JPH02257880A - 遺伝子工学処理された中熱性宿主細胞からの熱安定性酵素の単離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は熱安定性酵素、特に核酸代謝に関連する活性を
有する酵素（例えばＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼ、
リガーゼ、エンドヌクレアーゼまたはエクソヌクレアー
ゼ）の製造および回収に関する。

（従来の技術） 核酸代謝活性を有する熱安定性酵素には種々の用途が存
在する。

ケイス（Ｋｅ　ｉ　ｔ　ｈ）　Ｃ，バックマン（Ｂａｃ
ｋｍａｎ）およびチャングーニング（Ｃｈａｎｇ−ｎｉ
ｎｇ）Ｊ、ウオング（Ｗａｎｇ）が１９８７年１２月１
１日に出願した米国特許出願１３１９３６号（参照によ
り本明細書に含まれる）には、先ずプローブの対を標的
にハイブリダイズさせ、ついでこめハイブリダイズした
各プローブを連結し、最後に連結したハイブリダイズプ
ローブを変性させる、繰り返しサイクルにＤＮＡリガー
ゼを用いるアッセイ法が開示されている。このサイクル
によって、連結したプローブは増幅されて検出され、標
的の指標となる増幅信号を与える。

このアッセイにおいては、熱安定性ＤＮＡリガーゼ（例
えば、次の連結サイクルを追加リガーゼの添加なしに行
うために、リガーゼ活性の実質的消失無しにＤＮＡを変
性させるために要求される高温に耐えることができる、
サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕＳ）からのりガーゼ）を用いることが
望まれている。

米国特許４，６８３，１９５号および４，６８３．２０
２号は、ブライマー　トリホスフェートおよびＤＮＡポ
リメラーゼを用いた、サンプル中の標的ＤＮＡの増幅法
を開示している。ＥＰ出願０２５８０１７号はそのよう
な増幅法に用いるサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ　　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）の熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼの単離を開示している。その方法における熱安
定性酵素の使用は、各変性工程の後に付加的量の酵素の
添加の必要性を回避すると記載されている。

ＥＰ出願０２５８０１７号はまた、Ｔｈｅｒｍｕｓ　　
ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクロ
ーニングおよびそのＥ、ｃｏｌｉストレインＤＧ１１６
　（ＡＴＣＣ５３６０６）での発現を報告している。

高橋ら（１９８４）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ２５９．
１００４１−１００４７は、Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓの熱安定性ＤＮＡリガーゼの精製と
特性を開示している。他の関連文献として、ロマニーク
（ＲｏｍａｎｉｅＣ）ら（１９８７）、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１３３：１２９７−１３０８、リ
アオ（Ｌｉａｏ）ら、　　（１９８６）Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３：５７６−５８
０、原−構出ら）１９８４）、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、
９６：１５９９−１６０８、松材ら（１９８５）、Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６０：１５２９８−１５３０
３には、種々の熱安定性酵素の精製および特性が開示さ
れている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の目的は熱安定性酵素を、そのｉｎ　　ｖｆｖｏ
生産物に付随する夾雑物から、直接的に分離する方法を
提供することである。熱安定性酵素をその天然の背景か
ら分離する時には、やっかいな熱安定性夾雑物を避ける
ことは困難である。例えば、熱安定性リガーゼまたはポ
リメラーゼを精製するときは、プロテアーゼを避けるこ
とは困難で、上記増幅方法に致命的である。他の熱安定
性ＤＮＡ代謝酵素、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼち
また、上記増幅アッセイの有効性を低下させる。熱安定
性酵素をコードする遺伝子を、非熱安定性背景中にクロ
ーン化することが可能であるとはいえ、宿主も自分自身
のＤＮＡ代謝酵素やプロテアーゼを生産する。従って、
クローニング操作が一群の夾雑物を他の夾雑物群に交換
するにすぎない。

本発明は、所望の熱安定性酵素にたいする最小の危険性
で、単一工程のみで迅速且つ容易に、宿主微生物の蛋白
質を効果的に変性および除去する方法を提供する。

従って、本発明は、他の方法では除去が困難な致命的夾
雑物を含まない、熱安定性酵素の豊富で比較的安価な供
給源を提出する。

（課題を解決するための手段） 従って本発明は、（ａ）　　異種熱安定性酵素をコード
する遺伝子を発現するように遺伝子工学処理された中熱
性宿主細胞を用意し； （ｂ）　　該中熱性宿主細胞を培養して該熱安定性酵素
を不所望夾雑物を含む混合物中に生産させ；そして （Ｃ）　　該不所望夾雑物を不活性化するのに充分な温
度で且つ該熱安定性酵素を不活性化するには不十分な温
度で該酵素と該不所望夾雑物を加熱する少なくとも一つ
の工程を含む精製方法で、該熱安定性酵素を精製する； ことからなる実質的に不所望夾雑物を含まない熱安定性
酵素を得る方法、である。

この観点において、熱安定性酵素の精製とは夾雑物（例
えばエンドヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼ、プロテ
アーゼ）の存在または活性レベル、特に上記選択的増幅
方法におけるような酵素の使用目的に対して、または所
望酵素の回収に対して障害となる夾雑物の存在または活
性レベルを減少させることを意味する。中熱性宿主細胞
とは、所望熱安定性酵素を生産するように遺伝子工学処
理可能で、その蛋白質は通常、所望熱安定性酵素が変性
しない温度で変性するような細胞をいう。

適する中熱性宿主細胞の代表例は、後述する。本明細書
中で使用する「異種」という用語は、目的とする酵素が
天然にはその宿主細胞で生産されないことを意味する。

好ましい態様において、中熱性宿主細胞は培養の後、溶
解させて熱安定性酵素および不所望の夾雑蛋白質を含む
溶解物（ライゼート）を生じさせる。好ましくは加熱工
程は実質的に完全に不所望夾雑物を変性および沈澱させ
、そのため夾雑物は所望熱安定性酵素を含む液相から容
易に分離できる。本発明の方法は、好ましくは、ヌクレ
アーゼ、核酸メチル化酵素、ポリメラーゼ、リガーゼま
たはリコンビナーゼのような、核酸に対する代謝、修飾
および核酸への作用に関与する酵素を精製するために用
られる。特に好ましい酵素はＤＮＡリガーゼまたはポリ
メラーゼである。好ましい酵素は、中熱性宿主細胞の蛋
白質を不活性化するための６５ないし約１００℃（最も
好ましくは８゜ないし９５℃での加熱工程に、十分な時
間（例えば少なくとも約１〜３分間、そして好ましくは
少なくとも約５分間）耐えうる好熱性細菌（詳細は後述
する）からのものである。

本発明は特に熱安定性酵素リガーゼを得るに際して、ク
ローニングに関連する困難、例えば形質転換体をスクリ
ーニングする場合のりガーゼを容易にアッセイすること
の困難、および形質転換体でのりガーゼの高レベルの発
現を得るための困難、を解消する。

特に、本発明の第二の観点は、リガーゼとの安定な共有
結合アデニル付加物（例えば標識ＮＡＤからの）を形成
し、該付加物を検出することによる、ＮＡＤ依存性核酸
リガーゼ活性（特に熱安定性リガーゼ活性）のアッセイ
法である。不所望夾雑物を含むサンプル中に存在するり
ガーゼ活性は、このサンプルを夾雑物が変性する条件下
で加熱することにより検出することができる。この方法
は、アデニル化付加物を生じうる如何なる夾雑物も変性
することができる時には特に有用である。

本発明の第二の観点は、核酸セグメントのライブラリー
で形質転換された宿主細胞をスクリーニングし、リガー
ゼ活性を発現する細胞を同定するために用られる。

本発明の第三の観点は、一般にクローン化された熱安定
性核酸リガーゼ遺伝子、例えば熱安定性である核酸（Ｄ
ＮＡ）リガーゼ活性を有する蛋白質をコードする核酸（
ここで、該核酸は該遺伝子を天然には有しない遺伝子工
学処理されたクローニングベクターの一部である）であ
る。

本発明の第四の観点は、熱安定性核酸リガーゼをコード
する実質的に純粋なりＮＡ配列である。

好ましくは、第三および第四の観点において、クローン
化された遺伝子は、該遺伝子の発現の増強（例えば非遺
伝子工学処理細胞での遺伝子産物のレベルに比べて少な
くとも２倍）を提供するプロモーターを含む発現ベクタ
ー（プラスミドまたは他の形質転換可能なりＮＡ上セグ
メントの一部である。

本発明の他の態様および利点は、好ましい態様に関する
以下の説明および、特許請求の範囲の記載から明らかに
されるであろう。

ましい、　　のＨ［＋ １皿 第１図は、プラスミドｐＧＬ６２８の構成を示す模式図
であり、このプラスミドは、Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈｅ
ｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＢｓｔＸ１部位から約２．６ｋｂ
離れたＢｇｌＩＩ部位にわたるＤＮＡフラグメントを有
する。

旦 種々の酵素のために、本発明方法の種々の工程を実施す
る種々の方法が存在することは、当業者であれば理解す
るであろう。一般に組換えＤＮＡの操作、発現および細
胞培養の技術はこの分野で良く知られ理解されている。

本発明の方法で使用される中熱性宿主細胞は、Ｅ、ｃｏ
ｌｉの種々のストレインに代表される原核細胞である。

しかしながら、例えばバチルス（例えば、バチルス・ズ
ブチルス）、種々のシュードモナス属の種、または他の
細菌ストレインのような他の微生物ストレインを用いる
こともできる。そのような原核細胞系において、該宿主
または該宿主と相容性の種から由来する複製部位および
調節配列を含むプラスミドベクターが用られる。細菌に
加えて、真核微生物例えば酵母も宿主として使用できる
。サツカロミセス・セレビシェの実験質株およびパン酵
母が最も一般的に使用されるが、他の多くの株も普通に
入手できる。

もちろん多細胞生物由来の真核宿主細胞培養内で、好熱
酵素をコードする遺伝子を発現すること、も可能である
。例えば、クルツおよびパターソン編集（１９７３年）
、アカデミツク・プレス、［組織培養（Ｔｉｓｓｕｅ　
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）Ｊを参照。有用な宿主細胞ラインに
は、マウスミニローフＮ５１、ＶＥＲＯ，ＭＤイヌ腎臓
細胞、ＨｅＬａ細胞、およびチャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞が含まれる。そのような細胞の発現ベ
クターは、通常哺乳類細胞に相容性のプロモーターおよ
び調節配列を含み、例えばよく使用される霊長類ウィル
ス（ＳＶ４０）からの初期および後期プロモーター（フ
ィアスら、Ｎａｔｕｒｅ。

（１９７８）、２７３　：１１３）またはポリオーマ、
アデノウィルス２、ウシパピローマウィルス、またはト
リ腫瘍ウィルスのような他のウィルス由来のプロモータ
ー、または免疫グロブリンプロモーターおよびヒートシ
ョックプロモーターを含む。ＢＰＶをベクターとして用
いた哺乳類系中でのＤＮＡの発現のための系は、米国特
許４，４１９．４４６号に開示されている。この系の変
法は米国特許４，６０１，９８７号に記載されている。

哺乳類細胞宿主系での形質転換の一般的観点は、アクセ
ル（Ａｘｅｌ）の米国特許４，３９９゜２１６号に開示
されている。複製の開始点は、必要であればウィルス源
から入手できる。しかしながら、染色体への組み込みは
、真核動物ではＤＮＡ複製の共通機構である。

植物細胞宿主および、植物細胞と相容性の調節配列、例
えば、ツバリンシンターゼプロモーターおよびポリアデ
ニル化シグナル配列（デピッカー（Ｄｅｐ　ｉ　ｅｋｅ
　ｒ）、Ａ、　　ら、Ｊ、Ｍｏ　１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ
、（１９８２）、１：５６１）も利用できる。

さらに、最近バキュロウィルスベクターによって供給さ
れた調節システムを用いた昆虫細胞を採用した発現系が
開示されている（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｄ、Ｗ、ら
、Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅ　ｒ　ｉｎｇ　（
１９８６）、　セットｏ−（Ｓｅｔ　ｌｏｗ）、Ｊ、に
、　　ら編集、ブレナム出版社第８巻、２７７−２９７
頁）。

所望コード配列および調節配列を含む適当なベクターの
造成は、この分野で良く知られている標準的連結および
制限酵素技術を採用して行われる。単離されたプラスミ
ド、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、開
裂され、加工され、そして所望形状に再連結される。

部位特異的ＤＮＡ開裂は、適当な制限酵素（単数もしく
は複数）を用いて、この分野で一般に知られており、そ
の詳細は市販制限酵素の製造業者により示されている条
件で行われる。例えば、ニューイングランドバイオラブ
ズ社（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ）
の製品カタログを参照。

核酸代謝に関与する熱安定性酵素、例えばＴ。

ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　ｌｕｓのＤＮＡリガーゼ、をコー
ドする遺伝子のクローニングは、そのような酵素の活性
を検出する有効な方法が開発されれば、非常に促進され
る。特にその酵素がクローニングの背景で非常に低レベ
ルでしか発現されない場合には、その検出があまりに困
難なため、所望遺伝子を発現するクローンを同定するた
めに知られている伝統的手段（例えば、欠損ミュータン
トへの補償による同定または所望形質転換体の免疫学的
同定）では、本発明の良されたスクリーニング方法のよ
うには有効で無いであろう。

上記問題は、所望蛋白質の同定がなされていないときは
、配列データに基づくクローニング戦術が阻止されるた
めに、−層深刻である。特に、Ｔｔｈｅｒｍｏｐｈｉ　
ｌｕｓリガーゼは、該酵素の生産量が少ないことおよび
不純物の故に（特に蛋白質分解性不純物）、配列決定さ
れていない。

従って、核酸代謝酵素（特に熱安定性ＤＮＡリガーゼ）
の検出法に関する実施例１は、本発明のクローニング戦
術の重要な観点である。他の実施例も本発明を説明する
ために記載されるが、本発明を限定するためのものでは
ない。

実施例１　熱　　性　、の 以下の説明は、宿主蛋白質との混合物中の、ＮＡＤで標
識できる熱安定性酵素、例えばＴｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのリガーゼの検出法を提供する。

ＮＡＤは酸化／還元反応の仲介因子として最も頻繁に使
用され、そして貯蔵された化学エネルギーの供給源とし
てＮＡＤを用いているのは非常に僅かの酵素である。原
核生物のＤＮＡリガーゼは、そのような酵素の一クラス
である。他の殆どのエネルギー消費酵素反応は、ある種
のＤＮＡリガーゼを含め、エネルギー源としてＡＴＰを
用いる７０℃を越える温度に耐性で活性を保持する原核
生物の酵素は非常に少ない。特異な例を除けば、そのよ
うな酵素の大部分は好熱性細菌中に存在する。

ある種の核酸代謝酵素（例えばＤＮＡリガーゼ）が、該
酵素が触媒する反応過程の中間体として、共有結合で結
合した酵素アデニル化物を形成することが知られている
。７０〜８０℃の温度で好熱性のＴｈｅｒｍｕｓ　　ｔ
ｈｅｒｍｏｐｈｆｌｕＳの熱安定性ＤＮＡリガーゼは、
安定な共有結合アデニル付加物を形成することが出来る
こと、及びもしコファクターとして用いるＮＡＤが３２
ｐで標識されているならばにューイングランドヌクレア
ー社から入手可能である）、該付加物を３２ｐで特異的
に標識できることが見出された。この酵素はＮＡＤに対
して著しく低いＫＭ値を持ち、従って発現増大のための
遺伝子工学操作前に極端に少量の熱安定性リガーゼしか
Ｅ、ｃｏｌｉの中で発現していないとしても、上記反応
はクローン化されたりガーゼ生成物を標識するのに十分
である。

一般に、中熱性宿主細胞の蛋白質はＮＡＤで全く標識出
来ないか、または予め７０℃以上に暴露すれば、そのよ
うな蛋白質がＮＡＤで標識される能力は実質的に消失す
る。

簡単に述べると、熱安定性リガーゼを含むと考えられる
抽出物を７０℃またはそれ以上の温度にインキュベート
する。’２Ｐ−ＮＡＤを添加する；サンプルをさらにイ
ンキュベートする：サンプルを変性させてＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかける；ゲルをオートラジ
オグラフする；そして該サンプル中のＤＮＡリガーゼの
存在または不存在を、オーセンティックなリセブダーと
一緒に泳動する標識の存在または不存在によって確認す
る。

より詳細には、細胞を増殖させて、細胞の抽出物を次の
ようにアッセイする。

Ｔｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈｅｒｍｏｐｈｆｌｕｓから得た
クローン化ＤＮＡセグメントのライブラリーで形質転換
した７０以上のコロニーを含むプレートから、細胞をか
きおとしてＬブロス３．０ｉ中に加える。この懸濁物を
用いて、２リツトルフラスコ中のＬブロス１００１１１
１中に接種した。細胞を３７℃で飽和状態に達するまで
増殖させた（約３〜４時間）。この培養物の２０−分の
細胞を遠心分離で回収し、細胞ペレットを一２０℃で保
存した。

上記のペレットを破砕用緩衝液（２０ｍＭ　　トリス、
０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡおよびＩＩＩＩＭ　　β−メル
カプトエタノール、ｐＨ７，６）１０ｄに懸濁した。

細胞を音波で破砕した。細胞の残渣を遠心分離で除去し
た（２０．ＯＯＯｒｐｍ　、２０分間、４℃。

５Ｓ−３４０−ター使用）。得られた上清を８０℃の水
浴で３０分間インキュベートした。沈澱した蛋白質を遠
心分離で集め（７，ＯＯＯｒｐｍ　、　　２０分間、４
℃、５Ｓ−３４０−ター使用）。得られた上清をアミコ
ン・セントリコン装置（Ａｍｉｃｏｎ　　Ｃｅｎｔｒｉ
ｐｒｅｐ：商標名）（１０，０００ＭＷＣＯ）に入れ、
約０．５１Ｒ１に濃縮した。濃縮物をアミコン・セント
リコン装置（Ａｍｉｃｏｎ　　Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ：商
標名）（１０，０００ＭＷＣＯ）に移して濃縮操作を容
積的５０μｍになるまで続けた。濃縮されたサンプルを
次にプラスチック製の小型遠心管に入れて８０℃の水浴
で２０分間インキュベートした。沈澱を再び遠心分離（
小型遠心機で４分間）して除去し、上清を別のプラスチ
ック製小型遠心管に移した。この遠心管を再び８０℃の
水浴に置き、すンプルが８０℃の温度に達した後、１．
０μｌの希釈した”Ｐ−ＮＡＤを添加し、遠心管を８０
℃で２時間インキュベートした（ＮＥＮのストック”Ｐ
−ＮＡＤを０．２Ｍトリス、ｐＨ７，６中に１／２に希
釈して用いた）。次いで、レムリ（ｌａｅｍｍｌｉ）の
ＳＤＳゲルのサンプル緩衝液を遠心管に添加し、８０℃
でのインキュベートをさらに２０分間継続した。次に、
サンプルを１０％レムリ５ＤＳ−ゲルで電気泳動した。

先端色素がゲルの底付近まで移動したときに電気泳動を
停止しａｚｐ標識（ＮＡＤ）の大部分を含むゲルの底部
を切り落とした。ゲルをＨ２Ｏに３０分間浸漬しゲル乾
燥機で乾燥した。この乾燥ゲルを次にオートラジオグラ
フに付した。オートラジオグラフを電気泳動の間にオー
センティックなリガーゼと一緒に泳動した成分の有無に
関して分析した。

実施例２　　ＤＮＡＩガーゼのアッセイリガーゼはニッ
クシーリング法（ｎｉｃｋ　　ｓｅａｌｉｎｇ　　ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅ）で半定量的にアッセイすることができ
る。即ち、エチジウムプロミドの存在下にＢａｍＨｒエ
ンドヌクレアーゼで処理して、プラスミドＤＮＡ　（ｐ
Ｕｃ１９）ニックを作成する。（ｐＵｃ１８や他の多く
のプラスミドも用いることができる）。リガーゼは、ニ
ックを付したプラスミドの一定量をリガーゼを含むサン
プルの希釈物で処理し、エチジウムプロミドの存在下に
アガロースゲル電気泳動を行うことによりアッセイされ
る。ニックを有するＤＮＡからＣＣＣ型のＤＮＡへの転
換を調べ、希釈率で補正する。このアッセイは反応を５
０℃ないし７５℃で行う時に、特に熱安定性リガーゼの
活性を測定するために有用である。

この特異的ＤＮＡリガーゼアッセイは、次の緩衝液中で
行われる：５０ｍＭ　　トリス、１０ｍＭＭｇｃＩｚ　
、５０ｍＭ　　ＫＣＩ、２ｍＭ　　ＭｎＣｌ２゜１ｍＭ
　　ＤＴＴ、１０．ｃｚｇ／ｄ　　ＢＳＡ、および０１
ｍＭ　　ＮＡＤ０連結反応は２μｍのＤＮＡリガーゼ含
有サンプル、１μＩ　　ＤＮＡ（１μｇ／ｄのニックを
付したＤＮＡ）、および上記緩衝液７μｍの混合物を用
いて行われる。この混合物を６８℃で３０分間インキュ
ベートし、連結反応の停止は６μｍの５０ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡｌｏ、５％ＳＤＳ、および０．０５％　ＢＰＢを用
いて行う。

リガーゼを検出するために、上記１６μｌの混合物の５
μｍを１．　　Ｏμｌ　／ｉｄのエチジウムプロミドと
ともにＴＢＥ泳動緩衝液で０．８％アガロースゲルの電
気泳動に付する。

実施例３　熱　　性リガーゼのクローニングＴｈｅｒｍ
ｕｓ　　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＡＴＣＣ２７６３
４）の細胞を培養して、穏やかに溶解した細胞からＣｓ
Ｃｌ上の平衡濃度勾配遠心分離によってＤＮＡを調製す
る。ＤＮＡを５ａｕ３ＡＩで部分的に消化し、アンピシ
リン耐性遺伝子を含むｐＴＲ２６２（ｏパーツ（Ｒｏｂ
ｅｒｔｓ）　　ら、Ｇｅｎｅ、１２：１２３　　（１９
８０））の修飾物である、陽性選択ベクターｐＴＲ２６
４のＢｅｌｔ部位にクローン化した。テトラサイクリン
耐性クローン（即ち、挿入物を持つもの）を単離した。

７０コロニーのプールを作成し、このプールの溶解物（
ライゼート）の熱安定性リガーゼの存在を、実施例１の
方法によって検査した。陽性プールを同定し、７コロニ
ーづつのサブ−プールに分けた。この操作を繰り返し、
サブプールを単一コロニーに分割して熱安定性リガーゼ
を含ム一つのクローンを突き止めた。このクローンはｐ
ＧＬ６００と命名したプラスミドを有していた。

ＮＡＤ−標識成分がＤＮＡリガーゼであることを、実施
例２のアッセイによって確認した。

実施例４　　ＤＮＡリガーゼ　　　の ｐＧＬ６００は約８ｋｂのＤＮＡ挿入物を有していた。

サブクローニングによって目的遺伝子は約４ｋｂの領域
に存在することを突き止めた（遺伝子を特定するために
要求されるコード量は約２．２ｋｂであると推定された
）。サブクローニングはｐＵＣ１８およびｐＵｃ１９で
行ったため、同一サブクローンが、外部、（ａｃプロモ
ーターに関して反対側に位置して得られた。このような
りローンの対により生産されるリガーゼのレベルの定量
はりガーゼ遺伝子のオリエンテーションを、強く示唆し
た。

一方の端に近いＢｇｌｌで区切られたフラグメントを削
除するとりガーゼの形成は消失し、遺伝子の開始点はこ
のフラグメント中に存在することが示唆された。

Ｂｇｌｌｌによって生じたフラグメントの配列を決定し
、この配列を分析してリガーゼ遺伝子の推定開始点を突
き止めた。

Ｅ、ｃｏｌｉ中で熱安定性リガーゼは検出可能程度に発
現されたとはいえ、そのレベルが低く且つ変動したため
、相当改善の余地があると考えられた。配列の分析によ
って三つの有用な事実が判明した。

１、推定される開始コドンは制限エンドヌクレアーゼＢ
ｓｔＸＩで開裂する（第１図参照）；または分析により
この部位は該遺伝子を含む遺伝子中で、ユニークな部位
であることが判明した；２、この遺伝子はＥ、ｃｏｌｉ
中での発現のための最適リボゾーム結合部位を欠失して
いた；そして ３、この遺伝子は明らかに、Ｅ、ｃｏｌｉ中のコンセン
サスプロモーター配列に適合する付随プロモーターを欠
失していた。

上記の観察の結果次の方法が採用された。

遺伝子の殆ど大部分を、該遺伝子の一端部のＢｓｔＸ１
部位から遠位末端を越えたＢｇｌＩＩ部位まで含む、Ｄ
ＮＡフラグメントを調製した。調製したＤＮＡに強力プ
ロモーターを結合することのできる合成りＮＡを調製し
た；この合成りＮＡは開始コドンを回復させ、良好なり
、ボゾーム結合部位を提供した（第１図を参照）。

そのような造成物を数種、プロモーターおよびリボゾー
ム結合部位の性質を変えて調製した。例えば、ｐＵＣプ
ラスミドのｌａｃプロモーターλＰＬプロモーターおよ
びＭ１３遺伝子■プロモーターを使用した。ＤＮＡリガ
ーゼの生産は、細胞溶解物のポリアクリルアミドゲル電
気泳動および実施例２のアッセイ方法によりモニターし
た。

上記方法で得られた一つの適当な造成物は、ｐＧＬ６２
８と命名されたプラスミドである。その構成は第１図に
示されている。

ｐＧＬ６２８の造成は、該プラスミド上のＰｔ。

プロモーターからの発現を調節するｃ　Ｉ　ＪＪブレッ
サーを提供する細胞中で行われた。ＫｅｉｔｈＣ６Ｂａ
ｃｋｍａｎおよびＢａｒｂａｒａ　　ｂ。

ｔｔｅｎにより１９８７年９月１日に出願された米国特
許出願０９１，８３７号は、そのような株（ストレイン
）の調製の方法を記載している。その一つの株はＫＢ６
４９である。

プラスミドｐＧＬ６２８は、約２，６ｋｂのＢｓｔＸｌ
からＢｇｌＩＩまでのＴｈｅｒｍｕｓ　　ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉ　１ｕｓＤＮＡリガーゼのＤＮＡフラグメントを
含んでいる。このプラスミドはＥ、　　ｃｏｌｉ中に入
れて、アメリ、カン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン、１２３０１　　パークローンドライブ、ロックビル
、ＭＤ　　２０８５２．米国に寄託され、ＡＴＣＣ６７
８５８の寄託番号を得ている。

出願人は、本発明に成立した特許の期間満了前にこの培
養物が死滅した場合は、新たな培養物に交換する義務お
よび特許が成立したことをＡＴＣＣに通知する義務を承
知しており、その通知があったときは、第三者は少なく
とも寄託の日から３０年間、該微生物の分譲を要求でき
る。

実施例６　ユ左二並立翌遺 ＫＢ６４９／ｐＧＬ６２８は、ファーメンタ−中で、１
０リツトルの最小塩類液（例えば、Ｍ９培地）に１５〜
２０　ｇ／ｊ！のグルコースを加えて、３０℃で培養し
た。細胞が対数増殖期の最中に達した時、設定温度を４
２℃に変えて、インキュベートを約２時間続けた。細胞
を収穫し、細胞のペーストを凍結保存した。ＳＤＳ存在
下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し
た細胞溶解物を調べて、全細胞蛋白質の５〜１０％が熱
安定性リガーゼであることが決定された。

実施例７　　　ＧＬ６２８からのりガーゼの細胞ペレッ
ト（３３ｇ）を４ｄ１ｇに破砕用緩衝液に再懸濁した。

破砕用緩衝液は次の組成を有する：５０ｍＭ）リス塩酸
、１０ｍＭ　　Ｍｇ　Ｃ１２，５０ｍＭ　　ＫＣＩ、２
ｍＭ　　ＭｎＣＬ　　、１ｍＭ　　ＤＴＴおよび１０ｍ
Ｍ　　ＮＨ，ＣＩ、　ｐＨ７，７゜破砕はフレンチ・ブ
レシャー容器（Ｆｒｅｎｃｈ　　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　　
ｃｅｌｌ）で１４，０００ＰＳ　Ｉで行った。次に懸濁
液を２０Ｋｒｐｍで２０分間遠心分離して沈澱させた。

上清を除去して８０℃の水浴で３０分間インキュベート
した。この懸濁液を次に７．５Ｋｒｐｍで１５分間遠心
分離して沈澱させた。次に、上清に硫酸ストレプトマイ
シンを２％に加えた（１０％ストック液を用いた）。こ
の２％溶液を水浴上で２０分間撹拌し、１２．５Ｋｒｐ
ｍで２０分間遠心分離した。

この上清を２０ｍＭ）リス、５０ｍＭ　　ＫＣＩ、ｐＨ
７，６で平衡化した、チバクロン・ブルー（Ｃｉｂａｃ
ｒｏｎ　　ｂｌｕｅ）カラム（ベツド容積１３６−）に
通過させた。カラムをカラム容積の３倍量の５０〜５０
０ｍＭ　　ＫＣＩの勾配で溶出した。フラクションは２
．Ｏｄ／分の割合で５１１１づつ回収した。

活性フラクションをプールし、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ
）社の撹拌容器式濃縮装置およびアミコン・セントリブ
レブ濃縮装置で、次に行うゲル濾過カラムのカラム容積
の１〜５％の量に濃縮した。詳しくは、サンプルを１０
ｍＭ　　Ｋ　Ｐ　０４．１００ｍＭ　　ＫＣＩ、１ｍＭ
　　ＭｇＣ１２、ｐＨ７，６で平衡化したフラクトゲル
（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）５０Ｓカラム（ベツド容積１０
０ｄ）に通過させ、０．５ｄ／分の割合で５ｄづつのフ
ラクションを集めた。

活性フラクションをプールし、アミコン・セントリプレ
ブで濃縮し１グリセロールを２０％加えて一２０℃で保
存した。

その他の態様は請求の範囲に記載されている。

例えば、ポリメラーゼのような他の熱安定性酵素も調製
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＧＬ６２８の構成を示す模式図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）異種熱安定性酵素をコードする遺伝子を発現
   するように遺伝子工学処理された中熱性宿主細胞を用意
   し； （ｂ）該中熱性宿主細胞を培養して該熱安定性酵素を不
   所望夾雑物を含む混合物中に生産させ；そして （ｃ）該不所望夾雑物を不活性化するのに充分な温度で
   且つ該熱安定性酵素を不活性化するには不十分な温度で
   該不所望夾雑物を含む混合物を加熱する工程を少なくと
   も一つ含む精製方法で、該熱安定性酵素を精製する； ことからなる実質的に不所望夾雑物を含まない熱安定性
   酵素を得る方法。 ２、培養の後、中熱性宿主細胞を溶解して該熱安定性酵
   素を含む溶解物を製造する工程を含む、請求項１記載の
   方法。 ３、精製工程が、該不所望夾雑物を含む該混合物を加熱
   して、該熱安定性酵素を含む液相から該不所望夾雑物を
   実質的に完全に沈澱させる、請求項１記載の方法。 ４、該不所望夾雑物が蛋白質を含み、そして該加熱が該
   蛋白質を変性して沈澱させる、請求項３記載の方法。 ５、該熱安定性酵素が、核酸の代謝または修飾を触媒し
   、または核酸の作用を触媒する、請求項１記載の方法。 ６、該不所望夾雑物がエンドヌクレアーゼ、エクソヌク
   レアーゼまたはプロテアーゼである、請求項１または４
   項記載の方法。 ７、熱安定性酵素がＤＮＡリガーゼまたはＤＮＡポリメ
   ラーゼである、請求項５記載の方法。 ８、熱安定性酵素が好熱性細菌のＤＮＡポリメラーゼま
   たはＤＮＡリガーゼである、請求項７記載の方法。 ９、熱安定性酵素が、サーマス・フララス（Ｔｈｅｒｍ
   ｕｓｆｌａｒｕｓ）、サーマス・ルバー（Ｔｈｅｒｍｕ
   ｓｒｕｂｅｒ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒ
   ｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステア
   ロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈ
   ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・アクアチカス（Ｔ
   ｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・ラクテ
   ウス（Ｔｈｅｒｍｕｓｌａｃｔｅｕｓ）、サーマス・ル
   ーベンス（Ｔｈｅｒｍｕｓｒｕｂｅｎｓ）およびメタノ
   サーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕ
   ｓｆｅｒｖｉｄｕｓ）からなる群から選択された好熱性
   細菌の熱安定性酵素である、請求項８記載の方法。 １０、熱安定性酵素が、サーマス・サーモフィラス（Ｔ
   ｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＤＮＡリガ
   ーゼまたはＤＮＡポリメラーゼである、請求項９記載の
   方法。 １１、温度が６５℃ないし約１００℃である、請求項１
   記載の方法。 １２、温度が８０℃ないし約９５℃である、請求項１１
   記載の方法。 １３、ＮＡＤ−依存性の熱安定性核酸リガーゼの安定な
   共有結合ＡＭＰ付加物を生じさせて、この付加物を検出
   することにより、該リガーゼの活性をアッセイする方法
   。 １４、付加物のアデニル部分が標識される、請求項１３
   記載の方法。 １５、付加物のアデニル部分がＮＡＤに由来する、請求
   項１３記載の方法。 １６、リガーゼが好熱性リガーゼであり、該リガーゼ活
   性が、不所望夾雑物を含むサンプル中で検出されるもの
   であり、該方法が該リガーゼおよび該不所望夾雑物を含
   む混合物を該不所望夾雑物を変性または不活性化するが
   該リガーゼは不活性化しない温度で加熱することよりな
   る、請求項１３記載の方法。 １７、核酸セグメントのライブラリーを宿主細胞中に形
   質転換し、形質転換された宿主細胞をスクリーニングし
   て、請求項１３ないし１６のいずれか１項記載の方法で
   リガーゼ活性を発現している細胞を同定することよりな
   る、核酸リガーゼ活性をコードする核酸をクローニング
   する方法。 １８、クローニングされた熱安定性核酸リガーゼの遺伝
   子。 １９、熱安定性核酸リガーゼをコードする実質的に純粋
   な核酸配列。 ２０、遺伝子がその発現を増強するプロモーターを含む
   発現ベクターの一部である、請求項１８記載の遺伝子。 ２１、発現ベクターがｐＧＬ６２８である、請求項２０
   記載の遺伝子。