 균주 내의 기능성 유전자의 합은 ILV5 및 ILV3을 인코딩하는 기능성 유전자의 합 미만인, 효모 균주.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, ILV5 및 ILV3 대 ILV2의 상기 효모 균주 내의 기능성 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.5, 예컨대 적어도 2, 예컨대 적어도 2.5 또는 예컨대 적어도 3인, 효모 균주.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, ILV5 및 ILV3 대 ILV2 및 ILV6의 상기 효모 균주 내의 기능성 유전자 비율은 적어도 1, 예컨대 적어도 1.2, 예컨대 적어도 1.4, 예컨대 적어도 1.6, 예컨대 적어도 1.8 또는 예컨대 적어도 2인, 효모 균주.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV2 유전자의 돌연변이 또는 결실(deletion)을 보유하는, 효모 균주.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV2 유전자 내의 프레임시프트(frameshift) 돌연변이를 보유하는, 효모 균주.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV2 유전자의 낮은 발현(lower expression) 또는 비발현(no expression)을 야기하는 돌연변이를 보유하는, 효모 균주.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV6 유전자의 돌연변이 또는 결실을 보유하는, 효모 균주.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV6 유전자 내의 프레임시프트 돌연변이를 보유하는, 효모 균주.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 하나 이상의 ILV6 유전자의 낮은 발현 또는 비발현을 야기하는 돌연변이를 보유하는, 효모 균주.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션(incubation) 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물(apparent extract)을 갖는 맥아(malt) 및/또는 곡물(cereal)의 추출물이고, 상기 발효된 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.50° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
  22. 제21항에 있어서, 상기 시점은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 24시간에서 0.40° Plato, 예컨대 0.30° Plato, 예컨대 0.20° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점인, 효모 균주.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 55 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 50 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 45 ppb 디아세틸을 포함하는, 효모 균주.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하며, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
  25. 제24항에 있어서, 상기 시점은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 이전 12시간 동안 0.20° Plato, 예컨대 0.15° Plato, 예컨대 0.10° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점인, 효모 균주.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 55 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 50 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 45 ppb 디아세틸을 포함하는, 효모 균주.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 24시간 동안 0.5° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
  28. 제27항에 있어서, 상기 시점은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 24시간 동안 0.40° Plato, 예컨대 0.30° Plato, 예컨대 0.20° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점인, 효모 균주.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 시험 용액에서 인큐베이션 시 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 시험 용액은 적어도 10° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아 및/또는 곡물의 추출물이고, 상기 시험 용액은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 12시간 동안 0.25° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점에 최대 120 ppb 디아세틸, 예를 들어 최대 65 ppb 디아세틸을 포함하고, 상기 발효는 최대 18℃의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
  30. 제29항에 있어서, 상기 시점은 상기 시험 용액의 겉보기 추출물이 다음 12시간 동안 0.20° Plato, 예컨대 0.15° Plato, 예컨대 0.10° Plato 초과만큼 감소하지 않은 가장 빠른 시점인, 효모 균주.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 최대 115 ppb 디아세틸을 포함하는, 효모 균주.
  32. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 발효된 시험 용액을 생성할 수 있고, 상기 시험 용액은 인큐베이션 개시 후 5일 이내의 임의의 시점에 최대 265 ppb 디아세틸을 포함하고, 7 내지 8백만개 효모 세포/ml의 범위는 상기 시험 용액에 첨가되는, 효모 균주.
  33. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 최대 6일, 예컨대 최대 5일, 예컨대 최대 4일 동안 상기 시험 용액에서 인큐베이션 후 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하는 발효된 시험 용액을 생성할 수 있는, 효모 균주.
  34. 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 최대 5일, 예컨대 최대 4일 동안 최대 16℃의 온도에서 상기 시험 용액에서 인큐베이션 후 최대 50 ppb 디아세틸을 포함하는 발효된 시험 용액을 생성할 수 있는, 효모 균주.
  35. 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 소정의 시간 동안 상기 시험 용액에서 인큐베이션 후 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하는 제1 발효 시험 용액을 생성할 수 있고, 상기 소정의 시간은 상기 시험 용액에서 인큐베이션 후 최대 60 ppb 디아세틸을 포함하는 제2 발효된 시험 용액을 생성하기 위해 동일한 조건 하에 W-34/78 효모 균주를 인큐베이션하는데 필요한 시간보다 적어도 12시간, 예컨대 적어도 24시간 적은, 효모 균주.
  36. 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 상기 효모 균주를 상기 시험 용액에서 인큐베이션하는 경우 적어도 4.0 mL/L 에탄올/°Plato를 생성할 수 있는, 효모 균주.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 상기 효모 균주를 4 내지 6일의 범위 동안, 예컨대 대략 4일 동안 상기 시험 용액에서 인큐베이션하는 경우 적어도 4.0 mL/L 에탄올/°Plato를 생성할 수 있는, 효모 균주.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효모 균주는 멜리비오스(melibiose)를 유일한 탄소원(carbon source)으로 하는 배지에서 성장할 수 있는, 효모 균주.
  39. 제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 용액은 상기 가장 빠른 시점에 용액 중에 최대 1,000만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백 50만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 8백 50만개 세포/밀리리터를 포함하는, 효모 균주.
  40. 제21항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 용액은 대략 16° Plato의 겉보기 추출물을 갖는 맥아즙(wort)인, 효모 균주.
  41. 제21항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 시험 용액은 적어도 40 g/kg 말토스를 포함하는, 효모 균주.
  42. 제21항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효는 12℃ 내지 18℃의 범위의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
  43. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효는 최대 16℃의 온도에서 이루어지는, 효모 균주.
  44. 제21항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효는 7,000,000 내지 20,000,000개 생존 효모 세포/mL 시험 용액의 범위의 접종 후 발생하는, 효모 균주.
  45. 제21항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 추출물은 최대 6일, 예컨대 최대 5일, 예컨대 최대 4일 동안 상기 효모 균주와 발효되는, 효모 균주.
  46. 제21항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 추출물은 적어도 12° Plato, 예컨대 적어도 15° Plato의 겉보기 추출물을 갖는, 효모 균주.
  47. 제21항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 추출물은 맥아즙인, 효모 균주.
  48. 제21항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 추출물은 최대 3500 mg/L, 예컨대 최대 3000 mg/L, 예컨대 최대 2500 mg/L 아미노산을 포함하는, 효모 균주.
  49. 제21항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 최대 60 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 55 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 50 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 45 ppb 디아세틸, 예컨대 최대 40 ppb 디아세틸을 포함하는, 효모 균주.
  50. 제21항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 상기 가장 빠른 시점에 용액 중에 최대 1,000만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백 50만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 9백만개 세포/밀리리터, 예컨대 최대 8백 50만개 세포/밀리리터를 포함하는, 효모 균주.
  51. 제21항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 적어도 4% ABV, 예컨대 적어도 5% ABV의 알코올 함량을 갖는, 효모 균주.
  52. 제21항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 적어도 25 mg/L 프로판올, 예컨대 적어도 30 mg/L 프로판올을 포함하는, 효모 균주.
  53. 제21항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 최대 8 mg/L 이소부탄올, 예컨대 최대 6 mg/L 이소부탄올을 포함하는, 효모 균주.
  54. 제21항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발효된 수성 추출물은 적어도 2.0, 예컨대 적어도 2.5, 예컨대 적어도 3.0, 예컨대 적어도 4.0, 예컨대 적어도 5.0, 예컨대 적어도 5.5의 프로판올:이소부탄올 비율을 포함하는, 효모 균주.
  55. 발효된 수성 추출물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    i) 맥아 및/또는 곡물의 수성 추출물을 제공하는 단계;
    ii) 사카로마이세스 파스토리아누스(Saccharomyces pastorianus) 종의 효모 균주를 제공하는 단계로서, 상기 효모 균주는 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 따르는 효모 균주인 단계; 및
    iii) 단계 i)에서 제공된 수성 추출물을 단계 ii)의 상기 효모 균주로 발효시켜 발효된 수성 추출물을 획득하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 따른 방법에 의해 제조되는 발효된 수성 추출물.
  57. 음료를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    i. 제55항에 따른 발효된 수성 추출물을 제조하는 단계, 및
    ii. 상기 발효된 수성 추출물을 음료로 가공하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  58. 제57항에 있어서, 가공 단계는
    i. 여과,
    ii. 탄산화(Carbonation),
    iii. 숙성(Maturation), 또는
    iv. 병입(Bottling)
    중 하나 이상을 포함하는, 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 따른 방법에 의해 제조되는 음료.
  60. 제59항에 있어서, 상기 음료는 적어도 25 mg/L 프로판올, 예컨대 적어도 30 mg/L 프로판올을 포함하는, 음료.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 음료는 최대 8 mg/L 이소부탄올, 예컨대 최대 6 mg/L 이소부탄올을 포함하는, 음료.
  62. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음료는 맥주인, 음료.
  63. 제56항 또는 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물 또는 상기 음료는 적어도 3.0, 예컨대 적어도 4.0, 예컨대 적어도 5.0, 예컨대 적어도 5.5의 프로판올:이소부탄올 비율을 갖는, 발효된 수성 추출물 또는 음료.


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