JP3170602B2 - 非晶質のキチンを基質とする酵素によるｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンの製造方法 - Google Patents
非晶質のキチンを基質とする酵素によるｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンの製造方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、例えば甘味料等
として使用可能なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製
造方法、より詳しくは、非晶質のキチンを基質とする酵
素によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法に
関する。
として使用可能なＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製
造方法、より詳しくは、非晶質のキチンを基質とする酵
素によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、Ｄ−グルコサミンは、軟骨組
織の誘導効果を有することが知られており、欧米では変
形性関節症の治療薬として認可を受けている。一方、わ
が国では食品添加物として認可を受けており、主に甘味
料として使用されている。しかしながら、このＤ−グル
コサミンは、甘さを呈するものの、若干の渋みを伴うの
で、食品添加物として使用するには味覚の点から問題が
ある。
織の誘導効果を有することが知られており、欧米では変
形性関節症の治療薬として認可を受けている。一方、わ
が国では食品添加物として認可を受けており、主に甘味
料として使用されている。しかしながら、このＤ−グル
コサミンは、甘さを呈するものの、若干の渋みを伴うの
で、食品添加物として使用するには味覚の点から問題が
ある。
【０００３】これに対し、Ｄ−グルコサミンがＮ−アセ
チル化された単糖であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンは、さわやかな甘さを呈するので、Ｄ−グルコサミン
に代わり得る化合物として注目を集めており、これを大
量に製造する方法の開発が望まれている。
チル化された単糖であるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンは、さわやかな甘さを呈するので、Ｄ−グルコサミン
に代わり得る化合物として注目を集めており、これを大
量に製造する方法の開発が望まれている。
【０００４】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、例え
ばカニ、エビ、イカ等の細胞壁等を構成するキチンの構
成単位であるので、このキチンを何らかの方法で分解で
きればＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造が可能で
あるが、このために大きく分けて、強酸による分解とキ
チン分解酵素による分解の２つの方法が知られている。
ばカニ、エビ、イカ等の細胞壁等を構成するキチンの構
成単位であるので、このキチンを何らかの方法で分解で
きればＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造が可能で
あるが、このために大きく分けて、強酸による分解とキ
チン分解酵素による分解の２つの方法が知られている。
【０００５】強酸を用いる方法としては、例えば、 (1) 図１(c) 及び図１(d) に示すように、キチン４を強
酸で完全に加水分解して得られるＤ−グルコサミン１０
を、ナトリウムメトキシドと無水酢酸で化学的に変換
（Ｎ−アセチル化）することによって製造する方法（In
oue, Y.; Onodera, K.; Kitaoka, S.; Hirano, S.; J.
Am. Chem. Soc., 78, 4722-4724, 1956）等が知られて
いる。
酸で完全に加水分解して得られるＤ−グルコサミン１０
を、ナトリウムメトキシドと無水酢酸で化学的に変換
（Ｎ−アセチル化）することによって製造する方法（In
oue, Y.; Onodera, K.; Kitaoka, S.; Hirano, S.; J.
Am. Chem. Soc., 78, 4722-4724, 1956）等が知られて
いる。
【０００６】また、キチン分解酵素を用いる方法として
は、図１(e) に示すように、キチン分解酵素１１をキチ
ン４に作用させる方法が考えられるが、キチン４の高い
結晶性のためにほとんど分解せず、未分解物１２が多く
残ると考えられるので、 (2) 図１(f) 及び図１(g) に示すように、キチン４を酸
で部分加水分解して得られるＮ−アセチルキトオリゴ糖
１３に、加水分解能を有する酵素１４を作用させること
によって製造する方法（特公昭６３−２７３４９３号公
報参照）等に知られるような工夫がなされている。
は、図１(e) に示すように、キチン分解酵素１１をキチ
ン４に作用させる方法が考えられるが、キチン４の高い
結晶性のためにほとんど分解せず、未分解物１２が多く
残ると考えられるので、 (2) 図１(f) 及び図１(g) に示すように、キチン４を酸
で部分加水分解して得られるＮ−アセチルキトオリゴ糖
１３に、加水分解能を有する酵素１４を作用させること
によって製造する方法（特公昭６３−２７３４９３号公
報参照）等に知られるような工夫がなされている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
(1) の方法においては、得られるＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミン１が化学合成品であり、天然物としてはみな
されないので、食品添加物として使用できないという問
題点がある。
(1) の方法においては、得られるＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミン１が化学合成品であり、天然物としてはみな
されないので、食品添加物として使用できないという問
題点がある。
【０００８】また、上記(2) の方法においては、キチン
４を酸で部分加水分解する段階での収量低下が著しいの
で、最終的に得られるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
１の収量も低いという問題点がある。
４を酸で部分加水分解する段階での収量低下が著しいの
で、最終的に得られるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
１の収量も低いという問題点がある。
【０００９】この発明は、以上のような問題点に鑑みて
なされたものであり、人体に対して安全なＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンを効率良く製造できる、非晶質のキ
チンを基質とする酵素によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンの製造方法を提供することを目的とする。
なされたものであり、人体に対して安全なＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンを効率良く製造できる、非晶質のキ
チンを基質とする酵素によるＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンの製造方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の手段とするところは、脱アセチル化されていない非晶
質のキチン又は均一に部分脱アセチル化された脱アセチ
ル化率が１乃至２０％の非晶質のキチンを基質とし、卵
白由来のリゾチームと、トリコデルマ（Trichoderma）
属に属する不完全菌が生産する粗酵素とからなる混合酵
素を使用することによって、前記リゾチームで前記キチ
ンを低分子に加水分解すると共に、前記粗酵素で前記低
分子からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させる
ことにある。
の手段とするところは、脱アセチル化されていない非晶
質のキチン又は均一に部分脱アセチル化された脱アセチ
ル化率が１乃至２０％の非晶質のキチンを基質とし、卵
白由来のリゾチームと、トリコデルマ（Trichoderma）
属に属する不完全菌が生産する粗酵素とからなる混合酵
素を使用することによって、前記リゾチームで前記キチ
ンを低分子に加水分解すると共に、前記粗酵素で前記低
分子からＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させる
ことにある。
【００１１】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施形態を図面
に基づいて説明する。図１(a) に示すように、この実施
形態に係るＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１の製造方
法は、例えば、脱アセチル化されていない非晶質のキチ
ン２を基質とし、卵白由来のリゾチームと、トリコデル
マ（Trichoderma）属に属する不完全菌が生産する粗酵
素とからなる混合酵素３によって、非晶質のキチン２を
低分子に加水分解すると共に、これら低分子からＮ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミン１を遊離させるものである。
に基づいて説明する。図１(a) に示すように、この実施
形態に係るＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１の製造方
法は、例えば、脱アセチル化されていない非晶質のキチ
ン２を基質とし、卵白由来のリゾチームと、トリコデル
マ（Trichoderma）属に属する不完全菌が生産する粗酵
素とからなる混合酵素３によって、非晶質のキチン２を
低分子に加水分解すると共に、これら低分子からＮ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミン１を遊離させるものである。
【００１２】非晶質のキチン２は、脱アセチル化されて
いない、即ち、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位１
ａの含量が１００％の非晶質物質である。そのため、こ
の非晶質のキチン２は、水等に膨潤し易い。
いない、即ち、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位１
ａの含量が１００％の非晶質物質である。そのため、こ
の非晶質のキチン２は、水等に膨潤し易い。
【００１３】非晶質のキチン２を調製するには、例えば
図１(b) に示すように、キチン４をアルカリ処理等すれ
ばよい。即ち、まず、キチン４の粉末を所定濃度のアル
カリ水溶液に浸漬し、室温で数時間〜十数時間程度放置
した後、塩酸等の酸で中和するか、又は、アルコール類
やイオン交換樹脂等で脱アルカリする。その後、アセト
ンやメタノール等の有機溶媒中に滴下すれば非晶質のキ
チン２が沈殿してくるので、これを濾別し、蒸留水等で
充分に洗浄して脱塩等を行えば、精製品を得ることがで
きる。なお、アルカリ水溶液としては、アルカリ金属水
酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸アルカリ金属
塩等の水溶液を使用すればよいが、特にＮａＯＨ、ＫＯ
Ｈの水溶液が望ましい。
図１(b) に示すように、キチン４をアルカリ処理等すれ
ばよい。即ち、まず、キチン４の粉末を所定濃度のアル
カリ水溶液に浸漬し、室温で数時間〜十数時間程度放置
した後、塩酸等の酸で中和するか、又は、アルコール類
やイオン交換樹脂等で脱アルカリする。その後、アセト
ンやメタノール等の有機溶媒中に滴下すれば非晶質のキ
チン２が沈殿してくるので、これを濾別し、蒸留水等で
充分に洗浄して脱塩等を行えば、精製品を得ることがで
きる。なお、アルカリ水溶液としては、アルカリ金属水
酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸アルカリ金属
塩等の水溶液を使用すればよいが、特にＮａＯＨ、ＫＯ
Ｈの水溶液が望ましい。
【００１４】混合酵素３は、卵白由来のリゾチームと、
トリコデルマ（Trichoderma）属に属する不完全菌が生
産する粗酵素とから構成されている。前記リゾチーム
は、高分子である非晶質のキチン２の分子鎖にランダム
に作用して低分子に加水分解することができる。前記粗
酵素は、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有
するものであり、前記低分子の非還元末端からＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミン１を１分子ずつ遊離させること
ができる。
トリコデルマ（Trichoderma）属に属する不完全菌が生
産する粗酵素とから構成されている。前記リゾチーム
は、高分子である非晶質のキチン２の分子鎖にランダム
に作用して低分子に加水分解することができる。前記粗
酵素は、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有
するものであり、前記低分子の非還元末端からＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミン１を１分子ずつ遊離させること
ができる。
【００１５】前記リゾチームは、ニワトリ等の卵白由来
のものであり、安価であるので、コスト高にならないと
いう利点がある。
のものであり、安価であるので、コスト高にならないと
いう利点がある。
【００１６】前記粗酵素は、トリコデルマ（Trichoderm
a）属に属する例えばTrichoderma harzianum等の不完全
菌が生産するものである。この粗酵素は、例えば、上記
の菌体を培養した後の培養液からその菌体を除去して調
製した粗酵素液等として使用すればよい。ここで、この
ような不完全菌の菌体の大きさは他の微生物に比べて大
きく、粗酵素液等の調製時における除去操作が簡単であ
るので、このような粗酵素を使用すれば、コスト高にな
らないという利点がある。
a）属に属する例えばTrichoderma harzianum等の不完全
菌が生産するものである。この粗酵素は、例えば、上記
の菌体を培養した後の培養液からその菌体を除去して調
製した粗酵素液等として使用すればよい。ここで、この
ような不完全菌の菌体の大きさは他の微生物に比べて大
きく、粗酵素液等の調製時における除去操作が簡単であ
るので、このような粗酵素を使用すれば、コスト高にな
らないという利点がある。
【００１７】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１を製造
するには、非晶質のキチン２に上記のようなリゾチー
ム、及び粗酵素を含む粗酵素液等を加え、酸性条件下、
３６〜３７℃程度で数時間〜数十時間攪拌等して反応さ
せればよい。反応を停止するには、例えば数分間、沸騰
水中で加熱等して粗酵素等を失活させればよい。その後
は、従来公知の方法でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
１を単離、精製すればよい。
するには、非晶質のキチン２に上記のようなリゾチー
ム、及び粗酵素を含む粗酵素液等を加え、酸性条件下、
３６〜３７℃程度で数時間〜数十時間攪拌等して反応さ
せればよい。反応を停止するには、例えば数分間、沸騰
水中で加熱等して粗酵素等を失活させればよい。その後
は、従来公知の方法でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
１を単離、精製すればよい。
【００１８】このように、水等に膨潤し易い非晶質のキ
チン２を基質とするので、前記リゾチーム等との親和性
が高い。また、混合酵素を使用して非晶質のキチン２か
らＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１を直接的に製造で
きるので、製造効率が良いという利点がある。更に、キ
チン４から非晶質のキチン２を調製する際には収量の低
下がほとんどないので、最終的に得られるＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミン１の収率も高いという利点がある。
加えて、化学的な変換を伴わないので、人体に対して安
全であるという利点もある。
チン２を基質とするので、前記リゾチーム等との親和性
が高い。また、混合酵素を使用して非晶質のキチン２か
らＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１を直接的に製造で
きるので、製造効率が良いという利点がある。更に、キ
チン４から非晶質のキチン２を調製する際には収量の低
下がほとんどないので、最終的に得られるＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミン１の収率も高いという利点がある。
加えて、化学的な変換を伴わないので、人体に対して安
全であるという利点もある。
【００１９】なお、この実施形態においては、脱アセチ
ル化されていない非晶質のキチン２を基質とする場合に
ついて説明したが、これに限定されるものではなく、均
一に部分脱アセチル化された非晶質のキチンを基質とし
てもよい。
ル化されていない非晶質のキチン２を基質とする場合に
ついて説明したが、これに限定されるものではなく、均
一に部分脱アセチル化された非晶質のキチンを基質とし
てもよい。
【００２０】この均一に部分脱アセチル化されたキチン
は、所定含量のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位１
ａとＤ−グルコサミン単位とからなる、ランダムに脱ア
セチル化された非晶質物質である。そのため、均一に部
分脱アセチル化されたキチンは、冷水、氷水、水、及び
希酸に膨潤し易い。
は、所定含量のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位１
ａとＤ−グルコサミン単位とからなる、ランダムに脱ア
セチル化された非晶質物質である。そのため、均一に部
分脱アセチル化されたキチンは、冷水、氷水、水、及び
希酸に膨潤し易い。
【００２１】均一に部分脱アセチル化されたキチンを調
製するには、例えば、まず既述と同様にしてキチン４を
アルカリ処理した後、これに氷を加えて攪拌するか、又
は、分散液を直接凍結し、次に解凍する操作を繰り返し
て、非晶質のキチン２のドープ（アルカリキチンドー
プ）を調製する。なお、このドープには、均一に部分脱
アセチル化されたキチンの分子量低下を抑えるために、
必要に応じてチオフェノールやＮａＢＨ4等をあらかじ
め添加しておいてもよい。次いで、ドープを５０℃以下
で所定時間熟成させて脱アセチル化した後、既述と同様
の操作を行えば、精製品を得ることができる。
製するには、例えば、まず既述と同様にしてキチン４を
アルカリ処理した後、これに氷を加えて攪拌するか、又
は、分散液を直接凍結し、次に解凍する操作を繰り返し
て、非晶質のキチン２のドープ（アルカリキチンドー
プ）を調製する。なお、このドープには、均一に部分脱
アセチル化されたキチンの分子量低下を抑えるために、
必要に応じてチオフェノールやＮａＢＨ4等をあらかじ
め添加しておいてもよい。次いで、ドープを５０℃以下
で所定時間熟成させて脱アセチル化した後、既述と同様
の操作を行えば、精製品を得ることができる。
【００２２】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１の製造
の際には、均一に部分脱アセチル化されたキチンは、既
述した非晶質のキチン２の場合と同様、卵白由来のリゾ
チームで低分子に加水分解される。低分子がＤ−グルコ
サミン単位を含んでいる場合には、前記粗酵素による反
応は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位１ａである
非還元末端のみで起こる。そのため、Ｎ−アセチル−Ｄ
−グルコサミン１の収率が低下しないようにするには、
均一に部分脱アセチル化されたキチンの脱アセチル化率
を１〜５０％程度としておくのが望ましい。
の際には、均一に部分脱アセチル化されたキチンは、既
述した非晶質のキチン２の場合と同様、卵白由来のリゾ
チームで低分子に加水分解される。低分子がＤ−グルコ
サミン単位を含んでいる場合には、前記粗酵素による反
応は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位１ａである
非還元末端のみで起こる。そのため、Ｎ−アセチル−Ｄ
−グルコサミン１の収率が低下しないようにするには、
均一に部分脱アセチル化されたキチンの脱アセチル化率
を１〜５０％程度としておくのが望ましい。
【００２３】このように、均一に部分脱アセチル化され
た非晶質のキチンを基質とする場合には、脱アセチル化
されていない非晶質のキチン２に比べ、水等に対してよ
り膨潤し易いので、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１
をより効率良く製造できるという利点がある。その他の
利点は、脱アセチル化されていない非晶質のキチン２と
同様である。
た非晶質のキチンを基質とする場合には、脱アセチル化
されていない非晶質のキチン２に比べ、水等に対してよ
り膨潤し易いので、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン１
をより効率良く製造できるという利点がある。その他の
利点は、脱アセチル化されていない非晶質のキチン２と
同様である。
【００２４】
【実施例】次に、この発明を実施例により更に詳細に説
明するが、この発明は係る実施例に限定されるものでは
ない。
明するが、この発明は係る実施例に限定されるものでは
ない。
【００２５】〔実施例１〕 〔脱アセチル化されていない非晶質のキチンの調製〕 粉末状のキチンＴＣ−Ｌ（商品名，三栄工業社製）５．
０ｇ（絶乾重量）をアルカリ水溶液（ＮａＯＨ５０ｇ／
蒸留水７５ｇ）に浸漬し、室温で１２時間放置した。そ
の後、強酸でｐＨを８．４に調整し、これを有機溶媒中
に滴下した。生成した沈殿を濾別し、蒸留水で塩類がな
くなるまで洗浄することによって、脱アセチル化されて
いない非晶質のキチンを得た。
０ｇ（絶乾重量）をアルカリ水溶液（ＮａＯＨ５０ｇ／
蒸留水７５ｇ）に浸漬し、室温で１２時間放置した。そ
の後、強酸でｐＨを８．４に調整し、これを有機溶媒中
に滴下した。生成した沈殿を濾別し、蒸留水で塩類がな
くなるまで洗浄することによって、脱アセチル化されて
いない非晶質のキチンを得た。
【００２６】〔菌体の前培養〕トリコデルマ（Trichoderma）属に属する不完全菌 とし
ては、Trichoderma harzianum（TMIC 60622，財団法人
日本きのこセンター菌蕈研究所より分譲）を使用した。
この不完全菌を２％グルコース、０．５％ポリペプト
ン、０．２％酵母エキス、０．１％KH2PO4、０．０５％
MgSO4・7H2O、及び２％寒天を含む平面シャーレ上の平
面寒天培地に接種し、３０℃で３日間、静置培養した。
ては、Trichoderma harzianum（TMIC 60622，財団法人
日本きのこセンター菌蕈研究所より分譲）を使用した。
この不完全菌を２％グルコース、０．５％ポリペプト
ン、０．２％酵母エキス、０．１％KH2PO4、０．０５％
MgSO4・7H2O、及び２％寒天を含む平面シャーレ上の平
面寒天培地に接種し、３０℃で３日間、静置培養した。
【００２７】〔酵素生産〕 上記の寒天培地上に広がった不完全菌の菌糸をコルクボ
ーラー（内径１ｃｍ）で寒天ごと打ち抜き、０．５％非
晶質のキチン、０．２％ポリペプトン、０．０１％酵母
エキス、０．０７％K2HPO4、０．０３％KH2PO4、及び
０．０５％MgSO4・7H2Oを含む培養液１００ｍＬに接種
し、３０℃、１２０ｒｐｍで回転培養した。経時的に培
養液の一部を取り、キチナーゼ活性及びβ−Ｎ−アセチ
ルヘキソサミニダーゼ活性をそれぞれ測定した。その結
果を図２に示す。
ーラー（内径１ｃｍ）で寒天ごと打ち抜き、０．５％非
晶質のキチン、０．２％ポリペプトン、０．０１％酵母
エキス、０．０７％K2HPO4、０．０３％KH2PO4、及び
０．０５％MgSO4・7H2Oを含む培養液１００ｍＬに接種
し、３０℃、１２０ｒｐｍで回転培養した。経時的に培
養液の一部を取り、キチナーゼ活性及びβ−Ｎ−アセチ
ルヘキソサミニダーゼ活性をそれぞれ測定した。その結
果を図２に示す。
【００２８】〔酵素活性の測定〕 キチナーゼ活性は、グリコールキチンを基質とし、酵素
反応で遊離した還元糖を定量することによって算出し
た。即ち、０．１％グリコールキチンの０．１Ｍ酢酸ナ
トリウム溶液（ｐＨ６．０）１．０ｍＬに酵素液０．２
ｍＬを加え、３７℃で１０分間反応させた。反応終了
後、直ちにSchalesの試薬２．０ｍＬを加えて１５分間
煮沸した。室温まで放冷後、４２０ｎｍの吸光度を測定
した。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを標準物質とし
てあらかじめ検量線を作成しておき、遊離した還元糖量
を算出した。コントロール実験は、グリコールキチン溶
液にSchalesの試薬を加え、次いで酵素液を加えた後、
煮沸することによって行った。なお、酵素活性の１単位
（Ｕ）は、この反応条件下で１分間当たりに１μmol の
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離するのに必要な
酵素量と定義した。
反応で遊離した還元糖を定量することによって算出し
た。即ち、０．１％グリコールキチンの０．１Ｍ酢酸ナ
トリウム溶液（ｐＨ６．０）１．０ｍＬに酵素液０．２
ｍＬを加え、３７℃で１０分間反応させた。反応終了
後、直ちにSchalesの試薬２．０ｍＬを加えて１５分間
煮沸した。室温まで放冷後、４２０ｎｍの吸光度を測定
した。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを標準物質とし
てあらかじめ検量線を作成しておき、遊離した還元糖量
を算出した。コントロール実験は、グリコールキチン溶
液にSchalesの試薬を加え、次いで酵素液を加えた後、
煮沸することによって行った。なお、酵素活性の１単位
（Ｕ）は、この反応条件下で１分間当たりに１μmol の
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離するのに必要な
酵素量と定義した。
【００２９】β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性
は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グル
コサミニドを基質とし、酵素反応で遊離したｐ−ニトロ
フェノールを定量することによって算出した。即ち、
０．１ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−
Ｄ−グルコサミニドの０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ６．０）２．０ｍＬに酵素液０．２ｍＬを加え、反応
生成物の最大吸収波長３３７ｎｍにおける吸光度の増加
を経時的に追跡した。遊離したｐ−ニトロフェノール量
は、その分子吸光係数（３５００Ｍ-1・ｃｍ-1）及びこ
の吸光度における１分間当たりの増加量から算出した。
なお、酵素活性の１単位（Ｕ）は、この反応条件下で１
分間当たりに１μmol のｐ−ニトロフェノールを遊離す
るのに必要な酵素量と定義した。
は、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グル
コサミニドを基質とし、酵素反応で遊離したｐ−ニトロ
フェノールを定量することによって算出した。即ち、
０．１ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｎ−アセチル−
Ｄ−グルコサミニドの０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ６．０）２．０ｍＬに酵素液０．２ｍＬを加え、反応
生成物の最大吸収波長３３７ｎｍにおける吸光度の増加
を経時的に追跡した。遊離したｐ−ニトロフェノール量
は、その分子吸光係数（３５００Ｍ-1・ｃｍ-1）及びこ
の吸光度における１分間当たりの増加量から算出した。
なお、酵素活性の１単位（Ｕ）は、この反応条件下で１
分間当たりに１μmol のｐ−ニトロフェノールを遊離す
るのに必要な酵素量と定義した。
【００３０】〔実施例２〕 〔粗酵素液の調製〕 実施例１とほぼ同様にして不完全菌の培養を開始した
後、第５日目の培養液を０．４５μｍのメンブランフィ
ルターにより軽くアスピレーターで吸引しながらろ過
し、浮遊している菌体等を除去した。得られたろ液をそ
のまま粗酵素液として以下の操作に使用した。
後、第５日目の培養液を０．４５μｍのメンブランフィ
ルターにより軽くアスピレーターで吸引しながらろ過
し、浮遊している菌体等を除去した。得られたろ液をそ
のまま粗酵素液として以下の操作に使用した。
【００３１】〔粗酵素液を用いたＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンの製造〕実施例１で得られた脱アセチル化されていない 非晶質の
キチン０．１ｇに粗酵素液及び卵白由来のリゾチーム
（和光純薬社製）を加え、更にＨＣｌで反応液のｐＨを
４．５に調整した後、蒸留水で全量を２５ｍＬとした。
次いで、３７℃で攪拌し、生成したＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンの量を経時的に測定した。その結果を図３
に示す。
ルコサミンの製造〕実施例１で得られた脱アセチル化されていない 非晶質の
キチン０．１ｇに粗酵素液及び卵白由来のリゾチーム
（和光純薬社製）を加え、更にＨＣｌで反応液のｐＨを
４．５に調整した後、蒸留水で全量を２５ｍＬとした。
次いで、３７℃で攪拌し、生成したＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンの量を経時的に測定した。その結果を図３
に示す。
【００３２】〔Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの定
量〕 反応液の一部を取り、０．４５μｍのメンブランフィル
ターでろ過したろ液をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラ
フィー）〔カラム：Shodex NH2P-504E（4.6mm×250m
m），溶出液：アセトニトリル／水＝７０／３０，流
速：１mL/min，カラム温度：４０℃，検出：ＤＩ〕によ
り分析した。市販のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを
標準物質として検量線を作成し、ピーク面積から、生成
したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン量を定量した。
量〕 反応液の一部を取り、０．４５μｍのメンブランフィル
ターでろ過したろ液をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラ
フィー）〔カラム：Shodex NH2P-504E（4.6mm×250m
m），溶出液：アセトニトリル／水＝７０／３０，流
速：１mL/min，カラム温度：４０℃，検出：ＤＩ〕によ
り分析した。市販のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを
標準物質として検量線を作成し、ピーク面積から、生成
したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン量を定量した。
【００３３】〔実施例３〕 〔均一に部分脱アセチル化されたキチンの調製〕 実施例１と同様にしてキチンＴＣ−Ｌをアルカリ処理し
た後、その溶液に砕氷３７５ｇを入れ、室温で氷が完全
に溶けるまで放置することによって、非晶質のキチンの
ドープ（アルカリキチンドープ）を調製した。次いで、
このドープを３０℃で１０時間静置、熟成させて部分脱
アセチル化（均一系反応）した。その後、強酸でｐＨを
８．４に調整し、これを有機溶媒中に滴下した。生成し
た沈殿を濾別し、蒸留水で塩類がなくなるまで洗浄する
ことによって、均一に部分脱アセチル化された脱アセチ
ル化率が約２０％の非晶質のキチン（ＤＡＣ２０）を得
た。
た後、その溶液に砕氷３７５ｇを入れ、室温で氷が完全
に溶けるまで放置することによって、非晶質のキチンの
ドープ（アルカリキチンドープ）を調製した。次いで、
このドープを３０℃で１０時間静置、熟成させて部分脱
アセチル化（均一系反応）した。その後、強酸でｐＨを
８．４に調整し、これを有機溶媒中に滴下した。生成し
た沈殿を濾別し、蒸留水で塩類がなくなるまで洗浄する
ことによって、均一に部分脱アセチル化された脱アセチ
ル化率が約２０％の非晶質のキチン（ＤＡＣ２０）を得
た。
【００３４】〔酵素活性の測定〕脱アセチル化されていない 非晶質のキチンの代わりに、
上記で得られた脱アセチル化率が約２０％の非晶質のキ
チンを使用した他は、実施例１と同様にしてキチナーゼ
活性及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性をそ
れぞれ測定した。その結果を図２に示す。
上記で得られた脱アセチル化率が約２０％の非晶質のキ
チンを使用した他は、実施例１と同様にしてキチナーゼ
活性及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性をそ
れぞれ測定した。その結果を図２に示す。
【００３５】〔実施例４〕 〔粗酵素液を用いたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの
製造〕脱アセチル化されていない 非晶質のキチンの代わりに、
実施例３で得られた脱アセチル化率が約２０％の非晶質
のキチンを使用した他は、実施例２と同様にして、生成
したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの量を経時的に測
定した。その結果を図３に示す。
製造〕脱アセチル化されていない 非晶質のキチンの代わりに、
実施例３で得られた脱アセチル化率が約２０％の非晶質
のキチンを使用した他は、実施例２と同様にして、生成
したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの量を経時的に測
定した。その結果を図３に示す。
【００３６】〔比較例１〕 〔酵素活性の測定〕脱アセチル化されていない 非晶質のキチンの代わりにキ
チンＴＣ−Ｌを使用した他は、実施例１と同様にしてキ
チナーゼ活性及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ
活性をそれぞれ測定した。その結果を図２に示す。
チンＴＣ−Ｌを使用した他は、実施例１と同様にしてキ
チナーゼ活性及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ
活性をそれぞれ測定した。その結果を図２に示す。
【００３７】〔比較例２〕 〔粗酵素液を用いたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの
製造〕脱アセチル化されていない 非晶質のキチンの代わりにキ
チンＴＣ−Ｌを使用した他は、実施例２と同様にして、
生成したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの量を経時的
に測定した。その結果を図３に示す。
製造〕脱アセチル化されていない 非晶質のキチンの代わりにキ
チンＴＣ−Ｌを使用した他は、実施例２と同様にして、
生成したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの量を経時的
に測定した。その結果を図３に示す。
【００３８】〔比較例３〕 〔酵素活性の測定〕脱アセチル化されていない 非晶質のキチンの代わりにグ
ルコースを使用した他は、実施例１と同様にしてキチナ
ーゼ活性及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性
をそれぞれ測定した。その結果を図２に示す。
ルコースを使用した他は、実施例１と同様にしてキチナ
ーゼ活性及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ活性
をそれぞれ測定した。その結果を図２に示す。
【００３９】〔比較例４〕 〔粗酵素液を用いたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの
製造〕脱アセチル化されていない 非晶質のキチンの代わりにグ
ルコースを使用した他は、実施例２と同様にして、生成
したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの量を経時的に測
定した。その結果を図３に示す。
製造〕脱アセチル化されていない 非晶質のキチンの代わりにグ
ルコースを使用した他は、実施例２と同様にして、生成
したＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの量を経時的に測
定した。その結果を図３に示す。
【００４０】
【発明の効果】以上のように、この発明には次のような
利点がある。 （１）水等に膨潤し易い非晶質のキチンを基質とし、卵
白由来のリゾチーム等との親和性が高いので、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンを効率良く製造できる。 （２）混合酵素を使用して非晶質のキチンからＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンを直接的に製造できるので、製
造効率が良い。 （３）キチンから非晶質のキチンを調製する際には収量
の低下がほとんどないので、最終的に得られるＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンの収率も高い。 （４）化学的な変換を伴わないので、人体に対して安全
である。 （５）安価なリゾチームと、粗酵素液等の調製時におけ
る菌体の除去操作が簡単な粗酵素とからなる混合酵素を
使用するので、コスト高にならない。 （６）脱アセチル化されていないか又は脱アセチル化率
が１〜２０％の非晶質のキチンを基質とするので、Ｎ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンの収率が高い。
利点がある。 （１）水等に膨潤し易い非晶質のキチンを基質とし、卵
白由来のリゾチーム等との親和性が高いので、Ｎ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンを効率良く製造できる。 （２）混合酵素を使用して非晶質のキチンからＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンを直接的に製造できるので、製
造効率が良い。 （３）キチンから非晶質のキチンを調製する際には収量
の低下がほとんどないので、最終的に得られるＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンの収率も高い。 （４）化学的な変換を伴わないので、人体に対して安全
である。 （５）安価なリゾチームと、粗酵素液等の調製時におけ
る菌体の除去操作が簡単な粗酵素とからなる混合酵素を
使用するので、コスト高にならない。 （６）脱アセチル化されていないか又は脱アセチル化率
が１〜２０％の非晶質のキチンを基質とするので、Ｎ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンの収率が高い。
【図１】(a) は実施形態に係るＮ−アセチル−Ｄ−グル
コサミンの製造方法を示す模式図、(b) は脱アセチル化
されていない非晶質のキチンの調製方法を示す模式図。
(c) 及び(d) は従来例(1) を示す模式図、(e) はキチン
にキチン分解酵素を作用させる方法を示す模式図、(f)
及び(g) は従来例(2) を示す模式図。
コサミンの製造方法を示す模式図、(b) は脱アセチル化
されていない非晶質のキチンの調製方法を示す模式図。
(c) 及び(d) は従来例(1) を示す模式図、(e) はキチン
にキチン分解酵素を作用させる方法を示す模式図、(f)
及び(g) は従来例(2) を示す模式図。
【図２】実施例１、実施例２、比較例１、比較例２にお
けるキチナーゼ活性及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニ
ダーゼ活性を示すグラフ。
けるキチナーゼ活性及びβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニ
ダーゼ活性を示すグラフ。
【図３】実施例３、実施例４、比較例３、比較例４にお
けるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの収量を示すグラ
フ。
けるＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの収量を示すグラ
フ。
１ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン ２ 脱アセチル化されていない非晶質のキチン ３ 混合酵素
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−273493（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−7496（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−187094（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−47479（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 19/00 - 19/64
Claims (1)
- 【請求項１】 脱アセチル化されていない非晶質のキチ
ン又は均一に部分脱アセチル化された脱アセチル化率が
１乃至２０％の非晶質のキチンを基質とし、卵白由来の
リゾチームと、トリコデルマ（Trichoderma）属に属す
る不完全菌が生産する粗酵素とからなる混合酵素を使用
することによって、前記リゾチームで前記キチンを低分
子に加水分解すると共に、前記粗酵素で前記低分子から
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを遊離させることを特
徴とする、非晶質のキチンを基質とする酵素によるＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25317999A JP3170602B2 (ja) | 1999-09-07 | 1999-09-07 | 非晶質のキチンを基質とする酵素によるｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25317999A JP3170602B2 (ja) | 1999-09-07 | 1999-09-07 | 非晶質のキチンを基質とする酵素によるｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001078795A JP2001078795A (ja) | 2001-03-27 |
| JP3170602B2 true JP3170602B2 (ja) | 2001-05-28 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25317999A Expired - Fee Related JP3170602B2 (ja) | 1999-09-07 | 1999-09-07 | 非晶質のキチンを基質とする酵素によるｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンの製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3170602B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109679938A (zh) * | 2019-01-23 | 2019-04-26 | 华南理工大学 | 一种几丁质酶Chit46及其表达纯化方法与应用 |
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| CN106072490A (zh) * | 2016-06-14 | 2016-11-09 | 江苏澳新健康科技有限公司 | 含有n‑乙酰‑d‑氨基葡萄糖的组合物及其制备方法 |
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-
1999
- 1999-09-07 JP JP25317999A patent/JP3170602B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| CN109679938B (zh) * | 2019-01-23 | 2021-06-08 | 华南理工大学 | 一种几丁质酶Chit46及其表达纯化方法与应用 |
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