JP6355727B2 - Ｃｈｉ９２タンパク質の新たな用途及びＣｈｉ９２タンパク質発現菌株 - Google Patents
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Description
本発明はＣｈｉ９２タンパク質の新たな用途及びＣｈｉ９２タンパク質発現菌株に関する。
キチン（Ｃｈｉｔｉｎ）は甲殻素、甲殻質とも言われ、その基本的な構成単位がアセチルグルコサミンである。アセチルグルコサミンは直鎖ポリマーであり、その構造はセルロースに類似するが、ただしＣ２ヒドロキシがＮ−アセトアミノで置換されている。キチンの主な由来は海洋甲殻類動物、例えばエビ、蟹等であり、海洋環境における最も重要な栄養源とエネルギーであるとともに、中国の近海域の主な有機汚染源の１つである。キチンは自然界に広く分布されており、世界では含有量がわずかにセルロースに次ぐバイオポリマーであり、１年当たりの生合成量が１００億トンにも達する。キチンは分子量が大きく、構造が緊密で、水と一般的な溶剤に溶解しないため、その応用は大幅に制限されているので、生産上には、キチンを水溶性の良いキチンオリゴ糖等のキトオリゴ糖に分解する必要がある。
キチナーゼ（ＥＣ．３．２．１４）はキチンを特異性加水分解するタンパク質であり、キチンのβ−１，４グリコシド結合を加水分解し、キチンオリゴ糖、例えばＧｌｃ（ＮＡＧ）２、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）３、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）４、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）５、及びＧｌｃ（ＮＡＧ）６を生成し、最終的にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に分解することができる。
本発明は、Ｃｈｉ９２タンパク質の新たな用途及びＣｈｉ９２タンパク質発現菌株を提供することを目的とする。
本発明が提供するピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２は、既に２０１３年５月２３日に中国微生物菌株寄託管理委員会の一般微生物センタ（略称ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託され、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．７６３４である。
本発明は更にピキアパストリスｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２のＣｈｉ９２タンパク質の生産での応用を保護する。前記Ｃｈｉ９２タンパク質は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（ａ）、又は配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列に１つ又は複数のアミノ酸残基で置換及び／又は欠失及び／又は付加するとともにキチナーゼ活性を有する、配列番号１から誘導したタンパク質（ｂ）である。前記ピキアパストリスｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２を応用して前記Ｃｈｉ９２タンパク質を生産する方法は、前記菌株をＢＭＭＹ液体培地に接種し、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで４８時間発振培養し、培養システムにおけるメタノール濃度が０．５％（体積比）に達するまで、１２時間ごとにメタノールを加え、遠心して上澄み液を収集することである。前記方法は、前記上澄み液を１０ｋＤａ膜セルで濃縮し、そして透析し、最後に冷凍乾燥させ、乾燥粉末を得るステップを更に含む。
本発明は更に前記ピキアパストリスｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２の発酵産物を保護する。前記発酵産物の製造方法は、前記菌株をＢＭＭＹ液体培地に接種し、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで４８時間発振培養し、培養システムにおけるメタノール濃度が０．５％（体積比）に達するまで、１２時間ごとにメタノールを加え、遠心して上澄み液を収集することである。前記方法は、前記上澄み液を１０ｋＤａ膜セルで濃縮し、そして透析し、最後に冷凍乾燥し、乾燥粉末を得るステップを更に含む。
本発明は前記発酵産物のキチナーゼの製造での応用を更に保護する。前記応用において、反応の条件は、３０℃−４５℃（例えば３０−４０℃又は４０−４５℃）、ｐＨ６−９（例えばｐＨ６−７、ｐＨ７−８、ｐＨ８−９）である。
本発明は前記発酵産物のキチナーゼとしての応用を更に保護する。前記応用において、反応の条件は、３０℃−４５℃（例えば３０−４０℃又は４０−４５℃）、ｐＨ６−９（例えばｐＨ６−７、ｐＨ７−８、ｐＨ８−９）である。
本発明は前記発酵産物がキチン類基質の分解での応用を更に保護し、前記キチン類基質はコロイドキチン、β−グルカン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、エビ殻粉末、蟹殻粉末、キチン、グリコールキチン、及び熱不活化酵母粉末のうちの少なくとも１種である。前記応用において、反応の条件は、３０℃−４５℃（例えば３０−４０℃又は４０−４５℃）、ｐＨ６−９（例えばｐＨ６−７、ｐＨ７−８、ｐＨ８−９）である。前記熱不活化酵母粉末は、具体的には、ピキアパストリスＧＳ１１５菌体を冷凍乾燥して得られた菌粉末を熱不活化して得られる産物であってもよい。前記熱不活化の条件は、具体的には８０℃での３０分間の処理であってもよい。
本発明は前記Ｃｈｉ９２タンパク質のキチナーゼの製造での応用を更に保護する。前記応用において、反応の条件は、３０℃−４５℃（例えば３０−４０℃又は４０−４５℃）、ｐＨ６−９（例えばｐＨ６−７、ｐＨ７−８、ｐＨ８−９）である。
本発明は前記Ｃｈｉ９２タンパク質のキチナーゼとしての応用を更に保護する。前記応用において、反応の条件は、３０℃−４５℃（例えば３０−４０℃又は４０−４５℃）、ｐＨ６−９（例えばｐＨ６−７、ｐＨ７−８、ｐＨ８−９）である。
本発明は前記Ｃｈｉ９２タンパク質のキチン類基質の分解での応用を更に保護する。前記キチン類基質はコロイドキチン、β−グルカン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、エビ殻粉末、蟹殻粉末、キチン、グリコールキチン及び熱不活化酵母粉末のうちの少なくとも１種である。前記応用において、反応の条件は、３０℃−４５℃（例えば３０−４０℃又は４０−４５℃）、ｐＨ６−９（例えばｐＨ６−７、ｐＨ７−８、ｐＨ８−９）である。前記熱不活化酵母粉末は、具体的には、ピキアパストリスＧＳ１１５菌体を冷凍乾燥して得られた菌粉末を熱不活化して得られる産物であってもよい。前記熱不活化の条件は、具体的には、８０℃での３０分間の処理であってもよい。
本発明は前記Ｃｈｉ９２タンパク質の飼料添加剤としての応用を更に保護する。前記飼料添加剤は、具体的には、魚類飼料添加剤、例えばテラピア飼料添加剤であってもよい。
本発明は前記Ｃｈｉ９２タンパク質の飼料の製造での応用を更に保護する。前記飼料は、具体的には魚類飼料、例えばテラピア飼料であってもよい。
本発明は活性成分が前記Ｃｈｉ９２タンパク質である飼料添加剤を更に保護する。前記飼料添加剤は、具体的には魚類飼料添加剤、例えばテラピア飼料添加剤であってもよい。
以下の実施例は本発明を理解しやすいためのものであるが、本発明を限定するためのものではない。特に明記しない限り、以下の実施例における試験方法は、いずれも一般的な方法である。特に明記しない限り、以下の実施例に使用する試験材料は、いずれも普通の生化学試薬店から購入できるものである。以下の実施例での定量試験は、いずれも３回の繰り返し試験を設定し、結果として平均値を取る。酵素活性単位の定義について、１時間あたりにコロイドキチンを分解して１μｍｏｌのＧｌｃＮＡｃを放出することに必要な酵素量を１つの酵素活性単位（１Ｕ）に定義する。比活性単位は、１ｍｇ当たりの酵素タンパク質に含まれる酵素活性単位（Ｕ／ｍｇ）に定義する。Ｃｈｉ９２タンパク質を配列表の配列番号１に示し、そのコード遺伝子を配列表の配列番号２に示す。
アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）Ｂ５６５は、既に２０１０年１２月０３日に中国微生物菌株寄託管理委員会の一般微生物センタ（略称ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託され、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．４４０３である。
ピキアパストリス発現ベクターｐＰＩＣ９：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社。ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社。キチン：Ｓｉｇｍａ社、型番Ｃ９７５２。カルボキシメチルセルロース：北京鼎国生物技術会社、型番ＤＨ０５３。大麦β−グルカン：北京ＢｉｏＤｅｅ生物会社。キトサン（粉末）：ｓｉｇｍａ社、型番４１７９６３。グリコールキチン（粉末）：ｓｉｇｍａ社、型番Ｇ７７５３。Ｎ−アセチルグルコサミン：Ｓｉｇｍａｈ社、型番Ｎ８７５９。トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、α−キモトリプシン（α−Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、ペプシンはいずれもＳｉｇｍａ（ＵＳＡ）から購入されたものである。
ＭＤ固体培地は、溶剤が水で、溶質としてＹＮＢ １３．４ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ビオチン４×１０−４ｇ／Ｌ、寒天粉末２０ｇ／Ｌを含有する。
ＢＭＧＹ液体培地は、溶剤が水で、溶質として酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母窒素源（ＹＮＢ）１３．４ｇ／Ｌ、ビオチン４×１０−４ｇ／Ｌ、グリセリン１０ｍＬ／Ｌを含有する。
ＢＭＭＹ液体培地は、溶剤が水で、溶質として酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、酵母窒素源（ＹＮＢ）１３．４ｇ／Ｌ、ビオチン４×１０−４ｇ／Ｌ、メタノール５ｍＬ／Ｌを含有する。
実施例１、遺伝子操作菌の構築と寄託
一、組み換えプラスミドの構築
１、アエロモナスＢ５６５のゲノムＤＮＡを抽出する。
２、ステップ１で抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、Ｆ１とＲ１からなるプライマー対でＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物を得る。
Ｆ１：５’−ＧＧＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＣ−３’
Ｒ１：５’−ＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧ−３’。
３、限定的エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩでステップ２のＰＣＲ増幅産物を二重酵素消化し、酵素消化産物を回収する。
４、限定的エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩでピキアパストリス発現ベクターｐＰＩＣ９を二重酵素消化し、約９．３ｋｂのベクター骨格を回収する。
５、ステップ３の酵素消化産物とステップ４のベクター骨格を接続し、組み換えプラスミドを得る。配列決定結果により、組み換えプラスミドの構造を以下のように記載する：ピキアパストリス発現ベクターｐＰＩＣ９のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩの酵素消化部位の間に配列表の配列番号２における５’末端からの第７０−２５９５位のヌクレオチドで示す二重鎖ＤＮＡ分子が挿入されている。
一、組み換えプラスミドの構築
１、アエロモナスＢ５６５のゲノムＤＮＡを抽出する。
２、ステップ１で抽出されたゲノムＤＮＡをテンプレートとして、Ｆ１とＲ１からなるプライマー対でＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物を得る。
Ｆ１：５’−ＧＧＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＣＣ−３’
Ｒ１：５’−ＧＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧ−３’。
３、限定的エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩでステップ２のＰＣＲ増幅産物を二重酵素消化し、酵素消化産物を回収する。
４、限定的エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩでピキアパストリス発現ベクターｐＰＩＣ９を二重酵素消化し、約９．３ｋｂのベクター骨格を回収する。
５、ステップ３の酵素消化産物とステップ４のベクター骨格を接続し、組み換えプラスミドを得る。配列決定結果により、組み換えプラスミドの構造を以下のように記載する：ピキアパストリス発現ベクターｐＰＩＣ９のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩの酵素消化部位の間に配列表の配列番号２における５’末端からの第７０−２５９５位のヌクレオチドで示す二重鎖ＤＮＡ分子が挿入されている。
二、組み換え菌の構築
１、ステップ一で構築された組み換えプラスミドをピキアパストリスＧＳ１１５のコンピテント細胞に導入し、そしてＭＤ固形培地プレートをコーティングし、滅菌した爪楊枝で単一のコロニーを取り、番号に従って新たなＭＤ固形培地プレートに接種する。計９６個の単クローンを得る。
２、番号に従って単クローンを取り、３ｍＬのＢＭＧＹ液体培地に接種し、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで２−３日発振培養し、そして４５００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿（できるだけ上澄みを完全に除去する）を取り、沈殿に１ｍＬのＢＭＭＹ液体培地を加え、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで４８時間発振培養し、遠心して上澄み液を収集する。
１、ステップ一で構築された組み換えプラスミドをピキアパストリスＧＳ１１５のコンピテント細胞に導入し、そしてＭＤ固形培地プレートをコーティングし、滅菌した爪楊枝で単一のコロニーを取り、番号に従って新たなＭＤ固形培地プレートに接種する。計９６個の単クローンを得る。
２、番号に従って単クローンを取り、３ｍＬのＢＭＧＹ液体培地に接種し、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで２−３日発振培養し、そして４５００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿（できるだけ上澄みを完全に除去する）を取り、沈殿に１ｍＬのＢＭＭＹ液体培地を加え、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで４８時間発振培養し、遠心して上澄み液を収集する。
三、対照菌の構築
１、組み換えプラスミドの代わりに、ピキアパストリス発現ベクターｐＰＩＣ９でステップ二の１を行い、３０個の単クローンを得る。
２、ステップ二の２と同じである。
１、組み換えプラスミドの代わりに、ピキアパストリス発現ベクターｐＰＩＣ９でステップ二の１を行い、３０個の単クローンを得る。
２、ステップ二の２と同じである。
四、上澄み液のキチナーゼの酵素活性の検出
１、１％コロイドキチンの製造
４℃で、１０ｇのキチンを取りすり鉢に入れ、４０ｍＬのアセトンを加えて１０分間研磨し、研磨しながら４００ｍＬの冷たい濃ＨＣｌを徐々に添加し、完全に研磨することにより、ペーストにし、そして、４℃で２４時間静置し、その後、グラスウールで濾過し、濾液を収集した。濾液を２０００ｍｌの５０％（体積分率）エタノール水溶液が装入されているビーカに徐々に添加し、添加しながら激しく撹拌し、そして、静置し、コロイド状キチンを析出した後上澄みを除去し、コロイドキチンを収集し、蒸留水でコロイドキチンをｐＨ７．０まで洗浄し、蒸留水で１０００ｍｌまで定容積し、冷蔵しておく。
２、標準曲線の作成
ｐＨ７．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液でＮ−アセチルグルコサミンを異なる濃度の溶液に配合し、０．５ｍＬの各溶液（Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量がそれぞれ５．５μｍｏｌ、７．１μｍｏｌ、８．３μｍｏｌ、１０．０μｍｏｌ、１２．５μｍｏｌ、又は１６．７μｍｏｌである）をそれぞれ１ｍＬのＤＮＳ溶液と混合した後５分間沸騰水浴して呈色させ、そして蒸留水で２．５ｍＬまで補足し、室温に冷却した後５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線を作成し、標準曲線及び標準曲線方程式を図１（後続の実施例における標準曲線はいずれも本標準曲線と指す）に示す。
３、ステップ二で得られた各上澄み液、ステップ三で得られた各上澄み液のキチナーゼ酵素活性をそれぞれ検出する。
（１）４つの試験管を取り、０．２５ｍＬの被測定溶液と０．２５ｍＬの１％コロイドキチンをそれぞれ添加し、３つの試験管を４０℃で１時間水浴し、残り１つは４℃で置き、対照とする。
（２）ステップ（１）を完成した試験管を取り、各試験管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を添加し、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水で２．５ｍｌまで補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式と対照して酵素活性を計算する。
ステップ二で得られた９６個の単クローンのうち、２４個の単クローンで得られた上澄み液のキチナーゼ酵素活性は、順次に７．５８４、８．８７３、９．６０９、１６．７８８、３２．２５１、３２．８０３、３３．９０７、３３．９０７、３４．４６０、３５．２８８、３７．４９７、３７．６８１、３７．８６５、３７．９５７、３８．５０９、３８．６０１、３８．６９３、３８．９７０、３９．１５４、３９．８９０、４１．０８７、４１．１７９、４１．７３１及び６６．３９８Ｕ／ｍｌである。キチナーゼ酵素活性の最高の上澄み液の対応する菌株を遺伝子操作菌とし、ピキアパストリスｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２と命名する。
ステップ三で得られた３０個の単クローンのうち、上澄み液のキチナーゼ酵素活性はいずれも０Ｕ／ｍＬである。
１、１％コロイドキチンの製造
４℃で、１０ｇのキチンを取りすり鉢に入れ、４０ｍＬのアセトンを加えて１０分間研磨し、研磨しながら４００ｍＬの冷たい濃ＨＣｌを徐々に添加し、完全に研磨することにより、ペーストにし、そして、４℃で２４時間静置し、その後、グラスウールで濾過し、濾液を収集した。濾液を２０００ｍｌの５０％（体積分率）エタノール水溶液が装入されているビーカに徐々に添加し、添加しながら激しく撹拌し、そして、静置し、コロイド状キチンを析出した後上澄みを除去し、コロイドキチンを収集し、蒸留水でコロイドキチンをｐＨ７．０まで洗浄し、蒸留水で１０００ｍｌまで定容積し、冷蔵しておく。
２、標準曲線の作成
ｐＨ７．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液でＮ−アセチルグルコサミンを異なる濃度の溶液に配合し、０．５ｍＬの各溶液（Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量がそれぞれ５．５μｍｏｌ、７．１μｍｏｌ、８．３μｍｏｌ、１０．０μｍｏｌ、１２．５μｍｏｌ、又は１６．７μｍｏｌである）をそれぞれ１ｍＬのＤＮＳ溶液と混合した後５分間沸騰水浴して呈色させ、そして蒸留水で２．５ｍＬまで補足し、室温に冷却した後５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線を作成し、標準曲線及び標準曲線方程式を図１（後続の実施例における標準曲線はいずれも本標準曲線と指す）に示す。
３、ステップ二で得られた各上澄み液、ステップ三で得られた各上澄み液のキチナーゼ酵素活性をそれぞれ検出する。
（１）４つの試験管を取り、０．２５ｍＬの被測定溶液と０．２５ｍＬの１％コロイドキチンをそれぞれ添加し、３つの試験管を４０℃で１時間水浴し、残り１つは４℃で置き、対照とする。
（２）ステップ（１）を完成した試験管を取り、各試験管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を添加し、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水で２．５ｍｌまで補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式と対照して酵素活性を計算する。
ステップ二で得られた９６個の単クローンのうち、２４個の単クローンで得られた上澄み液のキチナーゼ酵素活性は、順次に７．５８４、８．８７３、９．６０９、１６．７８８、３２．２５１、３２．８０３、３３．９０７、３３．９０７、３４．４６０、３５．２８８、３７．４９７、３７．６８１、３７．８６５、３７．９５７、３８．５０９、３８．６０１、３８．６９３、３８．９７０、３９．１５４、３９．８９０、４１．０８７、４１．１７９、４１．７３１及び６６．３９８Ｕ／ｍｌである。キチナーゼ酵素活性の最高の上澄み液の対応する菌株を遺伝子操作菌とし、ピキアパストリスｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２と命名する。
ステップ三で得られた３０個の単クローンのうち、上澄み液のキチナーゼ酵素活性はいずれも０Ｕ／ｍＬである。
五、遺伝子操作菌の寄託
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２は、既に２０１３年５月２３日に中国微生物菌株寄託管理委員会の一般微生物センタ（略称ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託され、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．７６３４である。
ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２は、既に２０１３年５月２３日に中国微生物菌株寄託管理委員会の一般微生物センタ（略称ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路１号院３号）に寄託され、寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．７６３４である。
実施例２、Ｃｈｉ９２タンパク質の調製、精製及び酵素活性測定
一、Ｃｈｉ９２タンパク質の調製及び精製
１、ピキアパストリスｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２を２００ｍＬのＢＭＧＹ液体培地が装入されている１０００ｍＬ三角フラスコに接種し、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで２日発振培養し、４５００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿（できるだけ上澄みを完全に除去する）を取り、沈殿に１００ｍＬのＢＭＭＹ液体培地を加え、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで４８時間発振培養し、培養システムにおけるメタノール濃度が０．５％（体積比）に達するまで、１２時間ごとにメタノールを加え、遠心して上澄み液を収集する。
２、０℃で、ステップ１で得られた上澄み液を１０ｋＤａ膜セルで濃縮し、そして脱イオン水を透析液として透析し、最後に冷凍乾燥し、乾燥粉末を得る。
３、ステップ２で得られた乾燥粉末を取り、脱イオン水に溶解した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、図２に示すように、分子量が約９２ｋＤａの単一バンドが表示され、予測分子量に近い。目標バンドを切り取り、天津生物チップ技術有限会社に依頼して二級質量スペクトル分析を行い、分析結果から該目標バンドがＣｈｉ９２タンパク質であることが分かる。
一、Ｃｈｉ９２タンパク質の調製及び精製
１、ピキアパストリスｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２を２００ｍＬのＢＭＧＹ液体培地が装入されている１０００ｍＬ三角フラスコに接種し、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで２日発振培養し、４５００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿（できるだけ上澄みを完全に除去する）を取り、沈殿に１００ｍＬのＢＭＭＹ液体培地を加え、３０℃、２５０−２８０ｒｐｍで４８時間発振培養し、培養システムにおけるメタノール濃度が０．５％（体積比）に達するまで、１２時間ごとにメタノールを加え、遠心して上澄み液を収集する。
２、０℃で、ステップ１で得られた上澄み液を１０ｋＤａ膜セルで濃縮し、そして脱イオン水を透析液として透析し、最後に冷凍乾燥し、乾燥粉末を得る。
３、ステップ２で得られた乾燥粉末を取り、脱イオン水に溶解した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、図２に示すように、分子量が約９２ｋＤａの単一バンドが表示され、予測分子量に近い。目標バンドを切り取り、天津生物チップ技術有限会社に依頼して二級質量スペクトル分析を行い、分析結果から該目標バンドがＣｈｉ９２タンパク質であることが分かる。
二、Ｃｈｉ９２タンパク質のキチナーゼとしての比活性、Ｋｍ、Ｖｍａｘ
１、ステップ一の２で得られた５０ｍｇの乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、１％エビ殻粉末の調製
実施例５のステップ一の４と同じである。
４、１％大麦β−グルカンの調製
実施例５のステップ一の２と同じである。
５、クマシーブリリアントブルー法によりステップ１で得られた被測定溶液におけるタンパク質含有量を検出する。
６、ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。被測定溶液のキチナーゼの酵素活性は６９．４２３Ｕ／ｍＬであり、Ｃｈｉ９２タンパク質の比活性が８０９．２０７Ｕ／ｍｇである。
７、測定したＣｈｉ９２タンパク質の一級反応時間が６０分間であり、それぞれ異なる濃度の異なる基質（基質がそれぞれコロイドキチン、エビ殻粉末又は大麦β−グルカンであり、各種の基質の濃度がそれぞれ１％、０．８％、０．７％、０．６％、０．４％、０．３％又は０．１％である）を採用し、その他は実施例１のステップ四の３と同じであり、対応する反応速度を計算して、ミカエリスメンテン式二重逆数法でＫｍ値及びＶｍａｘを求める。二重逆数プロット法（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ法）によりミカエリスメンテン式を
に書き換えて、ｖ、［Ｓ］の逆数を計算し、１／ｖ及び１／［Ｓ］で作図し、直線を描画し、Ｋｍ値及びＶｍａｘを求める。結果を表１に示す。
１、ステップ一の２で得られた５０ｍｇの乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、１％エビ殻粉末の調製
実施例５のステップ一の４と同じである。
４、１％大麦β−グルカンの調製
実施例５のステップ一の２と同じである。
５、クマシーブリリアントブルー法によりステップ１で得られた被測定溶液におけるタンパク質含有量を検出する。
６、ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。被測定溶液のキチナーゼの酵素活性は６９．４２３Ｕ／ｍＬであり、Ｃｈｉ９２タンパク質の比活性が８０９．２０７Ｕ／ｍｇである。
７、測定したＣｈｉ９２タンパク質の一級反応時間が６０分間であり、それぞれ異なる濃度の異なる基質（基質がそれぞれコロイドキチン、エビ殻粉末又は大麦β−グルカンであり、各種の基質の濃度がそれぞれ１％、０．８％、０．７％、０．６％、０．４％、０．３％又は０．１％である）を採用し、その他は実施例１のステップ四の３と同じであり、対応する反応速度を計算して、ミカエリスメンテン式二重逆数法でＫｍ値及びＶｍａｘを求める。二重逆数プロット法（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ法）によりミカエリスメンテン式を
三、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー法）によりＣｈｉ９２タンパク質でコロイドキチンを分解した産物を検出する。
１、ステップ一の２で得られた５０ｍｇの乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ１で得られた５００μｌの被測定溶液とステップ２で得られた５００μｌの１％コロイドキチンとを混合して４０℃で１時間静置反応し、そして、１００℃で１０分間沸騰まで加熱し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心するとともに上澄みを取り、即ち試験組の反応産物とする。ステップ１で得られた５００μｌの被測定溶液とステップ２で得られた５００μｌの１％コロイドキチンを混合した後１００℃で１０分間沸騰まで加熱し、そして１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを取り、即ち対照組の反応産物とする。
ＤＧＸ９０５３−Ｂ−２ブラスト乾燥炉（上海福瑪）、Ｐ−１型層拡張シリンダ（二重スロット）（１００ｍｍ＊２００ｍｍ）、ＧＦ２５４シリカゲルプレート（１００ｍｍ＊２００ｍｍ）。拡張剤：ｎ−ブタノール：イソプロパノール：酢酸：水＝７：５：２：４（体積比）。呈色試薬は、アニリン４ｍｌ、ジフェニルアミン４ｇ、８５％リン酸３０ｍｌ、アセトン２００ｍｌ。１０５℃でオーブンにより５分間乾燥させて呈色させる。
結果を図３に示す。Ｃｈｉ９２タンパク質でコロイドキチンを分解した産物はキトビオースであり、スポッティング穴１、２、３、４、５、６はそれぞれＧｌｃ（ＮＡＧ）６、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）５、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）４、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）３、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）２及びＧｌｃ（ＮＡＧ）の標準品であり、７は試験組の反応産物であり、８は対照組の反応産物であり、９はＧｌｃ（ＮＡＧ）６、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）５、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）４、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）３、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）２及びＧｌｃ（ＮＡＧ）の標準品の混合物である。結果から、Ｃｈｉ９２タンパク質でコロイドキチンを分解した産物はキトビオースであることが分かる。
１、ステップ一の２で得られた５０ｍｇの乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ１で得られた５００μｌの被測定溶液とステップ２で得られた５００μｌの１％コロイドキチンとを混合して４０℃で１時間静置反応し、そして、１００℃で１０分間沸騰まで加熱し、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心するとともに上澄みを取り、即ち試験組の反応産物とする。ステップ１で得られた５００μｌの被測定溶液とステップ２で得られた５００μｌの１％コロイドキチンを混合した後１００℃で１０分間沸騰まで加熱し、そして１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを取り、即ち対照組の反応産物とする。
ＤＧＸ９０５３−Ｂ−２ブラスト乾燥炉（上海福瑪）、Ｐ−１型層拡張シリンダ（二重スロット）（１００ｍｍ＊２００ｍｍ）、ＧＦ２５４シリカゲルプレート（１００ｍｍ＊２００ｍｍ）。拡張剤：ｎ−ブタノール：イソプロパノール：酢酸：水＝７：５：２：４（体積比）。呈色試薬は、アニリン４ｍｌ、ジフェニルアミン４ｇ、８５％リン酸３０ｍｌ、アセトン２００ｍｌ。１０５℃でオーブンにより５分間乾燥させて呈色させる。
結果を図３に示す。Ｃｈｉ９２タンパク質でコロイドキチンを分解した産物はキトビオースであり、スポッティング穴１、２、３、４、５、６はそれぞれＧｌｃ（ＮＡＧ）６、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）５、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）４、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）３、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）２及びＧｌｃ（ＮＡＧ）の標準品であり、７は試験組の反応産物であり、８は対照組の反応産物であり、９はＧｌｃ（ＮＡＧ）６、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）５、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）４、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）３、Ｇｌｃ（ＮＡＧ）２及びＧｌｃ（ＮＡＧ）の標準品の混合物である。結果から、Ｃｈｉ９２タンパク質でコロイドキチンを分解した産物はキトビオースであることが分かる。
四、ＥＳＩ−ＭＳによりキチナーゼＣｈｉ９２でコロイドキチンを分解した産物を検出する
処理方法はステップ三と同じである。
８００μｌの反応産物と１／３体積の陰陽樹脂粒子とを渦巻きで均一に混合し、室温で３０分間静置し、脱塩反応産物として上澄み５００μｌを取る。脱塩反応産物を中科院化学研究所に依頼してＥＳＩ−ＭＳ分析を行い、結果を図４に示す。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとキトビオースの理論分子量はそれぞれ２２１．２１と４２４．４である。ＥＳＩ−ＭＳの過程において、電気噴霧剤としてクロロホルムを採用するので、糖の構造にＣｌ−イオンが導入され、キチンオリゴ糖におけるＯＨ−と水素結合を形成し、カラムと組み合わせて、ピークパターンを生成することに有利である。このため、図に示すピークパターンはＣｌ−を加えた分子量である。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとキトビオースのＣｌ−を加えた分子量はそれぞれ２５６．２１と４５９．４であり、ピークパターンの結果と一致する。ＥＳＩ−ＭＳ過程において、加えたＣｌ−は２種の形式があり、それぞれ３５Ｃｌ−と３７Ｃｌ−であり、理論的には、３５Ｃｌ−を加えたピーク高さは３７Ｃｌ−を加えたピーク高さの３倍である。ピークパターンにおいて、２５５．９と４５９．２のピークの後の２つの質量電荷比の位置にそれぞれピーク高さがその１／３のピークがあり、このピークパターンがＣｌ−を加えたピークパターンであることを更に証明できる。同図におけるピーク高さから分かるように、キトビオースの濃度が明らかにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンよりも高い。ＥＳＩ−ＭＳの検出解像度が約１ｎｇであり、ＴＬＣ検出解像度が約５ｎｇであるので、ＴＬＣ方法では濃度が低いＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが検出されていない。
処理方法はステップ三と同じである。
８００μｌの反応産物と１／３体積の陰陽樹脂粒子とを渦巻きで均一に混合し、室温で３０分間静置し、脱塩反応産物として上澄み５００μｌを取る。脱塩反応産物を中科院化学研究所に依頼してＥＳＩ−ＭＳ分析を行い、結果を図４に示す。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとキトビオースの理論分子量はそれぞれ２２１．２１と４２４．４である。ＥＳＩ−ＭＳの過程において、電気噴霧剤としてクロロホルムを採用するので、糖の構造にＣｌ−イオンが導入され、キチンオリゴ糖におけるＯＨ−と水素結合を形成し、カラムと組み合わせて、ピークパターンを生成することに有利である。このため、図に示すピークパターンはＣｌ−を加えた分子量である。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとキトビオースのＣｌ−を加えた分子量はそれぞれ２５６．２１と４５９．４であり、ピークパターンの結果と一致する。ＥＳＩ−ＭＳ過程において、加えたＣｌ−は２種の形式があり、それぞれ３５Ｃｌ−と３７Ｃｌ−であり、理論的には、３５Ｃｌ−を加えたピーク高さは３７Ｃｌ−を加えたピーク高さの３倍である。ピークパターンにおいて、２５５．９と４５９．２のピークの後の２つの質量電荷比の位置にそれぞれピーク高さがその１／３のピークがあり、このピークパターンがＣｌ−を加えたピークパターンであることを更に証明できる。同図におけるピーク高さから分かるように、キトビオースの濃度が明らかにＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンよりも高い。ＥＳＩ−ＭＳの検出解像度が約１ｎｇであり、ＴＬＣ検出解像度が約５ｎｇであるので、ＴＬＣ方法では濃度が低いＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが検出されていない。
実施例３、Ｃｈｉ９２タンパク質のキチナーゼとしての酵素学性質
実施例２のステップ一の２で得られた乾燥粉末を被測定乾燥粉末（主な成分がＣｈｉ９２タンパク質である）として、本実施例の試験を行う。
実施例２のステップ一の２で得られた乾燥粉末を被測定乾燥粉末（主な成分がＣｈｉ９２タンパク質である）として、本実施例の試験を行う。
一、最適ｐＨ
１、１％コロイドキチンの調製
４℃で、１０ｇのキチンを取ってすり鉢に入れ、アセトン４０ｍＬを加えて１０分間研磨し、研磨しながら冷たい濃ＨＣｌ ４００ｍＬを徐々に添加し、完全に研磨することにより、ペーストにし、そして４℃で２４時間置き、その後グラスウールで濾過し、濾液を収集し、濾液を２０００ｍＬの５０％（体積分率）エタノール水溶液が装入されているビーカに徐々に添加し、添加しながら激しく撹拌し、そして静置し、コロイド状キチンを析出した後上澄みを除去し、コロイドキチンを収集し、緩衝液でコロイドキチンを洗浄し、同じ緩衝液で１０００ｍｌに定容積し、冷蔵しておく。
それぞれｐＨ３．０−８．０の０．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０−９．０の０．２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液及びｐＨ９．０−１１．０の０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を採用する。
２、被測定乾燥粉末５０ｍｇを１０ｍｌの緩衝液（ステップ１と同じ緩衝液）に溶解し、被測定溶液を得る。
３、ステップ２で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を採用する際、Ｃｈｉ９２タンパク質の酵素活性が最高で、被測定溶液の酵素活性が６７．６４０Ｕ／ｍｌである。他の緩衝液を採用する際の被測定溶液の最高酵素活性に対する相対的酵素活性を計算し、図５に示す。ｐＨ６．０−９．０である場合、Ｃｈｉ９２タンパク質は８０％以上の相対的酵素活性を保持している。
１、１％コロイドキチンの調製
４℃で、１０ｇのキチンを取ってすり鉢に入れ、アセトン４０ｍＬを加えて１０分間研磨し、研磨しながら冷たい濃ＨＣｌ ４００ｍＬを徐々に添加し、完全に研磨することにより、ペーストにし、そして４℃で２４時間置き、その後グラスウールで濾過し、濾液を収集し、濾液を２０００ｍＬの５０％（体積分率）エタノール水溶液が装入されているビーカに徐々に添加し、添加しながら激しく撹拌し、そして静置し、コロイド状キチンを析出した後上澄みを除去し、コロイドキチンを収集し、緩衝液でコロイドキチンを洗浄し、同じ緩衝液で１０００ｍｌに定容積し、冷蔵しておく。
それぞれｐＨ３．０−８．０の０．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０−９．０の０．２ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液及びｐＨ９．０−１１．０の０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を採用する。
２、被測定乾燥粉末５０ｍｇを１０ｍｌの緩衝液（ステップ１と同じ緩衝液）に溶解し、被測定溶液を得る。
３、ステップ２で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
ｐＨ８．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を採用する際、Ｃｈｉ９２タンパク質の酵素活性が最高で、被測定溶液の酵素活性が６７．６４０Ｕ／ｍｌである。他の緩衝液を採用する際の被測定溶液の最高酵素活性に対する相対的酵素活性を計算し、図５に示す。ｐＨ６．０−９．０である場合、Ｃｈｉ９２タンパク質は８０％以上の相対的酵素活性を保持している。
二、ｐＨ安定性
１、緩衝液で被測定乾燥粉末（５ｍｇの乾燥粉末につき１ｍｌの緩衝液に溶解する）を溶解し、４℃で２時間静置した後に被測定溶液とする。それぞれｐＨ３．０−８．０の０．２ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝液及びｐＨ９．０−１２．０の０．２ｍｏｌ／Ｌのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を採用する。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
相対的酵素活性結果を図６に示す。Ｃｈｉ９２タンパク質はｐＨ範囲が４．０−９．０の間にいずれも安定的であり、７０％以上の酵素活性を保持している。
１、緩衝液で被測定乾燥粉末（５ｍｇの乾燥粉末につき１ｍｌの緩衝液に溶解する）を溶解し、４℃で２時間静置した後に被測定溶液とする。それぞれｐＨ３．０−８．０の０．２ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝液及びｐＨ９．０−１２．０の０．２ｍｏｌ／Ｌのグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を採用する。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
相対的酵素活性結果を図６に示す。Ｃｈｉ９２タンパク質はｐＨ範囲が４．０−９．０の間にいずれも安定的であり、７０％以上の酵素活性を保持している。
三、最適温度
１、５０ｍｇの被測定乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３（差異は異なる反応温度を採用するのみにある）を参照する。
４０℃の反応温度を採用する際、Ｃｈｉ９２タンパク質の酵素活性が最も高く、被測定溶液の酵素活性が８６．８６１Ｕ／ｍｌである。他の反応温度を採用する際の被測定溶液の最高酵素活性に対する相対的酵素活性を計算し、図７に示す。３０℃−４５℃である場合、Ｃｈｉ９２タンパク質は６０％以上の相対的酵素活性を保持する。
１、５０ｍｇの被測定乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３（差異は異なる反応温度を採用するのみにある）を参照する。
４０℃の反応温度を採用する際、Ｃｈｉ９２タンパク質の酵素活性が最も高く、被測定溶液の酵素活性が８６．８６１Ｕ／ｍｌである。他の反応温度を採用する際の被測定溶液の最高酵素活性に対する相対的酵素活性を計算し、図７に示す。３０℃−４５℃である場合、Ｃｈｉ９２タンパク質は６０％以上の相対的酵素活性を保持する。
四、温度安定性
１、５０ｍｇの被測定乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、異なる温度（４０℃又は５０℃）でそれぞれ２０、４０、６０、８０、１００又は１２０分間保温した後、被測定溶液とする。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
相対的酵素活性の結果を図８に示す。４０℃で６０分間処理した後、Ｃｈｉ９２タンパク質は依然として８０％以上の相対的酵素活性を保留し、温度安定性が良い。
１、５０ｍｇの被測定乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、異なる温度（４０℃又は５０℃）でそれぞれ２０、４０、６０、８０、１００又は１２０分間保温した後、被測定溶液とする。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
相対的酵素活性の結果を図８に示す。４０℃で６０分間処理した後、Ｃｈｉ９２タンパク質は依然として８０％以上の相対的酵素活性を保留し、温度安定性が良い。
実施例４、金属イオン及び化学試薬のＣｈｉ９２タンパク質のキチナーゼとしての酵素活性に対する影響
実施例２のステップ一の２で得られた乾燥粉末を被測定乾燥粉末（主な成分がＣｈｉ９２タンパク質である）として、本実施例の試験を行う。
実施例２のステップ一の２で得られた乾燥粉末を被測定乾燥粉末（主な成分がＣｈｉ９２タンパク質である）として、本実施例の試験を行う。
１、５０ｍｇの被測定乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ２で製造された１％コロイドキチンに化合物を加え、化合物の濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌ又は５ｍｍｏｌ／Ｌにする。それぞれ以下の化合物を採用する：ＫＣｌ（Ｋ＋を提供する）、ＮａＣｌ（Ｎａ＋を提供する）、ＣａＣｌ２（Ｃａ２＋を提供する）、ＬｉＣｌ（Ｌｉ＋を提供する）、ＣｏＣｌ２（Ｃｏ２＋を提供する）、ＣｒＣｌ３（Ｃｒ３＋を提供する）、ＮｉＣｌ２（Ｎｉ２＋を提供する）、ＣｕＣｌ２（Ｃｕ２＋を提供する）、ＭｇＣｌ２（Ｍｇ２＋を提供する）、ＦｅＣｌ３（Ｆｅ３＋を提供する）、ＭｎＣｌ２（Ｍｎ２＋を提供する）、ＰｂＣｌ（Ｐｂ＋を提供する）、ＺｎＣｌ２（Ｚｎ２＋を提供する）、ＡｇＮＯ３（Ａｇ＋を提供する）、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノール。
３、ステップ２で得られた各種の異なるシステムに対し、以下のように検出する：
（１）４つの試験管を取り、それぞれ被測定０．２５ｍＬの溶液とステップ２で得られた０．２５ｍＬのシステムを添加し、３つの試験管を４０℃で１時間水浴し、また、残りの１つを対照として４℃で置く。
（２）ステップ（１）を完成した試験管を取り、各管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を加え、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水で２．５ｍｌに補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式を対照して酵素活性を計算する。
４、ＣＫ組：ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
各組の処理における被測定溶液のキチナーゼ酵素活性とＣＫ組の被測定溶液のキチナーゼ酵素活性との比値を相対的酵素活性とし、結果を表２に示す。Ｍｎ２＋イオンはＣｈｉ９２タンパク質の酵素活性に対して一定の促進作用があり、Ｃｒ３＋、Ｃｕ２＋等はＣｈｉ９２タンパク質の酵素活性に対して一定の抑制作用があり、高濃度（５ｍＭ）のＥＤＴＡ（キレート剤）はＣｈｉ９２タンパク質の酵素活性をほとんど完全に抑制するが、低濃度（１ｍＭ）である場合、Ｃｈｉ９２タンパク質の酵素活性に基本的に影響しない。
２、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
３、ステップ２で製造された１％コロイドキチンに化合物を加え、化合物の濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌ又は５ｍｍｏｌ／Ｌにする。それぞれ以下の化合物を採用する：ＫＣｌ（Ｋ＋を提供する）、ＮａＣｌ（Ｎａ＋を提供する）、ＣａＣｌ２（Ｃａ２＋を提供する）、ＬｉＣｌ（Ｌｉ＋を提供する）、ＣｏＣｌ２（Ｃｏ２＋を提供する）、ＣｒＣｌ３（Ｃｒ３＋を提供する）、ＮｉＣｌ２（Ｎｉ２＋を提供する）、ＣｕＣｌ２（Ｃｕ２＋を提供する）、ＭｇＣｌ２（Ｍｇ２＋を提供する）、ＦｅＣｌ３（Ｆｅ３＋を提供する）、ＭｎＣｌ２（Ｍｎ２＋を提供する）、ＰｂＣｌ（Ｐｂ＋を提供する）、ＺｎＣｌ２（Ｚｎ２＋を提供する）、ＡｇＮＯ３（Ａｇ＋を提供する）、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノール。
３、ステップ２で得られた各種の異なるシステムに対し、以下のように検出する：
（１）４つの試験管を取り、それぞれ被測定０．２５ｍＬの溶液とステップ２で得られた０．２５ｍＬのシステムを添加し、３つの試験管を４０℃で１時間水浴し、また、残りの１つを対照として４℃で置く。
（２）ステップ（１）を完成した試験管を取り、各管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を加え、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水で２．５ｍｌに補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式を対照して酵素活性を計算する。
４、ＣＫ組：ステップ１で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
各組の処理における被測定溶液のキチナーゼ酵素活性とＣＫ組の被測定溶液のキチナーゼ酵素活性との比値を相対的酵素活性とし、結果を表２に示す。Ｍｎ２＋イオンはＣｈｉ９２タンパク質の酵素活性に対して一定の促進作用があり、Ｃｒ３＋、Ｃｕ２＋等はＣｈｉ９２タンパク質の酵素活性に対して一定の抑制作用があり、高濃度（５ｍＭ）のＥＤＴＡ（キレート剤）はＣｈｉ９２タンパク質の酵素活性をほとんど完全に抑制するが、低濃度（１ｍＭ）である場合、Ｃｈｉ９２タンパク質の酵素活性に基本的に影響しない。
実施例５、Ｃｈｉ９２タンパク質のキチナーゼとしての基質特異性
一、基質の調製
１、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
２、１％大麦β−グルカンの調製
１ｇの大麦β−グルカンを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１００℃で３分間水浴し、室温まで静置し、５０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿を除去し、上澄みの混濁物は１％大麦β−グルカンであり、４℃で保管する。
３、１％カルボキシメチルセルロース
１ｇのカルボキシメチルセルロースを１００ｍｌの蒸留水に徐々に添加し、添加しながら磁気撹拌機で撹拌し、均一な混濁物を得、１％カルボキシメチルセルロースであり、４℃で保管する。
４、エビ殻粉末と蟹殻粉末の調製
エビ殻又は蟹殻を取り、洗浄、乾燥した後粉末に粉砕し、１００メッシュの篩で濾過し、粉末を取り、そして、５％のＨＣｌ水溶液で２時間粉末を浸漬することによりＣａ２＋を除去し、中性まで水で洗浄し、乾燥させる。そして１０％のＮａＯＨ水溶液で粉末を浸漬し、２時間沸騰水浴してタンパク質を除去し、中性まで水で洗浄し、乾燥し、得られた粉末はエビ殻粉末又は蟹殻粉末である。
一、基質の調製
１、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
２、１％大麦β−グルカンの調製
１ｇの大麦β−グルカンを１００ｍｌの蒸留水に溶解し、１００℃で３分間水浴し、室温まで静置し、５０００ｒｐｍで５分間遠心し、沈殿を除去し、上澄みの混濁物は１％大麦β−グルカンであり、４℃で保管する。
３、１％カルボキシメチルセルロース
１ｇのカルボキシメチルセルロースを１００ｍｌの蒸留水に徐々に添加し、添加しながら磁気撹拌機で撹拌し、均一な混濁物を得、１％カルボキシメチルセルロースであり、４℃で保管する。
４、エビ殻粉末と蟹殻粉末の調製
エビ殻又は蟹殻を取り、洗浄、乾燥した後粉末に粉砕し、１００メッシュの篩で濾過し、粉末を取り、そして、５％のＨＣｌ水溶液で２時間粉末を浸漬することによりＣａ２＋を除去し、中性まで水で洗浄し、乾燥させる。そして１０％のＮａＯＨ水溶液で粉末を浸漬し、２時間沸騰水浴してタンパク質を除去し、中性まで水で洗浄し、乾燥し、得られた粉末はエビ殻粉末又は蟹殻粉末である。
二、Ｃｈｉ９２タンパク質のキチナーゼとしての基質（いくらかのβ−１，４−グリコシド結合で接続する多糖）特異性
１、実施例２のステップ一の２で得られた５０ｍｇの乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、ステップ一で調製した各種の基質、キチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、グリコールキチン、又は大麦β−グルカンにより１％コロイドキチンを代替し、方法は実施例１のステップ四の３を参照する。
結果を表３に示す。結果から、Ｃｈｉ９２タンパク質が１％コロイドキチン、１％大麦β−グルカン、１％カルボキシメチルセルロースに対して異なる程度の分解能力を有し、カルボキシメチルセルロース粉末、キトサン粉末、エビ殻粉末、キチン粉末、大麦β−グルカン粉末及びグリコールキチン粉末に対して微弱な分解能力が有するが、蟹殻粉末と反応した後還元糖の生成が検出されていないことが分かる。
１、実施例２のステップ一の２で得られた５０ｍｇの乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、ステップ一で調製した各種の基質、キチン、カルボキシメチルセルロース、キトサン、グリコールキチン、又は大麦β−グルカンにより１％コロイドキチンを代替し、方法は実施例１のステップ四の３を参照する。
結果を表３に示す。結果から、Ｃｈｉ９２タンパク質が１％コロイドキチン、１％大麦β−グルカン、１％カルボキシメチルセルロースに対して異なる程度の分解能力を有し、カルボキシメチルセルロース粉末、キトサン粉末、エビ殻粉末、キチン粉末、大麦β−グルカン粉末及びグリコールキチン粉末に対して微弱な分解能力が有するが、蟹殻粉末と反応した後還元糖の生成が検出されていないことが分かる。
実施例６、タンパク質酵素及びテラピア腸液のＣｈｉ９２タンパク質キチナーゼの酵素活性に対する影響
実施例２のステップ一の２で得られた乾燥粉末を被測定乾燥粉末（主な成分がＣｈｉ９２タンパク質である）として、本実施例の試験を行う。
実施例２のステップ一の２で得られた乾燥粉末を被測定乾燥粉末（主な成分がＣｈｉ９２タンパク質である）として、本実施例の試験を行う。
１、以下の各種のタンパク質酵素溶液を調製する：トリプシンをｐＨ７．０、０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、α−キモトリプシンをｐＨ７．０、０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、ペプシンをｐＨ２．０、０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解する。
２、テラピア腸液の調製
スーパーマーケットから購入したテラピアを取り、解剖し、ＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ ８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇ／Ｌで、溶剤が蒸留水で、ｐＨが７．２である）で腸管を洗浄し、洗浄液（ＰＢＳ緩衝液に溶解する腸管内容物を含有する）を収集し、テラピア腸液である。使用する際、ＰＢＳ緩衝液によりテラピア腸液を目標濃度（濃度がタンパク質濃度で計算する）に希釈する。
３、５０ｍｇの被測定乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
４、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
５、ステップ４で調製された１％コロイドキチンにタンパク質酵素溶液又はテラピア腸液を付加する。
６、酵素活性の検出
（１）１２本の試験管を取り、それぞれ０．２５ｍＬの被測定溶液とステップ５で得られた０．２５ｍＬの溶液（タンパク質酵素又はテラピア腸液でのタンパク質とＣｈｉ９２タンパク質との質量比が１：１０である）に入れ、試験管１−３は４０℃で０分間水浴し、試験管４は４℃で０分間（対照）置き、試験管５−７は４０℃で３０分間水浴し、試験管８は４℃で３０分間（対照）置き、試験管９−１１は４０℃で６０分間水浴し、試験管１２は４℃で６０分間（対照）置く。
（２）ステップ（１）を完成した試験管を取り、各管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を添加し、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水により２．５ｍｌまで補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式を対照して酵素活性を計算する。
７、ＣＫ組：ステップ３で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
各組の処理における被測定溶液のキチナーゼ酵素活性とＣＫ組の被測定溶液のキチナーゼ酵素活性との比値を相対的酵素活性とし、結果を図９に示す。ペプシンとトリプシンはＣｈｉ９２タンパク質の酵素活性に基本的に影響せず、α−キモトリプシンとテラピア腸液が６０分間作用した後Ｃｈｉ９２タンパク質は依然として４０％以上の相対的酵素活性を保持していることから、Ｃｈｉ９２タンパク質は養殖業での飼料添加剤として、飼料におけるキチン類物質（例えばエビ殻粉末、酵母菌粉末等であり、エビ殻粉末と酵母菌粉末はいずれも魚類飼料での一般的な成分である）を分解して、動物飼料のコストを低下できることが明らかである。
２、テラピア腸液の調製
スーパーマーケットから購入したテラピアを取り、解剖し、ＰＢＳ緩衝液（ＮａＣｌ ８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４ １．４４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２４ｇ／Ｌで、溶剤が蒸留水で、ｐＨが７．２である）で腸管を洗浄し、洗浄液（ＰＢＳ緩衝液に溶解する腸管内容物を含有する）を収集し、テラピア腸液である。使用する際、ＰＢＳ緩衝液によりテラピア腸液を目標濃度（濃度がタンパク質濃度で計算する）に希釈する。
３、５０ｍｇの被測定乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
４、１％コロイドキチンの調製
実施例１のステップ四の１と同じである。
５、ステップ４で調製された１％コロイドキチンにタンパク質酵素溶液又はテラピア腸液を付加する。
６、酵素活性の検出
（１）１２本の試験管を取り、それぞれ０．２５ｍＬの被測定溶液とステップ５で得られた０．２５ｍＬの溶液（タンパク質酵素又はテラピア腸液でのタンパク質とＣｈｉ９２タンパク質との質量比が１：１０である）に入れ、試験管１−３は４０℃で０分間水浴し、試験管４は４℃で０分間（対照）置き、試験管５−７は４０℃で３０分間水浴し、試験管８は４℃で３０分間（対照）置き、試験管９−１１は４０℃で６０分間水浴し、試験管１２は４℃で６０分間（対照）置く。
（２）ステップ（１）を完成した試験管を取り、各管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を添加し、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水により２．５ｍｌまで補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式を対照して酵素活性を計算する。
７、ＣＫ組：ステップ３で得られた被測定溶液のキチナーゼ酵素活性を検出し、方法は実施例１のステップ四の３と同じである。
各組の処理における被測定溶液のキチナーゼ酵素活性とＣＫ組の被測定溶液のキチナーゼ酵素活性との比値を相対的酵素活性とし、結果を図９に示す。ペプシンとトリプシンはＣｈｉ９２タンパク質の酵素活性に基本的に影響せず、α−キモトリプシンとテラピア腸液が６０分間作用した後Ｃｈｉ９２タンパク質は依然として４０％以上の相対的酵素活性を保持していることから、Ｃｈｉ９２タンパク質は養殖業での飼料添加剤として、飼料におけるキチン類物質（例えばエビ殻粉末、酵母菌粉末等であり、エビ殻粉末と酵母菌粉末はいずれも魚類飼料での一般的な成分である）を分解して、動物飼料のコストを低下できることが明らかである。
実施例７、Ｃｈｉ９２タンパク質のキチナーゼとしての酵母細胞壁を分解する能力
１、実施例２のステップ一の２で得られた５０ｍｇの乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、ＣｈｉＣＤ３タンパク質乾燥粉末の調製方法：特許「キチナーゼＣｈｉＣＤ３及びそのコード遺伝子並びに応用」（中国出願番号が２０１１１００９２０７９．１である）における実施例２のステップ一の２の（２）で調製したＣｈｉＣＤ３タンパク質液を取り、冷凍乾燥し、ＣｈｉＣＤ３タンパク質乾燥粉末を得る。ＣｈｉＣＤ３タンパク質乾燥粉末を、１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
３、Ｃ６１３７タンパク質はＳｉｇｍａ会社から購入したキチナーゼタンパク質である。Ｃ６１３７タンパク質を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
４、酵母菌粉末の調製：ピキアパストリスＧＳ１１５の単一コロニーを２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで４８時間発振培養し、そして０．１％（体積比）の接種量で２００ｍＬのＹＰＤ液体培地が装入されている１Ｌの三角フラスコに転移し、３０℃、１８０ｒｐｍで２ｄ発振培養し、培養システム全体を取り、１０℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、菌体の沈殿を収集し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、そして真空冷凍乾燥機で乾燥し、得られた粉末は酵母菌粉末である。酵母菌粉末を８０℃でオーブンにより３０分間処理した後、熱不活化酵母粉末を得る。１ｇの酵母菌粉末を１００ｍＬの蒸留水に溶解し、１％酵母菌粉末溶液を得る。１ｇの熱不活化酵母粉末を１００ｍＬの蒸留水に溶解し、１％熱不活化酵母粉末溶液を得る。
５、キチナーゼで酵母菌粉末を分解するキチナーゼ活性の測定
それぞれステップ１で調製された被測定溶液、ステップ２で調製された被測定溶液及びステップ３で調製された被測定溶液に対し、以下のように測定する：
（１）１２本の試験管を取り、それぞれ０．２５ｍＬの被測定溶液と０．２５ｍＬの１％熱不活化酵母粉末溶液を添加し、試験管１−３は４０℃で０時間水浴し、試験管４は４℃で０時間（対照）置き、試験管５−７は４０℃で１．５時間水浴し、試験管８は４℃で１．５時間（対照）置き、試験管９−１１は４０℃で３時間水浴し、試験管１２は４℃で３時間（対照）置く。
（２）ステップ（１）を完成した試験管を取り、各管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を添加し、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水で２．５ｍｌに補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式を対照して還元糖濃度を得る。
還元糖の含有量濃度を図１０に示す。１．５時間と３時間反応した後、Ｃｈｉ９２タンパク質組の還元糖含有量は、Ｃ６１３７タンパク質組とＣｈｉＣＤ３タンパク質組よりも高くなり、即ちＣｈｉ９２タンパク質は酵母細胞乾燥粉末を分解する能力を有し、且つその能力はＣ６１３７タンパク質とＣｈｉＣＤ３タンパク質よりも高い。
１％熱不活化酵母粉末溶液の代わりに、１％酵母菌粉末溶液により上記ステップを行い、Ｃｈｉ９２タンパク質、Ｃ６１３７タンパク質及びＣｈｉＣＤ３タンパク質はいずれも酵母細胞乾燥粉末を分解する能力がない。
６、Ｃｈｉ９２タンパク質の熱不活化酵母粉末を分解する能力
（１）１８本の試験管を取り、それぞれにステップ１で調製された０．２５ｍＬの被測定溶液と０．２５ｍＬの１％熱不活化酵母粉末溶液を添加し、試験管１−３と試験管１０−１２は４０℃で０時間水浴し、試験管４−６と試験管１３−１５は４０℃で１．５時間水浴し、試験管７−９と試験管１６−１８は４０℃で３時間水浴する。
（２）ステップ（１）を完成した試験管１−９を取り、各試験管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を付加し、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水で２．５ｍｌに補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式を対照して還元糖濃度を得る。
（３）ステップ（１）を完成した試験管１０−１８を取り、１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを取り、グルコース検出キット（北京利文生物技術有限会社、製品標準番号：ＹＺＢ／京０７４８−２００９）でグルコース濃度を検出する。
非グルコースの還元糖の濃度＝還元糖濃度−グルコース濃度。
結果を図１１に示す。１．５時間と３時間反応する際、グルコースの産量はそれぞれ総還元糖産量の約１８％と２５％である。非グルコースの還元糖の産量はグルコースの産量よりも明らかに高い。
７、Ｃｈｉ９２タンパク質のキチナーゼとしての熱不活化酵母粉末を分解した分解産物の調製と特徴
実施例７のステップ１の５００μＬのＣｈｉ９２タンパク質溶液と５００μＬの１％熱不活化酵母粉末溶液を取って混合し、４０℃の水浴で０時間、１．５時間又は３時間インキュベートし、そして、１０分間沸騰水浴し、室温まで冷却した後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を収集し、真空冷凍乾燥機で乾燥して、乾燥粉末を収集し、走査電子顕微鏡の分析を行う。
結果を図１２に示し、Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれ水浴で０時間、１．５時間及び３時間インキュベートした後得られた乾燥粉末であり、１と２はそれぞれ３０００倍と８０００倍拡大したものであり、矢印で示すのは細胞壁に出現した小さな穴である。０時間の熱不活化酵母粉末に、少量の細胞表面に孔状が存在する。水浴で１．５時間インキュベートした後、細胞壁の表面の小さな穴の数が増加する。水浴で３時間インキュベートした後、細胞壁の表面の小さな穴の数と深さがいずれも明らかに増加する。
結果から、Ｃｈｉ９２タンパク質は養殖業での飼料添加剤として、飼料における酵母菌粉末等（酵母菌粉末が魚類飼料での一般的な成分である）を分解して、動物飼料のコストを低下できることが分かる。
１、実施例２のステップ一の２で得られた５０ｍｇの乾燥粉末を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
２、ＣｈｉＣＤ３タンパク質乾燥粉末の調製方法：特許「キチナーゼＣｈｉＣＤ３及びそのコード遺伝子並びに応用」（中国出願番号が２０１１１００９２０７９．１である）における実施例２のステップ一の２の（２）で調製したＣｈｉＣＤ３タンパク質液を取り、冷凍乾燥し、ＣｈｉＣＤ３タンパク質乾燥粉末を得る。ＣｈｉＣＤ３タンパク質乾燥粉末を、１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
３、Ｃ６１３７タンパク質はＳｉｇｍａ会社から購入したキチナーゼタンパク質である。Ｃ６１３７タンパク質を１０ｍＬのｐＨ６．０、０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液に溶解し、被測定溶液を得る。
４、酵母菌粉末の調製：ピキアパストリスＧＳ１１５の単一コロニーを２０ｍＬのＹＰＤ液体培地に接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで４８時間発振培養し、そして０．１％（体積比）の接種量で２００ｍＬのＹＰＤ液体培地が装入されている１Ｌの三角フラスコに転移し、３０℃、１８０ｒｐｍで２ｄ発振培養し、培養システム全体を取り、１０℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、菌体の沈殿を収集し、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、そして真空冷凍乾燥機で乾燥し、得られた粉末は酵母菌粉末である。酵母菌粉末を８０℃でオーブンにより３０分間処理した後、熱不活化酵母粉末を得る。１ｇの酵母菌粉末を１００ｍＬの蒸留水に溶解し、１％酵母菌粉末溶液を得る。１ｇの熱不活化酵母粉末を１００ｍＬの蒸留水に溶解し、１％熱不活化酵母粉末溶液を得る。
５、キチナーゼで酵母菌粉末を分解するキチナーゼ活性の測定
それぞれステップ１で調製された被測定溶液、ステップ２で調製された被測定溶液及びステップ３で調製された被測定溶液に対し、以下のように測定する：
（１）１２本の試験管を取り、それぞれ０．２５ｍＬの被測定溶液と０．２５ｍＬの１％熱不活化酵母粉末溶液を添加し、試験管１−３は４０℃で０時間水浴し、試験管４は４℃で０時間（対照）置き、試験管５−７は４０℃で１．５時間水浴し、試験管８は４℃で１．５時間（対照）置き、試験管９−１１は４０℃で３時間水浴し、試験管１２は４℃で３時間（対照）置く。
（２）ステップ（１）を完成した試験管を取り、各管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を添加し、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水で２．５ｍｌに補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式を対照して還元糖濃度を得る。
還元糖の含有量濃度を図１０に示す。１．５時間と３時間反応した後、Ｃｈｉ９２タンパク質組の還元糖含有量は、Ｃ６１３７タンパク質組とＣｈｉＣＤ３タンパク質組よりも高くなり、即ちＣｈｉ９２タンパク質は酵母細胞乾燥粉末を分解する能力を有し、且つその能力はＣ６１３７タンパク質とＣｈｉＣＤ３タンパク質よりも高い。
１％熱不活化酵母粉末溶液の代わりに、１％酵母菌粉末溶液により上記ステップを行い、Ｃｈｉ９２タンパク質、Ｃ６１３７タンパク質及びＣｈｉＣＤ３タンパク質はいずれも酵母細胞乾燥粉末を分解する能力がない。
６、Ｃｈｉ９２タンパク質の熱不活化酵母粉末を分解する能力
（１）１８本の試験管を取り、それぞれにステップ１で調製された０．２５ｍＬの被測定溶液と０．２５ｍＬの１％熱不活化酵母粉末溶液を添加し、試験管１−３と試験管１０−１２は４０℃で０時間水浴し、試験管４−６と試験管１３−１５は４０℃で１．５時間水浴し、試験管７−９と試験管１６−１８は４０℃で３時間水浴する。
（２）ステップ（１）を完成した試験管１−９を取り、各試験管に１ｍＬのＤＮＳ溶液を付加し、５分間沸騰水浴し、そして蒸留水で２．５ｍｌに補足し、遠心して上澄み液を取り、５４０ｎｍでＯＤ値を測定し、標準曲線方程式を対照して還元糖濃度を得る。
（３）ステップ（１）を完成した試験管１０−１８を取り、１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、上澄みを取り、グルコース検出キット（北京利文生物技術有限会社、製品標準番号：ＹＺＢ／京０７４８−２００９）でグルコース濃度を検出する。
非グルコースの還元糖の濃度＝還元糖濃度−グルコース濃度。
結果を図１１に示す。１．５時間と３時間反応する際、グルコースの産量はそれぞれ総還元糖産量の約１８％と２５％である。非グルコースの還元糖の産量はグルコースの産量よりも明らかに高い。
７、Ｃｈｉ９２タンパク質のキチナーゼとしての熱不活化酵母粉末を分解した分解産物の調製と特徴
実施例７のステップ１の５００μＬのＣｈｉ９２タンパク質溶液と５００μＬの１％熱不活化酵母粉末溶液を取って混合し、４０℃の水浴で０時間、１．５時間又は３時間インキュベートし、そして、１０分間沸騰水浴し、室温まで冷却した後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を収集し、真空冷凍乾燥機で乾燥して、乾燥粉末を収集し、走査電子顕微鏡の分析を行う。
結果を図１２に示し、Ａ、Ｂ、Ｃは、それぞれ水浴で０時間、１．５時間及び３時間インキュベートした後得られた乾燥粉末であり、１と２はそれぞれ３０００倍と８０００倍拡大したものであり、矢印で示すのは細胞壁に出現した小さな穴である。０時間の熱不活化酵母粉末に、少量の細胞表面に孔状が存在する。水浴で１．５時間インキュベートした後、細胞壁の表面の小さな穴の数が増加する。水浴で３時間インキュベートした後、細胞壁の表面の小さな穴の数と深さがいずれも明らかに増加する。
結果から、Ｃｈｉ９２タンパク質は養殖業での飼料添加剤として、飼料における酵母菌粉末等（酵母菌粉末が魚類飼料での一般的な成分である）を分解して、動物飼料のコストを低下できることが分かる。
本発明が提供するピキアパストリスｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２は、Ｃｈｉ９２タンパク質を効率的に生産する能力がある。ピキアパストリスｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２の発酵産物（Ｃｈｉ９２タンパク質）は、キチナーゼ活性を有し、その比活性が８０９．２０７Ｕ／ｍｇであり、コロイドキチンに対してのＫｍ値とＶｍａｘ値はそれぞれ３．９６７ｍｇ／ｍＬと１６１０μｍｏｌ／（ｍｇ・ｈ）である。前記発酵産物（Ｃｈｉ９２タンパク質）は、キチナーゼとして、以下の利点を有している：最適反応温度が４０℃で、且つ３０−４５℃で６０．０％以上の活性を保持している；優れた熱安定性を有し、４０℃で６０分間処理した後、Ｃｈｉ９２タンパク質は依然として８０％以上の相対的酵素活性を保持している；最適反応ｐＨが８．０であり、ｐＨ６−９の範囲内に酵素活性を８０％以上に維持することができる；優れたｐＨ安定性を有し、高い比活性を有している。本発明は現代のキチン産業の発展に対して重要な意義を有している。
Claims (2)
- 寄託番号がＣＧＭＣＣ Ｎｏ．７６３４であるピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）菌株ｐＰＩＣ９／Ｃｈｉ９２。
- Ｃｈｉ９２タンパク質は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（ａ）である請求項１に記載の菌株のＣｈｉ９２タンパク質の生産での応用。
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