FI71576C - Foerfarande foer desinficiering av immobiliserade enzymerna. - Google Patents

Description

71576

Menetelmä immobilisoitujen entsyymien desinfioimiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää hiukkasmaiselle kantoaineel-le immobilisoitujen entsyymien laktaasin ja glukoosi-iso-meraasin desinfioimiseksi, joita entsyymejä käytetään laktoosin hydrolysoimiseen glukoosiksi ja galaktoosiksi.

Yleisesti tätä keksintöä voidaan käyttää minkä tahansa im-mobilisoidun entsyymin kanssa sikäli kuin desinfiointiaine ei vaikuta haitallisesti immobilisoituun entsyymiin.

Vuonna 1976 Ranskan juustotuotanto saavutti suunnilleen miljoonan tonnin määrän, mikä johti yli kuuden miljoonan heratonnin tuotantoon sivutuotteena. Tällainen hera sisältää litraa kohti noin 6-9 g proteiinia, 45-50 g laktoosia, 6-8 g mineraalisuoloja ja 1-2 g rasvaa. Maailmanlaajuisesti pelkästään herasta saatavan laktoosin määrä kohosi v. 1977 lähes 3,5 miljoonaan tonniin.

Aikaisemmin heraa pidettiin jätetuotteena ja se laskettiin viemäreihin tai virtoihin ja jokiin. Johtuen kasvavasta huolesta ympäristön saastumisen suhteen suuri määrä heraa prosessoidaan erilaisiksi eläin- ja ihmisravintotuotteiksi. Esimerkiksi erittäin suorituskykyisten ultrasuodattimien kehitys tekee nykyään mahdolliseksi heraproteiinin erottamisen herasta. Tällainen proteiini on poikkeuksellisen arvokasta. Esimerkiksi heraproteiinin 35-prosenttisella kon-sentraatilla voidaan korvata rasvaton kuivamaito monissa elintarviketuotteissa, kuten leipomotuotteissa, virvoitusjuomissa ja pakastejälkiruoissa. Valitettavasti proteiinin erottuminen herasta johtaa nestejakeeseen, jota kutsutaan permeaatiksi, jolla on viime aikoihin asti ollut vain vähän tai ei lainkaan arvoa.

Immobilisoitujen entsyymien tulon myötä permeaatissa olevan laktoosin hydrolyysi on kuitenkin joko mineraalien 2 71576 poiston kanssa tai ilman sitä tullut kaupallisesti mahdolliseksi. Glukoosin ja galaktoosin läsnäolosta johtuen hydrolysoitu laktoosi on paljon makeampaa ja 1iukenevampaa kuin pelkkä laktoosi. Niinpä hydrolysoitu tuote on funktionaalinen makeutin, jota voidaan käyttää sokerileivosten, maitopohjaisten jälkiruokien ja pakastejälkiruokatuottei-den, kuten jäätelön valmistuksessa. Sitäpaitsi hydrolysoitu tuote on tehokkaasti fermentoituva seos, joka sopii käytettäväksi käymisalustana esimerkiksi panimo- ja farmaseuttisessa teollisuudessa.

On myös mahdollista suorittaa herassa olevan laktoosin hydrolyysi ilman edeltävää ultrasuodatusvaihetta ja joko mineraalinpoiston kanssa tai ilman sitä. Tuote joka yhä sisältää proteiineja, muistuttaa hydrolysoitua permeaattia ja tämän vuoksi sitä voidaan käyttää myös elintarviketeollisuudessa, kuten jo esitettiin.

Erilaiset menetelmät laktoosin hydrolysoimiseksi ovat luonnollisesti hyvin tunnettuja alaan normaalisti perehtyneille. Entsymaattinen hydrolyysi on erityisen hyödyllinen elintarvikkeisiin liittyvien tuotteiden valmistukseen ja kuten jo mainittiin immobilisoitujen entsyymien käyttö on erityisen houkuttelevaa.

Yksinomaan kuvaamismielessä H.H. Weetall et. ai., Bio-technol. Bioeng., _1_6/ 295 (1 974) selostavat immobilisoi-dun laktaasin valmistusta ja sen käyttöä happaman heran entsymaattisessa hydrolyysissä. Entsyymi, jota eristettiin sekä sienistä että hiivasta, immobilisoitiin zirkoniumok-sidipäällysteisille huokoisille lasihiukkasille. Substraatti koostui joko laktoosin vesiliuoksesta tai happamasta herapermeaatista.

Lisäksi L.E. Wierzbicki et u.l ., B.i o techno] . Bioeng. 16, 397 (1974) selostivat happamassa herassa olevan laktoosin hydrolyysiä käyttäen laktaasia (β-galaktosidaasi), joka 71576 oli immobilisoitu huokoisille lasihiukkasille painottaen uudelleen käytettävän katalyytin valmistusta ja karakterisointia pienen laktoosipitoisuuden meijerituotteiden valmistukseen. Osittain puhdistetut laktaasit lajeista Aspergillus niger, Lactobacillus helveticus ja Saccharomyces lactis immobilisoitiin huokoisille lasihiukkasille. Substraatti koostui happamasta herajauheesta, joka oli muodostettu uudelleen vedessä sopivaan kuiva-ainepitoisuuteen. Joissakin tapauksissa uudelleenmuodostetusta happamasta herasta poistettiin proteiini kuumentamalla kiehuvassa vesi-hauteessa viisi minuuttia.

Lopuksi H.H. Weetall et ai., Biotechnol. Bioeng., J_6, 689 (1974) kuvaavat immobilisoidun laktaasin valmistusta osana laktoosin entsymaattisen hydrolyysin jatkotutkimuksista. Käytettiin sienilaktaasia immobilisoituna zirkoniumoksidi-päällysteisille, huokoskooltaan säädetyn lasin ja huokoisen titaanidioksidin hiukkasille. Saatuja immobilisoituja ent-syymivalmisteita käytettiin kokonaan makeassa herassa, kokonaan happamassa herassa happamassa heraultrasuodoksessa olevan laktoosin ja puhtaan laktoosin hydrolyysiin.

Kuten H.H. Weetall et. ai., Biotechnol. Bioeng., J_6, 295 (1974) mainitsivat, hera-alusta-aineen bakteeriepäpuhtaus oli pääongelma. Mikro-organismien jatkuva kasvu tukki ko-lonnit. Kaksiprosenttisen glutaraldehydin käytön pH-arvol-la 4,0 havaittiin tappavan bakteerit tuhoamatta immobilisoidun entsyymin aktiivisuutta. Nämä tutkijat väittävät, että sanitointimenettely olisi ehdottoman välttämätön missä tahansa laitostilanteessa.

On kuitenkin ilmeistä, että jokaisen kaupallisesti elinvoimaisen sanitointi- tai desinfiointimenettelyn on tehokkaasti tuhottava oleellisesti kaikki saastuttavat mikro-organismit ilman huomattavaa haitallista vaikutusta immo-bilisoituihin entsyymeihin. Sitäpaitsi tapauksissa, joissa tuote on tarkoitettu käytettäväksi elintarviketeollisuu- 71576 dessa, desinfiointiaineen on usein täytettävä viranomaisten säätämät vaatimukset.

Tähän saakka ei todella tyydyttävää desinfiointiainetta ole ollut saatavissa. Etikkahappo, jota on yleisesti käytetty laimeana vesiliuoksena, antaa vain kohtalaiset tulokset. Sitäpaitsi muut tunnetut desinfiointiaineet, kuten halogeeni johdannaiset, orgaaniset hapot, kvaternääriset ammo-niumyhdisteet, biguanidiinipolymeerit yms. pyrkivät olemaan käyttöön soveltumattomia johtuen entsyymien osittaisesta tai täydellisestä inaktivoinnista.

Näin ollen on edelleen olemassa tarvetta kaupallisesti elinvoimaisesta sanitointi- tai desinfiointimenettelystä immobilisoiduille entsyymeille, joka menettely on tehokas ilman merkittäviä haitallisia vaikutuksia immobilisoituihin entsyymeihin.

Tämän keksinnön tarkoituksena on tämän vuoksi saada aikaan menetelmä immobilisoitujen entsyymien desinfioimiseksi, joka menetelmä tehokkaasti tuhoaa oleellisesti kaikki saastuttavat mikro-organismit ilman merkittäviä haitallisia vaikutuksia immobilisoituihin entsyymeihin.

Nämä ja muut tarkoitukset käyvät alaan perehtyneille ilmi seuraavasta selityksestä ja patenttivaatimuksista.

Näin ollen tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi menetelmän hiukkasmaiselle kantoaineelle immobilisoitujen entsyymien laktaasin ja glukoosi-isomeraasin desinfioimiseksi, jossa menetelmässä saatetaan immobilisoidut entsyymit kosketukseen dioktyylidietyleenitriamiinin tai trioktyylidiety-leenitriamiinin laimean vesiliuoksen kanssa väkevyydessä ja ajanjakso, jotka riittävät oleellisesti tappamaan saastuttavat mikro-organismit ilman merkittäviä haitallisia vaikutuksia immobilisoituihin entsyymeihin.

71576

Kuten alalla hyvin tiedetään laktoosi saadaan ainakin 80-prosenttisesti hydrolysoitua glukoosiksi ja galaktoosiksi johtamalla laktoosia sisältävä vesiliuos kolonnin läpi, joka sisältää immobilisoitua laktaasia, tyypillisesti alle n. 60°C:n lämpötilassa. Poistovirta voidaan osittain väke-vöidä siirapin saamiseksi käytettäväksi makeuttimena erilaisissa elintarvikkeissa.

Tällaisessa prosessissa käytettyä laktaasia valmistetaan useiden eri mikro-organismien, kuten sienien, bakteerien ja hiivojen avulla. Sienilaktaasit ovat ehkä yleisimpiä, ts. laktaasit, jotka on eristetty lajeista Aspergillus niger ja Aspergillus oryzae. Tekniikka laktaasien eristämiseksi mikro-organismeista on luonnollisesti alalla hyvin tunnettu.

Entsyymin immobilisointi on helppo toteuttaa eri menetelmillä, jotka myös tunnetaan. Immobilisointitekniikan tuoreen katsauksen suhteen, ks. I. Chibata, toimittaja, "Immobilized Enzymes", Halsted Press, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1978, sivut 1-73. Vaikka immobilisointimenetelmän ei tiedetä olevan kriittinen, tämän keksinnön menetelmä soveltuu hyvin käytettäväksi entsyymien kanssa, jotka on sidottu veteen liukenemattomiin tuki- tai kantoaineisiin. Haluttaessa tällaiset kantoaineet voivat olla huokoisia, mikä tekee mahdolliseksi kasvaneen entsyymiannoksen tukiaineen massayksikköä kohti. Yleensä entsyymit sidotaan veteen liukenemattomiin kantoaineisiin fysikaalisella adsorptiolla, ionisidonnalla, kovalenttisidonnalla tai jollakin näiden yhdistelmällä.

Veteen liukenemattomat kantoaineet voivat yleensä olla orgaanisia tai epäorgaanisia. Esimerkkejä orgaanisista tukiaineista ovat muiden muassa polyesterit, kuten poly-(etyleenitereftalaatti); polyamidit, kuten nylon-6- ja nylon-6,6: polyakrylaatit; polymetakrylaatit; polyakryyli- 6 71576 amidit; poly(akryylihappo); poly(metakryylihappo); poly-(galakturonihappo); poly(asparagiinihappo); etyleeni-maleiinihappoanhydridikopolymeerit; polyolefiinit, kuten polyeteeni, polypropeeni, polvbuteeni ja polybutadieeni; polystyreeni; poly(aminostyreeni)? poly(vinyylikloridi); poly(vinyvlialkoholi); poly(vinylideenikloridi); selluloosa ja sen johdannaiset; agaroosigeelit; dekstraanigee-lit ja niiden johdannaiset; polysakkaridit; polypeptidit; kollageeni; yms.

Epäorgaaniset kantoaineet voidaan luokitella kvartsipitoi-siksi ja ei-kvartsipitoisiksi metallioksideiksi. Esimerkkejä kvartsipitoisista kantoaineista ovat mm. lasi, piidioksidi, wollastoniitti, bentoniitti, kordieriitti yms. Esimerkkejä ei-kvartsipitoisista metallioksideista ovat mm. alumiinioksidi, spinelli, apatiitti, nikkelioksidi, titaanidioksidi, zirkoniumoksidi yms.

Yleensä veteen liukenematon kantoaine voi olla missä tahansa halutussa muodossa. Kantoaine voi olla luonteeltaan hiukkasmainen vaihdellen hienojakoisesta pulverista karkeaan raemaiseen materiaaliin tai kantoaine voi olla jatkuva, muotoiltu kappale, kuten tasomainen tai käyrä levy tai pallo tai kolmiulotteinen kappale, kuten suorakulmainen tai svlinterimäinen putki tai monimutkainen pilari. Käytännössä kuitenkin kantoaine useimmiten on hiukkasmainen.

Mitä tulee esimerkkeihin menettelyistä entsyymien immobi-lisoimiseksi epäorgaanisille kantoaineille, vain kuvaus-mielessä katso US-patentti n:o 3 519 538 (joka vastaa ranskalaista patenttia n:o 2 020 527), US-patentti n:o 3 556 945 (joka vastaa ranskalaista patenttia n:o 2 001 336) ja US-patentit n:ot 3 666 627 ja 3 802 997 (jotka vastaavat ranskalaista patenttia n:o 2 020 661).

Substituoituja dietyleenitriamiineja ja menetelmiä niiden valmistamiseksi kuvataan ranskalaisissa patenteissa n:ot 7 71576 2 080 797 ja 2 110 303 ja saksalaisessa patentissa n:o 2 115 549. Näillä yhdisteillä on biomyrkkyominaisuuksia. Mieluummin dioktyylidietyleenitriamiinin ja trioktyylidi-etyleenitriamiinin synergististä seosta, jota on kuvattu ranskalaisessa patentissa n:o 2 110 303, yllä ja jota on kaupallisesti saatavissa Th. Goldschmidt AG-yhtiöltä Saksan liittotasavallasta kauppanimellä "Tego-Diocto BS", käytetään tämän keksinnön menetelmässä.

Tällaisia substituoituja dietyleenitriamiineja käytetään laimeina vesiliuoksina, tyypillisesti n. 0,1-0,5 paino-%:n väkevyytenä, vaikka pienempiä ja suurempia väkevyyksiä voidaan käyttää. Yleensä dioktyyli- ja trioktyylidietyleeni-triamiinin väkevyys, vesiliuoksen kokonaistilavuus ja des-infiointikäsittelyn kestoaika voivat vaihdella laajasti riippuen ainakin osittain mikrobisaastumisen ankaruudesta, läsnä olevien mikro-organismien tyypeistä ja immobilisoidun entsyymin määrästä. Joka tapauksessa tällaiset käsittelyolosuhteet tai -parametrit on alaan normaalisti perehtyneen helppo määrittää. Useimmiten kuitenkin n. 15-30 minuutin käsittely 5-10 litralla esimerkiksi Tego Dioctyl BS-valmisteen 0,1 paino-%:sta desinfiointiliuosta kilogrammaa kohti immobilisoitua entsyymiä on osoittautunut tyydyttäväksi .

Tämän keksinnön eräässä toteutusmuodossa immobilisoitu entsyymi asetetaan yksinkertaisesti desinfioivan liuoksen kylpyyn. Valinnaisesti kylpyä voidaan ravistella, hämmentää, kierrätää pumppulaitteella tai muulla tavoin sekoittaa .

Toisessa toteutusmuodossa desinfiointiliuosta kierrätetään kolonnin tai reaktorin läpi, joka sisältää immobilisoitua entsyymiä. Mieluummin tällainen desinfiointiliuoksen kierrätys suoritetaan vastavirtaperiaatteella, ts. vastakkaiseen suuntaan verrattuna syöttöliuoksen virtaukseen kolonnin tai reaktorin läpi. Kun entsyymi on immobilisoitu hiuk- 8 71576 kasmaiselle kantoaineelle ja kun kolonnin tai reaktorin rakenne sallii, desinfiointiliuoksen vastavirtausnopeus on mieluummin sellainen, että immobilisoidut entsyymihiukka-set fluidisoituvat. Tämä fluidisointi estää kanavoitumisen ja takaa immobilisoidun entsyymin täydellisen kosketuksen desinfiointiliuoksen kanssa.

On huomattava, että mitä tahansa desinfiointiliuosta voidaan käyttää useita kertoja desinfiointitoimenpiteen kustannusten pienentämiseksi. Kuitenkin kun desinfiointiliuosta kierrätetään, jotkut lisäkäsittelyt saattavat olla toivottavia tai tarpeellisia, kuten esimerkiksi suodatus solu-jätteiden poistamiseksi ja pH-arvon säädöt.

Vielä muussa tämän keksinnön toteutusmuodossa dioktvyli-tai trioktyylidietyleenitriamiini voidaan sisällyttää syöt-töliuokseen, jota prosessoidaan immobilisoidun entsyymin avulla. Tällä tavoin immobilisoidun entsyymin mikrobisaas-tuminen voidaan minimoida tai jopa estää. Luonnollisesti tällaista estokäsittelyä voidaan käyttää yksin tai yhdessä jo esitetyn desinfiointimenettelyn kanssa.

Tätä keksintöä kuvataan tarkemmin, mutta ei rajoiteta seuraavilla esimerkeillä, jotka kuvaavat vertailukokeita ja tiettyjä suositeltavia toteutusmuotoja.

Esimerkki 1

Reaktorin desinfiointi, johon on panostettu lajista A. Niger saatua immobilisoitua laktaasia, jota käytetään herapermeaa- tin hydrolysointiin_

Perusteellisen vesihuuhtelun jälkeen orgaanisen aineen mahdollisimman suuren määrän poistamiseksi kolonnia, johon oli panostettu 45 kg immobilisoitua A. niger-peräistä laktaasia, joka oli valmistettu sitomalla entsyymi hiukkasmaiseen pii-dioksidikanto-aineeseen US-patentissa n:o 3 519 538 kuvatulla menettelyllä, käsiteltiin n. 20 minuuttia johtamalla kolonnin läpi vastavirtaperiaatteella Tego Diocto BS- 71576 valmisteen 0,1 %:sta vesiliuosta nopeudella 1000 1/h. Kolon-ni huuhdeltiin sitten vedellä.

Mikro-organismien lukumäärät pesuvedessä ennen ja jälkeen desinfiointikäsittelvä olivat seuraavat (taulukko I).

TAULUKKO I

Pesuveden mikro-organismilukumäärät Käsittelyn Ennen Jälkeen hyötysuhde

Mikro-organis- 470 000 6 000 98,7 % meja yhteensä

Hiivoja ja Ί 550 65 95,8 % homeita /(Ennen-jälkeen)/ennen/ x 100

Yllä olevat luvut osoittavat selvästi käytetyn desinfiointiaineen mikro-organismeja tappavan toiminnan.

Esimerkit 2 ja 3 Vertailukokeet

Reaktorin desinfiointi, johon on panostettu A. niger-lajista saatua, immobilisoitua laktaasia, jota käytetään herasaostuman hydrolvysiin epäpuhtauksien rutii- nikäsittely ssä_

Suoritettiin kaksi koetta, joihin liittyi esimerkin 1 immo-bilisoidun entsyymin reaktorin tai kolonnin käyttö teollisissa olosuhteissa. Syöttöliuos koostui herapermeaatista pH-arvolla 3,5, jonka sisältämä laktoosi hydrolysoitiin glukoosiksi ja galaktoosiksi. Kolonnin tai reaktorin lämpötila pidettiin 38°C:ssa. Kokeiden aikana poistovirran epäpuhtaus ja immobilisoidun laktaasin aktiivisuus mitattiin päivittäin.

Ensimmäisessä kokeessa esimerkissä 2 reaktori puhdistettiin mikro-organismeista Tego Diocto BS-valmisteella esi- 10 71 576 merkissä 1 kuvatulla tavalla. Reaktoria käsiteltiin sitten päivittäin 30 minuuttia 500 litralla etikkahapon 0,1 paino-%:sta vesiliuosta, joka johdettiin reaktorin läpi 1000 l/h:n nopeudella.

Toisessa kokeessa esimerkissä 3, joka suoritettiin ensimmäisen kokeen jälkeen, reaktori puhdistettiin jälleen epäpuhtauksista Tego Diocto BS-valmisteella esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Reaktori käsiteltiin sitten päivittäin Tego Diocto BS-valmisteella samoissa olosuhteissa kuin ensimmäinen epäpuhtauksien poisto paitsi, että mitään alustavaa huuhtelua ei suoritettu.

Poistovirran epäpuhtaus ilmaistuna mikro-organismien luku-määränä/ml, on koottu taulukkoon II ja immobilisoidun lak-taasin aktiivisuus ilmoitettuna kansainvälisinä yksikköinä grammaa kohti immobilisoitua entsyymiä, on koottu taulukkoon III.

ψ

TAULUKKO II

Poistovirran epäpuhtauksien yhteenveto Päivä Mikro-organismeja yhteensä/ml Hiivoja/ml

Esimerkki 2 1 Reaktorin ensimmäinen desinfiointi 2 180 000 150 000 3 980 000 780 000 4 1 200 000 800 000 5 1 390 000a 940 000

Esimerkki 3 6 Reaktorin toinen desinfiointi 7 510 200 8 1 500 800 9 3 300 1 100 10 5 800 1 100 11 ja Toimenpiteiden jatkaminen0 eteenpäin 11 71576 aKoe lopetettiin liiallisen saastumisen vuoksi beuraavat toimenpiteet varmistivat mikrobiepäpuhtauksien pienenemisen tämän keksinnön menetelmän seurauksena.

TAULUKKO III

Yhteenveto immobilisoidun laktaasin aktiivisuudesta

Keskimääräinen aktii-Päivä Aktiivisuus/ I.U./g visuus, I.U./g_

Esimerkki 2 1 Reaktorin ensimmäinen desinfiointi 2 159 3 184 4 165 5 168 169

Esimerkki 3 6 Reaktorin toinen desinfiointi 7 161a 8 189 9 176 10 188 11 204 12 198 186 aAktiivisuus vääristyi virtausnopeusongelmien vuoksi.

Esimerkit 2 ja 3 osoittavat selvästi, että tämän keksinnön menetelmä takaa mikrobisaastumisen paljon tehokkaamman torjunnan (vähintään 10^-kertaisen) kuin etikkahapon käyttö. Samanaikaisesti tämän keksinnön menetelmä on paljon vaarattomampi inmobilisoi-dulle entsyymille. Itse asiassa Tego Diocto BS n. 0,ΙΟ, 5 paino-%:n väkevyyksinä ei vaikuta liukoisen A. ni-ger-peräisen laktaasin entsymaattiseen aktiivisuuteen, ts. entsyymin, jota ei ole imnobilisoitu.

12 71 576 Näin ollen esimerkit 2 ja 3 osoittavat selvästi, että tämän keksinnön menetelmä muodostaa valinnaisen des-infiointikäsittelyn immobilisoidun entsyymin reaktoreille .

Esimerkki 4

Tutkimus koskien tämän keksinnön menetelmän vaikutusta immobilisoituun A. oryzae-neräiseen laktaasiin, jota käytetään laktoosin hydrolysointiin_ A. Entsymaattisen aktiivisuuden vaihtelu ajan mukana Immobilisoidun A. oryzae-peräisen laktaasin entsymaattisen aktiivisuuden vaihtelut määritettiin laboratorio-olosuhteissa jokaisessa kolmessa eri tapauksessa: (1) immobilisoidun laktaasin käyt tö laktaasiliuoksen hydrolysointiin pH-arvolla 4,2 ja 35°C:n lämpötilassa (vertailukoe); (2) immobilisoidun laktaasin käyttö sen jälkeen kun sitä on desinfioitu 30 minuuttia Tego Diocto BS-valmisteen 0,1 pai-no-%:sella liuoksella, vertailukokeessa käytetyn lak-toosiliuoksen hydrolysointiin; ja (3) vertailukokeen immobilisoidun laktaasin käyttö laktoosi-liuoksen hydrolysointiin pH-arvolla 4,5 ja 35°C:n lämpötilassa, joka liuos sisältää myös 0,1 paino-% Tego Diocto BS-valmistetta. Saadut tulokset on koottu taulukkoon IV.

TAULUKKO IV

Yhteenveto entsymaattisen aktiivisuuden vaihteluista ajan mukana

Aika Entsymaattinen aktiivisuus, I.U./g tuntia Tapaus 1 Tapaus 2 Tapaus 3 2 114 114 125 3 120 114 125 4 129 119 134 5 124 117 132 keskimäärin 121 116 129 13 71 576

Yllä olevat tulokset osoittavat, että immobili-soidun laktaasin entsymaattiseen aktiivisuuteen vaikuttaa oleellisesti kosketus desinfioivan liuoksen kanssa ja että laktoosin hydrolyysi sujuu normaalisti jopa desinfiointiaineen läsnäollessa.

B. Toistettujen käsittelyjen vaikutusten vertailu Kokeet suoritettiin viiden päivän aikana. Joka päivä immobilisoidun A. oryzae-neräisen laktaasin panosta käytettiin 16 tuntia laktoosiliuoksen hydroly-sointiin pH-arvolla 4 ja 35°C:n lämpötilassa.

Immobilisoitua entsyymipanosta käsiteltiin sitten 30 minuuttia fluidisoivissa olosuhteissa joko 1 painoni: sella etikkahappoliuoksella (vertailukoe) tai 0,1 paino-%: sella Tego Diocto BS-liuoksella (tämän keksinnön mukainen koe). Tulokset esitetään taulukossa V.

TAULUKKO V

Yhteenveto toistettujen käsittelyjen vaikutuksista entsymaattiseen aktiivisuuteen

Aika Entsymaattinen aktiivisuus, I.U./g päiviä Vertailukoe Keksinnön mukainen koe 1 143 135 2 144 151 3 139 127 4 155 144 5 126 124

Yllä olevat tulokset osoittavat, ettei näillä kahdella käsittelyllä saaduilla entsymaattisilla aktiivisuuksilla ole merkittäviä eroja.

Tämän keksinnön menetelmän käyttöä rutiinikäsittelynä immobilisoidulle A. oryzae-peräiselle laktoosille voidaan kuitenkin suositella. Kuten aikaisemmin esitettiin tämän keksinnön menetelmässä käytetyt 14 71576 desinfiointiaineet ovat paljon tehokkaampia mikrobeja tappavia aineita kuin etikkahappo. Sitäpaitsi tämän keksinnön menetelmällä ei selvästi ole haitallisia vaikutuksia immo-bilisoituun A. oryzae-peräiseen laktaasiin.

Vaikka tätä keksintöä on ensisijaisesti kuvattu immobili-soidun laktaasin desinfioinnin suhteen, on ymmärrettävää, että tämän keksinnön menetelmää voidaan soveltaa muihin immobilisoituihin entsyymeihin. Kuvaamistarkoituksessa vain mainittakoon, että tiettyjä immobilisoituja entsyymisystee-mejä käytetään elintarvike- ja farmaseuttisessa teollisuudessa ja niitä ovat mm. immobilisoitu glukoamylaasi, glu-koosi-isomeraasi ja penisilliiniasylaasi.

Esimerkki 5 alla kuvaa tämän keksinnön menetelmän soveltamista immobilisoidun glukoosi-isomeraasin desinfiointiin, jota käytetään glukoosin konvertoimiseen fruktoosiksi.

Esimerkki 5 Tämän keksinnön menetelmän vaikutus immobilisoituun glukoosi-isomeraasiin

Glukoosi-isomeraasi immobilisoitiin alumiinioksidikanto-aineelle menettelyllä, joka on kuvattu US-patentissa n:o 3 868 304 (joka vastaa ranskalaista patenttia n:o 2 218 385). Tämä entsyymi on herkkä sen vesipitoisen väliaineen osmoottisen paineen vaihteluille, joissa se on läsnä. Entsyymiä käytetään teollisesti fruktoosin saamiseen glukoosiliuoksista, jotka sisältävät yhteensä n. 45-50 % kiintoaineita ja joiden pH on n. 8,4 ja lämpötila n. 60°C.

Laboratoriokokeissa, joissa simuloitiin teollisuus- 15 71 576 olosuhteita, tutkittiin seuraavia parametreja: A. Entsymaattisen aktiivisuuden häviäminen liittyen vesihuuhteluun pH-arvolla 8,4 ja 60°C:n lämpötilassa.

B. Entsymaattisen aktiivisuuden häviäminen liittyen samalla pH-arvolla ja samassa lämpötilassa käsittelyyn 0,1 paino-%: sella Tego Diocto BS:n vesiliuoksella.

Entsymaattinen aktiivisuus määriteltiin joka päivä perustuen 16 tunnin jatkuvaan fruktoosituotantoon. Saadut tulokset on koottu taulukkoon VI.

TAULUKKO VI

Veden ja desinfiointiliuoksen vaikutus immobilisoidun glukoosi-isomeraasin entsymaattiseen aktiivisuuteen

Para- Reaktorin _ Konver- Aktiivisuus metri Päivä tuotanto, cmyh sioa, % I.U ./g_ A 1 73 39 169

Vesihuuhtelu 90 minuutin ajan 2 72,6 32 116

B

1 77 40 189

Desinfiointiainekäsittely 90 min. ajan 2 77 33 128 aSyöttöliuoksessa olevan glukoosin fruktoosiksi konvertoitunut prosenttiosuus.

Molemmissa tapauksissa saatiin n. 30 prosenttinen entsymaattisen aktiivisuuden menetys. Tämä menetys aiheutui entsyymin desorptoitumisesta ja eluoitumises-ta alumiinioksiditukiaineesta, kun immobili-soitu entsyymi saatettiin alttiiksi laimeammalle liuokselle, jolla on merkittävästi suurempi osmoottinen paine. Näin ollen mitään havaittavaa entsymaattisen aktii- 16 71 576 visuuden laskua ei voida osoittaa johtuvaksi immobilisoidun entsyymin käsittelystä desinfiointiaineella.

On ymmärrettävä, että edellä oleva yksityiskohtainen kuvaus on annettu yksinomaan kuvaamistarkoituksessa ja että siihen voidaan tehdä monia muutoksia poikkeamatta keksinnön hengestä ja suojapiiristä. Esimerkiksi sanonnan "immobilisoidut entsyymit" tarkoitetaan tässä käytettynä sisältävän yksittäisen entsyymin, joka on immobilisoitu sopivalle kanto-aineelle ja yksittäisen entsyymityypin, joka on eristetty kahdesta tai useammasta lähteestä, tai kaksi tai useampaa entsyymityyppiä, jotka on samalla tavoin immobilisoitu. Jälkimmäisessä tapauksessa nämä useat entsyymit on voitu immobilisoida samalle kantoaineelle tai eri kantoaineille, jotka sitten on sekoitettu yhteen käyttöä varten. Muut muutokset ovat ilmeisiä alaan normaalisti perehtyneille.

Claims (3)

71576

1. Menetelmä hiukkasmaiselle kantoaineelle immobilisoi-tujen entsyymien laktaasin ja glukoosi-isomeraasin desinfioimiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan immobilisoi-dut entsyymit kosketukseen dioktyylidietyleenitriamiinin ja/ tai trioktyylidietyleenitriamiinin laimean vesiliuoksen kanssa, jonka väkevyys ja vaikutusaika riittävät oleellisesti tappamaan saastuttavat mikro-organismit ilman merkittäviä' haitallisia vaikutuksia immobilisoituihin entsyymeihin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että laimea vesiliuos sisältää sekä diok-tyylidietyleenitriamiinia että trioktyylidietyleenitriamiinia.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immobilisoidut entsyymit on sijoitettu reaktoriin, jolla on kolonnimainen rakenne ja laimeaa vesiliuosta johdetaan kolonnin läpi vastavirtaperiaat-teella olosuhteissa, jotka riittävät leijuttamaan hiukkasmai-sen, immobilisoidun entsyymin.