JP5821231B2

JP5821231B2 - デハロコッコイデス属細菌の培養方法

Info

Publication number: JP5821231B2
Application number: JP2011069494A
Authority: JP
Inventors: 徳也奥津
Original assignee: Kurita Water Industries Ltd
Current assignee: Kurita Water Industries Ltd
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2011-03-28
Publication date: 2015-11-24
Anticipated expiration: 2031-03-28
Also published as: JP2012200229A

Description

本発明は塩素化エチレンで汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーグメンテーションに用いるデハロコッコイデス属細菌の培養方法に関する。

バイオオーグメンテーションでは、培養した（ＶＣで止まるのではなく、ＶＣからエチレンまで浄化する能力を持つ）デハロコッコイデス属細菌を注入して汚染地下水中の初期の菌濃度を高めることが浄化期間短縮のために重要である。予めできるだけ高濃度に培養できれば、注入量も少なくてすみコスト的にも有利になる。

デハロコッコイデスは塩素化エチレンと分子状水素を用いて増殖することが知られている。また、分子状水素の添加方法については、水素ガスをそのまま添加する場合と、クエン酸等の有機物を添加して別の微生物（共生微生物）によって水素を生成させる方法がある。

特許文献１，２の各実施例には、クエン酸、硫化ナトリウム、酵母エキス等を含む培地を用いてデハロコッコイデス属細菌を培養する方法が記載されている。

特開２００８−１３１８７９特開２００９−２１３４２７

特許文献１，２では酵母エキスを培地添加しているが、酵母エキスは病原性微生物を増加させる可能性がある。

本発明は、病原性微生物を増殖させることなく、デハロコッコイデス属細菌を１６ＳｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することができるデハロコッコイデス属細菌の培養方法を提供することを目的とする。

請求項１のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、塩素化エチレンで汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーグメンテーションに用いるデハロコッコイデス属細菌の培養方法において、発酵槽に培地とデハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを添加し、クエン酸塩濃縮液を添加してデハロコッコイデス属細菌を培養する方法であって、該培地は酵母エキスを含んでおらず、０．１〜１Ｍのクエン酸塩、０．１〜１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３〜３０ｍＭのリン酸水素二アンモニウムを含み、酵母エキスを含まないクエン酸塩濃縮液を、クエン酸塩の供給量として０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなるように連続供給して嫌気条件下で培養することにより、デハロコッコイデス属細菌を１６ＳｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することを特徴とするものである。

請求項２のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、請求項１において、塩化ビニル分解能を有しており、かつランダムクローニング法により、病原菌の属する微生物が検出されていない、デハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを微生物源とすることを特徴とするものである。

請求項３のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、請求項１又は２において、塩素化エチレンが、シス−ジクロロエチレン及び／又は塩化ビニルモノマーであることを特徴とするものである。

本発明によると、クエン酸塩濃縮液を連続添加することにより、水素ガスのような危険物を使用せず、かつ病原性菌を増殖させることなく、デハロコッコイデス属細菌を活性化し、短期間でデハロコッコイデス属細菌を１６ＳｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することができる。

実施例に用いた装置のブロック図である。実験結果を示すグラフである。実験結果を示すグラフである。実験結果を示すグラフである。

本発明のデハロコッコイデス属細菌の培養方法は、塩素化エチレンで汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーグメンテーションに用いるデハロコッコイデス属細菌の培養方法であって、０．１〜１Ｍのクエン酸塩、０．１〜１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３〜３０ｍＭのリン酸水素二アンモニウムを含むクエン酸塩濃縮液を、クエン酸塩の供給量として０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなるように連続供給して嫌気条件下で培養することにより、デハロコッコイデス属細菌を１６ＳｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することを特徴とするものであり、具体的には、図１に示す装置を用い、次の（１）〜（６）の手順に従ってデハロコッコイデス属細菌を培養するのが好ましい。

図１では、発酵槽１に培養液採取口２、ガス採取・注入口３、撹拌機４及びｐＨ計５が設けられている。この発酵槽１の上部には、発酵槽１内の圧力を調整するためのガスパック６が接続されている。発酵槽１に対し、クエン酸塩濃縮液が容器７からポンプ８を介して供給される。容器７の上部には、圧力調整用のガスパック９が接続されている。ガスパック６，９内にはＮ_２ガスが充填されている。培養液採取口２は、１６ＳｒＤＮＡ測定のためのサンプリング口である。ガス採取・注入口３は、塩素化エチレン、ＶＣ、エチレンなどの測定のためのサンプリングを行ったり、発酵槽のｐＨ調整のためのガス注入を行ったりするためのものである。ｐＨが設定値より低い場合は、ガス採取・注入口からＮ_２ガスを注入して液中のＣＯ_２ガスをパージし、ｐＨが設定値より高い場合は、Ｎ_２−ＣＯ_２ガスを注入する。

（１）密閉された発酵槽に培地とデハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを添加する。培地は塩素化エチレン、クエン酸塩、無機塩（例えば（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４、Ｎａ_２Ｓ・９Ｈ_２Ｏ、ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ）、ビタミンからなる。塩素化エチレンは塩化ビニルモノマー（ＶＣ）ガスを０．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液の割合で添加する。クエン酸塩は１〜１０ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液の割合で添加する。無機塩とビタミンについては一般の嫌気性菌培養用に用いられる組成でよく、例えばメタン菌培養に用いられるＷｏｌｉｎ培地（Ｗｏｌｉｎら、１９６３、Formation of methane by bacterial extracts. The journal of Biological Chemistry, 236. 2882-2886）でも良い。

（２）デハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアはＶＣ分解能を有しており、かつランダムクローニング法（少なくとも４８クローン）により、病原性菌の属する微生物が検出されていない培養液を使用する。

（３）培養開始後は、クエン酸塩濃縮液を一定の割合で添加する。具体的には、０．１〜１Ｍのクエン酸塩、０．１〜１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３〜３０ｍＭのリン酸水素二アンモニウムを含むクエン酸塩濃縮液を、クエン酸塩として０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなるように発酵槽へ連続供給する。例えば１０Ｌ培養液に０．１Ｍのクエン酸塩濃縮液を添加する場合、１０ｍＬ／ｄａｙの流量で供給すれば０．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなる。クエン酸添加量が少ないと、クエン酸からの水素供給が不足して、デハロコッコイデス属細菌を活性化できない。また、クエン酸塩濃縮液を高濃度に添加しすぎると塩阻害が起きると共に、大量に添加すると培地容量が増大するため、１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙを上限としている。

クエン酸塩濃縮液を入れた容器には窒素ガスを封じたガスパックを接続する。ガスパックに封じる窒素ガスの容量は容器と同じ容量で良い。

（４）２０℃〜３０℃で培養する。撹拌速度は５０〜５００ｒｐｍ程度で良い。発酵槽にはクエン酸塩濃縮液が流入するので、発酵槽にもガスパックを接続する。このガスパックは窒素ガスで洗浄後、ガスを抜いたものを使用する。ガスパックの容量はクエン酸塩濃縮液の容器容量の２倍程度で良い。

（５）培地中のＶＣガス残量を定期的に計測し、０．０１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液未満であれば、０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液の割合でバッチ添加する。

（６）培地のｐＨを適宜あるいは常時測定し、７．０以下であれば窒素ガスを、８．０以上であれば窒素＋炭酸ガス（８０：２０）を注入してｐＨを７．０〜８．０に維持する。

＜実施例１＞
次の手順でデハロコッコイデス属細菌を培養した。

（１）１０Ｌの発酵槽に無機培地（（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ_４１００ｍｇ／Ｌ，Ｎａ_２Ｓ・９Ｈ_２Ｏ４８０ｍｇ／Ｌ，ＦｅＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ２００ｍｇ／Ｌ）及びビタミン（ビタミンＢ_１２）１．５ｍｇ／Ｌと、クエン酸三ナトリウム二水和物を２．５ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液、塩化ビニルモノマーを０．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液になるように添加して密閉した。

（２）塩化ビニルモノマー分解能を有しており、かつランダムクローニング法（４８クローン）により、４８クローン全てが非病原性のＴｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属細菌で占められている培養液を１％植菌した。

（３）さらに１Ｌ容のガラス瓶に入れたクエン酸塩濃縮液（０．１Ｍのクエン酸三ナトリウム二水和物、０．４ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３ｍＭのリン酸水素二アンモニウムからなる）を、１０ｍＬ／ｄａｙの流量となるように連続供給した。なお、ガラス瓶には１Ｌの窒素ガスを封じたガスパックを接続した。

（４）培養は３０℃、５０ｒｐｍでおこない、１０Ｌ発酵槽には２Ｌ容の窒素ガスで洗浄したガスパックを接続し、常時密閉条件でおこなった。

（５）培養中は、ヘッドスペースのガスを採取してＧＣ−ＦＩＤでＶＣ及びエチレン濃度を、培養液を１０ｍＬ程度採取して定量ＰＣＲ法によりデハロコッコイデス属細菌の１６ＳｒＤＮＡ（ＤＨＣ−１６ＳｒＤＮＡ）のコピー数を測定した。

（６）ＶＣが０．０１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液以下の場合には再度塩化ビニルモノマーを約０．１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液になるように添加した。

（７）ＤＨＣ−１６ＳｒＤＮＡが１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に到達した時点で、ランダムクローニング法（４８クローン）を実施し、病原性菌の有無を評価した。

（８）ＶＣ、エチレン、及びＤＨＣ−１６ＳｒＤＮＡの測定結果を図２に示す。ＶＣを２回追加添加した後、培養２６日目でＤＨＣ−１６ＳｒＤＮＡは１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに到達した。

（９）培養２６日目の培養液についてランダムクローニングを実施した結果、１クローンはＳｅｄｉｍｎｔｂａｃｔｅｒ属細菌であったが、４７クローンはＴｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であり、共に非病原性であった。

＜比較例１＞
クエン酸塩濃縮液を使用しなかったこと以外は実施例と同様に培養おこなった。ＶＣ、エチレン、及びＤＨＣ−１６ＳｒＤＮＡの測定結果を図３に示す。ＶＣを２回追加添加したものの、培養２７日目でＤＨＣ−１６ＳｒＤＮＡは１０の７乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬまでしか増加せず、培養６０日目でようやく１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに到達した。

＜比較例２＞
クエン酸塩濃縮液を使用しなかったこと及びＶＣを３回添加したこと以外は実施例と同様に培養おこなった。ＶＣ、エチレン、及びＤＨＣ−１６ＳｒＤＮＡの測定結果を図４に示す。ＶＣを３回追加添加したものの、培養２９日目でＤＨＣ−１６ＳｒＤＮＡは２×１０の７乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬまでしか増加しなかった。

そこで、培養３０日目に酵母エキスを０．１％（ｗ／ｖ）添加した結果、培養４０日目には１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに到達した。

培養４０日目の培養液についてランダムクローニングを実施した結果、１２クローンはＴｒｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ属細菌であったものの、１５クローンは病原性菌が含まれるＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属細菌であった。なお、残りの２１クローンは非病原性であった。

＜考察＞
実施例１の方法は、比較例１と比較して半分の期間で培養が可能であり、比較例２と比較した場合でも病原性の微生物が検出されないことが確認された。

１発酵槽
６，９ガスパック

Claims

塩素化エチレンで汚染された土壌及び／又は地下水のバイオオーグメンテーションに用いるデハロコッコイデス属細菌の培養方法において、
発酵槽に培地とデハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを添加し、クエン酸塩濃縮液を添加してデハロコッコイデス属細菌を培養する方法であって、
該培地は酵母エキスを含んでおらず、
０．１〜１Ｍのクエン酸塩、０．１〜１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物および３〜３０ｍＭのリン酸水素二アンモニウムを含み、酵母エキスを含まないクエン酸塩濃縮液を、クエン酸塩の供給量として０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液／ｄａｙとなるように連続供給して嫌気条件下で培養することにより、デハロコッコイデス属細菌を１６ＳｒＤＮＡコピー数として１０の８乗ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ以上に培養することを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
請求項１において、塩化ビニル分解能を有しており、かつランダムクローニング法により、病原菌の属する微生物が検出されていない、デハロコッコイデス属細菌を含むコンソーシアを微生物源とすることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
請求項１又は２において、塩素化エチレンが、シス−ジクロロエチレン及び／又は塩化ビニルモノマーであることを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記培地は、塩素化エチレン、クエン酸塩、無機塩及びビタミンを含むことを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。
請求項１ないし４のいずれか１項において、培地中の塩化ビニルモノマーガス残量を定期的に計測し、０．０１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液未満であれば、０．１〜１ｍｍｏｌｅ／Ｌ−培養液の割合で塩化ビニルモノマーガスを添加することを特徴とするデハロコッコイデス属細菌の培養方法。