CN114539433A - 一种乳低聚糖的制备方法及制备的低聚糖粉、食品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乳低聚糖的制备方法及制备的乳低聚糖粉、食品，属于乳制品深加工领域，包括如下步骤：对乳清液进行至少三次超滤，将超滤透过液进行多次纳滤浓缩，将纳滤截留液进行层析色谱分离纯化，去除含乳糖的层析收集液，收集含唾液酸乳糖的层析收集液，脱盐，干燥获得低聚糖粉。本发明制备得到的乳低聚糖，及含有该乳低聚糖的食品，主要是牛乳低聚糖，色泽呈浅黄色或白色，风味较淡，颗粒均一，热稳定性好、具有可溶性。该乳低聚糖主要包括3'‑唾液酸乳糖、6'‑唾液酸乳糖。

Description

一种乳低聚糖的制备方法及制备的低聚糖粉、食品
技术领域
本发明涉及乳品深加工技术领域，尤其涉及一种乳低聚糖的制备方法及制备的低聚糖粉、食品。
背景技术
母乳是新生儿生命第一阶段的唯一营养源。几个世纪以来，母乳不断进化以滋养新生儿，并被视为足月婴儿的营养“金标准”。母乳低聚糖在母乳中含量丰富且独特，在营养方面被忽视很多年。目前，已检测出200多种成分，其中100多种结构被阐明。
母乳低聚糖具有巨大的结构多样性。在个体之间和哺乳期间，浓度和成分有很大的变化。它们以自由结构出现，或与糖蛋白、糖脂等大分子结合。母乳低聚糖结构主要有5中单体组成：葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖和N-乙酰神经氨酸，每个HMOs均以乳糖残基为核心,通过重复的乳糖胺单元延长成直链或支链结构。由此形成的线性或支链结构，再通过岩藻糖基转移酶和唾液酸转移酶的作用，进一步延伸成岩藻糖基化和唾液酸化的寡糖
最初，母乳低聚糖作为一种“双歧因子”被发现，可以作为所需细菌的代谢底物，有助于形成优势肠道菌群。如今，越来越多的证据表明，母乳低聚糖还具有抗粘附、抗菌、调节肠上皮和免疫细胞，减少过度粘膜白细胞浸润和活化，降低新生儿坏死性小肠结肠炎，并为婴幼儿提供唾液酸作为大脑发育和认知的潜在必要营养素。因此，世界卫生组织针对母乳喂养提出：“建议纯母乳喂养至少6个月。但中国发展研究基金会于2019年2月发布的《中国母乳喂养影响因素调查报告》显示，6个月内婴儿的纯母乳喂养率只有29.2％，距《中国儿童发展纲要(2011-2020年)》和《国民营养计划(2017-2030)》提出的2020年我国纯母乳喂养率达到50％的目标差距非常大，低于43％的世界平均水平和37％的中低收入国家平均水平。我国母乳喂养率低，主要是由公众对母乳喂养的认知不足、产假较短、母婴室缺乏、母乳不足、自身职业或疾病等原因造成。婴幼儿配方奶粉的诞生，为母乳喂养不足或不能母乳喂养的宝宝提供了充足的营养物质。由于母乳低聚糖无法大规模生产，低聚半乳糖和低聚果糖通常被添加到婴儿配方奶粉中，但研究发现其不存在母乳低聚糖中的岩藻糖、唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺单体。
婴幼儿配方奶粉中添加1～6个母乳低聚糖单体分子是当前的一大进步，体外、体内和临床试验证明母乳低聚糖具有安全性和免疫效果。目前，高纯母乳低聚糖单体分子(2'-岩藻基乳糖、双岩藻基乳糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖)已经通过欧盟和美国食品药品监督管理局的批准，可作为婴幼儿配方奶粉的补充剂。但是仅添加一种或几种母乳低聚糖单体模拟不了母乳中低聚糖的复杂结构。
近年来膜分离技术高速发展，已广泛应用于各行各业，由于具有节能、降耗、无相变和无污染等优点，在乳品工业中已取得了广泛的应用，如微滤除菌、脱脂乳成份分离、乳清成份分离、乳糖浓缩、反渗透去除水分等方面显示出传统方法无法比拟的优点，并且可以实现真正意义上的副产物回收利用。其中，应用膜技术对乳除菌、乳清蛋白与酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白和β-酪蛋白的乳成份分离已成为目前国内外研究的热点课题。膜分离技术是一种环保的物理分离过程，与旋转、单效或多效蒸发、冷冻干燥和喷雾干燥相比能耗较低，并且分离过程中不用添加任何有毒、有害的有机试剂。而且操作温度较低，特别适合于对热敏感的成份，不会破坏蛋白质、乳糖和低聚糖的天然结构，生产出的产品具有更好的功能特性。在乳品加工过程中具有更多的应用价值和广阔的实用前景。
牛乳清是制作奶酪时产生的副产物或通过微滤制备的天然透过液，通常当作废液排掉或通过喷雾干燥制备乳清粉以低价出售。与其他家畜乳汁相比，具有量大和成本低等特点。因此，如何利用乳清进行大规模提取牛乳低聚糖作为母乳低聚糖的替代品具有重大意义。目前，还没有从任何动物来源的乳汁中获得母乳低聚糖代替物，以满足商业化需求。
发明内容
发明目的
为克服上述不足，本发明的目的在于提供一种乳低聚糖的制备方法及制备的低聚糖粉、食品。
动物乳低聚糖，尤其是牛乳低聚糖是模仿母乳低聚糖的新配料，具有母乳低聚糖的结构和生物功能。因此，牛乳低聚糖代替低聚半乳糖和低聚果糖，应用于婴幼儿配方和特殊医学等功能性食品上，既有健康价值，也有机会在目前未充分利用的乳制品中获取更高附加。
解决方案
为实现本发明目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种乳低聚糖的制备方法，包括如下步骤：对乳清液进行至少三次超滤，将超滤透过液进行多次纳滤浓缩，将纳滤截留液进行层析色谱分离纯化，去除含乳糖的层析收集液，收集含唾液酸乳糖的层析收集液，脱盐，干燥获得低聚糖粉。
进一步地，收集含唾液酸乳糖的层析收集液的方法为：按管收集层析收集液并检测，将含有唾液酸乳糖的层析收集液合并，唾液酸乳糖的检测方法采用低聚糖检测方法。
进一步地，干燥步骤为冷冻干燥；可选地，冷冻干燥的步骤包括：将脱盐后的浓缩截留液放入冷冻干燥机干燥，可选地，冷冻干燥包括：设定真空冷冻干燥升温程序为：20℃2h,40℃1h,55℃干燥至结束；冷阱温度-50℃，真空度2.50～6.50MPa，干燥至干基水分含量低于5％。
进一步地，层析色谱分离纯化步骤中，所用的层析填料的载体为琼脂糖和葡聚糖交联复合物或交联琼脂糖；可选地，所述层析填料的载体为Superdex30 increase预装柱、或DEAE琼脂糖凝胶、或Q-琼脂糖凝胶；可选地，层析色谱分离纯化步骤包括：
将纳滤截留液上样至Superdex30 increase预装柱，流速0.5～0.8mL/min,收集0.5～2mL/管；可选地流速0.6mL/min,收集1mL/管；
或者，将纳滤截留液上样至1.5cm×20cm的DEAE琼脂糖凝胶FF色谱柱，流速1～2mL/min,收集0.5～1.5mL/管；可选地流速1.5mL/min,收集1mL/管；
或者，将纳滤截留液上样至10cm×50cm的Q-琼脂糖凝胶FF色谱柱，流速15～25mL/min,收集40～60mL/管；可选地流速20mL/min,收集50mL/管。
本发明采用的层析填料具有耐热、耐压、高分辨率、高化学稳定性、高流速、高载量、可在位清洗、可重复利用、非特异性吸附低、回收率高，适用于工业化规模生产。
进一步地，所述乳清液为制作奶酪时产生的副产物乳清液、或脱盐乳清粉复溶后的乳清液、或脱脂后的动物乳经微滤制备的透过液，可选地，所述动物乳为牛乳；可选地，脱盐乳清粉和水的质量比例为1:4～20；
可选地，所述动物乳经微乳制备的透过液的方法为：将脱脂后的动物乳进行至少三次微滤，得微滤透过液；可选地，所述脱脂后的动物乳中脂肪的质量百分含量小于或等于0.1％，优选为0.02％～0.1％；
可选地，动物乳脱脂步骤包括：原料乳杀菌后通过板式换热器冷却至45℃-55℃进行脱脂；
可选地，至少三次微滤的方法为：将脱脂后的动物乳通过微滤浓缩至浓缩倍数为2～5倍时得到第一次微滤透过液；在第一次微滤截留液中加水稀释；再次微滤浓缩至浓缩倍数为2～5倍时得到第二次微滤透过液；在第二次微滤截留液中加水稀释；再次微滤浓缩至浓缩倍数为2～5倍时得到第三次微滤透过液；依次类推；可选地，微滤次数为五次；可选地，加水稀释至与未微滤前脱脂后的动物乳质量相近；
可选地，微滤浓缩中，采用的微滤膜的孔径为50nm-140nm；可选地，微滤膜采用管式陶瓷膜；陶瓷膜具有分离效率高、效果稳定、化学稳定性好、耐酸碱、耐有机溶剂、耐菌、耐高温、抗污染、机械强度高和再生性能佳的特点，并且分离过程简单、能耗低、操作维护简便，是一种绿色环保技术。
可选地，微滤条件为：料液温度为45℃～55℃，进口压力为2～5bar，出口压力为1～4bar，背压0.5-3bar，膜压差不超过3bar。这是由于若压力过大，膜堵塞严重，浓差极化加快，影响牛乳低聚糖通透。此外，膜压差过大或过小都会导致分离效率低，耗时耗能，易被微生物污染。
本发明中，将脱脂后的动物乳多次微滤是为了去除脱脂牛乳中的酪蛋白，防止污染下一阶段的超滤膜，同时使更多的牛乳低聚糖可以分离出来。
进一步地，至少三次超滤的方法为：将微滤透过液通过超滤浓缩至浓缩倍数为2～7倍时得到第一次超滤透过液；在第一次超滤截留液中加水稀释；再次超滤浓缩至浓缩倍数为2～7倍时得到第二次超滤透过液；在第二次超滤截留液中加水稀释；再次超滤浓缩至浓缩倍数为2～7倍时得到第三次超滤透过液；依次类推；可选地，超滤次数为六次；可选地，加水稀释的水加入量与待稀释的超滤截留液质量相近。
进一步地，超滤步骤中，所用的超滤膜的截留分子量为5KDa～30Kda；可选地，超滤膜为复合管式有机膜。有机膜有效膜面积大，价格低，投资少，孔径分布均匀，并且易于操作和清洗。
进一步地，超滤条件为：料液温度为20℃～45℃，进口压力为6～9bar，出口压力为5～8bar；可选地，膜压差不超过3bar。
进一步地，多次纳滤浓缩的方法为：将超滤透过液通过纳滤浓缩至浓缩倍数为2～13倍时得到第一次纳滤截留液；在第一次纳滤截留液中加水稀释；再次超滤浓缩至浓缩倍数为2～13倍时得到第二次纳滤截留液；在第二次纳滤截留液中加水稀释；再次纳滤浓缩至浓缩倍数为2～13倍时得到第三次纳滤截留液；依次类推；可选地，纳滤次数为六次；可选地，加水稀释的水加入量与待稀释的纳滤截留液质量相近。
进一步地，纳滤步骤中，所用的纳滤膜的截留分子量为100Da～3000Da；可选地，纳滤步骤中，纳滤膜为复合管式有机膜。
进一步地，纳滤条件为：料液温度为20℃-45℃，进口压力为16～20bar，出口压力为14～18bar；可选地，膜压差不超过3bar。
进一步地，脱盐步骤采用纳滤脱盐或电渗析脱盐；
可选地，纳滤脱盐步骤包括：将层析收集液通过纳滤分离并用去离子水洗滤直至电导率不再降低，并浓缩至设备的最小循环体积得到纳滤浓缩截留液，纳滤浓缩结束；可选地，纳滤脱盐中，采用的纳滤膜的截留分子量为100Da～500Da；可选地，纳滤脱盐中，采用的纳滤膜为复合管式有机膜；可选地，纳滤脱盐中，条件设置为：料液温度为20℃-45℃，进口压力为10～15bar，出口压力为5～10bar；可选地，膜压差不超过3bar；
可选地，电渗析步骤包括：将层析收集液加入到电渗析设备中进行渗析，待电流不再发生变化时，脱盐结束，可选地，电渗析的条件设置为：调整电压：8V，物料流速50L/h，超纯水流速50L/h,极液流速45L/h。
进一步地，还包括：对纳滤透过液进行反渗透浓缩，并产生工艺内适用的去离子水；
可选地，反渗浓缩步骤具体包括：将所述纳滤透过液通过反渗透浓缩至设备的最小循环体积得到反渗透透过液，反渗透结束；
可选地，反渗透步骤中，所用膜的稳定排盐率99.5％；
可选地，反渗透条件为：料液温度为20℃-45℃，进口压力为16～20bar，出口压力为14～18bar；可选地，膜压差不超过3bar。
进一步地，所述超滤、纳滤、反渗透的步骤采用集成化的超滤-纳滤-反渗透装置。
另一方面，提供一种低聚糖糖粉，为采用所述的方法制备得到的乳低聚糖粉；可选地，所述乳低聚糖粉中包括唾液酸乳糖；可选地，唾液酸乳糖包括3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖；可选地，所述乳低聚糖粉中3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖的总质量百分含量不低于25％。
再一方面，提供一种低聚糖食品或保健品，包括所述的方法制备得到的低聚糖粉或上述的低聚糖糖粉。
低聚糖食品或保健品，包括所述的方法制备得到的低聚糖粉，可选地，所述低聚糖粉包括唾液酸乳糖，可选地，唾液酸乳糖包括3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖。
有益效果
(1)本发明采用至少三次超滤可有效去除乳清液中的乳清蛋白，避免污染下一阶段的纳滤膜，并使更多的牛乳低聚糖分离出来；采用多次纳滤浓缩可以去除水分和部分乳糖，最大程度减少非益生元成分的干扰，同时提高干物质含量；通过层析色谱分离是为了去除残留的乳糖，从而获得主要含唾液酸低聚糖的产品，脱盐是为了去除层析色谱中引入的NaCl。
(2)本发明制备得到的乳低聚糖，及含有该乳低聚糖的食品，主要是天然牛乳低聚糖，色泽呈浅黄色或白色，风味较淡，颗粒均一，热稳定性好、具有可溶性。该乳低聚糖主要包括3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖。
(3)本发明是采用微滤、超滤、纳滤、反渗透、层析色谱、冷冻干燥技术得到的牛乳低聚糖粉，与传统的生物工程技术相比，未经发酵和酶转化，保持了牛乳低聚糖的天然结构，加工品质特性优良，风味纯正，在食品工业中具有广泛的应用前景。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为本发明实施例1的微滤步骤中各阶段的牛乳低聚糖透过率的柱状图；
图2为本发明实施例1、2对脱脂牛乳的膜分离过程中的脱脂牛乳、微滤透过液、微滤截留液和渗透液、超滤透过液和超滤截留液聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图3为本发明实施例2的复原脱盐乳清粉液的超滤各阶段的牛乳低聚糖透过率柱状图；
图4为本发明实施例2的复原脱盐乳清粉液的膜分离过程中的复原脱盐乳清粉液、超滤透过液及超滤截留液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为本发明实施例3的纳滤浓缩各阶段牛乳低聚糖截留率柱状图；
图6为本发明实施例5的Superdex30 increase预装柱对纳滤截留液的分离纯化图；
图7为本发明实施例5的DEAE琼脂糖凝胶FF对纳滤截留液的分离纯化图；
图8为本发明实施例5的Q-琼脂糖凝胶FF对纳滤截留液的分离纯化图；
图9为对比例1的ANX琼脂糖凝胶色谱对纳滤截留液的分离纯化图；
图10为对比例1的CM-琼脂糖凝胶FF色谱对纳滤截留液的分离纯化图；
图11为对比例1的QXL脂糖凝胶色谱对纳滤截留液的分离纯化图；
图12为对比例1的SP琼脂糖凝胶FF色谱对纳滤截留液的分离纯化图；
图13为对比例1的SP琼脂糖凝胶XL色谱对纳滤截留液的分离纯化图；
图14为对比例2的活性炭对低聚糖的回收率和乳糖的去除率；
图15为对比例3的不同分子量透析袋对低聚糖回收率和乳糖去除率；
图16为对比例4的不同结晶方式对牛乳低聚糖回收率和乳糖去除率；
图17为本发明实施例6的脱盐过程中的纳滤脱盐率柱状图；
图18为本发明实施例6的脱盐过程中的电渗析脱盐率的柱状图；其中，电导率单位：mS/cm，电流单位：A，电压单位：V，柱体积高度单位：cm。
图19为本发明实施例7的牛乳低聚糖粉照片图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
本发明单指的乳糖与唾液酸乳糖并无交叉关系，本发明的乳糖是指1,4-半乳糖苷葡萄糖，唾液酸乳糖属于益生元低聚糖，本发明从乳清液中分离的低聚糖主要是唾液酸乳糖。
本申请提供了一种乳低聚糖的制备方法，采用的乳清液的原料可以有三种来源：1)乳清液为制作奶酪时产生的副产物乳清液；2)脱盐乳清粉复溶后的乳清液；3)脱脂后的动物乳(一般采用牛乳)经微滤制备的透过液；
其中，制作奶酪时产生的副产物乳清液、或脱盐乳清粉复溶后的乳清液可直接或简单过滤后直接进行超滤；一般情况下，脱盐乳清粉复溶后的乳清液通过脱盐乳清粉和水按质量比例为1:4～20制备得到。
以下实施例和对比例中，乳糖和牛乳低聚糖的检测方法如下：
牛乳低聚糖检测方法：脱脂牛乳稀释100倍，透过液稀释2倍，过0.22μm尼龙滤膜后，取原液和分离得到的低聚糖样品各100微升，分别加入50微升0.5摩尔的2-氨基苯甲酰胺(以2-氨基苯甲酰胺为衍生试剂)和1摩尔的2-甲基吡啶硼烷复合物(以2-甲基吡啶硼烷复合物作为糖类标记的还原胺化试剂)，其中2-氨基苯甲酰胺和2-甲基吡啶硼烷复合物溶液所用溶剂均为体积比85：15的二甲基亚砜和醋酸混合溶液，混合均匀后于65℃衍生2.5h，取出冷却至室温，然后上样到液相小瓶进行检测。其中流动相为100毫摩尔的甲酸铵溶液(pH＝4.5)和乙腈溶液。色谱柱为Waters acquity UPLC glycan BEH Amide色谱柱(2.1mm×150mm,1.7μm)，色谱柱温度设置为52℃。荧光检测器的激发和发射波长分别为250和425nm。
乳糖检测方法：脱脂乳稀释10000倍，透过液稀释100～5000倍，截留液稀释100～5000倍，取稀释样品100微升，加入50微升0.5摩尔的2-氨基苯甲酰胺(以2-氨基苯甲酰胺为衍生试剂)和1摩尔的2-甲基吡啶硼烷复合物(以2-甲基吡啶硼烷复合物作为糖类标记的还原胺化试剂)，其中2-氨基苯甲酰胺和2-甲基吡啶硼烷复合物溶液所用溶剂均为体积比85：15的二甲基亚砜和醋酸混合溶液，混合均匀后于65℃衍生2.5h，取出冷却至室温，然后上样到液相小瓶进行检测。其中流动相为100毫摩尔的甲酸铵溶液(pH＝4.5)和乙腈溶液。色谱柱为Waters acquity UPLC glycan BEH Amide色谱柱(2.1mm×150mm,1.7μm)，色谱柱温度设置为52℃。荧光检测器的激发和发射波长分别为250和425nm。
SDS-PAGE方法：样品稀释后，分别与2×样品缓冲液以体积比1：1混合，沸水浴5min，取10μL上样。样品电压为140V，待溴酚蓝下沿距离下缘1cm时结束电泳。电泳结束后，采用考马斯亮蓝G250染色液染色1h，并用脱色液脱色4h至条带清晰后摄像。其中电泳支持介质由梯度胶组成，梯度胶浓度为6～18％的预制胶。其中，SDS-PAGE运行溶液、预制胶、染色液和脱色液均购自南京金斯瑞有限公司。
实施例1
乳清液为脱脂后的动物乳(一般采用牛乳)经微滤制备的透过液时，制备方法可以如下：
一般先对原料乳进行灭菌和脱脂处理，原料乳巴氏杀菌包括：将原料乳先在72～85℃加热15-30s，以抑制微生物在整个生产过程中的生长和繁殖，同时又得防止乳清蛋白发生变性。原料乳杀菌后通过板式换热器冷却至45℃-55℃进行脱脂或脱脂后再冷却至1～4℃储存，暂时储存的脱脂牛乳需要6～48小时内需消耗完毕，待加工时再利用板式交换器加热至45℃-55℃；上述方法中，所述脱脂牛乳中脂肪的质量百分含量小于0.1％，具体可为0.02％～0.1％，以防止脂肪球引起的微滤孔堵塞；
脱脂后的牛乳的微滤的一个操作实施例可以为：
(1)五次微滤浓缩：取脱脂牛乳48L投入微滤设备中，并通过开启冷媒装置将温度稳定在50℃；膜材料选用孔径为100nm的管式陶瓷膜；进口压力为5bar，出口压力为4bar，背压为3bar。
将脱脂牛乳通过微滤浓缩至浓缩倍数为3倍时得到第一次微滤透过液，第一次微滤结束；
再一次性加入去离子水32kg至加入的水和第一次微滤截留液的总质量与原脱脂牛乳相等，继续微滤浓缩至浓缩倍数为3倍时得到第二次微滤透过液，第二次微滤结束；
再一次性加入去离子水32kg至加入的水和第二次微滤截留液的总质量与原脱脂乳相等，继续微滤浓缩至浓缩倍数为3倍时得到第三次微滤透过液，第三次微滤结束，
再一次性加入去离子水32kg至加入的水和第三次微滤截留液的总质量与原脱脂乳相等，继续微滤浓缩至浓缩倍数为3倍时得到第四次微滤透过液，第四次微滤结束，
再一次性加入去离子水32kg至加入的水和第四次微滤截留液的总质量与原脱脂乳相等，继续微滤浓缩至浓缩倍数为3倍时，第五次微滤结束，共得微滤透过液160kg。
将膜分离过程中脱脂牛乳、截留液和渗透液进行低聚糖和乳糖检测，结果如图1
此外，将膜分离过程中脱脂牛乳、微滤截留液和第一、二、三、四和五次微滤透过液液进行SDS-PAGE，其中，脱脂乳稀释10倍，微滤截留液稀释26倍，微滤透过液稀释2倍，结果如图2。
由图1可以看出，与脱脂牛乳相比，微滤渗透液中含有91.05％的牛乳低聚糖。图2显示酪蛋白基本没有透过。这一现象充分证明了所用陶瓷膜能够将牛乳低聚糖透过和乳清蛋白透过,实现了其与酪蛋白的分离,减少了下一步超滤膜的污染。
实施例2六次超滤浓缩：
将实施例1所得微滤透过液160L投入集成化超滤-纳滤-反渗透设备中，
或取8kg脱盐乳清粉定容至160L投入集成化超滤-纳滤-反渗透设备中，
将复原脱盐乳清粉溶液分别进行如下超滤操作：
先将溶液通过超滤浓缩至浓缩倍数为6.4倍时得到第一次超滤透过液，第一次超滤结束；
再一次性加入去离子水25kg，继续超滤浓缩至浓缩倍数为2倍时得到第二次超滤透过液，第二次超滤结束；
再一次性加入去离子水25kg，继续超滤浓缩至浓缩倍数为2倍时得到三次超滤透过液，第三次超滤结束；
再一次性加入去离子水25kg，继续超滤浓缩至浓缩倍数为2倍时得到第四次超滤透过液，第四次超滤结束；
再一次性加入去离子水25kg，继续超滤浓缩至浓缩倍数为2倍时得到第五次超滤透过液，第五次超滤结束；
再一次性加入去离子水25kg，继续超滤浓缩至浓缩倍数为2倍时，第六次超滤结束，共计得到260kg超滤透过液；
本实施例所用的超滤膜的截留分子量为5KDa～30Kda；可选地，超滤膜为复合管式有机膜。
对复原脱盐乳清粉溶液、超滤透过液、超滤截留液进行低聚糖检测、乳糖检测和SDS-PAGE检测，其中超滤截留液稀释4倍，低聚糖检测结果如图3。复原脱盐乳清粉溶液及其超滤透过液、截留液的SDS-PAGE检测如图4。
由图3可以看出，复原脱盐乳清粉溶液的超滤透过液中含有96.92％的牛乳低聚糖，结合图4说明乳清蛋白得到了较大程度的截留，充分证明所用超滤有机膜能够将牛乳低聚糖和乳清蛋白分离,减少了下一步纳膜的污染。
通过对脱脂牛乳的微滤透过液进行超滤后，其超滤透过液中的牛乳低聚糖的含量也能达到96％以上，与复原脱盐乳清粉溶液的超滤透过液的成分也相近，且脱盐乳清粉的成本远远低于生牛乳，且脱盐乳清粉易获取和储存，故以复原脱盐乳清粉溶液的超滤透过液为例，进行下一步操作：
实施例3六次纳滤浓缩：
将实施例2所得复原脱盐乳清粉溶液的超滤透过液260kg投入超滤-纳滤-反渗透设备中，目的是去除多余的水分，将超滤透过液通过纳滤浓缩至浓缩倍数为13倍时得到第一次纳滤截留液，第一次纳滤结束；
再一次性加入去离子水20kg，继续纳滤浓缩至浓缩倍数为2倍时得到第二次纳滤截留液，第二次纳滤结束；
再一次性加入去离子水20kg，继续纳滤浓缩至浓缩倍数为2倍时得到三次纳滤截留液，第三次纳滤结束；
再一次性加入去离子水20kg，继续纳滤浓缩至浓缩倍数为2倍时得到第四次纳滤截留液，第四次纳滤结束；
再一次性加入去离子水20kg，继续纳滤浓缩至浓缩倍数为2倍时得到第五次纳滤截留液，第五次纳滤结束；
再一次性加入去离子水20kg，继续纳滤浓缩至浓缩倍数为2倍时，第六次纳滤结束，共计得到17kg纳滤截留液。
本实施例所用的纳滤膜的截留分子量为100Da～3000Da；可选地，纳滤膜为复合管式有机膜。
对纳滤截留液进行低聚糖检测，低聚糖检测结果如图5。由图5可以看出，超滤透过液进行纳滤浓缩时，纳滤截留液可以保留98.30％的牛乳低聚糖。
实施例4一次反渗透浓缩：
取实施例3获得的纳滤透过液进行反渗透浓缩，目的是获得去离子水，用于补充工艺中需水的地方，从而达到绿色生产示范。
取340L实施例3所获得的纳滤透过液投入到超滤-纳滤-反渗透设备中，进行反渗透浓缩20倍，得到一次反渗透透过液，反渗透浓缩结束。
结果显示反渗透制备的水电导率为2～5uS/cm，满足工艺需求用水，可以进行循环使用，全程绿色无污染，无有害物质残留。
实施例5层析色谱分离纯化：
取实施例3获得的纳滤截留液进行层析色谱分离，目的是去除非益生元物质(乳糖)。可用3种分离方法的层析柱分别为：Superdex30 increase预装柱、DEAE琼脂糖凝胶FF和Q-琼脂糖凝胶FF，均购自思拓凡公司。
a)取500μL实施例3所获得的纳滤截留液上样至Superdex30 increase预装柱，流速：0.6mL/min,收集：1mL/管；对每管收集液进行低聚糖和乳糖检测，检测结果如图6。
b)取500μL实施例3所获得的纳滤截留液上样至DEAE琼脂糖凝胶FF色谱柱(1.5cm×20cm)，流速：1.5mL/min,收集：1mL/管；对每管收集液进行低聚糖和乳糖检测，检测结果如图7。
c)取1L实施例3所获得的纳滤截留液上样至Q-琼脂糖凝胶FF(10cm×50cm)，流速：20mL/min,收集：50mL/管；对每管收集液进行低聚糖和乳糖检测，检测结果如图8。
由图6-8可以看出，这三种方法均可以满足唾液酸乳糖和非益生元物质(乳糖)的分离，为牛乳低聚糖的工业化提供了可能。
本发明的发明人在研发过程中还尝试采用ANX琼脂糖凝胶色谱、CM-琼脂糖凝胶FF色谱、QXL脂糖凝胶色谱、SP琼脂糖凝胶FF色谱和SP琼脂糖凝胶XL色谱进行低聚糖和乳糖的分离，但效果并不理想，详见对比例1：
对比例1其它层析色谱分离纯化
1)取100μL实施例3所获得的纳滤截留液上样至ANX琼脂糖凝胶色谱柱(0.7cm×2.5cm)，流速：0.1mL/min,收集：0.2mL/管；对每管收集液进行低聚糖和乳糖检测，检测结果如图9。
2)取100μL实施例3所获得的纳滤截留液上样至CM-琼脂糖凝胶FF色谱柱(0.7cm×2.5cm)，流速：0.1mL/min,收集：0.2mL/管；对每管收集液进行低聚糖和乳糖检测，检测结果如图10。
3)取100μL实施例3所获得的纳滤截留液上样至QXL脂糖凝胶色谱柱(0.7cm×2.5cm)，流速：0.1mL/min,收集：0.2mL/管；对每管收集液进行低聚糖和乳糖检测，检测结果如图11。
4)取100μL实施例3所获得的纳滤截留液上样至SP琼脂糖凝胶FF色谱柱(0.7cm×2.5cm)，流速：0.1mL/min,收集：0.2mL/管；对每管收集液进行低聚糖和乳糖检测，检测结果如图12。
5)取100μL实施例3所获得的纳滤截留液上样至SP琼脂糖凝胶XL色谱柱(0.7cm×2.5cm)，流速：0.1mL/min,收集：0.2mL/管；对每管收集液进行低聚糖和乳糖检测，检测结果如图13。
由图9～13可以看出，采用ANX琼脂糖凝胶色谱、CM-琼脂糖凝胶FF色谱、QXL脂糖凝胶色谱、SP琼脂糖凝胶FF色谱和SP琼脂糖凝胶XL色谱这五种离子色谱填料均不能将唾液酸乳糖和非益生元物质(乳糖)有效分离。
本发明的发明人在研发过程中还尝试了其它分离纯化方法，详见对比例2～4：
对比例2：活性炭吸附
将实施例3的纳滤截留液冷冻干燥获得粗牛乳低聚糖粉末，取粉末500mg和活性炭3g，溶解在100mL不同的乙醇溶液(5、10和15％)中，目的是测试BMO吸附和乳糖解吸的最佳浓度。随后搅拌30分钟，结束后将混合物在真空下通过Whatman 1号滤纸过滤，并用25mL相应的乙醇溶液洗涤活性炭。再用100mL乙醇(50％，v/v)从活性炭中解吸牛乳低聚糖。将混合物搅拌30分钟，并如前所述进行过滤。滤液在50℃的真空条件下蒸发，溶解在5mL去离子水中。本对比例的活性炭购自西格玛奥德里奇公司。
进行低聚糖和乳糖检测，结果如图14，结果表明，本对比例的活性炭吸附不能有效去除乳糖。
对比例3：透析袋脱除
将实施案例3的纳滤截留液分别装入分子量为100-500Da、500-1000Da的透析袋中，并在4℃下用去离子水透析48小时。本对比例的透析袋购自上海源叶有限公司。
进行低聚糖和乳糖检测，结果如图15，结果表明，本对比例的100-500Da的透滤袋的乳糖去除率仅为81％左右，但低聚糖的截留回收率并不理想，虽然500-1000Da能更好的去除乳糖，但对应的，低聚糖的回收率也大大降低。
对比例3：结晶法
将实施案例3的纳滤截留液通过结晶生产乳糖母液。利用旋转蒸发仪将纳滤截留液浓缩至50°Bé，其中两份加入0.02％的晶种并分别在室温和4℃下结晶，另外两份在相同条件下不添加晶种作对照。获得上清液后，用少量冰水(4℃)冲洗结晶乳糖。随后，根据低聚糖的产率和乳糖的去除率筛选结晶条件。乳糖晶种购自美国希尔马公司。
进行低聚糖和乳糖检测，结果如图16，结果表明，本对比例的结晶法去除乳糖的效果也不理想。
上述对比例2～3的结果表明，活性炭吸附和结晶法虽然可以回收大量的低聚糖，但是也回收了大量的乳糖，提高了非益生元物质的含量，可能会影响牛乳低聚糖的生物活性。透析袋法虽然乳糖去除率较高，但是也损失了大量的牛乳低聚糖。因此，这三种方法均不能满足唾液酸乳糖和非益生元物质(乳糖)的分离，更不能满足工业化需求。
实施例6纳滤或电渗析脱盐：
取实施例5中3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖的层析收集液进行合并(实施例5中的三种色谱层析填料均能有效分离牛乳低聚糖，取其中一个或多个层析色谱的收集液均可，本实施例中采用Q-琼脂糖凝胶FF分离纯化的收集液)，然后进行纳滤，目的是除盐。所用膜单元分别为：100Da。
或将合并液放入电渗析设备中进行脱盐。
低聚糖检测方法与上述相同，均是用上述2种试剂进行衍生再测样。
纳滤脱盐：取实施例5合并液1100mL加入到纳滤设备中，调整进口压力10bar，出口压力5bar,随着透过液不断透过，不断补加去离子水9L，此时电导率不再发生变化，结束试验，结果图17。
电渗析脱盐：取实施例5合并液1700mL加入到电渗析设备中，调整电压：8V，物料流速50L/h,超纯水流速50L/h,极液流速45L/h，待电流不再发生变化时，结束试验，结果如图18。
由图17-18可以看出，纳滤脱盐和电渗析脱盐的累计脱盐率分别为96.61％和94.5％，说明这两种方法均具有较好的脱盐率，相对来说，纳滤脱盐效率更高，且没有化学污染，优选为纳滤脱盐。
实施例7冷冻干燥
将实施例6的脱盐后的牛乳低聚糖溶液进行冷冻干燥得到牛乳低聚糖粉。
具体的，先放在冷冻干燥机的样品搁板上进行预冻，根据工艺，设定真空冷冻干燥升温程序为20℃-2h,40℃-1h,55℃干燥至结束。冷阱温度-50℃，真空度2.50～6.50MPa，干燥至干基水分含量低于5％。该牛乳清粉的实物图如图19所示。由图19可知，该牛乳低聚糖粉的色泽呈白色或浅黄色，样品均一，无正常视力所见杂质。
本发明的制备方法方法包括如下步骤：对脱脂牛乳进行微滤浓缩后得到微滤透过液，将所述微滤透过液进行超滤得到超滤透过液(或将脱盐乳清粉复溶进行超滤得到超滤透过液)，将所述超滤透过液体再经过纳滤最后得到纳滤截留液，纳滤透过液进行反渗透制备反渗透水，将所述反渗透水用于微滤、超滤、和纳滤的洗滤步骤，由此形成了系列环境友好型工艺，将所述纳滤截留液再通过层析色谱去除残留的乳糖，将所述层析收集液再进行纳滤获得牛乳低聚糖溶液，再通过冷冻干燥得到所述牛乳低聚糖粉。本发明是采用微滤、超滤、纳滤、反渗透、层析色谱、冷冻干燥技术得到的牛乳低聚糖粉，与传统的生物工程技术相比，未经发酵和酶转化，保持了牛乳低聚糖的天然结构，加工品质特性优良，风味纯正，在食品工业中具有广泛的应用前景。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种乳低聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：对乳清液进行至少三次超滤，将超滤透过液进行多次纳滤浓缩，将纳滤截留液进行层析色谱分离纯化，去除含乳糖的层析收集液，收集含唾液酸乳糖的层析收集液，脱盐，干燥获得低聚糖粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，收集含唾液酸乳糖的层析收集液的方法为：按管收集层析收集液并检测，将含有唾液酸乳糖的层析收集液合并，唾液酸乳糖的检测方法采用低聚糖检测方法；
和/或，干燥步骤为冷冻干燥；可选地，冷冻干燥的步骤包括：将脱盐后的浓缩截留液放入冷冻干燥机干燥，可选地，冷冻干燥包括：设定真空冷冻干燥升温程序为：20℃2h,40℃1h,55℃干燥至结束；冷阱温度-50℃，真空度2.50～6.50MPa，干燥至干基水分含量低于5％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，层析色谱分离纯化步骤中，所用的层析填料的载体为琼脂糖和葡聚糖交联复合物或交联琼脂糖；可选地，所述层析填料的载体为Superdex30 increase预装柱、或DEAE琼脂糖凝胶、或Q-琼脂糖凝胶；可选地层析色谱分离纯化步骤包括：
将纳滤截留液上样至Superdex30 increase预装柱，流速0.5～0.8mL/min,收集0.5～2mL/管；可选地流速0.6mL/min,收集1mL/管；
或者，将纳滤截留液上样至1.5cm×20cm的DEAE琼脂糖凝胶FF色谱柱，流速1～2mL/min,收集0.5～1.5mL/管；可选地流速1.5mL/min,收集1mL/管；
或者，将纳滤截留液上样至10cm×50cm的Q-琼脂糖凝胶FF色谱柱，流速15～25mL/min,收集40～60mL/管；可选地流速20mL/min,收集50mL/管。
4.根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，所述乳清液为制作奶酪时产生的副产物乳清液、或脱盐乳清粉复溶后的乳清液、或脱脂后的动物乳经微滤制备的透过液，可选地，所述动物乳为牛乳；可选地，脱盐乳清粉和水的质量比例为1:4～20；
可选地，所述动物乳经微乳制备的透过液的方法为：将脱脂后的动物乳进行至少三次微滤，得微滤透过液；可选地，所述脱脂后的动物乳中脂肪的质量百分含量小于或等于0.1％，优选为0.02％～0.1％；
可选地，动物乳脱脂步骤包括：原料乳杀菌后通过板式换热器冷却至45℃-55℃进行脱脂；
可选地，至少三次微滤的方法为：将脱脂后的动物乳通过微滤浓缩至浓缩倍数为2～5倍时得到第一次微滤透过液；在第一次微滤截留液中加水稀释；再次微滤浓缩至浓缩倍数为2～5倍时得到第二次微滤透过液；在第二次微滤截留液中加水稀释；再次微滤浓缩至浓缩倍数为2～5倍时得到第三次微滤透过液；依次类推；可选地，微滤次数为五次；可选地，加水稀释至与未微滤前脱脂后的动物乳质量相近；
可选地，微滤浓缩中，采用的微滤膜的孔径为50nm-140nm；可选地，微滤膜采用管式陶瓷膜；
可选地，微滤条件为：料液温度为45℃～55℃，进口压力为2～5bar，出口压力为1～4bar，背压0.5-3bar，膜压差不超过3bar。
5.根据权利要求1至4任一所述的方法，其特征在于，至少三次超滤的方法为：将微滤透过液通过超滤浓缩至浓缩倍数为2～7倍时得到第一次超滤透过液；在第一次超滤截留液中加水稀释；再次超滤浓缩至浓缩倍数为2～7倍时得到第二次超滤透过液；在第二次超滤截留液中加水稀释；再次超滤浓缩至浓缩倍数为2～7倍时得到第三次超滤透过液；依次类推；可选地，超滤次数为六次；可选地，加水稀释的水加入量与待稀释的超滤截留液质量相近；
和/或，超滤步骤中，所用的超滤膜的截留分子量为5KDa～30Kda；可选地，超滤膜为复合管式有机膜；
和/或，超滤条件为：料液温度为20℃～45℃，进口压力为6～9bar，出口压力为5～8bar；可选地，膜压差不超过3bar。
6.根据权利要求1至5任一所述的方法，其特征在于，多次纳滤浓缩的方法为：将超滤透过液通过纳滤浓缩至浓缩倍数为2～13倍时得到第一次纳滤截留液；在第一次纳滤截留液中加水稀释；再次超滤浓缩至浓缩倍数为2～13倍时得到第二次纳滤截留液；在第二次纳滤截留液中加水稀释；再次纳滤浓缩至浓缩倍数为2～13倍时得到第三次纳滤截留液；依次类推；可选地，纳滤次数为六次；可选地，加水稀释的水加入量与待稀释的纳滤截留液质量相近；
和/或，纳滤步骤中，所用的纳滤膜的截留分子量为100Da～3000Da；可选地，纳滤步骤中，纳滤膜为复合管式有机膜；
和/或，纳滤条件为：料液温度为20℃-45℃，进口压力为16～20bar，出口压力为14～18bar；可选地，膜压差不超过3bar。
7.根据权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于，脱盐步骤采用纳滤脱盐或电渗析脱盐；
可选地，纳滤脱盐步骤包括：将层析收集液通过纳滤分离并用去离子水洗滤直至电导率不再降低，并浓缩至设备的最小循环体积得到纳滤浓缩截留液，纳滤浓缩结束；可选地，纳滤脱盐中，采用的纳滤膜的截留分子量为100Da～500Da；可选地，纳滤脱盐中，采用的纳滤膜为复合管式有机膜；可选地，纳滤脱盐中，条件设置为：料液温度为20℃-45℃，进口压力为10～15bar，出口压力为5～10bar；可选地，膜压差不超过3bar；
可选地，电渗析步骤包括：将层析收集液加入到电渗析设备中进行渗析，待电流不再发生变化时，脱盐结束，可选地，电渗析的条件设置为：调整电压：8V，物料流速50L/h，超纯水流速50L/h,极液流速45L/h。
8.根据权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于，还包括：对纳滤透过液进行反渗透浓缩，并产生工艺内适用的去离子水；
可选地，反渗浓缩步骤具体包括：将所述纳滤透过液通过反渗透浓缩至设备的最小循环体积得到反渗透透过液，反渗透结束；
可选地，反渗透步骤中，所用膜的稳定排盐率99.5％；
可选地，反渗透条件为：料液温度为20℃-45℃，进口压力为16～20bar，出口压力为14～18bar；可选地，膜压差不超过3bar；
和/或，所述超滤、纳滤、反渗透的步骤采用集成化的超滤-纳滤-反渗透装置。
9.一种低聚糖糖粉，其特征在于，为采用权利要求1-8任一所述的方法制备得到的乳低聚糖粉；可选地，所述乳低聚糖粉中包括唾液酸乳糖；可选地，唾液酸乳糖包括3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖；可选地，所述乳低聚糖粉中3'-唾液酸乳糖和6'-唾液酸乳糖的总质量百分含量不低于25％。
10.一种低聚糖食品或保健品，其特征在于，包括权利要求1至8任一所述的方法制备得到的低聚糖粉或权利要求9所述的低聚糖糖粉。
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