DE68924251T2

DE68924251T2 - Gewinnung von thermostabilen Enzymen.

Info

Publication number: DE68924251T2
Application number: DE68924251T
Authority: DE
Inventors: Keith C Backman; Gail Lauer; Diane Mckay; Edwin A Rudd
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1988-12-16
Filing date: 1989-12-15
Publication date: 1996-04-25
Anticipated expiration: 2009-12-16
Also published as: EP0373962A2; AU4671589A; EP0373962B1; DE68924251D1; EP0373962A3; ES2080755T3; KR900009982A; JP2854902B2; GR3017991T3; TW203626B; ATE127843T1; CA2005667A1; JPH02257880A; AU627809B2

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Herstellung und der Gewinnung thermostabiler Enzyme, besonders Enzyme, die eine den Nucleinsäurestoffwechsel (z.B. RNA- oder DNA-Polymerasen, Ligasen, Endonucleasen oder Exonucleasen) betreffende Aktivität besitzen.
Es gibt verschiedene Verwendungen für thermostabile Enzyme mit Nucleinsäurestoffwechsel- Aktivität.
Unsere Europäische Patentanmeldung Nr. 88311741.8 (veröffentlicht unter der Nr. EP-A- 0320308), deren Offenbarung hierdurch durch Bezugnahme eingeschlossen gilt, offenbart einen Test, bei dem DNA-Ligase in wiederholten Zyklen verwendet wird bei denen zuerst Probenpaare an ein Ziel hybridisiert werden, dann die hybridisierten Proben ligiert werden und schließlich die hybridisierten ligierten Proben denaturiert werden. Durch diese Zyklen werden die ligierten Proben amplifiziert und nachgewiesen, so daß ein für das Ziel stellvertretendes amplifiziertes Signal geliefert wird. Bei diesem Test ist es wünschenswert, eine thermostabile DNA-Ligase zu verwenden, z.B. aus Thermus thermophilus, die der hohen für die Denaturierung der DNA erforderlichen Temperatur ohne wesentlichen Verlust der Ligaseaktivität standhalten kann, so daß der nächste Ligierungszyklus ohne Zugabe zusätzlicher Ligase ausgeführt wird.
Die US-Patente 4683195 und 4683202 beschreiben ein Verfahren für die Amplifizierung von Ziel-DNA in einer Probe unter Verwendung von Primern, Triphosphaten und DNA-Polymerase. Die EP-Anmeldung 0258017 offenbart die Isolierung thermostabiler DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus zur Verwendung in diesem Amplifikationsverfahren. Bei dem Verfahren soll durch die Verwendung eines thermostabilen Enzyms vermieden werden, daß nach jedem Denaturierungsschritt zusätzliches Enzym hinzugefügt werden muß. In EP '017 wird ebenfalls die Klonierung eines DNA-Polymerase-Gens aus Thermus aquaticus und dessen Expression im E. coli- Stamm DG116 (ATCC 53606) beschrieben.
Takahashi et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:10041-10047 beschreiben die Reinigung und die Eigenschaften thermostabiler DNA-Ligase aus Thermus thermophilus. Andere Literaturstellen, Romaniec et al. (1987) J. Gen. Microbiol. 133:1297-1308, Liao et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:576-580, Hara-Yokoyama et al. (1984) J. Biochem. 96:1599-1608, Matsumara et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:15298-15303, beschreiben die Reinigung und die Eigenschaften verschiedener thermostabiler Enzyme.
Diese Erfindung entstand im Verlauf unserer Arbeit, mit der wir einen direkten Weg bereitzustellen versuchten, auf dem thermostabile Enzyme von den Verunreinigungsstoffen getrennt werden, die ihre in vivo-Herstellung begleiten. Bei der Trennung des thermostabilen Enzyms von seiner natürlichen Umgebung ist es schwierig, lästige thermostabile Verunreinigungsstoffe zu vermeiden. Bei der Reinigung beispielsweise einer thermostabilen Ligase oder Polymerase kann es schwierig sein, Proteasen zu vermeiden, die sich nachteilig auf die oben beschriebenen Amplifikationsverfahren auswirken können. Andere thermostabile DNA-metabolisierende Enzyme wie DNA-Endonucleasen können die Wirksamkeit der oben beschriebenen Amplifikations-Tests ebenfalls ernsthaft untergraben. Selbst wenn das Gen, welches das thermostabile Enzym codiert, in eine nicht-thermostabile Umgebung kloniert ist, stellt der Wirt seine eigenen DNA- metabolisierenden Enzyme und Proteasen her. Folglich wird selbst beim Klonieren nur ein Satz von Verunreinigungsstoffen gegen einen anderen ausgetauscht.
Wie aus der folgenden genauen Beschreibung klar hervorgeht, liefern unsere Techniken eine Möglichkeit, um Proteine des Wirtsorganismus wirkungsvoll zu denaturieren und zu entfernen, schnell und einfach, möglicherweise in nicht mehr als einem einzigen Schritt mit kleinstem Risiko für das erwünschte thermostabile Enzym. Dieses ermöglicht eine ergiebige und relativ preiswerte Quelle thermostabiler Enzyme ohne nachteilige Verunreinigungsstoffe, die anders schwierig zu entfernen sein können.
Entsprechend dem ersten erfindungsgemäßen Gesichtspunkt wird ein Verfahren zur Gewinnung eines thermostabilen Ligaseenzyms bereitgestellt, das von unerwünschten Verunreinigungsstoffen im wesentlichen frei ist und das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Schritte umfaßt:
(a) Bereitstellen einer mesophilen Wirtszelle, die konstruiert wurde, um ein Gen zu exprimieren, das ein heterologes thermostabiles Ligase-Enzym codiert, wobei das Gen dadurch gekennzeichnet ist, daß es für ein Protein mit der im wesentlichen gleichen thermostabilen Ligierungsaktivität codiert wie das Protein, das durch das Gen codiert wird, das auf dem annähernd 2,6 kb großen Bst XI-Bgl II-Fragment gefunden wird, das in pGL628 gefunden wird.
(b) Kultivieren der mesophilen Wirtszelle, um das thermostabile Enzym in einem Gemisch, das unerwünschte Verunreinigungsstoffe umfaßt, herzustellen; und
(c) Reinigen des thermostabilen Enzyms, wobei die Reinigung mindestens einen Schritt umfaßt, bei dem ein Gemisch, das die unerwünschten Verunreinigungsstoffe umfaßt, auf eine Temperatur erhitzt wird, die ausreicht, um die unerwünschten Verunreinigungsstoffe zu inaktivieren, die aber nicht ausreicht, um das thermostabile Enzym zu inaktivieren.
In diesem Zusammenhang bedeutet die Reinigung des thermostabilen Enzyms, daß der Überschuß oder das Aktivitätsniveau verunreinigender Stoffe (z.B. Endonucleasen, Exonucleasen, Proteasen) vermindert wird, insbesondere derjenigen, die die beabsichtigte Verwendung des Enzyms wie bei dem oben beschriebenen selektiven Amplifikationsverfahren oder die Gewinnung des Enzyms stören. Mesophile Wirtszellen sind Zellen, die konstruiert werden können, um das erwünschte thermophile Enzym herzustellen und deren Proteine im allgemeinen bei einer Temperatur denaturiert werden, die das erwünschte thermophile Enzym nicht denaturiert. Typische geeignete mesophile Wirtszellen werden unten beschrieben. Heterolog, wie es oben verwendet wurde, bedeutet, daß das Enzym von Natur aus nicht von der Wirtszelle hergestellt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die mesophilen Wirtszellen nach dem Kultivieren lysiert, um ein Lysat herzustellen, welches das thermostabile Enzym und unerwünschte verunreinigende Proteine umfaßt. Bevorzugterweise denaturiert und fällt der Erhitzungsschritt die unerwünschten Verunreinigungsstoffe im wesentlichen vollständig , so daß die Verunreinigungsstoffe aus der flüssigen Phase, die das erwünschte thermostabile Enzym enthält, leicht entfernt werden. Besonders bevorzugte Enzyme sind DNA-Ligasen.
Bevorzugte Enzyme sind solche aus thermophilen Bakterien (die genauer weiter unten beschrieben werden), die einen Erhitzungsschritt von 65ºC bis ca. 100ºC (am bevorzugtesten 80ºC-95ºC) für eine ausreichende Zeitdauer (z.B. mindestens ca. 1-3 Minuten und bevorzugt mindestens 5 Minuten lang) überleben, damit die Proteine der mesophilen Wirtszelle inaktiviert werden.
Unsere beschriebenen Techniken überwinden mit der Klonierung zusammenhängende Schwierigkeiten, auf die bei der Gewinnung thermostabiler Ligasen gestoßen wurde, wie die Schwierigkeit, bei der Durchmusterung von Transformanten einfach auf Ligaseaktivität zu untersuchen, und die Schwierigkeit, hohe Spiegel der Ligaseexpression in den Transformanten zu erhalten.
Ein zweiter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt weist insbesonders ein Verfahren auf zur Untersuchung auf NAD-abhängige Nucleinsäure-Ligaseaktivität (besonders thermostabile Ligaseaktivität) durch Bildung eines stabilen kovalenten Adenyl- (z.B. aus markiertem NAD) Adduktes mit der Ligase und Nachweis des Adduktes. In einer Probe, die unerwünschte Verunreinigungsstoffe umfaßt, kann vorhandene Ligaseaktivität durch Erhitzen der Probe unter Bedingungen nachgewiesen werden, die die Verunreinigungsstoffe denaturieren. Dieses ist besonders dort nützlich, wo alle Verunreinigungsstoffe, die ebenfalls Adenyl-Addukte bilden würden, denaturiert sind.
Dieses Test-Verfahren kann zur Durchmusterung von Wirtszellen verwendet werden, die mit einer Genbank aus Nucleinsäuresegmenten transformiert wurden, wodurch Zellen identifiziert werden, die Ligaseaktivität exprimieren.
Ein dritter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt weist im allgemeinen ein isoliertes Nucleinsäure- Gen auf, z.B. Nucleinsäure, die ein Protein mit einer Nucleinsäure-(DNA)-Ligaseaktivität codiert, das ein thermostabiles Ligase-Enzym codiert, wobei das Gen dadurch gekennzeichnet ist, daß es für ein Protein mit der im wesentlichen gleichen thermostabilen Ligierungsaktivität codiert wie das Protein, das durch das Gen codiert wird, das auf dem annähernd 2,6 kb großen Bst XI-Bgl II- Fragment gefunden wird, das in pGL628 gefunden wird, wobei die Nucleinsäure Teil eines konstruierten Klonierungsvehikels ist, in dem dieses Gen von Natur aus nicht vorkommt.
Ein vierter erfindungsgemäßer Gesichtspunkt weist eine im wesentlichen reine DNA-Sequenz auf, die ein thermostabiles Nucleinsäure-Ligaseenzym codiert, wobei die Sequenz dadurch gekennzeichnet ist, daß sie für ein Protein mit der im wesentlichen gleichen thermostabilen Ligierungsaktivität codiert wie das Protein, das durch das Gen codiert wird, das auf dem annähernd 2,6 kb großen Bst XI-Bgl II-Fragment gefunden wird, das in pGL628 gefunden wird.
Bei den dritten und vierten Gesichtspunkten ist das klonierte Gen bevorzugterweise Teil eines Expressionsvehikels (ein Plasmid oder ein anderes transformierbares DNA-Segment), das einen Promotor umfaßt, der eine verstärkte Expression (z.B. mindestens doppelt so hoch wie der Genproduktspiegel in unmanipulierten Zellen) des Gens bewirkt.
Andere Eigenschaften und Vorteile werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Bestandteile des Plasmids pGL628, das ein sich von einer Bst XI-Stelle bis zu einer ca. 2,6 kb entfernten Bgl II-Stelle erstreckendes DNA- Fragment aus Thermus thermophilus enthält.
Der Fachmann erkennt, daß es zahlreiche Wege gibt, die verschiedenen Verfahrens-Schritte für eine große Anzahl von Enzymen anzuwenden. Im allgemeinen sind die Techniken der Manipulation rekombinannter DNA, der Expression und der Zell-Kultivierung wohlbekannte, auf dem Fachgebiet verstandene Techniken. Die bei dem Verfahren verwendeten mesophilen Wirtszellen können durch verschiedene E. coli-Stämme vertretene Prokaryoten sein. Es können aber auch andere Mikroorganismenstämme wie Bazillen, zum Beispiel Bacillus subtilis, verschiedene Pseudomonas- Arten oder andere Bakterienstämme verwendet werden. In diesen prokaryotischen Systemen werden Plasmid-Vektoren verwendet, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, die aus dem Wirt oder aus einer mit dem Wirt kompatiblen Art stammen. Zusätzlich zu Bakterien können auch eukaryotische Mikroorganismen, wie Hefe, als Wirte verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, der Bäcker-Hefe, werden am häufigsten verwendet, obwohl eine Anzahl anderer Stämme allgemein erhältlich ist.
Es ist natürlich ebenfalls möglich, Gene, die die thermophilen Enzyme codieren, in eukaryotischen Wirts-Zellkulturen zu exprimieren, die von vielzelligen Organismen abstammen. Siehe beispielsweise Tissue Culture, Academic Press, Cruz and Patterson, Herausgeber (1973). Nützliche Wirts-Zellinien schließen Maus-Myelome N51, VERO, MD Hunde-Nierenzellen, HeLa- Zellen und Ovarienzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) ein. Expressions-Vektoren für diese Zellen schließen gewöhnlich Promotoren und Kontrollsequenzen ein, die mit Säugetierzellen kompatibel sind, wie zum Beispiel die allgemein verwendeten, früh und spät wirkenden Promotoren aus Simian-Virus 40 (SV40) (Fiers et al., Nature (1978) 273:113) oder andere virale Promotoren, wie die, die aus Polyoma, aus Adenovirus 2, aus Rinder-Papillomvirus oder aus Vogel-Sarkom-Viren stammen oder Immunglobulin-Promotoren und Hitzeschock Promotoren. Ein System zur DNA Expression in Säugetier Systemen, bei denen der BPV als Vektor verwendet wird, ist im US Patent 4419446 offenbart. Eine Abwandlung dieses Systems wird in US Patent 460178 beschrieben. Allgemeine Gesichtspunkte der Transformationen in Säugetier-Wirtszell- Systemen wurden von Axel, US Patent Nr. 4399216, beschrieben. Replikationsursprünge konnen, talls benötigt, aus viralen Quellen gewonnen werden. Die Integration in das Chromosom ist jedoch ein üblicher Mechanismus fur die DNA-Replikation in Eukaryoten.
Pflanzenzellen sind mittlerweile auch als Wirte erhältlich, außerdem sind Kontrollsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssignal-Sequenzen (Depicker, A. et al., J. Mol. Appl. Gen. (1982) 1:561) erhältlich.
Vor kurzem wurden außerdem Expressionssysteme beschrieben, bei denen Insektenzellen eingesetzt werden, die die von Baculovirus-Vektoren gelieferten Kontrollsysteme verwenden (Miller, D.W. et al., in Genetic Engineering (1986), Setlow, J.K. et al., Hrsg., Plenum Publishing, Band 8, S. 277-297).
Bei der Konstruktion geeigneter Vektoren, die die erwünschten Codierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, werden Standard-Ligierungs- und -Restriktions-Techniken eingesetzt, auf die man sich im Fachgebiet gut versteht. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonukleotide werden gespalten, getrimmt und in der erwünschten Form religiert.
Stellenspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit dem geeigneten Restriktions- Enzym (oder -Enzymen) unter Bedingungen bewerkstelligt, auf die man sich allgemein im Fachgebiet versteht und deren Einzelheiten vom Hersteller dieser kommerziell erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben werden. Siehe z.B. im Produkt-Katalog von New England Biolabs.
Die Klonierung von Genen, die thermostabile Nucleinsäurestoffwechsel-Enzyme codieren, z.B. DNA-Ligase aus T. Thermophilus, wird merklich von der Entwicklung eines wirkungsvollen Verfahrens begleitet, mit dem man die Aktivität solcher Enzyme nachweisen kann. Insbesondere kann der Nachweis dort, wo die Spiegel der exprimierten Enzyme nur geringfügig über dem Klonierungshintergrund liegen, so schwierig sein, daß herkömmliche Strategien, die auf der Identifizierung von Klonen basieren, die das erwünschte Gen exprimieren (z.B. Komplementation defizienter Mutanten oder immunologische Identifizierung erwünschter Transformanten), wahrscheinlich nicht ohne solch ein verbessertes Durchmusterungsverfahren erfolgreich sind.
Das Problem wird durch nicht vorhandene Charakterisierung des erwünschten Proteins vergrößert, was die auf Sequenzdaten beruhende Klonierungsstrategie behindert. Insbesondere ist die Ligase aus T. thermophilus aufgrund geringer Enzym-Ausbeuten und Verunreinigungen (besonders proteolytische Verunreinigungen) nicht sequenziert worden.
Folglich ist Beispiel 1, das ein Nachweisveifahren fur das Nucleinsäurestoffwechsel-Enzym (besonders thermostabile DNA Ligase) betrifft, ein wichtiger Gesichtspunkt unserer Klonierungsstrategie. Es werden andere Beispiele geliefert, die Klonierung und Expression betreffen. Diese Beispiele werden gegeben, um die Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht, um sie einzuschränken.

Beispiel 1 - Nachweis des thermophilen Enzyms

Die folgenden Beobachtungen schaffen ein Verfahren zum Nachweis eines thermophilen Enzyms, das mit NAD markiert werden kann, z.B. Ligase aus Thermus thermophilus, in einem Gemisch aus Wirtsproteinen.
NAD wird am häufigsten als Vermittler bei Oxidations-/Reduktions-Reaktionen verwendet und sehr wenige Enzyme nutzen NAD als Quelle gespeicherter chemischer Energie. Prokaryotische DNA-Ligasen sind eine solche Enzymklasse. Die meisten anderen energieverbrauchenden enzymatischen Prozesse, die bestimmte DNA-Ligasen einschließen, nutzen ATP als Energiequelle. Sehr wenige prokaryotische Enzyme überleben und bleiben bei Temperaturen uber 70ºC aktiv. Abgesehen von idiosynkratischen Beispielen, ist die Mehrheit dieser Enzyme in thermophilen Organismen vorhanden.
Es ist bekannt, daß einige Nucleinsäurestoffwechsel-Enzyme (z.B. DNA-Ligase) eine kovalent verknüpfte Enzym-Adenylat-Spezies als Zwischenprodukt in der von ihnen katalysierten Reaktionssequenz bilden. Wir haben herausgefunden, daß thermostabile DNA-Ligase aus dem thermophilen Thermus thermophilus bei Temperaturen zwischen 70ºC und 80ºC ein stabiles kovalentes Adenyl-Addukt bilden kann und daß das Addukt spezifisch mit ³²P markiert werden kann, wenn das als Cofaktor verwendete NAD mit ³²P (erhältlich bei New England Nuclear) markiert ist. Das Enzym besitzt einen extrem niedrigen KM-Wert für NAD, so daß sich die oben genannte Reaktion für die Markierung des Produktes der klonierten Ligase als zufriedenstellend erweisr, selbst wenn extrem geringe Mengen thermophiler Ligase vor der Konstruktion zur gesteigerten Expression in E. coli exprimiert werden.
Im allgemeinen können mesophile Wirtsproteine entweder überhaupt nicht mit NAD markiert werden, oder ihre Fähigkeit, markiert zu werden, ist durch die vorangegangene Behandlung bei 70ºC oder höher im wesentlichen beseitigt.
Im Überblick, werden Extrakte, die im Verdacht stehen, thermophile Ligase zu enthalten, bei 70ºC oder höher inkubiert; ³²P-NAD wird hinzugegeben; die Proben werden weiter inkubiert; die Proben werden denaturiert und mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt; von dem Gel wird ein Autoradiogramm angefertigt; und die Anwesenheit oder Abwesenheit von DNA- Ligase in einer Probe wird ermittelt durch die Anwesenheit oder Abwesenheit einer markierten Spezies, die mit der authentischen Ligase komigriert.
Spezifischer werden Zellen angezogen und Zellextrakte wie folgt untersucht.
Die Zellen einer Platte, die ≤ 70 Kolonien enthält, die mit einer Genbank klonierter DNA- Segmente aus T. thermophilus transformiert wurden, werden in 3,0 ml L-Brühe geschabt. Diese Suspension wurde verwendet, um 100 ml L-Brühe in einem 2-Liter-Kolben anzuimpfen. Die Zellen wurden bei 37ºC bis zum Erreichen der Sättigung angezogen ( 3-4 Std). Die Zellen eines 20 ml- Aliquots der Kultur wurden mittels Zentrifugation geerntet und das Zellsediment wurde bei -20ºC aufbewahrt.
Die oben beschriebenen Zellsedimente wurden in 10 ml Disruptionspuffer (20mM TRIS, 0,1mM EDTA und 1mM β-Mercaptoethanol, pH 7,6) suspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall-Behandlung zertrümmert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (20 Min. bei 20000 Upm, 4ºC, SS-34-Rotor) entfernt. Der sich ergebende Überstand wurde in einem Wasserbad bei 80ºC 30 Minuten lang inkubiert. Die gefällten Proteine wurden anschließend durch Zentrifugation (20 Min., 7000 Upm bei 4ºC, SS-34-Rotor) entfernt. Der sich ergebende Überstand wurde in einem Amicon Centriprep (10000 MWCO) untergebracht und auf 0,5 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde in einen Amicon Centricon (10000 MWCO) übergeführt und der Konzentrationsprozess wurde bis zum Erreichen eines Volumens von 50 ul fortgesetzt. Die konzentrierten Proben wurden anschließend in Mikrofugen-Röhrchen aus Kunststoff plaziert und in einem Wasserbad bei 80ºC 20 Minuten lang inkubiert. Der Niederschlag wurde erneut durch Zentrifugation (4 Min. in der Mikrofuge) entfernt und der Überstand in ein weiteres Mikrofugen-Röhrchen aus Kunststoff übergeführt. Das Röhrchen wurde erneut in dem Wasserbad bei 80ºC plaziert. Nachdem die Probe die Temperatur erreicht hatte, wurde 1,0 ul verdünntes ³²P-NAD hinzugegeben und das Röhrchen wurde 2 Stunden lang bei 80ºC inkubiert (NEN ³²P- NAD-Stammlösung wurde mit 0,2M TRIS, pH 7,6 1:2 verdünnt). Anschließend wurden 25 ul eines SDS-Gel-Probenpuffers nach Laemmli zu dem Röhrchen gegeben und die Inkubation bei 80ºC wurde weitere 20 Minuten lang fortgesetzt. Die Probe wurde dann auf einem 10% SDS-Gel nach Laemmli elektrophoretisch aufgetrennt. Die Elektrophorese wurde beendet, als sich der Markierungsfarbstoff dem unteren Teil des Gels näherte und der untere Teil des Gels, der den größten Teil der ³²P-Markierung (NAD) enthielt, wurde abgeschnitten. Das Gel wurde in H&sub2;O 30 Minuten lang eingeweicht und anschließend auf einem Geltrockner getrocknet. Danach wurde von dem getrockneten Gel ein Autoradiogramm angefertigt. Das Autoradiogramm wurde auf die Anwesenheit einer mit der authentischen Ligase während der Elektrophorese komigrierenden Spezies untersucht.

Beispiel 2 - Untersuchung der DNA-Ligase

Ligase kann semiquantitativ mittels eines Einschnittverschluß-Verfahrens untersucht werden. Plasmid-DNA (pUC19) wird durch Behandlung mit Endonuklease BamHI in der Anwesenheit von Ethidiumbromid eingeschnitten (pUC18 und viele andere Plasmide könnten ebenfalls verwendet werden). Ligase wird untersucht durch Behandlung einer festen Menge eingeschnittenen Plasmids mit Verdünnungen von Proben, die Ligase enthalten, gefolgt von Agarose-Gelelektrophorese in der Anwesenheit von Ethidiumbromid. Die Umwandlung von eingeschnittener Form in die CCC-Form der DNA wird beurteilt und mit der Verdünnung korreliert. Der Test ist besonders nützlich zur Bestimmung thermophiler Ligaseaktivität, wenn die Umsetzung bei einer Temperatur zwischen 50ºC und 75ºC durchgeführt wird.
Der spezifische DNA-Ligase-Test wird in folgendem Puffer durchgeführt: 50mM Tris, 10mM MgCl&sub2;, 50mm KCl, 2mM MnCl&sub2;, 1mM DTT, 10ug/ml BSA und 0,1 mM NAD. Die Ligierung wird in einem Gemisch aus 2ul DNA-Ligase enthaltender Probe, 1ul DNA (1ug/ml eingeschnittene DNA) und 7ul des oben genannten Puffers durchgeführt. Das Gemisch wird bei 68ºC 30 Min. lang inkubiert und die Ligierung wird unter Verwendung von 6ul 50 mM EDTA/0,5% SDS und 0,05% BPB beendet.
Um Ligase nachzuweisen, werden 5ul des 16ul-Gemisches auf einem Gel aus 0,8% Agarose mit 1,0ul/ml Ethidiumbromid, TBE Laufpuffer, elektrophoretisch aufgetrennt. Eine positive Kontrolle, bei der DNA-Ligase aus E. coli verwendet wird, wird durchgeführt.

Beispiel 3 - Klonierung thermophiler Ligase

T. thermophilus-Zellen (ATCC 27634) wurden angezogen und DNA wurde aus schwach lysierten Zellen mittels Gleichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugation in CsCl hergestellt. DNA wuide mit Sau3AI partiell gespalten und in die BcII-Stelle des Positiv-Selektions-Vektors pTR264 kloniert, einer Variante von pTR262 (Roberts et al., Gene 12:123 (1980)), der ein Ampicillin- Resistenzgen enthält. Tetracyclinresistente Klone (d.h. diejenigen mit Insertionen) wurden isoliert. Es wurden 70 Kolonien vereinigt und Lysate dieser vereinigten Kolonien wurden auf die Anwesenheit thermophiler Ligase mit Hilfe des Verfahrens des Beispiels 1 untersucht. Ein positiver Klonpool wurde identifiziert und in Unterpools zu 7 Kolonien geteilt. Durch Wiederholen des Verfahrens und Aufteilen der Unterpools in Einzelkolonien wurde ein thermophiler Ligase enthaltender Klon identifiziert. Dieser trug ein Plasmid, das pGL600 genannt wurde.
Die Identität der Spezies mit NAD-Markierung stellte sich durch Untersuchung wie in Beispiel 2 beschrieben als DNA-Ligase heraus.

Beispiel 4 - Lokalisierung des DNA-Ligase-Gens

pGL600 enthielt ca. 8kb inserierte DNA. Durch Subklonierung lokalisierten wir das Gen in einer Region von ca. 4kb (die zur Spezifizierung des Gens erforderliche Codierungskapazität wurde auf ungefähr 2,2kb geschätzt). Da die Subklonierung in pUC18 und pUC19 durchgeführt wurde, wurden identische Subklone mit entgegengesetzter Orientierung hinsichtlich eines externen lac- Promotors erhalten. Quantifizierung der von solchen Klonpaaren hergestellten Ligasespiegel wies stark auf die Orientierung des Ligasegens hin.
Deletion eines durch BglII begrenzten Fragmentes in der Nähe eines Endes führte zur Eliminierung der Ligasebildung und deutete darauf hin, daß der Genanfang innerhalb dieses Fragmentes lag.
Das durch BGlII erzeugte Fragment wurde sequenziert und ein putativer Startpunkt für das Ligase-Gen wurde durch Sequenzanalyse identifiziert.

Beisniel 5 - Expression der thermophilen Ligase in E. coli

Obwohl thermophile Ligase nachweisbar in E. coli exprimiert wurde, wiesen uns die niedrigen und unterschiedlichen Spiegel darauf hin, daß erhebliche Verbesserungen erhalten werden könnten. Die Sequenzanalyse zeigte drei nützliche Tatsachen.
1. Das putative Start-Codon wird durch die Restriktionsendonuklease BstXI gespalten (siehe Fig. 1); zusätzliche Analyse zeigte, daß diese Stelle innerhalb der sich über das Gen erstreckenden DNA einmalig vorkam:
2. dem Gen fehlte eine optimale Ribosomen-Bindungsstelle fur die Expression in E. coli; und
3. dem Gen fehlte offenbar ein angegliederter Promotor, der einer Promotor-Konsensussequenz bei E. coli entsprach.
Ein Verständnis fur diese Beobachtungen vermittelte das folgende Verfahren:
Ein DNA-Fragment, das beinahe das gesamte Gen umfaßte, wurde ausgehend von der BstXI- Stelle einerseits bis zu einer BglII-Stelle hinter dem distalen Ende des Gens hergestellt. Synthetische DNA wurde hergestellt, die die hergestellte DNA mit einem starken Promotor verknupfen konnte, diese synthetische DNA stellte das Initiations-Codon wieder her und lieferte eine gute Ribosomen-Bindungsstelle (siehe Fig. 1).
Verschiedene dieser Konstruktionen wurden hergestellt, mit denen die Natur des Promotors und der Ribosomen-Bindungsstelle verändert wurde. Beispielsweise wurde der lac-Promotor aus dem Plasmid pUC verwendet, der λ PL-Promotor wurde verwendet und der Gen II-Promotor aus M13 wurde verwendet. Die DNA-Ligaseherstellung wurde mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Zellysaten und mit Hilfe des Untersuchungsverfahrens des Beispieles 2 überwacht.
Eine geeignete sich aus dem oben genannten Verfahren ergebende Konstruktion ist ein als pGL628 bezeichnetes Plasmid. Seine Bestandteile sind in Fig. 1 gezeigt.
Die Konstruktion von pGL628 wurde in Zellen ausgeführt, die cI-Repressor zur Expressionskontrolle des PL-Promotors auf dem Plasmid lieferten.
Die am 1. September 1987 von Keith C. Backman und Barbara Bolten eingereichte US- Patentanmeldung mit der Anmeldenummer 091837 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung solcher Stämme. Einer dieser Stämme ist KB649.
Plasmid pGL628 enthält das -2,6 kb große DNA-Fragment von BstXI bis BglII für die DNA- Ligase aus Thermus thermophilus. Dieses Plasmid im E. coli-Stamm KB649 wurde in der American Type Culture Collection, Rockville, MD unter der ATCC-Zugangs-Nr. 67858 hinterlegt.

Beispiel 6 - Herstellung der Ligase

In einem Fermenter wurde der Stamm KB649/pGL628 bei 30ºC in 10 Liter Minimalsalzen (z.B. M9-Medien) und 15-20g/l Glucose angezogen. Der Temperatur-Sollwert wurde auf 42ºC umgestellt, als die Zellen die mittlere Log-Phase erreichten, und die Inkubation wurde ungefähr 2 Stunden lang fortgesetzt. Die Zellen wurden geerntet und eine Zellpaste wurde gefroren aufbewahrt. Durch Untersuchung von Zellysaten, die in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt wurden, wurde bestimmt, daß zwischen 5% und 10% des gesamten Zellproteins thermophile Ligase darstellte.

Beispiel 7 - Ligase-Reinigung aus pGL628

Zellsedimente (339) wurden in Disruptionspuffer zu 4ml/g resuspendiert. Der Disruptionspuffer war von folgender Beschaffenheit: 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl&sub2;, 50mM KCl, 2mM MnCl&sub2;, 1mM DTT und 10 mM NH&sub4;CL, pH7.7.
Die Zertrümmerung wurde in einer French-Pressure-Zelle bei 14000 PSI (9,65 x 10&sup7; N/m²) bewerkstelligt. Die Suspension wurde anschließend bei 20K Upm 20 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und einem H&sub2;O-Bad bei 80ºC 30 Minuten lang inkubiert. Diese Suspension wurde dann bei 7,5K Upm 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde dann auf 2% Streptomycinsulfat unter Verwendung einer 10%igen Stammlosung eingestellt. Diese 2 %ige Losung wurde auf Eis 20 Minuten lang gerührt, anschließend 20 Minuten lang bei 12,5K Upm zentrifugiert.
Dieser Überstand wurde auf eine mit 20mm Tris, 50mm KCl, pH7,6 äquilibrierte Cibacron- Blue-Säule (136ml Bettvolumen) aufgetragen. Die Säule wurde mit einem Gradienten von 50 bis 500 mm KCl mit einem dreifachen Säulenvolumen eluiert. Fraktionen wurden in einem 5ml- Volumen bei einer Geschwindigkeit von 2,0 ml/min gesammelt.
Aktive Fraktionen wurden vereinigt und einem Amicon-Rührzellkonzentrator, anschließend einem Amicon-Centriprep-Konzentrator ausgesetzt, bis das Volumen 1-5% der darauf folgenden Gelfiltrationssäule betrug. Die Probe wurde speziell auf eine mit 10mM KPO&sub4;, 100mM KCl, 1mM MgCl&sub2;, pH7,6 äquilibrierte Fractogel-50S-Säule (Bettvolumen 100 ml) geladen, 5ml-Fraktionen wurden bei einer Geschwindigkeit von 0,5ml/min gesammelt.
Aktive Fraktionen wurden vereinigt, in einem Amicon-Centriprep konzentriert, auf 20% Glycerin eingestellt und bei -20ºC aufbewahrt.
Andere Ausführungsformen sind möglich.
Es können beispielsweise andere thermostabile Enzyme wie Polymerasen hergestellt werden.

Claims

1. Ein Verfahren zur Erlangung eines von unerwünschten Verunreinigungsstoffen im wesentlichen freien thermostabilen Ligase-Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß es die Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen einer mesophilen Wirtszelle, die konstruiert wurde, um ein Gen zu exprimieren, das ein heterologes thermostabiles Ligase-Enzym codiert, wobei das Gen dadurch gekennzeichnet ist, daß es für ein Protein mit der im wesentlichen gleichen thermostabilen Ligierungsaktivität codiert wie das Protein, das durch das Gen codiert wird, das auf dem ca. 2,6 kb großen Bst XI-Bgl II- Fragment gefunden wird, das in pGL628 (ATCC Nr. 67858) gefunden wird,

(b) Kultivieren der mesophilen Wirtszelle, um das thermostabile Enzym in einem Gemisch, das unerwünschte Verunreinigungsstoffe umfaßt, herzustellen: und

(c) Reinigen des thermostabilen Enzyms, wobei die Reinigung mindestens einen Schritt umfaßt, bei dem ein Gemisch, das die unerwünschten Verunreinigungsstoffe umfaßt, auf eine Temperatur erhitzt wird, die ausreicht, um die unerwünschten Verunreinigungsstoffe zu inaktivieren, die aber nicht ausreicht, um das thermostabile Enzym zu inaktivieren.

2. Ein Verfahren nach Anspruch 1, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß nach dem Kultivierungsschritt die mesophile Wirtszelle lysiert wird, um ein Lysat herzustellen, welches das thermostabile Enzym umfaßt.

3. Ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß die Reinigung das Erhitzen des unerwünschte Verunreinigungsstoffe umfassenden Gemisches umfaßt. um im wesentlichen vollständige Fällung der unerwünschten Verunreinigungsstoffe aus einer das thermostabile Enzym umfassenden flüssigen Phase zu erreichen.

4. Ein Verfahren nach Anspruch 3, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß die unerwünschten Verunreinigungsstoffe Proteine umfassen und daß der Erhitzungsschritt die Proteine denaturiert, wodurch sie ausfallen.

5. Ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß die unerwünschten Verunreinigungsstoffe Endonucleasen, Exonucleasen oder Proteasen sind.

6. Ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß das thermostabile Enzym eine DNA-Ligase ist.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 6, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß das thermostabile Enzym eine DNA-Ligase aus einem thermophilen Bakterium ist.

8. Ein Verfahren nach Anspruch 7, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß das thermostabile Enzym aus einem aus Thermus flarus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus, Thermus lacteus, Thermus rubens und Methanothermus fervidus ausgewählten, thermophilen Bakterium stammt.

9. Ein Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß die Temperatur zwischen 65ºC und ungefähr 100ºC und bevorzugt zwischen 80ºC und ungefahr 95ºC liegt.

10. Ein Verfahren zur Untersuchung auf NAD-abhängige thermostabile Nucleinsäure-Ligaseaktivität, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Bildung eines stabilen kovalenten AMP-Adduktes der Ligase und den Nachweis des Adduktes umfaßt,

11. Ein Verfahren nach Anspruch 10, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß der Adenyl-Teil des Adduktes markiert ist.

12. Ein Verfahren nach den Ansprüchen 10 oder 11, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß der Adenyl-Teil des Adduktes von NAD abgeleitet ist.

13. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 10, 11 oder 12, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß die Ligase eine thermophile Ligase ist und daß die Ligaseaktivität in einer Probe nachgewiesen wird, die unerwünschte Verunreinigungsstoffe umfaßt, und dadurch, daß das Verfahren das Erhitzen eines die Ligase und die unerwünschten Verunreinigungsstoffe umfassenden Gemisches auf eine Temperatur umfaßt, bei der die unerwünschten Verunreinigungsstoffe, nicht aber die Ligase denaturiert oder inaktiviert werden.

14. Ein Verfahren zur Klonierung von Nucleinsäure, die Nucleinsäure-Ligaseaktivität codiert, bei dem eiiie Genbank von Nucleinsäuresegmenten in Wirts-Zellen transformiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die transformierten Wirtszellen zur Identifizierung von Zellen durchmustert werden, die bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13 Ligaseaktivität exprimieren.

15. Ein isoliertes Nucleinsäure-Gen, das ein thermostabiles Ligase-Enzym codiert, wobei das Gen dadurch gekennzeichnet ist, daß es für ein Protein codiert mit der im wesentlichen gleichen thermostabilen Ligierungsaktivität wie das Protein, das durch das Gen codiert wird, das auf dem ca. 2,6 kb großen Bst XI-Bgl II-Fragment gefunden wird, das in pGL628 (ATCC Nr. 67858) gefunden wird.

16. Ein Gen nach Anspruch 15, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß das Gen Teil eines Expressionsvehikels ist, der einen Promotor umfaßt, der eine erhöhte Expression des besagten Gens bewirkt.

17. Ein Gen nach Anspruch 16, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß das Expressionsvehikel durch die Restriktionskarte der Figur 1 veranschaulicht wird.

18. Ein Gen nach Anspruch 16, das dadurch weiter gekennzeichnet wird, daß das Expressionsvehikel dasjenige ist, das unter der ATCC-Zugangs-Nr.: 67858 in E. coli hinterlegt ist.

19. Ein Gen nach einem der Ansprüche 15 bis 18, das dadurch weiter gekennzeichnet ist, daß die Ligase eine NAD-abhängige Ligase ist.

20. Eine im wesentlichen reine Nucleinsäuresequenz, die ein thermostabiles Nucleinsäure-Ligaseenzym codiert, wobei die Sequenz dadurch gekennzeichnet ist, daß sie für ein Protein codiert mit der im wesentlichen gleichen thermostabilen Ligierungsaktivitat wie das Protein, das durch das Gen codiert wird, das auf dem ca. 2,6 kb großen Bst XI-Bgl II-Fragment gefunden wird, das in pGL628 (ATCC Nr. 67858) gefunden wird.