JP2003018983A

JP2003018983A - 熱殺菌方法

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Publication number: JP2003018983A
Application number: JP2001208791A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Ishikawa; 均石川; Akihiro Sakamoto; 晃大坂本; Takeya Abe; 阿部　　剛也; Teruo Arii; 輝夫有井; Sakaki Sasaki; 佐々木　　賢樹
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2001-07-10
Publication date: 2003-01-21
Anticipated expiration: 2021-07-10
Also published as: JP4675512B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明の課題は、有用物質の工業的生産に利用
できるような、微生物の殺菌方法を提供することであ
る。【解決手段】本発明は、目的とするタンパク質を生産し
菌体内に蓄積する性質を有する微生物を、熱殺菌後の該
タンパク質の生理活性能力の低下度が25％以下になる条
件で熱殺菌することを特徴とする微生物の熱殺菌方法で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は微生物の熱殺菌方法
に関するものであり、例えばニトリルヒドラターゼ等の
工業的に有用な酵素を産生する微生物の殺菌方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来から、酵素、酵素を産生する微生物
を用いて有用物質を製造すること、例えばアクリロニト
リル、メタクリロニトリル等のニトリル化合物を原料と
してアクリルアミド、メタクリルアミド等のアミド化合
物を製造することが研究されている。

【０００３】酵素を産生する微生物として遺伝子組換え
微生物を使用する方法も提案されている。遺伝子組換え
微生物は環境・人体の保護等の観点から各種ガイドライ
ンによりその取扱が定められている。遺伝子組換え微生
物の組換えレベルによっては、生きた遺伝子組換え微生
物の外部環境への漏洩及び人体への直接の接触を防止す
るために、当該微生物は閉鎖設備内で取り扱う必要があ
るとされているが、当該微生物を殺菌することにより閉
鎖設備を最小限のものとすることができるという利点が
ある。

【０００４】菌体の殺菌方法としては、熱殺菌法や菌体
破砕法が一般的であるが、酵素の失活が問題となり、キ
レート剤と界面活性剤を併用する殺菌法（新潟県食品研
究所・研究報告第30号17-21（1995））なども報告され
ているが、殺菌後に残留する薬剤を次工程以降で除去す
る必要があるなど、現在までのところ、その酵素活性を
低下させることなく、例えばアミド化合物等の有用物質
の工業的製法に利用できるような、効率的な殺菌方法に
ついては報告された例はない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、有用
物質の工業的生産に利用できるような、微生物の殺菌方
法を提供することである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、
（１）目的とするタンパク質を生産し菌体内に蓄積する
性質を有する微生物を、熱殺菌後の該タンパク質の生理
活性能力の低下度が25%以下になる条件で熱殺菌するこ
とを特徴とする微生物の熱殺菌方法。（２）微生物のTR
T₁₀が、60℃において0分以上5分以下であり、該タンパ
ク質の生理活性能力の低下度が60℃×3分間の時40%以下
である前記（１）に記載の方法、（３）微生物が遺伝子
組換え微生物であることを特徴とする前記（２）に記載
の方法、（４）遺伝子組換え微生物が遺伝子組換え大腸
菌であることを特徴とする前記（３）に記載の方法、
（５）遺伝子組換え大腸菌の宿主がEscherichia coli K
-12由来W3110株（ATCC27325）、同HB101株（ATCC3369
4）、同JM109株（ATCC53223）または同WA802株（ATCC33
526）株であることを特徴とする前記（４）に記載の方
法。（６）目的とするタンパク質が酵素であることを特
徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法、
（７）酵素がニトリルヒドラターゼであることを特徴と
する前記（６）に記載の方法、（８）熱殺菌の条件が53
〜63℃であるとする前記（１）〜（７）のいずれかに記
載の方法、（９）熱殺菌の条件が53〜63℃で保持時間が
40分〜2分であることを特徴とする前記（１）〜（７）
のいずれかに記載の方法、である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明の微生物は、目的とするタ
ンパク質を生産し菌体内に蓄積する性質を有しており、
この微生物には自然界より単離された微生物も遺伝子組
換え微生物も含まれる。目的とするタンパク質とは、例
えば取得をめざす有用物質の生産に触媒として使用され
る酵素の他、インターフェロン、成長ホルモン、血清ア
ルブミン等が挙げられる。ここで酵素としては、特に制
限されるものではないが、例えばニトリルヒドラター
ゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、リパーゼ、ヌクレオ
シドホスホリラーゼ、トリプトファンシンターゼ等を挙
げることができる。TRTは、加熱減少時間（TRT；Therma
l reduction time）を意味し、TRT₁₀とは、はじめの生
菌数を10^-10倍に減少させるのに必要とする時間を意味
する。本発明の微生物は、60℃におけるTRT₁₀が、好ま
しくは0分以上5分以下、より好ましくは0分以上3.5分以
下である。ここでいう生理活性能力とは、単位微生物重
量・単位時間あたりの、目的物質の変換（合成、または
分解）速度や、目的物質への結合速度などを意味する。
本発明のタンパク質は、生理活性能力の低下度が60℃×
3分の時好ましくは40％以下、より好ましくは30％以下
である。TRT₁₀およびタンパク質の生理活性能力の低下
度は、後述する実施例に記載の方法により、あるいはそ
の方法に準じて測定することができる。

【０００８】本発明の微生物としては、例えばニトリル
ヒドラターゼを産生する微生物を挙げることができる。
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物の具体例として
は、シュードノカルディア・サーモフィラ（Pseudonoca
rdia thermophila）JCM3095、アクロモバクター・キセ
ロシス(Achromobacter xerosis)IFO12668等を挙げるこ
とができる。また該微生物よりクローニングしたニトリ
ルヒドラターゼ遺伝子を任意の宿主で発現させた形質転
換体も含まれる。ここでいう任意の宿主としては、大腸
菌（Escherichia coli）の他、枯草菌(Bacillus subtil
is)等のバチルス属細菌、酵母や放線菌、糸状菌等が挙
げられる。遺伝子組換え大腸菌の宿主としては、例えば
Escherichia coli K-12由来W3110株（ATCC27325）、同H
B101株（ATCC33694）,同JM109株（ATCC53223）,同WA802
株（ATCC33526）株を挙げることができる。

【０００９】また、組換えDNA技術を用いて該タンパク
質の構成アミノ酸の1個または2個以上を他のアミノ酸で
置換、欠失、削除もしくは挿入することにより、薬剤耐
性、温度耐性等を更に向上させた変異型のニトリルヒド
ラターゼを発現させた形質転換体も本発明の微生物に含
まれる。

【００１０】本発明の微生物は通常、分子生物学、生物
工学、遺伝子工学の分野において、公知の一般的な方法
を利用して調製される。例えば、LB培地やM9培地等の通
常液体培地に該微生物を植菌した後、適当な培養温度
（一般的には20〜50℃であるが、好熱菌の場合は50℃以
上でもよい。）で生育させ、続いて該微生物を遠心分離
等によって培養液より分離することにより得られる。

【００１１】本発明の熱殺菌方法は、熱殺菌後の該タン
パク質の生理活性能力の低下度が25%以下になる条件で
熱殺菌することを特徴とする。本発明では、上記の条件
を充たすように温度、保持時間等をコントロールする。
熱殺菌後の生菌数は、5cfu/ml以下であることが好まし
い。保持温度としては、53〜63℃、より好ましくは54〜
60℃、更により好ましくは55〜57℃の範囲が好ましい。
このような温度範囲であれば、殺菌が十分に行なわれ、
かつタンパク質の生理活性能力の低下が少ないので好ま
しい。また、保持時間は、特に制限されるものではない
が、本発明においては、TRT₁ ₀程度の殺菌が行うことが
できる時間が好ましい。53〜63℃で殺菌を行う場合、40
〜2分、より好ましくは54〜60℃で殺菌を行う場合、25
〜3分、更に好ましくは55〜57℃で殺菌を行う場合、20
〜5分の範囲が好ましい。すなわち、このような条件で
あれば、殺菌が十分に行われ、また生理活性の低下を抑
えることができるので好ましい。熱殺菌の装置として
は、例えばプレートヒータ式熱交換器や、２重管式熱交
換器等の間接加熱手段の熱交換器を挙げることができ
る。

【００１２】次いで、本発明では上記温度範囲の微生物
を好ましくは30℃以下に、より好ましくは10℃以下に降
温するのがよい。これは殺菌が終わった時点で余計な温
度履歴をかけないよう素早く降温することで、活性の低
下をより抑えようとするものである。本発明においてこ
の温度降下は急冷状態とすること、即ちこの降温に要す
る時間はできるだけ短時間であることが好ましい。具体
的には前記した50〜64℃の温度より30℃以下となる時間
が、180秒以下であることが好ましい。より好ましくは2
0℃以下となる時間が180秒以下となるように急冷条件下
で冷却することが好ましい。

【００１３】

【実施例】以下、実施例により本発明の殺菌方法を更に
詳細に説明する。（実施例１）図３に示すようにSUS304の管を蛇管状に巻
いた伝熱管を2つ直列につないだものを用意し、それぞ
れを水の入った浴槽につける。浴槽に入れられた伝熱管
はそれぞれ加熱部と保温部であり、内径はそれぞれ6mm
と10mm、長さはそれぞれ20mと12.8mある。特に保温部は
3.2mごとに4本の管が連結されてできており、必要に応
じて保温部の管長を変えることができるため、流量と管
長から保温時間を変更することができる。伝熱管には図
に示すように熱電対が付けられており、各場所ごとの流
体の温度を測定することができる。

【００１４】伝熱管の入口側にはポンプが取り付けら
れ、培養された大腸菌を含む流体を伝熱管の中に任意の
吐出流量(5.3〜21L/hr)で送ることができる。また入口
からは菌体液を任意のタイミングでサンプリングできる
よう分岐されたバルブを持つ。大腸菌としては、野生型
酵素が大腸菌HB101株に導入され、三井化学株式会社が
寄託しているMT-10822株（特開平11-253168参照）を用
いた。伝熱管出口より出た液体は、氷バスの中の容器に
入り、急速に20℃程度まで冷却される。急速に冷却する
のは、所定の温度と時間で殺菌された液が、その後の自
身の熱で殺菌されたり酵素活性低下が生じるのを抑える
ためである。

【００１５】この装置を用いて以下の実験を行った。培
養した菌体を含む培養液を集菌機にかけて、固形分率が
約15％となるように集菌処理する。処理液(以下、菌体
液と言う)を直ちに氷バス内のステンレス容器に移し、
緩やかに攪拌する。一方上記の熱処理装置は一旦浴槽か
ら出し、伝熱管内に高圧のスチームを通し、各部が120
℃以上の温度になったことを確認後、15分間以上スチー
ムを流し続けることで、伝熱管内を滅菌処理する。滅菌
処理後、伝熱管を元通り浴槽につけ、各部が常温に下が
るまで静置する。

【００１６】浴槽の温度を殺菌しようとする温度に合わ
せて、昇温・安定させる。例えば目標とする殺菌温度を
60℃とするならば、加熱部の浴槽温度を61℃、保温部の
浴槽温度を60℃となるように、浴槽内を良く攪拌しなが
ら水中のヒータを加熱し、熱電対により浴槽の温度を測
定・記録して、浴槽の温度が一様に安定したことを確認
する。浴槽温度が安定し、熱処理装置の各部が常温に下
がったら、ポンプを作動させて、ステンレス容器内の菌
体液を熱処理装置の中に通す。装置内の菌体液の流れが
安定するよう、装置出口側より菌体液が出始めてから約
20分間、菌体液を流し続ける。

【００１７】菌体液の流れが安定したところで、各部の
温度、流量を測定する。温度は各部に取り付けられた熱
電対で、流量は装置出口から出る菌体液を一定時間サン
プリングし、その重量を測定して、サンプリング時間で
割ることで算出する。また流量と伝熱管の容積（断面積
×長さ）から保温部での菌体液の滞留時間を算出する。

【００１８】次にステンレス容器内にある熱処理前の菌
体液と、装置出口から出る熱処理後の菌体液をそれぞれ
100mlづつサンプリングし、直ちに細かく砕いた氷の入
った容器内で冷却する。

【００１９】菌体液をポンプで送出し始め、出口から菌
体液が出はじめてからさらに15分以上経って、流量や温
度が安定したら実験を開始する。実験を開始したら、各
部の温度を5分ごとに記録する。開始30分後および1時間
後に殺菌前の菌体液および、殺菌後の液を100ml程度ず
つ無菌のサンプリング容器に入れ、密閉した後、直ちに
細かく砕いた氷の中に漬ける。実験終了後直ちに生菌数
および酵素活性の測定を行う。

【００２０】（実施例２）加熱部として内径φ8mm、外
径φ10mmのSUS304管を蛇管状に15m巻いたものを充分に
保温されたバスに漬け、バスの熱媒温度をコントロール
できるようにする。また内側80A、外側100A、長さ1mの
二重管を4本用意して菌体液の温度保持部として用い
る。二重管は配管のつなぎ換えにより、1m, 2m, 4mと長
さが可変である。また菌体液は温度保持部を通過した後
に、加熱部と同じ仕様で熱媒の変わりに冷却水を入れた
冷却部を通り、20℃以下にまで冷却される。殺菌後に冷
却されるのは、所定の温度と時間で殺菌された液が、そ
の後の自身の熱で殺菌されたり、酵素活性低下が生じる
のを抑えるためである。

【００２１】この装置を用いて、流量および温度保持部
長さを変えることで、任意の時間殺菌処理を行うことが
できる。また加熱部、温度保持部、冷却部の前後およ
び、熱媒の温度が熱電対により測定できる。流量が安定
したら、実際に冷却部出口より殺菌された菌体液をサン
プリングし、重さとサンプリング時間から流量を測定す
る。菌体液をポンプで送出し、出口から菌体液が出始め
てからさらに15分以上経って、流量や温度が安定したら
実験を開始する。実験を開始したら、各部の温度を5分
ごとに記録する。開始30分後および1時間後に殺菌前の
菌体液および、殺菌後の液を100ml程度ずつ無菌のサン
プリング容器に入れ、密閉した後、直ちに細かく砕いた
氷の中に漬ける。実験終了後直ちに生菌数および酵素活
性の測定を行う。

【００２２】（測定方法）サンプリングした処理前後の
菌体液それぞれの、生菌数（cfu/ml）と酵素活性（kU/g
-DC）を以下の手順で測定する。酵素活性は、1gの乾燥
菌体あたりの活性量を意味し、活性量：1kUは、1分間に
1mmolのアクリルアミドを生成するものと定義する。

【００２３】生菌数の測定方法は以下の通り。無菌的に
サンプリングした培養液を、生理食塩水でコロニー数が
30〜300になるよう適当な倍率に希釈する。1サンプルあ
たり3枚のマッコンキー寒天培地にサンプリング液ある
いは希釈液を100μlずつ播種し、35℃で24時間培養す
る。周囲に赤みがかった沈降線の帯を持つ赤レンガ色の
コロニー（大腸菌）の数を計測する。生菌数（cfu/ml）
＝コロニー数の平均値×サンプル希釈倍率÷0.1

【００２４】また酵素活性の測定方法は、以下の方法に
よって行う。各画分液をリン酸カリウム緩衝液により適
当に希釈し、これに1重量%のアクリロニトリルを添加し
て10℃で10分間反応させる。反応液にこれと等量の1Mリ
ン酸水溶液を添加して反応を停止させ、生成したアクリ
ルアミド濃度をHPLC分析により測定する。HPLCカラムは
ULTRON 80HG（50×8φmm）を用い、10mMリン酸水溶液を
展開液として使用する。アクリルアミドは220nmの吸光
度により検出する。

【００２５】これらの結果より、TRT₁₀の値および、こ
の温度条件で殺菌したときの酵素活性の低下度を求め
る。

【００２６】TRT₁₀は、実験により得られた値を対数死
滅曲線と呼ばれる曲線上にプロットすることで得られ
る。具体的には、ある温度Te（℃）において、温度の保
持時間Ti（分）で熱処理を行ったときの、熱処理前の生
菌数をN₀（cfu/ml）、熱処理後の生菌数をN（cfu/ml）
として、横軸に保持時間、縦軸に熱処理前後の生菌数の
割合＝N/No（−）をとり、実験ごとのデータをこのグラ
フ上にプロットする。ただし測定された処理後の生菌数
が0の場合は、グラフ化の便宜上生菌数1（cfu/ml）とし
てグラフ上にプロットする。このグラフで保持時間0
（分）、熱処理前後の生菌数の割合1の点（グラフの左
上）から各プロット点に直線を引き、その直線を延長す
る。TRT₁₀の値を求めるには、延長された直線がN/No＝1
0^-10の横軸と交わるときの時間を読みとればよい。

【００２７】また酵素活性の低下度は「（1−殺菌後の
酵素活性／殺菌前の酵素活性）×100（%）」であらわさ
れる。

【００２８】実施例１と実施例２の結果を図１と図２に
は一緒にプロットした。図１は横軸に殺菌温度、縦軸に
TRT₁₀の時間をプロットしたもの、図２は横軸に殺菌温
度、縦軸に酵素活性低下度をプロットしたものである。
図２から読みとれるように、殺菌温度が高いと酵素活性
の低下度が大きく、大体57℃よりも低い温度で殺菌する
ことで酵素活性の低下度は約10%となる。また57℃より
も殺菌温度を低くしても酵素活性の低下度はもはや小さ
くならない。また図１より殺菌温度が高い方がより短い
時間で殺菌が可能であることが示され、より工業的には
効率が高いと言える。これらのことから、おおよそ55〜
57℃と比較的マイルドな温度で、20〜5分間保持するこ
とで、酵素活性の低下を抑えてなおかつTRT₁₀程度の殺
菌を行うことができる。

【００２９】

【発明の効果】以上の説明、特に実施例の結果からも明
らかなように、本発明の殺菌方法によれば、そのタンパ
ク質の生理活性の低下度は極めて小さく、しかも非常に
効率的に殺菌し得る。従って本発明の熱殺菌方法は、特
に、有用物質の生産に触媒として使用される微生物を、
予め熱殺菌する方法として工業的に有利である。

【図面の簡単な説明】

【図１】殺菌温度とTRT₁₀時間の関係を示すグラフ。

【図２】殺菌温度と活性低下度の関係を示すグラフ。

【図３】実施例１で使用した熱交換器の摸式図。

【図４】実施例２で使用した熱交換器の摸式図。

【符号の説明】

１…ポンプ２…加熱部３…保温部４…氷バス５…熱電対

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者有井輝夫千葉県茂原市東郷1900 三井化学株式会社内 (72)発明者佐々木賢樹千葉県茂原市東郷1900 三井化学株式会社内Ｆターム(参考） 4B065 AA26X AB01 AC14 BD08 CA24 CA27 CA54 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】目的とするタンパク質を生産し菌体内に蓄
積する性質を有する微生物を、熱殺菌後の該タンパク質
の生理活性能力の低下度が25%以下になる条件で熱殺菌
することを特徴とする微生物の熱殺菌方法。
【請求項２】微生物のTRT₁₀が、60℃において0分以上5
分以下であり、該タンパク質の生理活性能力の低下度が
60℃×3分間の時40%以下である請求項１に記載の方法。
【請求項３】微生物が遺伝子組換え微生物であることを
特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】遺伝子組換え微生物が遺伝子組換え大腸菌
であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】遺伝子組換え大腸菌の宿主がEscherichia
coli K-12由来W3110株（ATCC27325）、同HB101株（ATCC
33694）、同JM109株（ATCC53223）または同WA802株（AT
CC33526）株であることを特徴とする請求項４に記載の
方法。
【請求項６】目的とするタンパク質が酵素であることを
特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】酵素がニトリルヒドラターゼであることを
特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】熱殺菌の条件が53〜63℃であることを特徴
とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】熱殺菌の条件が53〜63℃で保持時間が40分
〜2分であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか
に記載の方法。