NL8006772A - Werkwijze voor het desinfecteren van geimmobiliseerde enzymen. - Google Patents

Description

» * 70 1228

Titel: Werkwijze voor bet desinfecteren van gedemobiliseerde enzymen

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het desinfecteren van geïmmobiliseerde enzymen 3 zoals geirnebi lis eerde enzymen gebruikt voor de hydrolyse van lactose tot glucose en galactose.

5 In het algemeen kan de uitvinding vorder, tcegepast voor elk geïmmobiliseerd enzyme, zolang dit niet door het desinfecteermiddel nadelig wordt beïnvloed. Gemakshalve wordt echter de navolgende uiteenzetting beperkt tot geïmmobiliseerde enzymen, gebruik: bij de hydrolytische omzetting van lactose in glucose en galae-10 tose, doch dit mag niet worden cpgevat als een beperking van de geest en cmvang van de uitvinding.

In 197b bereikte de Franse ksaspreduktie het niveau van - ongeveer een miljoen ton, waarbij meer dan 5 miljoen ten wei als bijprodukt werd verkregen. Dergelijke vei bevat per liter 15 ongeveer 5-9 g proteïne, -5-50 5 lactose, 5-8 g minerale zouten en 1-2 g vet. Over de gehele wereld bedroeg de hoeveelheid uit vei beschikbare lactose in IJ"77 in totaal bijna 3,5 miljoen ton.

Ws'’ v^rd. i.n hi£2*v varn 2^2. bsscbc^v-d. 3I.3 esn νΛ7^.^Γν-wil verd geloosd in riolen of snrccen en rivieren, In verband ner de 20 b een eras n de b^zor^dn^nd over ml*1 •^nvs^'cnrrs** nn na·7 ve^d veel vei.

verwerkt tot een variëteit van dierlijks en menselijks voedingsmiddelen. Zo is bij voorbeeld door ie ontwikkeling van ultrafilters de mogelijkheid ontstaan om veiproteïne uit de wei af te scheiden. Dergelijk proteïne is van uitzonderlijke waarde. Ze 25 kan bij voorbeeld een 35 5!s concentraat van veiproteïne vetvrije melkpoeder in vele vcedïr.gstrodukter vet”'armen, bij voorbeeld In bakvaren, dranken en cevrcren desserts. De afscheiding van proteïnen uit wei leidt echter tot een vloeistoffractïe, het zogenaamde permeaat, dat tot voor kort weinig of geen vaarde had.

8 0 0 S 77 2 2

Door de komst van geïmmobiliseerde enzymen is echter de hydrolyse van de lactose in het permeaat, met of zonder demineralisering, commercieel haalbaar geworden. Door de aanwezigheid van glucose en galactose is gehydrolyseerde lactose veel zoeter en meer oplosbaar 5 dan lactose alleen. Het gehydrolyseerde produkt is derhalve een functionele zoetstof» die toegepast kan worden bij de bereiding van gebak, desserts op melkbasis en bevroren lekkernijen, zoals consumptie-ijs. Bovendien is het gehydrolyseerde produkt een doelmatig fermenteerbaar mengsel, dat geschikt is voor toepassing als 10 fermentatiesubstraat in bij voorbeeld de brouwerij-industrie en farmaceutische industrie.

Ook is het mogelijk de hydrolyse van de lactose in wei uit te voeren zonder een voorafgaande ultrafiltratie en met of zonder de-mineralisatie. Het produkt, dat nog proteïne bevat, is analoog aan 15 gehydrolyseerd permeaat en kan dan ook in de voedingsmiddelenindustrie worden toegepast, zoals reeds beschreven.

Be deskundigen zijn uiteraard verschillende methoden bekend voor het hydrolyseren van lactose. Enzymatische hydrolyse is bijzonder geschikt voor de bereiding van veedingsmiddelverwante produkten 20 en de toepassing van geïmmobiliseerde enzymen is bijzonder aantrekkelijk.

Zo wordt bij voorbeeld in 3iotechnol. Bioeng. l6_ (197*0 295 de bereiding van geïmmobiliseerd lactase en de toepassing daarvan voor de enzymatische hydrolyse van zure vei besproken. Het van zowel 25 schimmels ais gist geïsoleerde enzyme werd geïmmobiliseerd op met zirconiumoxyde beklede poreuze glasdeeltjes. Het substraat bestond uit hetzij een waterige lactoseoplcssing, hetzij uit zuur weiper-meaat,

In Biotechnol. Bioeng. io (197*0 397 wordt melding gemaakt van 30 de hydrolyse van lactose in zure wei met cehulp van lactase ( . -galaetosidase), geïmmobiliseerd op poreuze glasdeeltjes, met de nadruk cp de bereiding en karakterisering van een herhaald oruikoare katalysator voor de bereiding van zuivelproducten met een laag lac-tosegehalte. Gedeeltelijk gezuiverde lactases van Aspergillus niger, 8008772 *- * 3 »

Lactobacillus helveticus en Saceharomyces Lactis werden op poreuze glasdeeltjes geïmmobiliseerd. Het substraat bestond uit zure veipoeder, dat in water tot de geschikte vastestofccncentratie was gereconstitueerd. In sommige gevallen werd de gereconstitu-5 eerde zure wei van proteïne ontdaan door verhitting in een kokend waterbad gedurende 5 minuten.

Verder wordt in Biotechnol. Bioeng. l6 (197*0 689 de bereiding beschreven van geïmmobiliseerde lactase als onderdeel van * voortgezet onderzoek van de enzymatische hydrolyse van lactose.

10 Gebruik werd gemaakt van een schimmellactase, geïmmobiliseerd op met zirconiumoxyde beklede poreus glas en poreuze titaanoxyde— deeltjes. De verkregen geïmmobiliseerde ensympreparaten werden gebruikt voor de hydrolyse van lactose in gehele zoete wei, ge-hele zure wei, uitrafiltraat van zure vei en zuivere lactose.

I5 Zoals vermeld in Biotechnol. 3ioeng. l£ (197*0 295 was bacteriële verontreiniging van het weisucstraat een belangrijk probleem. De kolommen raakten verstopt door de voortdurende groei van micro-organismen. Toepassing van 2 % gluteraldehyde bij een pïï ’ran ^,0 bleek de bacteriën te doden, zonder dat de activiteit 20 van het geïmmobiliseerde enzym werd vernietigd. Ter plaatse wordt vermeld, dat in fabriekssituaties hygiënische maatregelen absoluut noodzakelijk zijn.

Het is echter duidelijk, dat commercieel mogelijke hygiënische of desinfecterende maatregelen nagenoeg alle verontreinigen-25 de micro-organismen doelmatig moeten kunnen vernietigen, zonder dat de geïmmobiliseerde enzymen merkbaar nadelig worden beïnvloed. Bovendien meet in gevallen, waarin het produkt bedoeld is voor toepassing in de voedingsmiddelenindustrie, het desinfectie-middel dikwijls voldoen aan overheiiscepalingen.

30 Tot nu toe was geen werkelijk bevredigend desinfeeterings- middel beschikbaar. Azijnzuur, dat gsweonlijk in de vorm van een verdunde waterige oplossing wordt tcegepast, geeft slechts matige resultaten. Andere bekende des infect eringsmiddeien, zoals halo geenderivaten, organische zuren, quatamaire ammoniumverbindingen, 8006772 Η * biguanidinepolymeren en dergelijke, zijn meestal ongeschikt vegens gedeeltelijke of volledige desactivering van de enzymen.

Er bestaat derhalve een behoefte aan een commercieel uitvoerbare desinfecteringsprocedure voor geïmmobiliseerde enzymen, die 5 doelmatig is zonder dat de geïmmobiliseerde ënzymen in betekenende mate nadelig worden beïnvloed.

Een doel van de uitvinding is derhalve het verschaffen van een werkwijze voor het desinfecteren van geïmmobiliseerde enzymen.

Een ander doel van de uitvinding is het verschaffen van een 10 werkwijze voor het desinfecteren van geïmmobiliseerde enzymen, waarmee nagenoeg alle-verontreinigende micro-organismen doelmatig worden vernietigd, zonder dat de geïmmobiliseerde enzymen in betekenende mate nadelig worden beïnvloed.

Volgens de uitvinding worden de geïmmobiliseerde enzymen in 15 aanraking gebracht met een verdunde waterige oplossing van ten minste een gesubstitueerd diethyleentriamine in een concentratie en gedurende een tijd, die voldoende zijn om nagenoeg alle verontreinigende micro-organismen te doden, zonder, dat de geïmmobiliseerde enzymen in betekenende mate nadelig worden beïnvloed, welk diethy-20 leent ri amine voldoet aan de op het formuleblad af geheelde formule, waarin R^, R,,, R^» R^ en R^ eerwaardige groepen zijn, (1) onafhankelijk gekozen uit waterstof en octyl, met dien verstande, dat ten minste twee van de groepen R^, , R^, R^ en R^ octyl voorstellen en (2) waarin en R^ waterstof voorstellen en R^5 R^ en R^ onaf-25 hankelijk worden gekozen uit waterstof, benzyl en lauryl, met dien verstande, dat van de groepen , R^ en R,- geen twee gelijk kunnen zijn.

Zoals bekend wordt lactose voor ten minste ongeveer 80 % ge-hydrolyseerd tot glucose en galactose, indien een lactose bevatten-30 de waterige oplossing door een kolom wordt gevoerd, die geïmmobiliseerd lactase bevat, gevoonlijk bij een temperatuur beneden ongeveer 60°C. Het effluent kan gedeeltelijk vorden geconcentreerd tot een stroop, die geschikt is als zoetmiddel in verschillende voedingsmiddelen.

8006772 5

De bij een dergelijke werkwijze gebruikte lactase wordt geproduceerd door een variëteit van micro-organismen, zoals schimmels, bacteriën en gisten. Schimmellactases zijn wellicht het meest gebruikelijk, bij voorbeeld lactases geïsoleerd uit Asnersallus 5 niger en Aspergillus orvzae. Technieken voor het isoleren van lactases uit micro-organismen zijn algemeen bekend.

Immobilisering van het enzyme wordt gemakkelijk tot stand gebracht volgens verschillende bekende methoden. Voor een recent overzicht van immobiliseringstechnieken kan worden verwezen naar 10 I. Chibata, Editor, "Immobilized Enzymes", Halsted Press, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1978» blz. 1-73· Hoewel de voor de immobilisering toegepaste methode niet kritisch schijnt te zijn, is de werkwijze volgens de uitvinding bijzonder geschikt voor toepassing met enzymen, gebonden aan in water onoplosbare dragers.

15 Desgewenst kunnen dergelijke dragers poreus zijn, waardoor een grote enzymebelading per eenheid van dragermassa mogelijk is, In het algemeen worden enzymen aan in water oplosbare dragers gebonden door fysische adsorptie, ionische binding, covalente binding of' enige combinatie daarvan.

20 De in water onoplosbare dragers kunnen in het algemeen orga nisch of anorganisch zijn. Voorbeelden van organische dragers zijn polyesters, zoals poly(ethyleentereftalaat); polyamiden, zoals nylon 6 en nylon 6.6; polyacrylaten; polymethacrylaten; polyacryl-amiden; poly(acrylzuur); poly(methacrylzuur); poly(galacturonzuur); 25 poly(aspartinezuur); etheen-maleinesuuranhydride copolymeren; polyalkenen, zoals polyetheen, polypropeen, polybuteen en poly-buta-dieen; polystyreen; poly(aninostyreen); poly(vinylchloride); poly-(vinylalcohol); poly(vinylideenchloride); cellulose en derivaten daarvan; agarosegels; dextrangels en derivaten daarvan; polysaccha-30 riden; polypeptiden; collageen; en dergelijke.

De anorganische dragers kunnen worden geclassificeerd als kiezelhoudende dragers en niet-kiezelhoudende metaaloxyden. Voorbeelden van kiezelhoudende dragers zijn glas, silica, vollas toniet, bentoniet, cordieriet en dergelijke. Voorbeelden van niet-kiezel-35 houdende metaaloxyden zijn alumina, spinel, apatiet, nikkeloxyde, 8006772 . 6 ~~ " ..........

titaanoxyde, zirkoonoxyde, en dergelijke.

In het algemeen kan de in water onoplosbare drager elke gewenste gedaante of vorm hebben. De drager kan korrelvormig zijn, variërend van een fijnverdeeld poeder tot een grof korrel vormig 5 materiaal, of kan een continu gevormd voorwerp zijn, zoals een vlak of gekromd vel of pellet, of een drie-dimensionaal voorwerp, zoals een rechthoekige of cilindrische buis of complex monoliet.

In de praktijk zal de drager echter meestal korrelvormg zijn. Voorbeelden van methoden voor het immobiliseren van enzymen 10 op anorganische dragers zijn te vinden in de Amerikaanse octrooi -schriften 3-519-538, 3-556-9^5, 3-666.627 en 3-802.997-

De volgens de uitvinding te gebruiken, gesubstitueerde diethy-leentriaminen en werkwijzen ter bereiding daarvan zijn bekend uit de Franse octrooischriften 2.080.797 en 2.110.303 en het Duitse 15 octrcoischrift 2.115-5^9- Deze verbindingen bezitten biocide eigenschappen. Bij voorkeur wordt het synergistische mengsel van dioctyldiethyleentriamine en trioctyldiethyleentriamine, beschreven in het genoemde Franse octrooi schrift 2.110.303 en in de handel verkrijgbaar onder de naam "Tego Diocto BS,T, bij de werkwijze vol-20 gens de uitvinding toegepast.

Dergelijke gesubstitueerde diethyleentriaminen worden gebruikt in verdunde waterige oplossingen, meestal met een concentratie van 0,1-0,5 gew.%, hoewel ook grotere of kleinere concentraties kunnen worden toegepast. In het algemeen kunnen de concentratie van het 25 gesubstitueerde diethyleentriamine, het totale volume van de waterige oplossing en de duur van de desinfecteringsbehandeling binnen ruime grenzen variëren, ten minste ten dele afhankelijk van het gebruikte gesubstitueerde diethyleentriamine, de mate van de micro-biële verontreiniging, de aanwezige micro-organisme(n) en de hoe-30 veelheid geïmmobiliseerd enzyme. De behandelingsomstandigheden of parameters kunnen echter gemakkelijk door een deskundige aan de hand van eenvoudige proeven worden bepaald.. In de meeste gevallen is een behandeling gedurende 15-30 minuten met 5-10 liter van een 0,1 gew. %'s desinfecterende oplossing van bij voorbeeld Tego 35 Dioctyl BS per kg geïmmobiliseerd enzyme bevredigend gebleken.

8006772 7 ...... ~ «· .

In een uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt het geïmmobiliseerde enzyme eenvoudig in een bad van de desinfecterende oplossing geplaatst. Desgewenst kan het bad worden geschud, geroerd, omge-pompt of op andere wijze in beroering worden gebracht.

5 In een andere uitvoeringsvorm wordt de desinfecterende oplos sing door een kolom of reactor gecirculeerd, die het geïmmobiliseerde enzyme bevat. Bij voorkeur geschiedt de circulatie van de desinfecterende oplossing in de richting, tegengesteld aan de stroming van de toevoeroplossing door de kolom of reactor. Indien 10 het enzyme is geïmmobiliseerd op een korrelvormige drager en indien de kolome of reactorconstructie zulks toelaat, is het wenselijk, dat de stroomsnelheid van de desinfecterende oplossing zodanig is, dat de geïmmobiliseerde enzymdeeltjes worden gefluidi-seerd. De fluidisatie voorkomt kanaalvorming en verzekert een 15 volledig contact van het geïmmobiliseerde enzyme met desinfecterende oplossing.

Het verdient opmerking, dat elke desinfecterende oplossing enige malen kan worden gebruikt, teneinde de kosten van de desinfecterende behandeling te reduceren. Indien de desinfecterende 20 oplossing wordt gerecirculeerd, kunnen echter aanvullende behandelingen gewenst of nodig zijn, bij voorbeeld filtratie ter verwijdering van celresten of aanpassing van de pH.

In een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding kunnen de gesubstitueerde dietkyleentriaminen worden opgenomen in de toevoer-25 oplossing, die door het geïmmobiliseerde enzyme moeten worden behandeld . Op deze wijze kan microbiële verontreiniging van de geïmmobiliseerde enzyme tot een minimum worden beperkt of zelfs geheel worden voorkomen. Uiteraard kan een dergelijke preventieve behandeling op zichzelf worden toegepast of in combinatie met een 30 der beschreven desinfecteringsprocedures.

De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht.

8006772 8

Voorbeeld I

Desinfectie van een reactor, geladen met geimmobiliseerde lactase, afkomstig van A^ niger, en gebruikt voor de hydrolyse van weipermeaat' 5 Na grondig spoelen met vater, teneinde organisch materiaal zoveel als mogelijk te verwijderen, werd een kolom, die geladen was met 1+5 kg geïmmobiliseerde, van A. niger afkomstige lactase, bereid door binding van het enzyme aan een korrelvormige silica-drager op de in het Amerikaanse octrooischrift 3.519·538 beschreven 10 wijze, gedurende ongeveer 20 min. behandeld door doorvoer door de • kolom in omgekeerde stroomrichting van een waterige 0,1 gew. %'s oplossing van lego Diocto BS in een hoeveelheid van 1000 liter per uur. Vervolgens werd de kolom met water gespoeld.

Telling van het aantal micro-organismen in het waswater 15 voor en na de desinfeeteringsbehandeling gaf de in tabel A vermelde resultaten.

TABEL· A

Voor Na Behandelings- _ _ rendement (1) 20 Totaal micro-organismen 1+70.000 6.000 98,7 %

Gisten en schimmels 1.550 65 95,8 % (1) voor ,-.aa voor

Deze resultaten tonen duidelijk de germicide werking van het gebruikte desinfecteringsmiddel.

25 Voorbeelden II-III Vergelijkende proeven

Er werden twee proeven uitgevoerd onder industriële omstandigheden, tijdens het bedrijf van de reactor of kolom van voorbeeldl met het geïmmobiliseerde enzyme. De toevoeroplossing bestond uit 30 weipermeaat met een pH van 3,5» waarbij de daarin aanwezige lactose werd gehydrolyseerd tot glucose en galactose. De kolocH of reactor-temperatuur werd op 38°C gehouden. Tijdens de proeven werd de verontreiniging van het effluent en de activiteit van de geïmmobiliseerde lactase dagelijks gemeten.

8 00 6 77 2 9

In de eerste proef, voorbeeld II, werd de reactor op de in voorbeeld I beschreven wijze gedesinfecteerd met Te go 'Diocto BS. Vervolgens werd de reactor dagelijks gedurende 30 minuten behandeld met 500 liter van een 0,1 gew. %'s waterige oplossing van azijn-5 zuur, die in een hoeveelheid van 1000 liter per uur door de reactor werd gevoerd.

In de tweede proef, voorbeeld III, die na de eerste proef werd uitgevoerd, werd de reactor opnieuw op de in voorbeeld I beschreven wijze gedesinfecteerd met Te go Diocto BS. Vervolgens werd de 10 reactor dagelijks behandeld met Tego Diocto BS onder dezelfde omstandigheden als de eerste desinfectie, behalve dat tevoren niet werd gespoeld.

Dé verontreiniging van het effluent, weergegeven als het aantal micro-organismen per cm^, is vermeld in tabel B, en de activiteit 15 van de geïmmobiliseerde lactase, uitgedrukt als Internationale Eenheden per g geïmmobiliseerd enzyme, is vermeld in tabel C.

TABEL B

Dag Totaal micro-organismen/cm Gisten/cm

Voorbeeld II

20 1 Eerste desinfectie van de reactor 2 180.000 150.000 3 980.000 780.000 k 1.200.000 800.000 5 1.390.000 (1) 9^0.000

25 Voorbeeld III

6 Tweede desinfectie van de reactor 7 510 200 8 1.500 800 9 3.300 1.100 30 10 5*800 1.100 11 en Voortzetting van de behandeling (2) volgende (1) Proef gestaakt wegens overmatige verontreiniging (2) Verdere behandeling bevestigde de vermindering van de veront- 35 reiniging als gevolg van de werkwijze volgens de uitvinding 8006772 10

TABEL· C

Dag Activiteit, I.E./g Gemiddelde activiteit, I.E./g

Voorbeeld II

1 Eerste desinfectie van de reactor 5 2 159

3 18U

U 165 5 168 169

Voorbeeld ΠΙ 10 6 Tweede desinfectie van de rea ctor T 161 (1) 8 189 9 176 10 188 15 U 20k 12 198 ' 186 (1) De activiteit was afwijkend door stromingsproblemen De voorbeelden II en III tonen duidelijk, dat door de werkwijze volgens de uitvinding de microbiële verontreiniging veel doelmati-20 ger (met een factor van ten minste 10^) wordt bestreden dan door toepassing van azijnzuur. Tevens is de werkwijze volgens de uitvinding veel minder schadelijk voor het geïmmobiliseerde enzyme. Tego Diocto BS heeft in concentraties van 0,1-0,5 gew. % geen invloed op de enzymatische activiteit van oplosbaar lactase, afkomstig van 25 A. niger, d.w.z. op het niet geïmmobiliseerde enzyme.

De voorbeelden II en III tonen derhalve duidelijk, dat de werkwijze volgens de uitvinding een uitstekende desinfecteringsbe-handeling voor reactors met geïmmobiliseerd enzyme is.

Voorbeeld IV

30 Onderzoek van het effekt van de werkwijze volgens de uitvinding op geïmmobiliseerd, van A. oryzae afkomstig lactase, gebruikt voor de hydrolyse van lactose A. Variatie van de enzymatische activiteit met de tijd

De variatie van de enzymatische activiteit van geïmmobiliseerd, 35 van Aj_ oryzae afkomstig lactase werd onder laboratoriumomstandighe- 8006772 11 den bepaald voor elk van drie verschillende gevallen: (l) gebruik van het geimmobiliseerde lactase voor de hydrolyse van een lactose-oplossing met een pH van U,2 en een temperatuur van 35°C (referentieproef) ; (2) gebruik van het geïmmobiliseerde lactase na desin-5 fectie in de gefluïdiseerde toestand gedurende 30 min. met een 0,1 gew.^’s oplossing van Tego Diocto BS, voor de hydrolyse van de zelfde lacboseoplossing als in de referentieproef werd gebruikt; en (3) gebruik van het geïmmobiliseerde lactase van de referentieproef voor de hydrolyse van een lactoseoplossing met een pH van 1*,5 en een 10 temperatuur van 35°C, velke oplossing tevens 0,1 gew.* Tego Diocto BS bevat. De resultaten zijn samengevat in tabel D.

TABEL D

Tijd, Enzymatische activiteit, I.E./g.

uren Geval 1 Geval 2 Geval 3 15 2 Uk lik 125 3 120 Uk 125

k 129 119 13V

5 12k 11T 132

Gemiddeld 121 llé 129 20 Deze resultaten tonen, dat de enzymatische activiteit van het geïmmobiliseerde lactase nagenoeg niet wordt beïnvloed door contact met de desinfecterende oplossing en dat de hydrolyse van lactose zelfs in tegenwoordigheid van het desinfecteringsmiddel normaal verloopt.

25 B. Vergelijking van de effekten van herhaalde behandelingen

De proeven werden in de loop van vijf dagen uitgevoerd. Elke dag werd de lading geïmmobiliseerd, van oryzae afkomstige lactase gedurende 16 uren gebruikt voor de hydrolyse van een lactoseoplossing bij een pH van ^ en een temperatuur van 35°C. Vervolgens 30 werd de lading gedurende 30 min. in geflui dis eerde toestand behandeld met hetzij een 1 gew. %'s azijnzuurcplossing (referentieproef), hetzij een 0,1 gew. %'s oplossing van Tego Diocto BS (proef volgens de uitvinding). De resultaten zijn vermeld in tabel E.

8006772 ~4 12

TABEL E

Tijd, Enzymatische activiteit, I.E./g dagen Referent iep roef Proef volgens de uitvinding 1 lk3 135 5 2 Ikk 151 3 139 127

k 155 lU

5 126 I2k

De resultaten tonen, dat de twee behandelingen geen signifi-10 cante verschillen in enzymatische activiteit opleveren.

De toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding als een routinebehandeling voor geïmmobiliseerd, van oryzae afkomstige lactase kan echter worden aanbevolen. Zoals eerder aangetoond, zijn de desinfecteringsmiddelen, die bij de werkwijze volgens de uitvin-15 ding worden toegepast, veel doelmatigere germiciden dan azijnzuur. Bovendien heeft de werkwijze volgens de uitvinding duidelijk geen nadelige effekten op geïmmobiliseerde, van A» oryzae afkomstige lactase.

Hoewel de uitvinding primair is beschreven met betrekking tot 20 de desinfectie van geïmmobiliseerde lactase, zal duidelijk zijn, dat zij ook kan worden toegepast voor andere geïmmobiliseerde enzymen. Zo worden bij voorbeeld bepaalde geïmmobiliseerde enzymsyste-men gebruikt in de voedingsmiddelenindustrie en in de farmaceutische industrie, zoals geïmmobiliseerde glucoamylase, glucose isome-25 rase en penicilline acylase.

Het volgende voorbeeld toont de toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding voor het desinfecteren van een geïmmobiliseerde glucose isomerase, die gebruikt wordt voor omzetting van glucose in fructose.

30 Voorbeeld V

Glucose isomerase werd op de in het Amerikaanse octrooi-schrift 3.868.30^ beschreven wijze geïmmobiliseerd op een alumina-drager. Dit systeem is gevoelig voor variaties in de osmotische druk van het waterige medium, waarin het aanwezig ia. Het systeem wordt 8 0 0 6 77 2 13 industrieel toegepast ter verkrijging van fructose uit glucose-oplossingen, die in totaal ^5-50 % vaste stof bevatten en een pH van. ongeveer 8,¼ en een temperatuur van ongeveer 60°C hebben.

Door laboratoriumproeven, waarbij industriële omstandigheden 5 werden nagebootst, werden de volgende parameters bestudeerd: A. Het verlies van enzymatische activiteit bij spoelen met water bij een pH van 8,¼ en een temperatuur van 60°C; B. het verlies van enzymatische activiteit bij de behandeling bij dezelfde pH en temperatuur met een 0,1 gew.^'s waterige oplossixg 10 van Te go Diocto BS.

De enzymatische activiteit werd dagelijks bepaald op basis van 16 uren continue fructos eproduktie. De verkregen gegevens zijn samengevat in tabel F.

TABEL F

15 Parameter Dag Reactor- % Omzetting Activiteit, _output, car/uur (l) I.E./g A 1 T3 39 169

Spoelen met water gedurende 90 minuten 20 2 72,6 32 116 B 1 77 UO 189 Γ- Behandeling met desinfectans gedurende 90 minuten 2 77 33 128 25 (l) Percentage glucose in de toevoeroplossing, omgezet in fructose

In beide gevallen werd een verlies van enzymatische activiteit van ongeveer 30 % waargenomen. Dit verlies werd veroorzaakt door de desorptie en elutie van het enzyme uit de alumina drager, 30 wanneer het geïmmobiliseerde enzyme werd blootgesteld aan een meer verdunde oplossing met een aanmerkelijk grotere osmotische druk. Er kan derhalve geen waarneembare daling van de enzymatische activiteit worden toegeschreven aan de behandeling van het geïmmobiliseerde enzyme met desinfectants.

35 Uiteraard dient de voorgaande gedetailleerde beschrijving 8006772

Ik slechts als voorbeeld. Vele variaties zijn mogelijk» zonder dat buiten het kader van de geest en de omvang van de uitvinding wordt getreden. Zo wordt onder "geïmmobiliseerde enzymen” een enkel op een geschikte drager geïmmobiliseerd enzyme verstaan, alsook een 5 enkel enzymtype, geïsoleerd uit twee of meer bronnen, of twee of meer enzymtypen, op analoge wijze geïmmobiliseerd. In het laatstbedoelde geval kunnen de verschillende enzymen op dezelfde drager geïmmobiliseerd zijn, maar ook op verschillende dragers, die vervolgens voor het gebruik zijn gemengd.

i 8 00 6 77 2

Claims (6)

1. Werkwijze voor het desinfecteren van geïmmobiliseerde enzymen, met het kenmerk, dat de geïmmobiliseerde enzymen in aanraking worden gebracht met een verdunde waterige oplossing van ten minste een gesubstitueerd diethyleentriamine in een concentratie en gedu- 5 rende een tijd, die voldoende zijn om nagenoeg alle verontreinigende microorgaaismen te doden zonder aanmerkelijk nadelig effekt op de geïmmobiliseerde enzymen. *

2. Werkwijze volgens conclusie-1, met het kenmerk, dat het diethyleentriamine voldoet aan de op het formuleblad afgebeelde formule, 10 waarin B^, Rg, R^» en R^ eenwaardige groepen voorstellen, (l) onafhankelijk gekozen uit waterstof en octyl, met dien verstande, dat ten minste twee van de groepen R^, R^, R^» R^ en R^ octyl, moeten zijn, en (2) waarin R^ en R^ waterstof voorstellen en R^, R^ en R^ onafhankelijk worden gekozen uit waterstof, benzyl en lauryl, met 15 dien verstande, dat van de groepen R^, R^ en R^ geen twee gelijk zijn. <

3. Werkwijze volgens conclusies 1-2, met het kenmerk, dat als· gesubstitueerd diethyleentriamine dioctylethyleentriamine en/of trioc-tyldiethyleentriamine wordt gebruikt. 20 k. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de verdunde waterige oplossing zowel dioctyldiethyleentri amine als trioctyldi-etbyleentriamine bevat.

5. Werkwijze volgens conclusies 1-¼, met het kenmerk, dat de enzymen zijn geïmmobiliseerd op een korrelvormige drager.

6. Werkwijze volgens conclusie 5» met het kenmerk, dat de geïmmobiliseerde enzymen zich bevinden in een reactor met een kolomvormige configuratie en de verdunde waterige oplossing door de kolom wordt gevoerd in een richting, tegengesteld aan die van de toevoeroplos-sing, onder zodanige omstandigheden dat het korrelvormige geimmo- 30 biliseerde enzyme wordt gefluïdiseerd. 7* Werkwijze volgens conclusies 1-6, met het kenmerk, dat een of meer van de gesubstitueerde diethyleentriaminen in de toevoeroplos- 8006772 sing wordt opgenomen.

8. Werkwijze volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat de enzymen zijn geïmmobiliseerd op een korrelvormige anorganische drager en gekozen worden uit lactase en glucose isomerase. 8006772