FR2471192A1 - Procede de desinfection de reacteurs a enzymes immobilises - Google Patents
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-
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- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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Abstract
L'INVENTION SE RAPPORTE AUX REACTEURS ENZYMATIQUES. ELLE CONCERNE PLUS PARTICULIEREMENT UN PROCEDE DE DESINFECTION D'UN REACTEUR A ENZYME IMMOBILISE, CARACTERISE EN CE QU'ON MET EN CONTACT LES ENZYMES A DESINFECTER AVEC UNE SOLUTION AQUEUSE DILUEE D'AU MOINS UNE DIETHYLENETRIAMINE SUBSTITUEE A PROPRIETES BIOCIDES PENDANT UN TEMPS SUFFISANT POUR ASSURER L'EFFET DE DESINFECTION DESIRE. APPLICATION NOTAMMENT A LA DESINFECTION DES REACTEURS A LACTASE IMMOBILISEE UTILISES POUR HYDROLYSER LE LACTOSE PROVENANT DU LACTOSERUM.
Description
- 1- -
L'invention concerne un procédé de désinfection de réacteurs à enzymes immobilisés, en particulier mais non exclusivement des réacteurs utilisés pour l'hydrolyse
du lactose, provenant du lactosérum, en glucose et galac-
tose. En 1976, la production fromagère française a atteint environ 1 million de tonnes correspondant à la
production de plus de 6 millions de tonnes de lactosé-
rum. le lactosérum contient environ par litre: 6 à 7 grammes de protéines, 45 à 50 grammes de lactose, 6 à 8 grammes de sels minéraux et 1 à 2 grammes de matières grasses. Dans le passé, le lactosérum était rejeté en
rivières mais le renforcement de la lutte contre les pol-
lutions a conduit à chercher des utilisations pour le lac-
tosérum, en particulier pour l'alimentation humaine. Ain-
si, on sait maintenant séparer par ultrafiltration les
protéines du lactosérum et ces protéines, qui ont une ex-
ceptionnelle valeur nutritive, ont des utilisations en
alimentation humaine. Le développement de l'ultrafiltra-
tion du lactosérum est toutefois freiné par le manque de
débouchés pour le perméat (jus lactosé) dont la valorisa-
tion a été jusqu'à présent difficile. Un débouché possi-
ble est celui de l'utilisation directe du perméat en ali-
mentation animale mais la valorisation du lactosérum pour cette utilisation est très faibles Aussi s'est-on tourné vers la déminéralisation du perméat, par exemple par échange d'ions ou électrodialyse, pour l'élimination des sels minéraux, et vers l'hydrolyse du lactose restant en glucose et galactose. Cette hydrolyse est intéressante car, alors que le lactose ne possède qu'un faible pouvoir
sucrant, le mélange glucose-galactose a un pouvoir su-
crant important qui permet son emploi, par exemple, en confiserie, dans la fabrication de desserts lactés, de
crèmes glacées, comme substrat de fermentation en brasse-
rie, dans l'industrie pharmaceutique, etc...
En variante, on peut aussi réaliser directement h -2- l'hydrolyse du lactose dans le lactosérum déminéralisé ou non pour obtenir après séchage partiel un préconcentré de protéines et de sucres qui peut être directement utilisé
dans les industries alimentaires.
Afin de réaliser cette hydrolyse du lactose en glucose et galactose, la Demanderesse a mis au point un procédé d'hydrolyse par voie enzymatique selon lequel on
fait passer la solution contenant le lactose dans une co-
lonne garnie d'un enzyme lactase ou V-galactosidase inso-
lubilisé ou stabilisé par fixation sur un support minéral
poreux approprié en particules à une température infé-
rieure à 600C, et à recueillir à la sortie de la colonne une solution de lactose hydrolysé, en général.à raison
d'au moins 80% environ, en glucose et galactose. Après sé-
chage partiel de cette solution, on obtient un sirop uti-
lisable pour l'alimentation humaine.
la lactase ou P-galactosidase peut être produi-
te, de façon connue, à partir de divers micro-organismes, en particulier de Bacillus ou de fungi comme Aspergillus
Niger ou Aspergillus Oryzae.
La fixation de l'enzyme à un support peut 9tre
effectuée de diverses manières également connues. Par exem-
ple, on peut la fixer sur un support minéral poreux comme décrit dans les brevets français 2 001 336, 2 020 527 et 2 020 661, qui décrivent également des supports minéraux utilisables. On peut aussi immobiliser l'enzyme actif sur
des supports organiques divers ou bien réticuler ou inclu-
re dans un gel des cellules de micro-organismes producteurs
d'enzymes afin de les utiliser directement dans un réac-
teur enzymatique.
Au cours des essais entrepris par la Demande-
resse, on s'est aperçu toutefois que le garnissage d'enzymè immobilisé avait tendance à se colmater et-à se dégrader
au bout d'un certain temps de service, par suite de la pré-
sence de micro-organismes dans la solution de lactose, avec pour résultat une production réduite en produit hydrolysé
et une contamination du produit hydrolysé.
-3 Il s'est donc avéré qu'il était nécessaire de procéder périodiquement à une désinfection du garnissage
d'enzymes immobilisés.
Cette désinfection pose, toutefois, un problè-
me difficile car il faut utiliser un produit sélectif qui
détruira efficacement les micro-organismes mais qui n'exer-
ce, en même temps, aucun effet néfaste appréciable sur les
enzymes immobilisés, c'est-à-dire ne provoque ni inactiva-
tion, ni destruction desdits enzymes. Au surplus, le pro-
duit sélectif doit 4tre agréé pour utilisation dans l'in-
dustrie alimentaire.
Jusqu'à présent on ne disposait d'aucun produit
désinfectant vraiment satisfaisant, l'acide acétique uti-
lisé couramment, sous forme de solution aqueuse diluée, ne
donnant que des résultats médiocres.
La Demanderesse a donc entrepris des recherches
intensives en vue de trouver un produit ayant l'action sé-
lective recherchée. Ces recherches ont porté sur l'emploi de très nombreux produits tels que des dérivés halogénés
(désinfectants), des acides organiques (agents de conserva-
tion alimentaires), des dérivés d'ammonium quaternaire, des polymères de biguanidine, etc... et ont montré qu'aucun de
ces produits ne convenait, provoquant tous-une désactiva-
tion des enzymes.
C'est donc, de façon surprenante, que la Deman-
deresse a finalement trouvé que certaines diéthylènes tria-
mines substituées, connues comme biocides, présentaient
l'action sélective désirée.
L'invention concerne donc un procédé de désin-
fection de réacteurs à enzymes immobilisés, caractérisé en ce qu'on met en contact les enzymes à désinfecter avec une solution aqueuse diluée d'au moins une diéthylènetriamine substituée à propriétés biocides pendant un temps suffisant pour assurer l'effet de désinfection désirée Des diéthylènetriamines substituées utilisables sont décrites dans les brevets français no 2 080 797 et 2 110 303 et dans le brevet allemand 2 115 549, tous au
24711 92
-4 - nom de la Société allemande Tho GOLDSCHMIDT AG, dont les enseignements sont incorporés ici par référence. A ce jour, on préfère utiliser le mélange synergique à base de
dioctyl diéthylène triamine et de trioctyl diéthylènetri-
amine décrit dans le brevet français 2 110 303 précité et qui est disponible dans le commerce sous la dénomination "Tego Diocto BS" (fabriqué par la Société Th. GOIDSCHMIDT AG). Ce produit présente, en outre, l'avantage d'4tre
agréé pour l'utilisation dans l'industrie alimentaire.
Le procédé de l'invention peut 8tre mis en
oeuvre soit pour décontaminer un réacteur à enzymes im-
mobilisés contaminés par des micro-organismes, soit, de façon routinière, pour contrôler la contamination dans
le produit traité dans un réacteur à enzymes immobilisés.
Les diéthylènetriamines substituées biocides sont utilisées en solution aqueuse diluée, par exemple à une concentration de 0,1 à 0,5% en poids environ. La quantité de solution aqueuse à utiliser et la durée du traitement de désinfection peuvent varier dans de larges limites en fonction de l'importance de la contamination -du réacteur, de la nature de la contamination et, bien entendu, de la taille du réacteur à traiter. Le plus souvent, un traitement d'une durée de 15-30 minutes par à 10 litres d'une solution aqueuse à 0,1% en poids de Tego Diocto BS par kilogramme d'enzymes immobilisés à désinfecter, s'est révélé satisfaisante La mise en contact des enzymes immobilisés avec la solution aqueuse de désinfectant peut s'effectuer de diverses manières A ce jour, on préfère faire passer la solution de désinfectant à contre-courant dans la colonne garnie d'enzymes immobilisés, c'est-à-dire dans le sens opposé à celui dans lequel on fait passer normalement le produit
soumis à l'action des enzymes (par exemple le jus lactosé-
à hydrolyser), avec un débit tel qu'il se produise une "fluidisation" des particules d'enzymes immobilisés. Une telle fluidisation s'accompagne d'une agitation desdites -5 particules qui favorise un bon contact entre les enzymes
immobilisés à désinfecter et la solution de désinfectant.
En variante, on peut décharger la charge d'enzy-
mesimmobilisés de la colonne (réacteur) et la traiter par la solution de désinfectant dans un récipient séparé muni
de moyens d'agitation.
Il est à noter qu'on peut utiliser plusieurs fois la solution de désinfectant, par exemple en prévoyant un système de recyclage, afin de réduire le codt de
l'opération de désinfection.
Selon une autre variante, on peut ajouter direc-
tement le désinfectant au produit à traiter devant passer
dans le réacteur enzymatique.
Les exemples non limitatifs et les essais compa-
ratifs présentés ci-après sont donnés dans le but d'illus-
trer la présente invention.
EXEMPLE 1 - Désinfection d'un réacteur garni de lactase d'A. Niger immobilisée servant à l'hydrolyse de jus lactosé: Après avoir abondamment rincé le garnissage
d'enzymes avec de l'eau afin d'éliminer le maximum de ma-
tières organiques, on a traité pendant 20 minutes environ
une colonne garnie de 45 kg de lactase d'A. Niger immobi-
lisée sur silice par le procédé du brevet français
2 020 527, en y faisant passer à contre-courant une solu-
tion aqueuse à 0,1% de Tego Diocto BS à un débit de /h. Après quoi, on a rincé la colonne avec de l'eauo La détermination des germes sur les eaux de rinçage avant et après le traitement de désinfection a donné les résultats suivants: i Avant i Après Taux de destruction germes totaux 470 000 6000 98,7%
levures + moi-
sissures 1 550 65 95,8% Ces résultats montrent bien l'effet germicide du désinfectant utilisée - 6- EXEMPIE 2 et essai comparatif A - Désinfection
d'un réacteur garni de lactase d'A. Niger immobilisée ser-
vant à l'hydrolyse d'un perméat de lactosérum ultrafiltré
en traitement de routine-pour contr8ler le niveau de conta-
mination: On a procédé à deux essais effectués dans les conditions industrielles de fonctionnement d'un réacteur garni de 45 kg environ de lactase d'A. Niger immobilisée
sur silice et servant à l'hydrolyse d'un perméat de lacto-
sérum ultrafiltré (3800, pH = 3,5) en glucose et galactose
et on a suivi l'évolution de la contamination sur le pro-
duit obtenu. Dans le premier essai (essai comparatif A) on a effectué une décontamination du réacteur à l'aide de Tego Diocto BS comme décrit à l'Exemple 1, puis on a opéré ensuite des traitements quotidiens du réacteur à l'aide d'une solution aqueuse à 1% en poids d'acide acétique (500 litres de solution, débit de 1000 litres/heure,
traitement pendant 30 minutes).
Dans le deuxième essai (Exemple 2) effectué à
la suite du premier essai, on a effectué une décontamina-
tion du réacteur à l'aide de Tego Diocto BS comme décrit à l'Exemple 1, puis on a opéré ensuite des traitements quotidiens du réacteur à l'aide de Tego Diocto BS dans les m4mes conditions que la décontamination initiale sauf
qu'on n'a pas opéré de rinçage préliminaire.
Le Tableau suivant récapitule les résultats
obtenus: -
Jours Flore totale/ml I Levures/ml I I de nroduit Ide oroduit! 1 lère désinfection du réacteur
2 180 000 150 000
3 980 000 780 000 Essai 4 1 200 000 800 000 comparatif A
1 390 000* 940 000*
6 2ème désinfection du réacteur
?471192
- 7 - Flore totale/ml de produit Levures/ml de Produit
7 510 200
8 1 500 800
9 3 300 - 1 100 Exemple
5 800 1 100 2
si et suivants poursuites des opérations ** suivants * On a arrêté là l'essai, le produit obtenu étant trop contaminé ** Les opérations ultérieures confirment la réduction de la contamination microbienne grâce au traitement de l'invention. EXEMPLE 3 et essai comparatif B - étude de l'influence du traitement de l'invention sur l'activité 19 pnzvmatnial À Au cours des deux essais décrits à l'Exemple
précédent, on a également déterminé l'influence du traite-
ment de désinfection (au CH3C00OH dans l'essai comparatif B et au Tego Diocto BS à 0,1% dans l'Exemple 3) sur l'enzyme
immobilisé en mesurant l'activité enzymatique.
Activité enzymatique, Activité Jours Unités internationa- enzymatique les/g d'enzyme immo- moyenne hi i é
2 159
Essai 3 184 comparatif 4 165 169 B
B 4 165
168
7 161 *
8 189
Exemple 9 176
3 10 188 186
11 204
12 198
* Le résultat a été faussé par des problèmes de débit.
Les exemples 2 et 3 et les essais comparatifs Jours m
2-471 1 92
_-8-
A et-B montrent bien que le traitement de désinfection se-
lon l'invention assure un contrôle de la contamination beau-
coup plus efficace (par un facteur d'au moins 103) que l'acide acétique, tout en présentant une innocuité-plut t supérieure à celle de l'acide acétique vis-à-vis de l'en-
zyme. Cette innocuité a pu être confirmée par le fait que -
le Tego Diocto BS, à des concentrations de 0,1 à 0,5% en poids d'affecte pas l'activité enzymatique de la lactase
d'A. Niger soluble, c'est-à-dire non immobilisée.
Ceci démontre bien que le traitement de l'in-
vention constitue un traitement de désinfection de choix
pour réacteurs enzymatiques.
EXEMPLE 4 - Etude de l'influence du traitement
de l'invention sur la lactase d'Ao Oryzae-immobilisée ser-
vant à l'hydrolyse de lactose: A) Etude cinétique comparée: On a déterminé, en laboratoire, les variations
de l'activité enzymatique de la lactase d'A. Oryzae immo-
bilisée dans trois cas différents: (a) utilisation de la lactase immobilisée telle que produite pour l'hydrolyse d'une solution de lactose à pH = 4,2 et à une température
de 35 C (essai témoin); (b) utilisation de la lactase im-
mobilisée, après désinfection avec du Tego Diocto BS à
0,1% en poids de la charge de lactase immobilisée à 1'é-
tat fluidisé pendant 30 minutes, pour l'hydrolyse d'une solution de lactose à pH = 4,2 et à une température de C; et (c) utilisation de la lactase immobilisée telle que produite pour l'hydrolyse d'une solution de lactose contenant 0,1% en poids de Tego Diocto BS et ayant un pH de 4,5 à une température de 3500. Les résultats obtenus sont résumés dans le Tableau ci-après: Temps, Activité enzymatique, U.I./g d'enzymie immobilisé heures I a (témoin)b c
2 114 114 125
3 120 - -114 125
4 129 119 134
124 117 132
Moyenne 121 11,6 129
2471 1 92
- 9 -
Ces résultats montrent que l'activité enzymati-
que n'est pas affectée par le contact avec le désinfectant
et que l'hydrolyse est possible, m9me en présence du désin-
fectant. B) Effets comparés de traitemens réipétés: On a conduit des essais d'une durée de cinq jours. Chaque jour, la charge d'enzyme immobilisée a été utilisée pendant 16 heures pour hydrolyser une solution de
lactose à pE 4 et à une température de 35 C, puis on a trai-
té la charge d'enzyme soit à l'aide d'une solution d'acide
acétique à 1% en poids pendant 30 minutes dans des condi-
tions de fluidisation de la charge d'enzyme (essai-témoin), soit à l'aide d'une solution de Tego Diocto BS à 0,1% en
poids pendant 30 minutes dans des conditions de fluidisation.
Les résultats obtenus sont résumés dans le ta-
bleau ci-après: Temps, Activité enzymatique, U.Io/g d'enzyme immobilisé Jours essai témoin essai selon l'invention
1 143 135
2 144 - 151
3 139 127
4 155 144
126 124
Ces résultats montrent qu'il n'y a pas de diffé-
rence significative au niveau de l'activité enzymatique en-
tre les deux traitements.
En conclusion, en raison de l'efficacité germi-
cide puissante du traitement de l'invention comparée à celle
du traitement à l'acide acétique, et de l'innocuité du trai-
tement de l'invention vis-à-vis de la lactase d'A. Oryzae immobilisée, on peut recommander l'utilisation du traitement
de l'invention en traitement de routine.
Bien que l'invention ait été décrite jusqu'à présent plus particulièrement à propos de la désinfection
d'enzymes lactases, il y a lieu de comprendre que le procé-
t
- 10 -
dé de l'invention peut être appliqué à d'autres types d'en-
zymes. Certains systèmes enzymatiques sont déjà couramment
utilisés dans l'industrie alimentaire, par exemple gluco-
amylase immobilisée et glucose isomérase immobilisée, ou dans l'industrie pharmaceutique, par exemple pénicilline-
acylase immobilisée.
L'exemple 5 ci-après illustre l'emploi du trai-
tement désinfectant de l'invention sur la glucose isomérase immobilisée par le procédé décrit dans le brevet français no 2 218 385 et utilisée pour convertir le glucose en fructose. SXEMPIE 5 - Effet du traitement de l'invention sur la glucose isomérase immobilisée: On utilise une glucose isomérase absorbée sur
un support en alumine. Cet enzyme est sensible aux varia-
tions de pression osmotique du milieu et/ou à la présence de sels minéraux en solution. En production industrielle, elle est utilisée pour isomériser le glucose en solution
à 45-50% de solides totaux à pH = 8,4 et à 60eC, en fruc-
tose.
Dans des essais de laboratoire simulant les conditions industrielles, on a déterminé: I) la perte d'activité enzymatique liée au rinçage avec de l'eau à pH = 8,4 et à 600C; II) la perte d'activité enzymatique liée au traitement avec
du Tego Diocto BS à 0,1% en poids dans les mêmes con-
ditions de pH et de température.
Les activités enzymatiques ont été déterminées
chaque jour sur 16 heures de production continue.
- 11 -
Débit du réacteur cm3/h % de conversion du glucose en fructose U.I./g d'enzyme Rinçage à l'eau pendant 90 minutes
1 Rinag a-
72,6 _I
1 77 40 189
Traitement au Tego Diocto BS pendant minutes
- - 2 77.33 128
Dans les deux cas, on observe une perte d'acti-
vité de l'ordre de 30%. Cette perte est liée à la désorp-
tion et à l'élution de l'enzyme lors du contact avec une
solution diluée.
Comparativement, on n'observe pas de désactiva-
tion résultant d'une attaque de l'enzyme par le désinfec-
tant de l'invention.
Jour I 1.0 -12 -
Claims (5)
1.- Un procédé de désinfection d'un réacteur à enzyme immobilisé, caractérisé en ce qu'on met en contact les enzymes à désinfecter avec une solution aqueuse diluée d'au moins unediéthylènetriamine substituée à propriétés biocides pendant un temps suffisant pour assurer l'effet de désinfection désiréo
2.- Un procédé selon la revendication 1, carac-
térisé en ce qu'on utilise une solution aqueuse diluée d'un
mélange à base de dioctyldiéthylènetriamine et de trioctyl-
diéthylènetriamine.
3.- Un procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le réacteur est sous la forme d'une
colonne et en ce qu'on fait passer la solution aqueuse di-
luée à contre-courant dans ladite colonne avec un débit
suffisant pour fluidiser les particules d'enzyme immobili-
se.
4.- Un procédé selon la revendication 1 ou 2,
caractérisé en ce que la solution aqueuse diluée est incor-
porée dans le produit devant passer dans le réacteur.
5.- Un procédé selon l'une quelconque des reven-
dications 1 à 4, caractérisé en ce que l'on désinfecte un
réacteur garni de lactase immobilisée.
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