KR20060113769A - 락토페록시다제의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

(1) 이온교환기로서 약산성기를 갖는 양이온 교환체에 유원료를 접촉시켜서 흡착 처리하는 공정, (2) 상기 흡착 처리 후의 양이온 교환체를 세정 처리하는 공정, (3) 상기 세정 처리 후의 양이온 교환체에 용출 용매를 접촉시켜, 이 용출 용매 중에 락토페록시다제가 용출된 용출액을 얻는 공정, (4) 상기 용출액을 한외여과막으로 농축함으로써 이 농축된 용출액 중에 침전을 생성시키는 공정, 및 (5) 상기 농축된 용출액으로부터 침전을 제거하여 락도페록시다제 용액을 얻는 공정을 갖는 락토페록시다제의 제조 방법.

이온교환기, 양이온 교환체, 락토페록시다제, 용출액

Description

락토페록시다제의 제조 방법{Process for producing lactoperoxidase}

본 발명은 유원료(milk material)로부터 고순도의 락토페록시다제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 출원은 2004년 2월 17일에 출원된 특원2004-039704호에 대하여 우선권을 주장하고 그 내용을 여기에 원용한다.

락토페록시다제는 우유등의 포유류의 유즙을 비롯해 타액, 누액, 기도점액 등의 분비액에 함유되는 산화환원효소이다(예를 들어, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 미국, 제166권, 2002년, p. S57~S61). 락토페록시다제는 분자량이 약 8만의 단백질이다. 락토페록시다제는 조효소로서 1 분자당 한 개의 헴을 함유하고 있다. 이 헴의 극대 흡수 파장은 412nm에 존재하기 때문에 고도로 정제된 락토페록시다제는 갈색을 띠고 있다(예를 들어, British Journal of Nutrition, 영국, 제84권, 2000년, p. S19~S25).

락토페록시다제에는 항균성, 항바이러스 활성, 항산화 활성, 항암 작용, 면역조절 작용 등의 다양한 생물기능이 보고되고 있고(예를 들어, British Journal of Nutrition, 영국, 제84권, 2000년 p. S19∼S25, 및 Life Sciences, 영국, 제43권, 1988년, p. 739~745), 생체방어에 관여하는 단백질로서 매우 중요하다는 것이 밝혀져 있다. 이러한 락토페록시다제의 산업상의 이용에 관해서, 이미 헬리코박터 피로리 감염의 치료용 의약을 제조하기 위한 락토페록시다제, 퍼옥사이드 공여자(donor) 및 티오시아네이트의 사용(예를 들어, 특허출원공표 2000-509367호 공보), 양식 수생동물의 배합 사료에 첨가되는 병원균 감염 예방 및 치료제(예를 들어, 특허 제3103615호 공보), 노화방지제(예를 들어, 특허 제3103167호 공보), 간기능 개선제(예를 들어, 특허공개 2001-226289호 공보), 페록시다제의 예방 및 치료에의 응용(예를 들어, 특허출원공표 평6-501453호 공보), 각막장해 치료제(예를 들어, 특허 제2840795호 공보)등에 관한 기술이 개시되어 있다. 또한, 본 출원인에 의해 우레아제 불활성화 조성물 및 음식품(예를 들어, 특허공개 2002-238554호 공보) 및 장내 플로라 개선제 및 음식품(예를 들어, 특허공개 2003-246753호 공보)에 관한 기술이 개시되어 있다.

실험실 규모에서의 락토페록시다제의 정제법에 관해서는, Acta Chemica Scandinavica, 덴마크, 제23권, 1969년, p.171~184, FEBS Letters, 네델란드, 제110권, 1980년, p.200~204, Journal of Chromatography, 네델란드, 제795권, 1998년, p. 277~287에서 보고되어 있다.

그 전형적인 방법으로서는, 염산 등의 산을 우유에 첨가하여 카세인을 등전점 침전시켜 상층액인 유장(whey)을 조제한다. 얻어진 유장을 양이온 교환체에 접촉시키고 유장 중에서 양(正)으로 대전되어 있는 락토페록시다제를 양이온 교환체에 흡착시킨다. 다음에 양이온 교환체를 염농도가 낮은 완충액으로 세정한 후, 염농도가 높은 완충액으로 락토페록시다제를 탈리시키는 방법이 알려져 있다.

실험실 규모에서의 정제법에서는, 락토페록시다제의 순도를 높이기 위해서 입자 직경이 작은 겔상의 양이온 교환체를 고밀도로 충전한 칼럼을 사용하고, 고압 펌프로 고속 통액(passing through)을 수행하는 방법이 일반적이다(예를 들어, Journal of Chromato graphy, 네델란드, 제795권, 1998년, p. 277~287).

이에 대하여 칼럼에 입자 직경이 비교적 큰 양이온 교환체를 충전하고, 자연낙하로 통액할 경우에는 더욱 시간을 필요로 한다(예를 들어, Acta Chemica Scandinavica, 덴마크, 제23권, 1969년, p. 171~184 및 FEBS Letters, 네델란드, 제110권, 1980년, p. 200~204).

최근 공업적 규모의 분리 기술의 진보에 따라, 우유에 함유되는 생리활성물질을 고순도로 분리·정제하고 대량으로 제조할 수 있게 되었다. 대부분의 경우, 실험실 규모에서 최적화된 단백질의 정제법을 그대로 공업적 규모로 스케일업하는 것은 현실적으로는 곤란하다. 그 요인으로, 실험실에서 범용 되는 이온교환체나 칼럼의 특성이 반드시 원료의 대량처리에 적합하다고는 할 수 없는 점을 들 수 있다.

또한 유원료에의 첨가물의 첨가는, 젖의 풍미 및 물성을 변화시키므로 유원료로부터의 단백질의 정제에는 적합하지 않다. 또한, 양이온 교환체의 세정 및 양이온 교환체로부터의 단백질의 탈리의 목적으로 대량의 첨가물을 사용했을 경우, 정제된 단백질로부터 그들 첨가물을 제거할 필요가 생기기 때문에 제조법이 복잡해진다.

원료로부터의 고순도의 단백질의 제조에 있어서, 이들의 문제점을 해결한 제조법으로서 고순도 소 락토페린의 제조법(예를 들어, 특허공고 평6-13560호 공보)이 당 출원인에 의해 이미 제안되었다.

락토페록시다제의 공업적인 제조 방법에 관해서는 이하의 것이 개시되어 있다.

미국특허 제4667018호의 명세서에서는, 우유 및 그 파생물로부터 락토페린이나 락토페록시다제 등의 단백질을 정제하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법에서는, 양이온성의 다당류로 이루어지는 양이온 교환체에 우유 및 그 파생물을 접촉시키고, 양이온 교환체를 저농도의 염류용액으로 세정한 후 고농도의 염류용액으로 양이온 교환체로부터 단백질을 탈리하는 방법이 공개되어 있다. 그러나, 이 특허문헌에 기재된 방법으로 제조되는 단백질은 혼합물로 얻어지기 때문에 순도가 높지 않으며 순도 높은 락토페록시다제를 제조할 수 없다는 문제점을 갖고 있었다.

특허 제2985158호 공보에서는, 활성이 높은 락테닌 분획의 회수 방법이 개시되어 있다. 이 특허문헌에 기재된 방법에 있어서도 락토페록시다제는 락테닌을 구성하는 일 성분으로서 단백질의 혼합물에 포함된 상태로 얻어지기 때문에 고순도의 락토페록시다제를 제조할 수 없다는 문제점을 갖고 있었다.

유럽특허 제0518448호 명세서에서는, 유 중의 단백질을 단리하는 방법으로서 금속 킬레이트 담체를 사용한 방법이 개시되어 있다. 이 방법에서도 단리되는 단백질이 면역글로블린, 락토페린 및 락토페록시다제로 구성되는 혼합물이기 때문에 고순도의 락토페록시다제의 제조는 불가능하다는 문제점을 갖고 있었다.

특허 제3403066호 공보에서는, 우유 혹은 우유 유도물로부터 세포증식인자 혹은 1종 또는 2종 이상의 세포증식인자를 포함하는 조성물을 회수하는 방법이 개시되어 있는데, 이 방법에서 얻어지는 조성물은 혼합물이기 때문에 고순도의 락토 페록시다제 제조법이 아니라고 하는 문제점을 갖고 있었다.

특허 제2710283호 공보에서는, 유청으로부터의 금속 단백질의 선택적 추출법으로서, 카르복실기 또는 술폰산기를 구비한 덱스트란으로 피복된 무기의 다공성입자(실리카 입자)에 유청을 접촉시키는 공정을 갖는 방법이 개시되어 있다. 이 방법으로 제조된 락토페록시다제의 순도는 높아야 50% 정도이며, 고순도의 락토페록시다제를 제조하기 위해서는 별도의 공정에 의해 정제도를 높일 필요가 있다고 하는 문제점을 갖고 있었다.

특허 제2553180호 공보에서는, 유청으로부터의 락토페록시다제 및 락토페린의 순수한 분획 추출법이 개시되어 있다. 이 방법에서는, 양이온 교환체의 용적변화에 의해 일어나는 막힘(clogging) 문제를 해결하는 수단으로서 마이크로 여과로 처리한 유청이 원료로서 사용되고 있다. 이 방법에는, 유청 이외의 유원료를 사용할 수 없기 때문에 적응 범위가 좁다고 하는 문제점을 갖고 있었다. 또한, 유원료의 사전처리로서 마이크로 여과도 필요하게 되고 제조공정이 복잡하다. 또한 양이온 교환체에는 강양이온 교환체가 사용되고 있고 락토페록시다제 및 락토페린은 각각 염농도가 다른 완충액에 의해 선택적으로 양이온 교환체로부터 탈리된다. 이 방법에서는, 양이온 교환체의 세정과 단백질의 선택적 탈리를 가능하게 하기 위해 사용하는 완충액의 pH를 조정할 필요가 있고, 이러한 완충액을 조제하기 위해서는 다량의 첨가물을 필요로 한다. 또한 정제된 단백질로부터 첨가물을 제거할 필요가 있으며 더욱 공정을 복잡화시키는 요인이 되는 여러가지 문제점을 갖고 있었다.

특허 제2686831호 공보에서는, 강양이온성의 술폰기를 유입한 다당류 친화성 담체를 양이온 교환체로서 사용한 철결합성 단백질의 분리 정제법이 개시되어 있다. 이 방법에서는, 비교적 고순도(순도 85%)의 락토페록시다제가 제조된다. 그러나, 흡착 처리 후의 양이온 교환체의 세정 공정에 있어서, pH5 이하로 조정된 완충액에 의한 세정 처리가 필수적이다. 또한 락토페록시다제 및 락토페린의 선택적 탈리에는 각각 염농도가 다른 pH5 이하의 완충액이 필요하였다.

특허공개 평5-202098호 공보에서는, 유원료로부터의 생리활성물질의 제조법으로서 술폰기를 가지는 강양이온 교환체와 카르복실기를 가지는 약양이온 교환체를 모두 사용할 수 있는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 이 방법에 있어서도 역시 흡착 처리 후의 양이온 교환체의 세정과 락토페록시다제의 선택적 탈리를 가능하게 하기 위해서 pH5 이하의 완충액이 필요하다고 하는 문제점을 갖고 있었다.

미국특허 제5596082호 공보에서는, 우유 및 유제품으로부터의 락토페린 및 락토페록시다제의 정제법이 개시되어 있다. 이 특허에서는, 우유 및 유제품을 고유속으로 통액할 수 있도록 하기 위해서 양이온 교환체로서 입자 직경이 크고 물리적으로 안정성이 높은 겔이 사용되고 있다. 이 방법에 있어서도, 흡착 처리 후의 양이온 교환체의 세정과 락토페록시다제의 선택적 탈리를 위해서는 완충액의 사용에 의한 pH의 조정이 필요하다고 하는 문제점을 갖고 있었다. 또, 이 특허에서 제조되는 락토페록시다제는 그 순도에 관한 설명이 없는 점에서 고순도 락토페록시다제의 제조 가능여부가 불분명하다.

상술한 바와 같이, 종래의 락토페록시다제의 제조 방법의 대부분에 있어서는, 유원료로부터 회수된 락토페록시다제는 다른 단백질과의 혼합물로서 얻어지며 그 순도는 충분히 높다고 할 수 없었다. 또한 락토페록시다제의 순도를 높이기 위해서는 별도의 정제 공정이 필요하며 그를 위한 시간과 제조 비용이 필요하였다.

또한 락토페록시다제의 순도가 비교적 높아지는 제조 방법이라 해도 유원료에 포함되는 락토페록시다제의 선택적 흡착, 양이온 교환체의 세정, 단백질의 선택적 탈리 등을 수행하기 위해서 각 공정에서 pH를 조정할 필요가 있으며, 이에 의해 다량의 첨가물의 사용이 필요하다고 하는 문제점도 포함되어 있었다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 이온교환법과 한외여과막법을 사용한 처리 공정을 수행함으로써 제조공정 전체를 통하여 pH를 조정하지 않아도 유원료로부터 직접 고순도의 락토페록시다제를 공업적으로 제조할 수 있는 방법을 찾아내고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명의 락토페록시다제의 제조 방법은, (1) 이온교환기로서 약산성기를 갖는 양이온 교환체에 유원료를 접촉시켜서 흡착 처리하는 공정, (2) 상기 흡착 처리 후의 양이온 교환체를 세정 처리하는 공정, (3) 상기 세정 처리된 양이온 교환체에 락토페록시다제를 용출시키는 용출 용매를 접촉시켜, 상기 용출 용매 중에 락토페록시다제가 용출된 용출액을 얻는 공정, (4) 상기 용출액을 한외여과막으로 농축함으로써 농축된 용출액 중에 침전을 생성시키는 공정, 및 (5) 상기 농축된 용출액으로부터 침전을 제거하여 락토페록시다제 용액을 얻는 공정을 갖는 락토페록시다제의 제조 방법이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 형태에 대해서 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 바람직한 실시 형태에 한정되지 않고 본 발명의 범위 내에서 자유롭게 변경할 수 있다.

본 발명은 종래 기술 등의 문제나 사정을 감안하여 이루어진 것이다. 본 발명은 첨가물의 사용에 의한 유원료의 조성 및 품질의 변화를 방지하면서 종래보다 간단한 공정으로 보다 단시간에 보다 저비용으로 순도 높은 락토페록시다제를 제조할 수 있고, 또한 공업적 규모에서의 제조에도 적용할 수 있는 락토페록시다제의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 바람직한 조건이나 얻을 수 있는 효과를 이하에 기재한다.

본 발명에 있어서, 미가열의 탈지유 1kg 속에 상기 양이온 교환체 10ml를 투입했을 때의 락토페린 흡착능은 85mg/10ml 이상인 것이 바람직하다.

상기 이온교환기는 카르복시메틸기인 것이 바람직하다.

상기 (4) 공정에 있어서, 용출액 중의 단백질 함량은 0.9∼15%가 되도록 농축하여 침전을 생성시키는 것이 바람직하다.

상기 (3) 공정에서 사용하는 용출 용매의 이온 강도는 0.07∼0.3인 것이 바람직하다.

상기 (3) 공정에서 사용하는 용출 용매는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 염화마그네슘으로 이루어진 염류군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는 수용액인 것이 바람직하다.

또한, 상기 (5) 공정에서 얻어진 락토페록시다제 용액의 용매를 제거함으로써 고체상의 락토페록시다제를 얻는 공정을 갖는 것이 바람직하다.

상기 공정에서 얻어지는 고체상의 락토페록시다제의 순도는 80%이상인 것이 바람직하다.

본 발명에서는, 양이온 교환체에 흡착된 락토페록시다제를 용출 용매 중에 용출시킬 때는 락토페록시다제를 다른 분획(불순물)과 혼합된 상태에서 얻고, 이 후에 한외여과막을 이용하여 농축할 때 용해도의 차이에 따라 다른 분획(불순물)을 선택적으로 분리·제거한다. 이렇게 함으로써 고순도의 락토페록시다제를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명에 의하면, 이하와 같은 효과를 얻을 수 있다.

(1) pH 조정을 필요로 하는 공정을 거치지 않고 락토페록시다제를 선택적으로 회수할 수 있다.

(2) 간단한 공정에 의해, 보다 단시간에 보다 저비용으로 고순도의 락토페록시다제를 제조할 수 있다.

(3) 완충액이나 다량의 첨가물을 필요로 하지 않으므로 저비용화의 면에서 유리하다.

(4) 첨가물의 사용에 의한 유원료의 조성 및 품질의 변화를 방지할 수 있다.

(5) 공업적 스케일에 용이하게 적용할 수 있다.

(6) 양이온 교환체에 접촉시키는 원료로서 유청 이외의 유원료도 넓게 적용할 수 있다.

다음에 본 발명의 바람직한 실시 형태에 대해서 더욱 상세하게 설명한다.

본 명세서에 있어서의 단백질 함량에 대해서는, 시료 중의 질소함량을 켈달법으로 측정하고, 질소/단백질 환산계수 6.38을 이용하여 환산한 백분율로서 표시하였다.

또한 락토페록시다제의 순도에 대해서는 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분석하고, 시료 중의 단백질에 유래하는 전체 피크 면적에 대한 락토페록시다제의 피크 면적의 백분율로서 표시하였다.

본 명세서에 있어서, 상기 단백질 함량 및 순도 이외의 백분율은 특별히 기재하지 않는 한 질량에 의한 표시이다.

본 발명에서 사용할 수 있는 유원료로서는 적어도 락토페록시다제가 함유되어 있다면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간, 소, 물소, 양, 염소, 말 등의 포유류에서 유래된 우유, 탈지유, 유청 등을 사용할 수 있다. 그중에서도 열처리 조건이 까다롭지 않은 것이나 미가열된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 또한 탈지분유, 전지분유, 유청분, 유청 단백질 농축물(WPC), 유청 단백질 분리물(WPI) 등을 물 또는 완충액에 용해시킨 용액도 사용할 수 있다. 또한, 등전점 침전에 의해 카세인을 제거하거나, 응유효소에 의해 카세인을 배제한 상층액, 또는 치즈 제조시에 배출되는 치즈 유청도 사용할 수 있다. 이것들의 유원료는 미리 정화, 마이크로 여과, 여과 등의 조작에 의해 침전물을 제거하지 않아도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 특히, 유원료로서 소에서 유래된 유원료를 이용하여 소 락토페록시다제를 제조하는 것이 바람직하다.

또 상기 유원료는 단독으로 사용할 수도 있고 두 가지 종류 이상을 조합시켜서 사용할 수도 있다.

본 발명의 제조 방법에 대해서 이하에 설명한다.

(1) 우선, 유원료를 양이온 교환체에 접촉시켜서 흡착 처리를 수행한다. 양이온 교환체로서는 이온교환기로서 약산성기를 갖는 것을 사용할 수 있다. 약산성의 이온교환기로는 이온교환기로서의 목적하는 기능을 갖는 교환기를 임으로 선택할 수 있다. 약산성의 이온교환기의 예로는 카르복실기, 카르복시메틸기, 페놀기 등을 들 수 있다. 바람직하게는 카르복시메틸기이다.

양이온 교환체는 특별히 한정되지 않으며 필요에 따라 임으로 선택할 수 있다. 바람직한 양이온 교환체의 예로서는, 가교형의 다당류(아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 등), 친수성 실리카겔, 합성 폴리머 등으로 이루어진 다공성 입자에 약산성 이온교환기를 도입한 것 등을 들 수 있다. 구체예로서는, SEPABEADS FP-CM13(미츠비시화성사 제품, 교환기: 카르복시메틸기), CM-Sephadex C-50(아머샴사 제품, 교환기: 카르복시메틸기), CM-Sepharose-FF(아머샴사 제품, 교환기: 카르복시메틸기)를 적합하게 사용할 수 있다.

양이온 교환체 수지의 모양, 사이즈, 표면상태, 재질 등은 필요에 따라 임의로 선택할 수 있다. 사용 형태의 예로서는, 이온교환체 수지가 이미 충전된 미리 패킹된 칼럼이나 양이온 교환체의 수지 비드를 칼럼 등의 매체에 충전한 것 등을 들 수 있다. 이들의 경우, 한 종류의 양이온 교환체를 하나의 매체와 조합시켜서 사용하는 것이 간편성의 면에서 바람직하다. 그러나, 필요에 따라서 복수의 매체 각각에 수지 비드를 채운 것을 직렬 또는 병렬로 접속해서 크로마토그래피를 수행해도 된다. 매체의 형상은 필요에 따라서 선택할 수 있는데 세정이 용이하고 포함되는 수지 비드 등에 많은 접촉면을 주는 형상인 것이 바람직하며, 또한 내벽은 요철이 없는 평평한 표면인 것이 바람직하다. 구체적으로는 원통형(원기둥 모양, 막대 형상)이나 원추형 등, 원형면을 갖는 형상이 매체의 형상으로서 바람직하게 사용할 수 있다. 매체의 재질은 임으로 선택할 수 있지만, 바람직하게는 스테인레스, 글래스, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리카보네이트, 아크릴수지 등을 사용할 수 있다. 매체의 사이즈는 처리 스케일에 따라 적절히 선택할 수 있으며 예를 들어, 수 입방센티미터에서 수 입방미터의 규모까지 임의로 선택할 수 있다. 본 발명에 바람직하게 사용할 수 있는 시판 미리 패킹된 칼럼으로서는, HIREP 10/16CM FF(아머샴사 제품, 교환기: 카르복시메틸기), CM-TOYOPEARLPAK650 시리즈(토소사 제품, 교환기: 카르복시메틸기) 등을 들 수 있다.

여기에서, 락토페록시다제의 회수율을 높이기 위해서는 이보다 후의 공정에서 흡착 처리 후의 양이온 교환체에 용출 용매를 접촉시켰을 때에 양이온 교환체에 흡착된 단백질이 용이하게 탈리되어서 상기 용출 용매 중으로 용출되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 유원료 중의 단백질이 양이온 교환체와 너무 강하게 결합되지 않는 편이 바람직하다. 이온교환기로서 강산성기를 갖는 양이온 교환체는 넓은 pH 범위에서 이온교환기가 해리되고 있다. 이에 대하여 이온교환기로서 약산성기를 갖는 양이온 교환체는 pH에 의존해서 전하가 변화된다. 이 때문에, 단백질의 결합능도 변화되는 특성을 가지므로 본 발명의 제조 방법에 있어서 바람직하다. 또 본 발명에 있어서 이온교환기의 산 해리상수가 3 미만의 것을 강산성기, 3 이상의 것을 약산성기로서 정의할 수 있고, 강산성기로서는 술폰산기, 약산성기로서는 카르복시메틸기를 각각 예시할 수 있다.

또한 본 발명에서 사용할 수 있는 양이온 교환체의 다공성, 또는 흡착성의 스케일은 임으로 선택할 수 있으며, 또한 락토페록시다제와 거의 같은 등전점과 분자량을 갖는 단백질, 구체적으로는 분자량 7∼9만 달톤, 등전점 7∼9인 단백질에 대한 흡착능을 지표로서 나타낼 수 있고, 그 중에서도 락토페린(분자량: 약 8만. 등전점: 약 8)에 대한 흡착능을 지표로서 나타내는 것이 바람직하다. 또, 양이온 교환체의 락토페린에 대한 흡착능은 예를 들어, 특허공고 평6-13560호에 기재된 방법으로 구할 수 있다.

즉, 나트륨형의 양이온 교환체를 물로 팽윤시켜서 10ml로 한 것을 미가열의 탈지유 1kg(pH 6.7) 속에 투입하고, 이들의 혼합액을 4℃에서 16시간 교반한 후 양이온 교환체를 분취해서 물로 세정한다. 물로 세정한 양이온 교환체를 농도 10%의 식염수 150ml에 접촉시켜 양이온 교환체로부터 식염수로 락토페린을 용출시킨다. 이 용출에 의해 얻어진 회수액 중의 락토페린 함량을 로리법〔Analytical Biochemistry, 미국, 제15권, 1966년, p.45~52〕에 의해 측정함으로써 흡착능(단위: mg/10ml)을 산출한다.

상기 방법으로 측정되는 락토페린 흡착능이 더 높은 양이온 교환체를 선택함으로써 본 발명의 방법에 의한 락토페록시다제의 회수량을 높일 수 있다. 즉 상기 방법에 따라 미가열 탈지유 1kg 속에 양이온 교환체 10ml를 투입했을 때의 락토페린 흡착능이 70mg 이상인 양이온 교환체가 바람직하며, 85mg 이상인 양이온 교환체가 더 바람직하며, 90mg 이상인 양이온 교환체가 더욱 바람직하다. 이 흡착능의 값은 높은 것이 더욱 바람직하며 일반적으로 우유 1kg 중의 락토페린 함량은 약 100mg 정도이며 그 전량을 흡착할 수 있는 양이온 교환체가 이상적이다. 구체적으로, 상기에서 예로 든 SEPABEADS FP-CML3의 락토페린 흡착능은 85mg/10ml, CM-Sephadex C-50의 락토페린 흡착능은 91mg/10ml이며 모두 높은 락토페린 흡착능을 나타내는 양이온 교환체이다.

유원료와 양이온 교환체와의 흡착 처리(접촉)는 임으로 선택할 수 있다. 흡착 처리는 예를 들어, 배취(batch)식 교반법, 칼럼 연속법 등의 방법으로 행할 수 있다. 유원료와 양이온 교환체를 충분히 접촉시킬 수 있는 것이면 어떠한 처리라도 실시가능하다. 하나의 처리로 수행할 수도 있으며 복수의 흡착 처리를 조합시켜 수행할 수도 있다.

배취식의 경우, 일정량의 유원료로부터 많은 수량(Yield)을 바랄 경우에는 많은 양이온 교환체를 사용하고, 일정량의 양이온 교환체에서 많은 수량을 바랄 경우에는 많은 유원료를 사용하는 것이 적당하다. 배취식에서의 유원료와 양이온 교환체의 혼합 체적비율은 양이온 교환체의 흡착능이나 구체적인 흡착 처리 방법에 따라 임의로 조정할 수 있다.

여기에서, 양이온 교환체의 특성은 경질 타입과 연질 타입으로 크게 구분되는데 본 발명에서는 모든 타입이 사용가능하다.

경질 타입은 이온 강도, 또는 pH에 의해 이온교환체 자신의 체적은 거의 변화되지 않고, 또 유속의 변화 등에 의해 양이온 교환체에 걸리는 압력이 변화되어도 양이온 교환체 자체의 체적은 거의 바뀌지 않는다. 따라서, 경질 타입은 양이온 교환체를 칼럼 내에 유지하여 고유속으로 통액하는 칼럼 연속법에 더 적합하다.

한편, 연질 타입의 양이온 교환체는 이온 강도, 또는 pH에 의해 이온교환체 자신의 체적이 크게 변화되고, 또 유속의 변화 등에 의해 양이온 교환체에 걸리는 압력이 변화되면 양이온 교환체 자체의 체적이 쉽게 변화된다. 그 때문에 연질 타입의 양이온 교환체를 칼럼 내에 유지하여 고유속으로 통액하는 것은 쉽지 않다. 특히 탈지유나 유청 등을 통액할 때는 다른 염류 용액 등을 통액할 때에 비해서 양이온 교환체층 내에서 큰 압력손실이 생긴다. 따라서, 연질 타입의 양이온 교환체는 배취법에만 적합하다.

상기 SEPABEADS FP-CML3(미츠비시화성사 제품)은 경질 타입이며 CM-Sephadex C-50(아머샴사 제품)은 연질 타입이다.

유원료와 양이온 교환체를 흡착 처리시키는 온도는, 0℃ 미만에서는 유원료의 동결 또는 점도 상승 등이 생길 수 있고, 60℃를 넘는 경우에는 락토페록시다제가 변성될 가능성이 있기 때문에 0∼60℃의 범위에서 수행되는 것이 바람직하다. 또, 25∼60℃라 해도 흡착에 장시간을 요할 경우 등에서는 락토페록시다제가 조금씩 변성될 가능성이 있는 점에서 특히 0∼25℃에서 수행되는 것이 바람직하다. 또한 미살균의 유원료를 사용하는 경우에는 세균의 번식을 막기 위해서 0∼10℃에서 실시하는 것이 바람직하다.

유원료와 양이온 교환체의 흡착 처리 시간(접촉 시간)에 대해서는 흡착 처리시의 온도, 채용하는 흡착 처리방식(배취식 또는 칼럼 연속법) 등을 감안해서 적정 조건을 선택할 수 있다. 예를 들어, 배취식의 경우에는 유원료와 양이온 교환체의 흡착 처리 시간은 1분 이상 24시간 이하가 바람직하고, 10분 이상 6시간 이하가 더 바람직하다. 또한 칼럼 연속법의 경우에는 선유속 10cm/h 이상 1000cm/h 이하인 것이 바람직하다.

(2) 다음에 흡착 처리 후의 양이온 교환체를 세정 처리한다. 이때의 세정액으로서는 이온 강도가 0.07 미만으로 낮은 염류수 용액 또는 중성 혹은 약산성 영역의 완충액을 사용하는 것도 가능하지만, 제조비용을 고려하면 물에서 세정하는 것이 바람직하다.

흡착 처리 후의 양이온 교환체에 대해서는 사용된 유원료를 어떤 방법으로 세정 제거해도 좋다. 예를 들면 유원료와 양이온 교환체가 들어간 용기로부터 양이온 교환체만을 이동해서 다른 장소에서 세정할 수도 있고, 상기 용기로부터 유원료를 이동시키고 그 후에 양이온 교환체를 용기 중에서 세정할 수도 있다.

(3) 이어서, 세정 처리를 끝낸 양이온 교환체에 용출 용매를 접촉시킨다. 이에 따라 양이온 교환체로부터 상기 용출 용매 중으로 락토페록시다제를 용출시켜서 용출액을 얻는다.

이 공정에서 사용하는 용출 용매는, 이온 강도가 0.07 이상 0.3 이하의 범위의 것이 바람직하며, 0.10 이상 0.25 이하의 범위의 것이 더 바람직하며, 0.15 이상 0.22 이하의 범위의 것이 더욱 바람직하다. 이온 강도가 상기 범위에 있는 용출 용매를 사용함으로써 양이온 교환체로부터 락토페록시다제를 효율적으로 용출시킬 수 있다.

상기 용출 용매로서는, 이온 강도를 상기 범위로 조정한 중성 또는 약산성 영역의 완충액을 사용할 수도 있다. 그러나, 제조 비용면에서 염류만을 용해한 수용액(염류용액)을 사용하는 것이 더 바람직하다. 본 출원에서 사용할 수 있는 염류는 필요에 따라서 1종 혹은 2종 이상의 조합을 임으로 선택할 수 있다.

바람직한 염류용액은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 염화마그네슘 등으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종, 또는 2종 이상의 혼합물로 이루어지는 염류의 수용액이다.

(4) 다음에, 얻어진 용출액에 대하여 한외여과막을 사용한 막분리법에 의해 막처리를 수행한다. 이에 의해 용출액을 농축하고 상기 용출액 중에 침전을 생성시킨다.

한외여과막의 운전 방법은 물 및 분획분자량 이하의 분자량을 갖는 성분을 투과시켜서 제거하는 통상의 한외여과법과, 막을 투과한 투과액과 등량의 물을 막위의 유지액에 첨가하면서 연속 운전하는 유수여과법(다이아필터레이션)의 두가지로 구분되지만 본 발명에 있어서는 모든 방법을 사용할 수 있다. 특히, 후자의 유수여과법은 농축과 동시에 탈염 처리를 할 수 있는 동시에 유지액으로부터의 저분자량 성분을 고도로 제거할 수 있는 점에서 더 바람직하다.

또, 전자의 일반적인 한외여과법을 사용했을 경우에는 한외여과 후에 투석 또는 겔 여과 등의 방법으로 탈염 처리를 수행하는 것이 바람직하다.

한외여과막은 일반적으로 시판되고 있는 한외여과막이면 모두 사용할 수 있다. 구체예로서는, IRIS3038막 및 IRIS3072막(모두 롱플랑사 제품),혹은 GR-61pp막(DDS사 제품) 등을 들 수 있다.

한외여과막의 재질은 유기재료제 또는 무기재료제를 전부 사용가능하며 비용면, 범용성 등을 고려하여 선택하면 좋다.

한외여과 처리시의 용출액의 온도는 사용하는 막의 내열온도 이하이면(예를 들어, GR-61pp막이라면 80℃ 이하) 실시가능하다. 단 60℃ 이상에서는 락토페록시다제가 열변성될 가능성이 있고, 또 10∼60℃의 범위에서는 미생물의 번식이 두드러지므로 0∼10℃의 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.

한외여과시의 압력은 사용하는 막의 내압한계 이하이면(예를 들어, GR-61pp막이라면 0.6MPa 이하) 모든 압력에서 가능하다. 또 내압한계치 부근에서의 사용은 막의 수명을 단축시킬 가능성이 있기 때문에 내압한계의 2/3 이하(예를 들어, GR-61pp막이라면 0.4MPa 이하)에서 실시하는 것이 바람직하다.

사용하는 한외여과막 모듈은 관형, 중공사형, 평막형, 나선형 등 모든 형식이 가능하다. 단, 중공사형 내압식 등의 모듈에서는 중공사 내에 침전물이 생성되었을 경우에 유로폐쇄를 일으킬 가능성이 있으므로 압력 등을 고려하여 행하는 것이 바람직하다.

앞의 (3) 공정에서 얻어지는 용출액은 갈색의 청징한 용액인 것이 바람직하다. 그리고, 이 용출액에 대하여 한외여과막에 의한 농축을 행하면 단백질의 용해성의 차이로부터 한외여과막상의 유지액 중에서 락토페록시다제 이외의 단백질이 침전을 형성한다. 여기에서, 락토페록시다제 이외의 단백질 즉, 불순물로서의 단백질을 효율적으로 침전시키기 위해서는 농축 후의 용출액 중의 단백질 함량이 0.9% 이상이 되도록 농축하는 것이 바람직하다. 용출액 중의 단백질 함량이 15%를 넘으면 용출액의 점성이 상승하고, 한외여과막 처리의 효율이 떨어질 우려가 있으므로 농축 후의 용출액의 단백질 함량은 0.9∼15%의 범위 내인 것이 더 바람직하고 1.5∼12%인 것이 더욱 바람직하고, 3∼10%인 것이 가장 바람직하다.

침전을 생성시킬 때까지의 각 공정의 조건 등을 조절함으로써 침전 중에 혼입하는 락토페록시다제의 양을 저감시킬 수 있고 락토페록시다제를 전혀 포함하지 않는 침전을 생성시키는 것도 가능하다.

(5) 다음에 침전이 생성된 용출액(유지액)으로부터 침전을 제거한다. 이에 따라 용출액으로부터 불순물로서의 단백질을 제거하고, 고순도의 락토페록시다제를 함유하는 용액(락도페록시다제 용액)을 얻는다.

침전의 제거 방법은 임으로 선택할 수 있다. 침전이 생성된 용출액(유지액)을 정치시켜 침전물을 회수하는 방법이어도 좋고, 혹은 원심분리 또는 정밀여과(마이크로 여과) 등에 의한 청징화 처리를 행함으로써 침전물이 제거된 청징화(clarified) 처리액(락도페록시다제 용액)을 회수하는 방법이어도 좋다.

이 공정에서 얻어진 락도페록시다제 용액은 필요에 따라서 살균 처리를 행하는 것이 바람직하다. 그 때, 락토페록시다제의 열 안정성을 높이는 관점에서 염화칼슘 등의 칼슘 이온을 20mM 정도의 농도가 되도록 첨가하고, 72℃에서, 15∼90초 정도의 시간 동안 가열살균함으로써 살균 처리하는 것이 바람직하다.

(6) 이 후, 얻어진 락도페록시다제 용액의 용매를 제거함으로써 고체상의 락토페록시다제를 얻을 수 있다.

용매를 제거하는 방법은 특별히 한정되지 않고 필요에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들어, 한외여과막을 이용하여 더 농축한 후에 통상의 방법에 의해 동결건조하여 수분을 제거하는 방법을 적합하게 사용할 수 있다. 이에 따라 고순도의 락토페록시다제 분말을 제조할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 고체상의 락토페록시다제는 순도 80% 이상의 고순도를 달성할 수 있다.

덧붙여 용매를 제거하는 (5) 공정은 필수가 아니며 고순도 락토페록시다제로서 (5) 공정에서 얻어진 락도페록시다제 용액을 용액의 상태로 사용할 수도 있다.

다음에 시험예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 각 실시예에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 출원에 있어서는 이들 실시예의 구성요소 및 실시예에 포함되지 않는 구성요소를 적절히 조합할 수도 있다. 또한 특별히 기재하지 않는 한 상기 단백질 함량 및 순도 이외에 있어서 %는 질량%를 나타낸다.

[시험예 1]

본 시험에서는 공정 (1)∼(3)에 이어 약산성 양이온 교환체로부터 회수한 용출액을 한외여과막으로 농축하고 침전을 생성시키는 (4) 공정에 있어서, 농축액 중에서 침전을 생성하는 데 바람직한 조건을 검토하기 위해서 실시하였다.

(1) 시료

약산성 양이온 교환체로서 카르복시메틸기를 갖고 락토페린 흡착능이 91mg/10ml인 CM-Sephadex C-50(아머샴사 제품)을 사용하였다.

상기 약산성 양이온 교환체 170ml를 충전한 칼럼에 탈지유 20리터를 첨가함으로써 교환체에 단백질을 흡착시켰다. 이어서, 칼럼 내의 약산성 양이온 교환체를 물로 세정한 후 칼럼 내에 용출 용매로서 1.6% 식염수(이온 강도 0.27) 200ml를 첨가함으로써 약산성 양이온 교환체에 흡착된 단백질을 상기 식염수중에 용출시켰다. 회수한 약 200ml의 용출액을 시험 시료로 하였다. 얻어진 시험 시료 중의 단백질 함량을 켈달법에 의해 측정한 바 0.26%이었다.

(2) 시험 방법

3종의 원심분리식 한외여과 필터 유니트(분획분자량: 1만 달톤, 3만 달톤, 및 5만 달톤. 모두 밀리포아사 제품)를 준비하였다.

각각의 필터 유니트에 시험 시료 0.5ml를 첨가하고 매분 6,000 회전으로 원심분리하여 한외여과하고 침전 생성의 유무를 관찰하였다. 이때, 원심분리 시간을 조절함으로써 필터 유니트 내의 유지액의 체적을 단계적으로 변화시켰다.

(3) 시험 결과

본 시험 결과, 분획분자량이 다른 3종의 필터 유니트 모두에 있어서 필터 유니트 내의 유지액의 체적이 0.15ml로 농축된 경우에 필터 위에 백색의 침전이 관찰되었다. 유지액의 체적이 0.15ml 이하의 경우에도 침전의 생성이 관찰되었지만 0.15ml 이상에서는 침전의 생성은 전혀 관찰되지 않았다.

또한 유지액의 체적이 0.15ml로 농축되었을 때의 상기 유지액 중의 전단백질 함량은 0.9%이었다.

이것으로부터, 농축 후의 유지액의 전단백질 함량이 0.9%이상이 되도록 농축하면 유지액 중에 침전이 생성되는 것을 알았다.

[시험예 2]

본 시험은 한외여과막을 사용한 농축에 의해 생성된 침전의 용해성에 미치는 탈염처리의 영향을 검토하기 위하여 실시하였다.

(1) 시료

본 시험의 시료는 시험예 1과 동일한 시험 시료(1.6% 식염수에 단백질을 용출시킨 용출액, 단백질 함량: 0.26%)를 사용하였다.

(2) 시험 방법

분획분자량 3만 달톤의 한외여과막을 장착한 교반식 셀 유니트(밀리포아사 제품)를 3개 준비하고 각각의 셀 유니트에 시험 시료 50ml를 첨가했다. 질소 가스를 이용하여 셀 유니트 안이 약 0.3MPa가 되도록 가압하고 셀 유니트 내의 상기 유지액이 10ml가 될 때까지 농축하였다.

첫 번째 셀은 유지액이 10ml가 되었을 때 셀 유니트 내의 유지액 전량을 원심 튜브에 옮기고 매분 10,000 회전으로 원심분리함으로써 고액분리하고, 침전(침전 시료 1)을 회수하였다.

두 번째 셀은 유지액이 10ml가 되었을 때 셀 유니트 내의 유지액 전량을 원심 튜브에 옮기고 매분 10,000 회전으로 원심분리함으로써 고액분리하고 침전을 회수하였다. 이 침전에 10ml의 정제수를 첨가하고 볼텍스 믹서로 1분간 교반하였다. 이렇게 해서 얻어진 침전 현탁액을 원심 튜브에 옮기고 매분 10,000 회전으로 더 원심분리함으로써 고액분리하고, 침전(침전 시료 2)을 회수하였다.

세 번째의 셀은 유지액이 10ml가 될 때까지 농축된 셀 유니트 내에 정제수 40ml를 첨가하고 전회와 같이 가압하면서 다시 유지액이 10ml가 될 때까지 농축하였다. 유지액이 10ml가 되었을 때 이 셀 유니트 중의 유지액 전량을 원심 튜브에 옮기고 매분 10,000 회전으로 원심분리함으로써 고액분리하고, 침전(침전 시료 3)을 회수하였다.

침전 시료 1∼3의 건조 중량을 통상의 방법에 의해 측정하였다.

(3) 시험 결과

본 시험의 결과, 모든 셀에서 셀 유니트 내의 유지액이 10ml가 된 상태에서 유지액 중에 침전이 형성되었다.

또한 침전 시료 1, 침전 시료 2, 및 침전 시료 3의 질량에 거의 차이는 없었다. 따라서, 농축 공정에 의해 일단 생성된 침전에 정제수를 첨가하더라도 침전은 재용해되지 않는 것이 확인되었다.

또한 용출액 중에서 일단 생성된 침전은 탈염 처리에 의해 염농도가 변화되더라도 그 영향을 받지 않고 침전은 재용해되지 않는 것이 확인되었다.

다음에 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

약산성 양이온 교환체로서 카르복시메틸기를 가지며 락토페린 흡착능이 91mg/10ml인 CM-Sephadex C-50(아머샴사 제품)을 준비하였다.

이 양이온 교환체 17 리터를 내경 50cm의 칼럼에 충전하고, 상기 칼럼에 1.5% 식염수 40리터를 통액한 후 물로 세정하여 칼럼 내의 양이온 교환체를 나트륨형으로 조제하였다.

유원료로서 소에서 유래된 탈지유(pH 6.7, 후술하는 시료 1)를 준비하였다. 이 탈지유 2000 리터를 온도 4℃, 유속 60 리터/h의 조건에서 상기 칼럼에 통액해서 흡착 처리하였다.

흡착 처리 후의 칼럼에 물을 통액하여 양이온 교환체에 비특이적으로 흡착한 유성분을 세정 처리했다.

이어서, 용출 용매로서 1.6% 식염수(이온 강도 0.27) 20 리터를 30 리터/h의 유속으로 통액하고 양이온 교환체에 흡착한 단백질를 용출 처리했다. 이에 의해 소 락토페록시다제를 포함하는 용출액(후술하는 시료 2) 21 리터를 회수하였다.

다음에 용출액 21 리터를 분획분자량 2만의 한외여과막(DDS사 제품) 유니트를 이용하여 평균 압력 0.3MPa로 한외여과하고 유지액량이 2 리터가 될때까지 농축하였다.

이 후, 물을 첨가하면서 더 한외여과함으로써 유지액을 탈염 처리하고 최종적으로 2리터의 유지액을 회수하였다. 유지액 중에는 백색의 침전이 생성되어 있었다.

이어서, 백색의 침전을 포함하는 유지액을 고정시켜 청징화하고 상청 분획(후술하는 시료 3) 1.95 리터를 소 락토페록시다제 용액으로서 회수하였다.

회수한 상청 분획(소 락토페록시다제 용액)에 대하여, 미세공 사이즈(pore size) 1.4㎛의 정밀여과막을 사용한 마이크로 여과를 수행하여 더 미량의 침전물을 제거하고 소 락토페록시다제를 포함하는 정제 제제를 제조했다.

또한, 얻어진 정제 제제를 동결건조하고 소 락토페록시다제를 포함하는 분말상의 동결건조 제제(후술하는 시료 4) 26g을 제조하였다.

제조공정 중에 얻어진 상기 시료 1∼4, 즉 탈지유(유원료): 시료 1, 양이온 교환체로부터의 용출액: 시료 2, 한외여과막 처리 후의 유지액의 상청 분획: 시료 3, 동결건조 제제: 시료 4에 대해서, 각각 단백질 함량 및 소 락토페록시다제 활성을 측정하고 비활성(比活性)을 구하였다. 여기에서, 단백질 함량은 켈달법에 의해 측정하고 소 락토페록시다제 활성은 Putter 등의 방법 〔Bergmeyer편, Methods of Enzymatic Analysis 제3판, 제3권, 1983년, p.286~293〕으로 측정하고 단백질 1mg당 페록시다제 활성(비활성)을 구하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

시료	단백질 함량(%)	비활성(unit/mg)
시료 1	3.30	0.2
시료 2	0.26	132.5
시료 3	1.64	220.3
시료 4	92.30	224.4

표 1에 나타나 있는 바와 같이 시료 1의 단백질 함량은 3.30%이며 비활성은 0.20 unit/mg이었다. 또한 시료 2의 단백질 함량은 0.26%, 비활성은 132.5 unit/mg이었다. 이들의 결과로부터, 탈지유(유원료) 중의 단백질 중, 소 락토페록시다제가 선택적으로 용출액 중으로 용출된 것을 알 수 있다.

또한 시료 3의 단백질 함량은 1.64%, 비활성은 220.3 unit/mg이며, 시료 4의 비활성은 224.4 unit/mg이었다.

시료 2와 시료 3, 4의 결과를 비교하면, 용출액을 한외여과막을 이용하여 농축하고 생성한 침전물을 제거함으로써 소 락토페록시다제의 비활성이 현저하게 높아지고 있다. 이것으로부터, 이러한 침전물의 제거에 의해 소 락토페록시다제 이외의 불순물로서의 단백질이 효과적으로 제거되고 소 락토페록시다제의 정제효율이 향상된 것을 알 수 있다.

또한 상기 시료 4(동결건조 제제)에 대해서, 락토페록시다제의 순도를 고속액체크로마토그래피로 분석했다.

이 분석에는, SHODEX ASAHIPAK C4P-50 칼럼, 및 측정 파장 280nm의 자외부 흡수 검출기를 장착한 HPLC장치를 사용하였다. 이동상은 유속 0.8ml/min이며, A액(트리플루오로아세트산 0.03%를 포함하는 아세트니트릴:0.5M 염화나트륨=10:90의 혼합액) 및 B액(트리플루오로아세트산 0.03%를 포함하는 아세트니트릴:0.5M 염화나트륨=50:50의 혼합액)에 대해서, 30분간 A:B=50:50→A:B=0:100의 농도변화로 하는 직선농도구배법에 의해 용출하였다. 시료는 약 20mg 칭량하고, 2.9% 염화나트륨 수용액 10ml에 용해하여 그 25㎕를 상기 분석 방법으로 시험하였다.

여기에서, 미리 표준품으로서 정제 소 락토페록시다제(시그마사 제품)를 사용하고, 상기 분석 방법으로 표준품의 피크가 용출시간 약 18분인 것을 확인하였다.

계속해서, 상기 분석 방법으로 시료 4를 분석하고 소 락토페록시다제의 순도를 피크 면적의 자동 적분법에 의해 측정하였다.

그 결과, 시료 4의 소 락토페록시다제의 순도는 89%인 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해, 유원료로부터 고순도로 락토페록시다제를 제조할 수 있음이 확인되었다.

본 발명은, 종래보다 간단한 공정으로 보다 단시간에 보다 저비용으로 순도 높은 락토페록시다제를 제조할 수 있고, 또한 공업적 규모에서의 제조에도 적용할 수 있는 락토페록시다제의 제조 방법을 제공한다.

Claims (8)

1. (1) 이온교환기로서 약산성기를 갖는 양이온 교환체에 유원료(milk material)를 접촉시켜서 흡착 처리하는 공정, (2) 상기 흡착 처리 후의 양이온 교환체를 세정 처리하는 공정, (3) 상기 세정 처리 후의 양이온 교환체에 락토페록시다제(lactoperoxidase)를 용출시키는 용출 용매를 접촉시켜, 이 용출 용매 중에 락토페록시다제가 용출된 용출액을 얻는 공정, (4) 상기 용출액을 한외여과막으로 농축함으로써 이 농축된 용출액 중에 침전을 생성시키는 공정, 및 (5) 상기 농축된 용출액으로부터 침전을 제거하여 락토페록시다제 용액을 얻는 공정을 포함하는 락토페록시다제의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 양이온 교환체에 있어서의 락토페린 흡착능이 85mg/10ml 이상인 락토페록시다제의 제조 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 이온교환기가 카르복시메틸기인 락토페록시다제의 제조 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 (4) 공정에 있어서, 상기 농축된 용출액 중의 단백질 함량이 0.9∼15% 가 되도록 농축하여 침전을 생성시키는 락토페록시다제의 제조 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 (3) 공정에서 사용하는 용출 용매의 이온 강도가 0.07∼0.3인 락토페록시다제의 제조 방법.
6. 제5항에 있어서,

   상기 (3) 공정에서 사용하는 용출 용매가 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 염화마그네슘으로 이루어진 염류 군으로부터 선택되는 적어도 일종을 포함하는 수용액인 락토페록시다제의 제조 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 (5) 공정에서 얻어지는 락도페록시다제 용액의 용매를 제거함으로써 고체상의 락토페록시다제를 얻는 공정을 갖는 락토페록시다제의 제조 방법.
8. 제7항에 있어서,

   고체상의 락토페록시다제의 순도가 80% 이상인 락토페록시다제의 제조 방법.