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五、發明说明（ A6 B6 經濟部中央樣準馬印裝 發明背署 本發明是藺於製造及回收熱檯定酵素’待別是具有W於 核酸代謝活性之酵素（如：RNA. DNA聚合誨、連接酶、核 酸内切《或核酸外切《)。 有核酸代謝活性的熱穩定酵素有各棰用途。 在 U . S . S . N 1 3 1 . 9 3 6 . 1 9 8 7 . 1 2 . 11 .申謫 * K e ί t h . C . Backnan Chang-Ning Wang所有發表*在此併作為本文參 考，其中揭示一種分析，其中DNA連接酶用於第一次雜交 探针對至一目禰物的重複循環，然後連接雜交探針，而最 後使雜交的連接探針變性。拜由如此循環|所連接的探針 被搛（大並偵測，K致提供一種代表目禰物的擴大信號。在 此分析中•較佳為使用热穩定DNA速接_，例如，由嗜熱 熱菌（T h e r m η <i thf>rB〇Dhi lus)，其可忍受使DHA爱性所需 的高溫且無連接_活性霣霣的搔失.使得在不再加人另外 接«下完成下一狸連接循環。 美國專利第4,683,195和4,683,202¾描述一種在樣本中 播大目檷DNA的方法，使用引子.三磷酸鹽，及DHA聚合 _ °歐洲專-利申請累第0258017號掲示由水生热菌 (Lh e r a.gua..tJ cus)分離熱穩定DNA聚合酶，M用於攘 大遇程中。在此遇程中使用熱棰定酵素據說要避免在每一 變性步霉加入額外酵素的需要。EP’ 〇17亦報導選殖一種 水生熱菌(Lhecjms aguat i cus ) DNA聚合酶基因，及表現 於大腸菌菌株DG116 UTCC 5360δ>中。 川橋（Takahashi)等人（1984), J , R i 〇 i . chpm . 25¾ ：

CH C〇i. nv i>qr {請先閱讀背面之注意事項再瑱寫本頁) 装· •訂· •綠· A6 B6 五、發明説明（> ) 10041-10047中，描述由唯熱熱菌(Thermus thernoph i 1 u s)熱穩定DNA連接酶的纯化和性質。其他參 考* Roman 丨 ec 等人（1987) !__ Gen M i 〇 r 〇 h i 〇 1 . mi 297- 1308 ，Liao 等人（1986)

Proc.Hatl.Acad. Sci·. USA 8-3 : 576-580 ’ 原-横山 (Ha「a-Yokoyaaa)等人（1984) J . B i ο 1 C h e a . : 1599-1608 ， Matsumara 等人（1985) J. Biol. Chem. 260 : 15298-15303描述各種熱穩定酵素的纯化和性質。 本發明的摘述 本發明的一儸特定目的在於提供一種直接方法由伴随體 内產生的污染物中分離出熱穩定酵素。|當由其天然背景中 分離熱S定酵素時，很難避免麻煩的热S定污染物。例如 ，當纯化一種熱穩定連接酶或聚合_時，可能難Μ避免對 上述擴大過程有害的蛋白_。其他熱穩定DHA代謝酵素， 如DNA核酸内切海也可能嚴重損壊上述擴大分析的效用。 {請先聞碛背面之注意事項再填寫本页) .装. .訂· 經濟部中央搮準局印装

宿殖 ，害酵 步 ，選 Μ危定 下 境髓 白小穩 Μ 環自 蛋最熱 含 定此 體素的 包 Μ因 機酵本 ’ 熱。 有定成 法 非_ 主穩低 方 種白 宿熱對。的 一蛋。去需相物素 入和換除所且染酵 殖，交和對，污定 選素姐性般量害S _ 因酵 一變驟足有熱 4 基謝另效步充的種 _ 之代和有一 到去一 素 Α 物會單得除到 酵DH染機如可 Μ得 定的污一在明難在 穩己组供，發有徴 熱自一提地本沒特 碼造把明單，且明 编製有發簡此，發 至會只本速因源本 ·· 甚主， 快。素 撕CH •線· 經濟部中央揉準局印裝 lOciobo A6 B6 五、發明说明（，） 提供一種嗜中溫宿主畑胞 > 重姐以表現编碼源熱穩定 酵素之基因； <b)於含有不要污染物的混合物中，培養嚙中溫宿主细胞 及產生熱穩定酵素；及 純化該熱穩定酵素係藉一-種包括加熱此酵素和不要的 污染物至一足使不需的污染物失活性但不致使熱穩定酵素 失活性的溫度的方法。 在此文中，純化熱穩定酵素意指減少污染物質（如核酸 内切_、核酸外切酶、或蛋白_ )的量或活性程度，特別 是那些干擾酵素的特定用途，如在上述的選擇性擴大過程 ，或酵素回收。嗜中溫宿主细胞是一種可重姐而產生所欲 之熱穩定酵素的妞胞，其蛋白質通常在一届不會使所需熱 稞定酵素變性的溫度下會雯性。具代表性合逋之嗜中溫宿 主妞胞如下所述。如上所用之異源*指不是由宿主细胞自 然產生的酵素。 在較佳貢例中，此嗜中溫宿主细胞在培養後溶解•以產 生一種含有熱S定酵素和不要的污染蛋白質的溶菌產物。 較佳者 > 加熱步驟基本上使不要的污染物完全赛性和沉澱 ，使得污染物已和含有所需熱穩定酵素的液相分開。本方 法較適用於純化有Μ核酸代謝、改性、或作用核酸上之酵 素。例如核酸酶、核酸甲烷海、聚合酶、連接_、重組酶 {請先閑讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· •訂· •綠· Λη έ Ν^ rD-詳 是< 素菌 酵细 的溫 適中 合嗜 別自 持來 ο 是 V ο 8 佳 最 /|\ 琢 步 熱 Λ3* 加 的 素 Ρ 1 酵 ο 約 的10少 適約至 合至如 較 Ρ ί ，65間 海於時 合活通 聚存合 或其 I 酶-, 0 3 經濟部中央揉準扃印装 A6 _ B6 五、發明说明（心） . -3分鐘，較佳為至少5分鐘>，Μ使嗜中S宿主衄胞蛋 白質失活性。 本發明特別克眼在獲得热穩定連接_時有U選釋的困難 ，如在篩選轉形物時輕易分析連接_活性，及在轉形物中 高度連接酶表現的困雞。 - 特別的，在本發明的第二目標係在於一種分析依靠NAD 核酸連接S活性（特別是熱穩定埋接S活性）的方法•由與 連接_形成一種穩定共價腺嘌呤（例如•由檷記HAD)加合 物，並偵測此加合物。埋接醻活性在一種含有不要的污染 物的樣品中，可由在使污染物變性的瓖堍中加热樣品來偵 測。道在同樣形成腺嘌呤加合物的污染物赛性*特別有用 本發明的第二目欏是用於篩選Μ核_片斷摩轉形的宿主 细胞 > 因此鑑定表現連接_活性的细胞。 本發明的第三目欏通常描述—種選殖的熱穩定核酸連接 酶基因，例如®碼有一種热穩定核酸（DHA)連接_活性之 蛋白霣之核酸，其中核酸是一種重姐選殖載轉的一部份* 其中該基因不會自然產生。 本發明的第四目欏涤闞於一種纒碣热穩定核酸連接_實 質上纯的DKA序列。 較佳地，在第三和第四目檷’此堪殖基因是一種表現載 雅（一種質《或其他可轉形之DNA片段）的一部份，包含提 供加強（如對未菫姐细胞之基因產物量至少二倍）基因表規 的故動子。

CH az.j./9inv 一 {請先閱讀背面之注意事項再填寫本瓦) •装. .打. •線· 五、發明说明（< ) 本發明的其他特激和優點 申講專利範圍中看出。 較住奮俐的紡诚

Α6 Β6 可明顯的由Μ下較佳實例及

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Vl· 經 濟 部 中 央 棣 準 局 印 裝 圏1是圖示霣《 PGL62&姐成-，此質》含有自BstXI位置 延伸至Bglll位置距離約2.6kb的嗜熱熱菌（Ther^us therMoph i 1 us) DNA 片段。） 方法 在熟諸此領域技術者會知道有很多方法來完成製備各種 類的酵素方法之各步驟。通常*重姐DNA的搡作，表現和 «胞培餐之技術是在此範圃中被廣知的技術。在本方法中 所用的唯中溫宿主细胞*可為原核生物，Μ大腸菌的各種 菌株為代表。然而•其他微生物的菌株亦可使用，例如桿 菌*像枯草捍菌(Bacillus. Subti 1 is)、各種帚形菌靨 (Pseudomonas)或其他佃菌菌株。在這些原核生物系统中 ，使用含由宿主或相當於所用宿主的物種的複製位置及控 制序列之霣體載體。除了细菌，輿核»生物，如酵母•亦 可做為宿主。.啤酒酵母菌（SaerrharoBY^es cerevisiae)的 實驗室菌株，貝克（Bakers’）酵母，是最常用的•雖然有 許多其他菌株是一般可用的。 當然同樣可能在自多细胞生物中衍出的真核宿主细胞培 養中表琨埋碼熱穩定酵素基因。參考如：Tissue Culture, Academic Press. Cruz and patterson (1973)。可用的宿主细胞株包括，鼠科骨M细胞瘸N51 *

CH {請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .¾.. .線. Ιο.λ nv ?q7 λ' 經濟部中央棣準為印裝 L〇3cib i A6 _ B6_ 五、發明說明（L ) VERO，MD犬科Sffl胞、HeLa细胞，中國翕鼠_»(CHO)细 胞。這些细胞的表現載體一般包括放動子及可和哺乳類佃 胞相容的控制序列•例如，通常使用糸曼病毒40 (SUian Virus 40) (SV 40)的早期和晩期敢動子（Fiers, et a 1 · H a t u r e (19 7 8 ) 11 3 )-，或其他病毒啟動子，如取 自多瘤（Polyoaa) *腺苷病籌2 (Adenovirus 2)，牛乳頭 狀涵病毒（bovine papilloma virus)、或烏類肉涵病毒 (avian sarcoma viruses)、或免疫球蛋白放動子、和熱 止放動子（heat shock pr〇B〇ter)。一種在哺乳類系统中 表現DH A的系统，使用BPV作為載《係公告在美國專利蒹 號4,419,446 。一種此系统的改良公佈於美國專利號 4,601,978 。一般哺轧類细胞宿主系统轉形的方向由艾爾 (Axel)，美B專利累號4,39 9,216中描述。如果需要，重 覆的起點可得自病毒源。然而，整合入染色SI在冥核生物 的DNA裡製是普通櫬制。 植物细胞琨在亦可做為宿主。逋合植物细胞之控制序列 如nopaline合成《放動子和聚睇苷酸信號序列（Depicker Α·等人 J.Mol.Appl.Gen. (1982) L:561)是可用的。 最近，另可使甩昆S细胞及使用控制系统的表現系统* 提供一種桿狀病泰（baculovirus)載體已被教述。 (M i 1 1 e r D . W .等人，G e n e t i c E n g i n e e r i n g ( 1 9 8 6 )， S e t l o w J . K .等人编輯，P 1 e n u m P u b 1 ί s h i n g , V o 1 . 8 . PP. 277-297) 〇 包含所需编碼及控制序列適合之載體之構造使用已在此 C Η - 8 - —3U/J3 J Ο Y .釐、 . ........ !f|»W ..Hv r ............... ...............................,...................*...............................ir...........................xk (請先聞讀背面之注意事項再Λ寫本莨) 經濟部中央搮準扃印装 r A6 B6 五、發明説明（7) 技中热知的檷準連接和限制技術。分離質》，DNA序列， 或合成寡核脊酸被切開、切尾、重新連接於所需的形式。 特定DNA切裂之位置是由在一般此領域中所了解的狀況 下Μ合逋的限制酵素（或酵紫）處理而完成，特別是那些特 定製造的商業上可得到的限制-酵素。參見，例：Hew England Biolabs的產品目錄。 基因編碼熱穩定核酸代謝基因的選殖，如嘈热嘈熱菌 DNA連接酶，是得發展偵澜該酵素活性的有效技術之重大 助益。待別地，在選殖背景下酵素表現只有極低程度時， 偵测可能很困雞以致於預测在表現所要基因的確定選殖株 之傅铳策咯·在沒有此改良篩邇方法時是不可能有效的（ 所要基因如：缺乏突變異種之互補或所欲轉形物的免疫檢 定）。 問題的加重在於缺乏所需蛋白質的特性，其阻止基於序 列資料的選殖策略。特別當嘈熱晡熱菌連接醻因酵素的低 產最和雜霣（特別是分解蛋白霣雜質）；而無法定序時。 因此•例1M於偵剷核酸代謝酵素的方法（特別是嗜热 性DN A連接梅）對吾案之選殖策略是一重要的目檷。其他 例子提供Μ於選殖和表現。這些例子是用以說明本發明， 而非用以限制。 例1 嗜熱酵素的偵測 Μ下親察提供在一種宿主蛋白質的混合物中偵測可以 NAD摞記的嘈熱酵素的方法，例如，嘈熱菌連接_。 NAD最常用於氧化還原反懕中的一涸中間物，而極少酵

CH ...............................,...................St..............................tr·:··.......................xk {請先閱讀背面之注意事項再瑱寫本頁) 經濟部中央揉準局印装 A6 B6 五、發明説明（S ) 素使用NAD作為篛存化學能源。原核DHA連接海是一類如 此的酵素。大部份其他消耗能源的酵素過程，包括某些 DNA連接海•係使用ATP作為能源。極少數原核酵素可在 超«70 下存活並保持活性。除了持異反應例子，埴些酵 素的大部份存於晡熱生物中。- 已知某些核酸代謝酵素（如DNA«接_ )，形成一種共價 速结的酵素嘌呤物種*於其催化的反懕序列中•作為中間 產物。並發現在70 1C和80 1C的溫度之間，由嗜热菌所得的 熱穩定DNA連接》，可Μ形成一種穩定一共價腺嘌呤加合 物•並且其加合物可Μ32Ρ檷記*在如果用為共因的MAD K32P禰記（可由New England Huclear搮供 > 。此酵素對 HAD而言有極低的1U，因此Μ上反應對檁記可滿足遘殖連 接酶產物•即使在為了增加表現而重姐前在大腸中僅能表 琨極少量的热穩定連接海。 通常，哺中溫宿主细胞不能完全和HAD檷£·或在事先 暴δ於70 t：或Μ上溫度時·其被標記能力會簧霣降低。 在®略而言*預澜含熱穩定連接酶的萃取物培養在70t： 或更高溫；加入32P-HAD ·樣品進一步培養；揉品被變性 並進行SDS聚乙醯胺謬》霣泳•此謬體是自動放射定影· 而DNA連接B的存在樣品中與否•認定連接酶的搏記物存 在與否而定。 更持別的，ffl胞K殖和细胞萃取如下。 含！ 70之由Μ選殖DNA片段庫轉形的唯热瞜热菌之培養 皿中所得细胞被切碎於3.0毫升的L.培養液中。本懸浮物 CH - 10 - ..................................................»...............................#…：.......................^ {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) — ^SO,Λ(01 OV 9Q7 ^.Μλ 經濟部中央揉準局印裝 〇3o> ° A6 _B6_ 五、發明说明（？） 用於被接種於100毫升L培養液中，在一2升的錐形瓶中 。细胞在371C下生長，直到其達飽和（〜3-4小時）。由一 個20毫升份的培養物K離心收獲，並將此细胞離心沉澱粒 存於-20 1C。 上述的细胞麯心沉澱粒懸浮-於10«升的分解媛衝液（ 20·Μ TRIS 0. UM EDTA.和 lmM /3 ·乙碕酵 pH 7.6)由超 音波分解。K雕心櫬除去细胞碎片（20分鐘，K 20,000 γρ· 4 t SS-34旋轉器）。產生的懸浮物在80 的水浴中培 養30分鐘。然後沉澱的蛋白質Κ離心法除去（2〇分鐘 7,000 rp· ，SS-34旋轉器）。所產生的懸浮物置於一 種 Aiaicon Centrip「epc-( 10,000 MWC0)，並濃縮至〜0.5 毫升。此濃镅液移至一儷Anicon Centriprepte10000 MWC0)，並且濃縮驟维持到得到二50微升的體稹。此濃縮 樣品然後置於塑膠微離心苷中，並在8010的浴中培養20分 鏟。沉澱物再次以離心法（4分鐘，在微離心苷中）除去， 而懸浮物移至另一届塑膠激離心苷。此苷再一次置於 水浴中。在樣品至達溫度後•加入1.0微升的32P稀釋物 ，然後此苷在80C下培養2小時（NEN原液32P稀釋至1/2 ，在 0.2M TRIS, pH 7.6)。然後 25撖笔升 Laenmli SDS 膠體樣品媛街液加入此管，並且在80X：下18鑲培養20分鐘 。然後樣品在10S Laennli SDS-膠體中電泳。當此追踪染 料靠近膠體底部，罨泳停止，然後含有最多的32P標記 (HAD)的膠體底部被剪下。此膠體浸於H20 30分鐘，並在 —個膠體乾燥器上乾烽。此乾缲膠體然後自動放射顯影。 CH - 11 - ...............................;...................裝..............................訂........................線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本貰) 經濟部中央搮準属印裝 一

Ocio^-o A6 __ B6_ 五、發明说明（丨J ) 此自動放射顯影匾分析在霣泳時同架於認定埋接酶的物種 之存在。 例2 DNA連接_分析 連接梅可以切口密封步驟做半-量化分析。質HDHA (PUC19)在溴化亞乙鼸存在下-M hjJU核酸内切梅處理下 切口（PUC18和許多其他霣體亦可用）。連接_的分析由固 定董的切口質《和含有連接_的稀釋樣品處理•然後在溴 化亞乙醢存在下以瓊膠電泳。切口至CCC形成DH A的轉換 被分析*並伴隨稀釋。此分析對當此反應在5013和751C之 間的一儷溫度進行時，決定嗜熱埋接K活性特別有用 此特定DHA連接_分析Μ下述埋衡液處理：50·Μ Tris, 10·Μ氢化鎂* 50·Μ氣化鉀，2·Μ氛化錳，1·Μ DTT ,10ug/iil BSA ，及 0.1·Μ HAD 。使用含有 2ul DHA 連接 _樣品，1 u 1 D H A (1 u g / 丨刻痕D N A )，和7 u 1 Μ上媛®液之 混合物完成連结。此混合物在681C培養30分鐘，然後用6 ul 50·Κ EDTA/0.5X SDS ，和 0.05Χ ΒΡΒ 停止連接。 為了偵測連接誨，5ul的16ul混合物於0.8：«的洋菜膠和 I.OuI/bI溴化亞乙醮TBE進行媛衝液的膠上電泳。使用大 腸菌DNA連接_進行作為正對照。 例3 暗热連接S的選殖 嘈熱菌细胞（ATCC 27634)被培養· DNA由在氯化筢的均 匀密度梯度難心中溫和分解的细胞而製得。DHA被 S_aji_3 AI部份消化，並且選殖於正選擇載體pTR264的B_c_LI邊 *含有抗氨苄育霉素基因的一種PTR262的轉換（羅伯特等 CH - 12 - _ ...................................................裝..............................訂.............................線 {請先閱讀背面之注意事項再瑱寫本贸) A6 B6 經濟部中央棣準局印装 五、發明說明（"） 人，GeneI2_: 123(1980))。抗四環徽索選殖Μ (即那些有 插入《者）被分離出來的。70株選殖株庫被製出· Μ及這 群的溶菌物Κ例1中的步驟用Κ檢定哺热連接_的存在。 一個正群被鑑定出•並分裂至7個埋殖株的次群。由重複 步嫌和分裂次群至單株選殖株-，、檢定出一種含有嗜熱速接 酶的壤殖株。其帶有名為PGL600的質8。 此NAD-禰記物種的檢定，由述於例2中的分析被確定為 D Η A連接ϋ。 例4 DNA連接豳基因的位置 PGL600含有約8kb的插人DNA 。由傅代培《繁殖，我們 把基因置於約4k b的範園（用於特定基因所需编碼量估為 約2.2kb)。因為傳代培養繁殖在PUC18和PUC19中做》得到 相同的傅代繁殖株，其置於相對外lac啟動子處。由如此 遘殖株對製得的連接_量之量化，強烈表示連接®基因的 方向性。 劂除一價靠近皤黏的I連接片段，會濟除連接酶的 產生*表示基因的生成由此段落產生。 此Bglll生成片段被定列，而一推想的連接酶基因起始 黏由分析此序列檢定。 例5 在大腸菌中唓熱連接_的表現 雖然嗜熱連接酶在大腸菌中是可偵测地表現，但低和變 化的程度顬示可以得到相當的改良。分析此序列得到三倨 有用事實 L推想的起始密碼子被限定核酸内切_BstXI (見圖1 CH -13- (請先閏讀背面之注意事磺再填寫本頁) .装· .打· •線 -—,^"ji πν 9〇7 H.) 鳗濟部中央揉準局印装 ^0O：r,〇 A6 _B6 五、發明说明（f/) )切開，進一步的分析表示在DNA延長此基因中，此段是 唯一的。 2此基因缺乏可表現在大腸菌中有用的核糖驩連接段 a此基因很明顯地缺乏一届協同的啟動子，以傾應在大 腸菌中的一致故動序列。 - 對這些觀察的了解提供下列步骤： —β嫌乎含有全部基因的DHA片段，由Bglll段一端的 .BstXI段製造，通過此基因的末稍皤。合成DNA製出· W 連接製出的DNA至強的敖動子。此合成DHA篛存此放動密 碼*並提供一届好的核糖體連接位置。（見圏1 ) 一些如此的構造被製出，變化敢動子的性霣和核耱體連 接位置。例如，使用取自PUC粒子的Lsl£_放動子，用入 PL敢動子，及用Μ13基因I故動子。DNA連接酶的製造以 衄胞溶胞物的聚丙烯醣胺膠電泳，和例2中的分析步驟監 視。 由上述步驟所得的一届通當结構是一個霣體消化 PGL628。其組成如圖1所示。 PGL6 2 8的構成在一届细胞中完成，其使CI抑制子控制在 霣體中的PL放動子的表現。在美國專利應用SH 091,837, 1 9 8 7 · 9 . 1 .申請，K e ί t h C . B a c k 丨 a n a n d B a r b a r a Bolten描述一個製造此菌株的方法。一®這種菌株是 KB649 。 質 S PGL628含〜2 · 6KB BstXT 至 B g 1 I I D N A 連接 SS D N A 片段。在大腸菌中的此質體，已被存於美國型態培養收集 CH - 14 - ...............................i ...................SL..............................#…··......................体 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央揉準局印装 A6 B6 五、發明説明（丨:Μ 中心（American Type Culture Collection)，洛克皮爾 (Rockville) ，MD，及給予ATCC編號67858 。申請人之受 讓人，生化國際公司（Biotechnica InternationaJ Inc) 承諾若這些裁培物亡於此專利期間止之前，將替換這些栽 培物之责任；及通知ATCC此專-利獲准之資任*在寄存日期 後至少30年可供諸於世。至其時·在條例37 CFR ξ 1.14 和35，U.S.C.S 112之下*該寄存物可供專利委員。 例6 連接梅的製造 菌株KB649/PGL628於一個發酵槽中，Μ3〇υ，10公升礦 物鹽（如Μ9媒霣）加15-20克/升葡萄糖栽培。當细胞達到 中對数期，此溫度設定黏改到4 2 C，且栽培延鱭至約2小 時。细胞收成，且將一涸细胞團冷凍儲存。由檢査细胞溶 菌產物，其由存有钠十二基醯酸鹽的聚丙烯醯胺膠電泳決 定出所有ffl胞蛋白質的5«和10¾之間為嗜熱連接SS。 例7 由PGL628純化連接酶 妞胞粒（33 4鼍升/克被再懋浮於分裂嫒衝液。分 裂媛衝液包含以下：50aH Tris-氛化氫· 10mM氯化鎂· 50mM氛化鉀* 2ιΜ氣化錳，IbM DTT，和ΙΟηΜ氯化銨， pH 7 . 7 〇 此分裂在法式壓力槽14000 PSI中進行。此媛衝液以 20K rpm延長20分鐘。此浮液被移開並在一 80CH20浴下 栽培30分鐘。此®浮液後Μ 7 . 5K rpm延長15分鐘。此上清 液使甩10¾原溶液做成2¾鐽霉碲酸鹽，此2¾溶液在冰上攪 拌20分鐘，然後在12.5K「pm延長20分鐘。 CH - 15 - (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) •装· 綵 〇V 9Q7 Λ： A6 B6 五、發明説明（) 此浮液装入一種夕巴隆藍管柱（Cibacron blue column) (136 毫升床座體積），K20mM Tris * 50nM 氣化 鉀，PH7.6平衡。此苷柱M三管柱體稹，50至500mM氛化 鉀梯度冲洗。以速度2.0奄升/分的速度，5奄升體積收 集各瓶。 具活性瓶被匯集|並置於阿米康（AmicorO攪拌榷濃縮器 ，然後用阿米康離心濃縮器，直到體積為下述膠體過濾管 柱的1-5¾。樣品特定装人膠50S管柱（床座髓積100ml)， 以1〇以磷酸鉀，1〇〇以氯化鉀*11^氯化鎂01{7.6平衡， 以0.5毫升/分之速度每瓶收集5奄升。 匯集具活性瓶•濃縮於一阿米康離心，至20¾甘油，存 於-20 t：。 其他實施範例含於下述申請專利範圍内。例如，像聚合 酶之申請專利範圍是： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本百) •装· •綠. 經濟部中央橾準局印裝 CH - 16 -

Claims (1)

1. 〇3⑽3 附件一a : 第79101599號專利申請案中文申請專利範圔修正本 民國82年3月修正 1. 一種獲得基本上沒有不要的汚染物的熱穩定連接酶 的方法，包括： (a)提供一種經重組之喃中溫宿主細胞，以表現編碼異源熱 穩定性DNA連接酶之基因，該異源熱穩定性DNA連接酶係源 自下列群體之喃熱菌··淺黃熱菌(Thermus f larus)、羅 伯喃熱菌(Thermus ruber)、好熱喃熱菌(Thermus thermophilus)、 Π盏熱月旨B方芽抱桿菌（Bac i 1 1 us stearothermoph i lus)、7_K生口塞熱® (Thermus aquat icus) +、孚L>D畜熱(菌(Thermus 1 acteus)、赤卩畜熱閣(Thermus rubens)及嗜熱甲院噴熱菌（Methanothermus f erv idus)； Cb)在含有不要的污染物之混合物中培養該喃中溫宿主細 胞，以製造該熱欏定連接酶； (c)純化該熱穩定連接酶；該純化^過程包含至少一個步驟 ，其中含該不要的污染物之混合物被加熱至6 5 °C至 1〇O °C之間。 2. 根據申諸專利範圍第1項的方法，其中在培養後， 該喃中溫宿主細胞溶解而得含有該熱欏定連接酶的溶菌物 〇 ： 3. 根據申§青專利範圍第1項白勺方法，其中姊仆·渦辟 (21«X297公«) , _ l包含加熱該含有不要的污染物之混合物，以從含有熱穩定 連接酶的液體中使該不要的污染物本質上完全沉殿。 4. 根據申請專利範圍第3項的方法，其中該不要的污 染物包含蛋白質，而該加熱使該蛋白質變性，並使其沉殿 B 〇 5. 根據申請專利範圍第1項的方法，其中熱穩定迪接 酶催化核酸之代謝、修飾、或核酸上之作用。 6 .根據申請專利範圍第1.或4項的方法，其中該不要 的污染物為核酸内切酶、核酸外切酶或蛋白酶。 10 7 .根據申請專利範圍第1項的方法，其中該熱穩定連 接酉®是源自一口盞熱菌 (Thermus thermoph i 1 us)之DNA連接 酶。 8.根據申請專利範園第？項的方法，其中溫度是由ί 8 ◦ °C 至約 9 5 °C。 16 9 —種分析侬關N D A的熱穏定核酸迪接酶活性之方 法，包括： ⑻提供衍自N D A之經標蝴的腺核管基部分： Cb)形成該連接酶與該經標幟之腺核苦部分的穩定共價 A Μ P加合物； 20 (c)加熱至6 5 °C — 1 ◦ ◦ °C而將污染物變性，測定該趣 標Φ戟之加合物。 i 1 〇.根據申請專利範圍第9項的方法，.其中該迪接购 是一種_熱連接酶，旦該連接酶活性是於含士不要的污染 物樣品中被偵測，該方法包含加熱含有該連接酿和該不$ γ4 (21βΧ297^ίΙ) — 2. ~ J的污染物之混合物，於致使不要的污染物，但不致使該連 接酶變性或失活性之·溫度。 1 1 種選殖編碼核酸連接酶活性的核酸之方法，料 中核酸片段廊被神形宿主細胞，且以申請專利範圍第9或 5 1 Ο項之方法飾選該鞞形宿主細胞而檢定表現連接酶活性 6勺纟田拜包〇 1 2 . 一视本質上純的核酸序:列》其爲編碼一植熱擺定核 酸連接@3之基因，該基因 具有如下列示之核苛酸序列及其DMA片段： τί (2UXW7公X) flKQ ID NOI 1: * ATO ACC CTQ ΟΑΛ GAO OCO AGO AAQ CCQ OTA AAO QAG TTA Thr Lqu Clu Qlu Ala Arg Lya Axg VaI λβη Glu Leu * 1 10 I COO OAC CTC ATC CGG TAG CAC AAC ΤΛΟ CGC TAG tAC OTC CTO OCO CAC Arg Aesp Lqu He Arg Tyr Hie Aon Tyr Arg Tyr Tyr Val Ala Aep 2〇 CCQ QAa ATC TCC GAC GCC OAO TAC QAC COG CTT CXT AOO OAO CTC AAG Pro Glu 11© Ser Asp Ala Glu Tyr Asp Axg； Leu Leu Arg Glu Leu Lya 30 ·. 40 GAG CTT OAG GAO CC3C TTC CCC OAG CTC AAA AGC CCO GAC TCC CCC ACC Ql\x Leu Qlu Glu Ar^ PhQ Pro Qlu Lou Lye S«r Pro Aep fler Pro Thr 50 60 ctt cag στα oqo ggg aqq cct tto qao gcg acg ttc cac cca gtc coc Leu oln Val Gly Ala Arg Pro Leu Olu Ala Thr Phe Arg Pro Veil Arg 7〇 4 CAG CCC ACC cac ATG TAC TCC TTQ GAC AAC2 OCC TTT AAC CTT CA。ΟΑσ Hie Pro Thr Arg Met Tyr Ser Leu Aep Ann Ala Phe Aan Leu Aep Oly 80 90 CTC ΑΑ0 GCC TTT OAO GAG COO ATA OAA CGG CCC CTO GGG COO ΑΛΟ CGC Leu Lya Ala Phe Glu Givi Arg Xlo Olu Arg Ala Leu Oly Arg Lye Oly -100 CCC TTO GCG TAC ACC CXC OAO CAC ΑΛΟ OTQ CAG GOO CTT TCC OTG AAC Pro Phe Ala Tyr Thr Val Olu Hia Lyes VaI Aap Oly Lou Ser Val Asn HO 120 CTC TAC TAC 0AG GAG GGG GTC CTG OTC TAC GG(3 GCC ACC CGG CGG QAC Leu Tyr Tyr Glu Olu Gly Val Leu Val Tyr Gly Ala Thr Arg Gly'Asp 130 140 000 GAO OTG GGG GAG GAG GTO ACC CAG AAC CTC CTC ACG ATC CCC ACC cly Qlu Val Gly Glu Glu Val Thr cln Aan Leu Leu Thr lie Pro Thr 150. ATC CCC AGO ACC CTC AAQ GCG QTO CCG GAQ CQO CTC GAO CTC CGG GGQ He Pro Arg Ατςτ Leu I#ya Oly Val Pro Olu Arg Leu Olu Val Arg Gly 160 170 QAQ CTC TAG ATO Clu Val Tyr Met CCC ΑΤΛ GAO OCG !T*rC CXC CGO CTC AAG QAQ OAG CTO Pro Xlo'Qlu Ala Fho Lou Arg Leu Aen Qlu Glu Leu 180 - GAG GAO CCC OQQ Olu Clu Arg Gly 190 ·» . · . QAO AGQ ATC ΤΤΟ ΑΛΑ AAC CCT AGO ΑΛΤ OCO OCG GCa Olu Arg lie Pho Lye Λβπ Pro Arg Aan Ala Ala Ala 200 f OGT TCG TTA AGQ Oly 5Θ2： Leu Arg • 1 CM ΑΛΑ GAC CCC CGC ATC ACC CCC AAO COG GCC CTC j Gin Lya Aep Pro Arg lie Thr Ala Lye Arg GXy Leu 210 220 * ▲ t* (210ΧΜ7Λ-Χ) -Γ-— 10 16 20 AGC GCC ACC TTC TAC OCC XTA QGC CTX OCC CTQ CAO GAG OTC QAG AGO Azry AXa Thr Phe Tyr Ala Uau Oly He Qly lie Qlu Qlu Val Glu Arg 230 GAA GGO OTQ QCG ACC CAG XTT GCC CTC OTC CAC TOQ CTC ΑΛΟ QAA AAA Clu Qly Val A1a Thr Oln Phe Ala I«*u Ii«u Hie Trp Leu Lye Clu Lye 240 250 ·» · COC TTC CCC GAG CAC GCC TAC GCC CO<5 GCC GTG ooa GCG GAA OGCJ Oly 2Phe Pro Val Glu His Gly Ala Arg Ala Val (Sly Ale· Olu Qly 260 GTO GAG pCO C3TC TAC CA。GAC TOO CTC AAG AAG COO COO GCQ CTT CCC Val Glu Ala Vftl Tyr Qln Aep Trp Leu Lya Lye Arg Arg Ala I-eu Pro 270 2β0 TTT GA。GCC aAC GGC CTO GTC GXQ AAG CTCJ GAC GAG CTT (SCC CTT TOG Phe olu Ala Asp Gly val Val Vftl Lye Ii«u Aep Clu Leu Ala Leu Trp 290 300 • ·——- ... ------— CQG GAC CTC CCG TAC ACC QCC CCG QCC CGC COO TTC GCC ATC GCC TAC Arg Olu Lqu Qly Tyr Thr Ala Arg Ala Pro Arg Phe Ala lie Ala Tyr 310 aao rrc CCC GCC qao cao aao c^o ACC om ctt TXG CAC QTO OTC TTC Lya Phe Pro Ala Glu alu lya Cjiu Thx Arg Leu L«u Aep Val Val Phe 320 33〇 UI〇X»7a·复） -ζ CAO GTG GOO CGC ACC €K3<3 CGC2 GTG ACC CCC GTCt QCG ATC CTC GAG CCC Gin Val Oly Arg Thr Oly 7ixq Val Thr Pro VAl aly lie Leu Glu Pro 340 GTC TtC CTA OAG GOO ACC GAO OTC TCC QOC OXC ACC GT5 CAC AAC OAG Val Fhe I<eu Glu GXy Ser'Cilu Val Sor Arg Val Thr Leu His Aen Clu 350 360 • ’ > * AGCJ TAG ΑΤΑ GA<J GAG TTG CAC ATC CGC ATC <WO GAC TOO GTT ΤΤσ CiTO ser Xya： lie Glu Glu Ι·βύ Αβρ lie Arg lie (31y Αβρ Trp Val !<eu Val .( 370 380, k · . CAC AAG CCO G<3C GCO OTC ATC CCC OAO GTC CXC CCG OXC CTC AAC3 GAO Kia X-ya Ala. Oly GXy Val IXo Pro CXu Val Lau Arg Val L«u Lys Olu 390 AGO CGC ACG OGC OAG CAA AQG CCC ATT CQC TOC CCC OA(； ACC TCC CCG Arg Arg Thr Oly Glu Glu Arg Pro lie Arg Trp Pro Glu Thr Cya Pro 400 * 41Q GAO TOG OCC CAC CGC CTC CTC AAO GAG GOO AAG QTC CAC COC TOG CCC Olu Cya Oly Hifl Arg L«u Leu Lye Qlu Gly Lye Val Hi« Arg Cya Pro 420 AAC CCC TTQ TGC CCC CCC AAO CGC TTT CAO GCC AXC COC CAC TTC OCC Aon Pro Leu Cya Pro Ala Lye Arg Phe Olu Ala lie Ary Hin Phe Ala 430 440 TCC CCC AAG GCC ATC CAC ATC CAQ OGC CTO <W5 CAA AAO CTC AXX GAO fler Arg Lya Ala Met· Aep lie Oln aly Leu Oly Glu- Lye Leu lie Glu 450 460 is 20 T4 U10XM7办复） AGO CXT TTO GAA AAO QQQ CTC GTC AAO GAC OXC? OCC QAC CTC TAC CGC Axg Leu Leu Glu Lye <?ly Leu Val Lye Aep Val Ala Asp Leu Tyr 470 TTQ λΟλ λλα Ολλ GAC CTO GTG GOC CTG <ΆΟ CGC ATO CCO GAG ΛΛ0 AGC £#au Ary Lya Olu Λβρ Leu V*X Cly L«u Olu Arg Met QXy Glu l*ys sor 480 49 ' GCC ΟΑΛ ΆΛΟ CTC CTC CGC CAQ ATA GAG -CAG AGC ΑΛΟ ΆΛΑ. Α9Λ CQC CTG fi Ala Gin Asp £i<iu X*eu Acg <3lz\ lie GLu Glu Set X^ye Iiya Arg Gly Ii〇u • . soo GAO CGC CTC CTC TAC QCC TTO QGG CTT CCC <WO CTQ OGC 〇A〇 GTC TTO Qlu Λχ^ Leu Leu Tyr Ala Leu Qly £i〇u Pro QXy Val Cly Olu Val Lou 510 520 10 15 aca ccc aac crc qcq gcc cac ttc doo aac ato gac toc ctc cxc oao Ala Arg Λβη Leu Ala Ala Arg Pho Gly Aen Mat: Aep Arg Leu Leu Glu 530 540 QCC AGC CTO CAG QAQ CTC CTO GAO OTG GAO OAC OTG CCO GAO CTC ACG Ala ser Leu Olu Glu Leu I*eu Qlu Val Qlu Olu Val Oly Glu Leu Xhr 550 GCG AOO GCC ATC CTO CAQ ACC TTO AAO GAG CCC QCC TTG CGC CAC CTG Ala Arg Ala lie Leu Olu Thr Leu Lye Aep Pro Ala Ph« Arg Aep Lou 560 570 (Λ0Χ：»7公复） 20 1 GTA CGG AGO CTO KAG GAG OCO COG QTO GAG AXO GAG GCC AAO GAO AAC Val Arg Arg Leu Lye Glu Ala Qly Val Clu Met Glu Ala Lyfl Cilu Xye 580 OGC QQG OAC GCC CTT AAA GOO CTC A.CC TTC GTO ATC XCG OQG OAO CXX Gly Qly Olu AXa Leu Lye Qly Leu Thr Phe Val Xle Xhr Oly Glu Lou 590 600 % · XCC CCC CCC QQQ GAA GAG GTG AAO GCC CTC CTK AGO CCC CTC GGO GCC fi . Ser Arg Pro Arg Glu Qlu V&l Lye Ala Leu Leu Arg Arg Leu Gly A1& 610 620 i AAC CTO ACQ OAC TCC GTO AOC COG AAO ACO ACC TAG CTC GTG GTQ OGG Lye Val Thr Aap ser Val ser Arg I#ye Thr Ser Tyr Leu Val Val Oly 630 GAG AAC CCO GGG AQC AAG CTO OAO AAO OCC ACO OCC CTC GCC QTO CCC Glu Aert Pro Gfly 5ejr Lye Leu Glu Ly丨 Ala Arg Ala Leu Gly Val Pro 640 · 650 ACC CTC ACO CAC OAO OAC CXC XAC CCO CTC CTC OAO CCO COO ACO QQC Thr L«u Thr Qlu Clu Glu l,eu Tyr Arg X.eu Leu Clu AlA Arg Thr Oly 660 AAG AAO OCG GAO GAG CTC QTC T^A. Lye Lye Ala Olu Clu Leu Val 670 .i f- IS C210X»7 公复） 1 1 3 ·根據申請專利¢5圍第12項之核酸序列，其中該基因 是包含一提供該基因的力CI強表現之啓動子之表現載體之一 部份。 · 1 4 ·根據申請專利範圍第13項之核酸序列，其中該表現 5 .載體是pGL6 2 8 〇 T4 (210X297公复） 一 10 一 ιο IS 附件一：第79101599號専利申請案 中文補充實施例 民國81年4月呈 連接酶之純化與活性分析 如下所示的表I與圖2係說明大部分之大腸桿菌的汚染 蛋白質在一單次溫度變性之步驟中被除去。流份I(由 E. coli KB649/PGL628萃取而未處理者），具有特異活性 爲0.2 units/mge活性的測定是藉由缺口一黏合實驗步媒 (n i ck-sea 1 i ng procedure!)，其使用質 ISDNA，在 EtBr存在下，以BamHI限制酶水解。基本上，活性的測 定是令一固定置的經切.口處理的質《以含有連接酶之稀釋 樣品處理，然後在EtBr存在下進行膠髏電泳。經切口處理 的共價性閉合型DNA的轉化作用是由於連接酶之活性 。萃取物在的t：，加熱處理30分鐘後，連接酶特異活性增 加7倍至1.4 units/mg (表I所示之流份I與H，與附圖 2之第2與3行）。加熱處理後，最主要殘留的汚染物是 核酸，其可使用鏈徽素硫酸蕴沈激法（streptomycin sulfate precipitation)除去（表I之流份H >。剩餘的 不純物以藍31脂糖（Blue agarose)及Fractogel 50S作 層析而去除（表I之流份IV與V，及圖2之第5及6行） 。必須加熱萃取物以去除不要之汚染物的溫度是約70¾至 的TC，即說明書第4、9及10頁所揭示的。 Τ4 (2Ι0ΧΜ7Α·!) 20 I 得自 KB6 4 9 /PGL6 2 8 之T.tliermophilus 連接酶 的純化 流份 I萃取物 I加熱處理 I鍵徽素 IV藍瓊脂糖 V Fractogel 50S 特異活性（單位/毫克） 0.2 1.4 1.9 3.1 3.7 檢析流份I —V，係藉由SDS聚丙烯醣胺膠體電泳法， 10如下之圖2所示。 圖2 (附圖）是以SDS聚丙烯醣胺膠體電泳法所進行 的連接酶流份的分析。電泳是進行在如實例1所述之105 聚丙烯醣胺膠（15X20X0.15cm)。膠體以考馬斯亮藍染 色。第1行，蛋白質分子量標準，分子量以千道耳呑表示 ，第2行，1 2 3微克之流份I ;第3行，1 5微克之流 份I ;第4行，1 2微克之流份Π ;第5行，6微克之流 份IV;以及第6行，6微克之流份V。 (2Ι0ΧΜ7Α·羹）