JP2008512105A - K5多糖の製造方法 - Google Patents
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- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
Abstract
Description
−発酵槽で行うことができ、
−バッチ増殖段階と、
−1回または数回のフェッドバッチ増殖段階と、
−温度を下げ、培地のpHを9までの値に上げる冷却段階と、
−バイオマスを培養培地から分離する段階と、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階と、
を含む、K5多糖を産生する大腸菌株の発酵工程と、
−培養培地および/またはバイオマスを使用する精製工程と、
を含むK5多糖の製造方法である。
−約7−約11の値へのpHの調整、
−沈殿、
−沈殿物の溶解、
−得られた懸濁液の濾過、および、
−アルコール沈殿、
を記載の順序で含んでいる。
本発明によるK5多糖の製造に使用できる大腸菌株は、パブリックコレクション例えばCNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorgansmes,France)またはATCC(American Type Culture Collection,USA)から得られる。あるいは、これらの菌株を臨床的に単離し、次いで文献に記載されたように莢膜の抗原型のキャラクタリゼーションを行ってもよい(Eur.J.Biochem,1988 117:112−125)。
−バッチ増殖段階と、
−指数増加量または一定量のフィードを伴う1回または複数のフェッドバッチ増殖サイクルと、
−温度を約10−12℃に下げpHを約7.5−9に上げる冷却段階と、
−バイオマスを培養培地から分離する段階と、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階と、
を含む。
−炭素源がグリセロールであり、グリセロールの濃度は、
−バッチ増殖段階の出発培養培地中に約10−約90g/lの範囲であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中に約250−約1200g/lの範囲であり、
−増殖温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階では約30℃であり、
−必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約25℃である。
−炭素源がグリセロールであり、グリセロールの濃度が、
−バッチ増殖段階の出発培養培地中に約10−約90g/lの範囲であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中に約250−約1200g/lの範囲であり、
−バッチ増殖段階の培地の窒素源が
−出発培養培地では約1−約10g/lの範囲の濃度のNH4OH、NH3または(NH4)2HPO4であり、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではpHを調整するために約20%濃度のNH4OHまたはNH3によって供給される。
−バッチ増殖段階の培地の窒素源が、
−出発培養培地では約1−約10g/lの範囲のNH4OH、NH3または(NH4)2HPO4であり、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではpHを調整するために約20%濃度のNH4OHまたはNH3によって供給され、
−増殖温度が、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階では約30℃であり、
−必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約25℃である。
発酵工程が、以下の段階、すなわち、
−バッチ増殖段階、
−先行段階の培地中の炭素源が完全消耗したときに開始する指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する二回目の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル、
−温度を約12℃に下げpHを約7.5−約9の範囲の値に上げる冷却段階、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階、
を記載の順序で含み、
上記段階を以下のパラメーターで行う、すなわち、
−温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階中は約30℃、
−他の2回のフェッドバッチ増殖段階中は約25℃
であり、
−窒素源は、
−出発培養培地には約1−約10g/lの範囲の濃度のNH4OH、NH3または(NH4)2HPO4によって供給され、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階にはpHを調整するために約20%の濃縮NH4OHまたはNH3の添加によって供給され、
−炭素源はグリセロールであり、その濃度は、
−最初のバッチ増殖段階の出発培養培地中で約10−約90g/lの範囲の濃度であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中で約250−約1200g/lの範囲の濃度である。
本発明の1つの目的はまた、精製工程を含む上記のようなK5多糖の製造方法である。この精製工程では、発酵ブロスの遠心上清またはこの遠心で得られたペレットの再懸濁液から成るK5多糖含有溶液のpHを約7−約11に調整し、この溶液から多糖を沈殿させる。次に沈殿物を洗浄し、再溶解し、濾過し、次いで沈殿させる。
−バイオマスから培養培地を分離するために培養物を遠心する段階;
−発酵ブロスの遠心上清を使用して
−pHを約7−約11の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を10%酢酸ナトリウムに溶解し、
−10%酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって3回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階;
−同時に、発酵ブロスの遠心によって得られたペレットを使用して
−ペレットを再懸濁化し、
−pHを約7−約11の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を10%酢酸ナトリウムに再溶解し、
−10%酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって3回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階;
−各々の精製工程で得られた2つの調製物を合せる段階;
−K5多糖の沈殿、遠心および乾燥を行う段階;
を行う方法である。
−バッチ増殖段階、
−先行段階の培地中の炭素源が完全消耗したときに開始する指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する二回目の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル、
−温度を約12℃に下げpHを約7.5−約9の範囲の値に上げる冷却段階、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階、
を記載の順序で含み、
上記段階が以下のパラメーターで行われる、すなわち:
−温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階中は約30℃、
−他の2回のフェッドバッチ増殖段階中は約25℃
であり、
−窒素源は、
−出発培養培地には約1−約10g/lの範囲の濃度のNH4OH、NH3または(NH4)2HPO4によって供給され、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階にはpHを調整するために約20%の濃縮NH4OHまたはNH3の添加によって供給され、
−炭素源はグリセロールであり、その濃度は、
−最初のバッチ増殖段階の出発培養培地中に約10−約90g/lの範囲の濃度であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中に約250−約1200g/lの範囲の濃度であり、
精製工程が以下の段階:
−バイオマスから培養培地を分離するために培養物を遠心する段階;
−発酵ブロスの遠心上清を使用して
−pHを約7−約11の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を10%酢酸ナトリウムに溶解し、
−10%酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって3回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階;
−同時に、発酵ブロスの遠心によって得られたペレットを使用して
−ペレットを再懸濁化し、
−pHを約7−約11の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を10%酢酸ナトリウムに再溶解し、
−10%酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって3回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階;
−各々の精製工程で得られた2つの調製物を合せる段階;
−K5多糖を沈殿、遠心および乾燥させる段階を含む方法である。
(a)発酵
発酵は20リットルの発酵槽で大腸菌株ATCC23506を使用して行う。
−処理容量12l、
−初期容量8l、
−追加容量4l
−最終容量は12lプラス基底容量、
−溶存酸素は空気飽和量の15%−80%の範囲(好ましくは30%)に維持、
−温度は20−40℃の範囲(好ましくは30℃)、
−pHは濃NH4OHまたはNH3を加えて6.0−7.5(好ましくは6.5)に調整、
−圧力は0.3バール、0.5バールおよび0.8バール、
−初期通風は4l.分−1(0.5VVM)(4−20l.分−1の範囲で調整)、
−初期撹拌速度は200rpm(200−1500rpmの範囲で調整)。
バッチモードの培養段階では、菌株の世代時間を二酸化炭素の発生量の測定値から算定し、管理された基質フィードを伴うバッチ増殖の最初の部分の初期速度を計算する:
Q0=(CO2pmax×VolFer)/(1000×MWCO2×YCO2/グリセロール×G0)
Q0:濃縮培地の初期流速(1.時−1);
CO2pmax:二酸化炭素の最大発生量(mmol.l−1.時−1);
G0:管理された基質フィードを伴うバッチ増殖中に使用された濃縮培地中のグリセロールまたはグルコースの濃度(750g.l−1);
VolFer:発酵槽中の液体容量;
MWCO2:CO2の分子量(g.l−1);
YCO2/グリセロール:グリセロール消費量あたりのCO2の発生量。
炭素源の消耗後、バイオマスの濃度を増加させるために、指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクルを開始する。新しい培地を供給するポンプのスイッチを入れる。ポンプの吐出量は時間の経過に伴って指数関数的に増加する。
Q(t)=Q0×2[t/(τ×2.4)]
Q0:フィードポンプの初期供給量(l.時−1);
t:指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル開始後の経過時間;
τ:バッチ増殖中に測定した菌株世代時間。
最初の酸素移動の極限に達すると、(溶存酸素<20%、撹拌速度>1350rpm、空気流速>19,5l.分−1、圧力=0.5バール)、この指数増加量の基質フィードを伴う1回目のバッチ増殖段階を停止する。管理された基質フィードを伴う1回目のバッチ増殖サイクルの開始時の8.4ml.時−1という流速に基づいて次の指数増加量のフィードを開始する。先行の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクルと同様に、4−10の範囲(好ましくは6)の新しい補正率を世代時間に乗算する。この供給量は0.05時−1から0.16時−1の範囲の増殖率を微生物に与える。
Q’(t)=0.0084×2[t/(τ×6)]
t:指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル開始後に経過した時間;
τ:バッチ増殖中に測定した菌株世代時間。
2回目の酸素移動の極限(溶存酸素<20%、撹拌速度>1350rpm、空気流速>19.5l.分−1、圧力=0.5バール)が出現すると、指数増加量の培地フィードを1−20ml.l−1.時−1の範囲(好ましくは4.2ml.l−1.時−1)の一定供給量に切換える。4lのフィード培地が注入されるかまたはpHの有意な低下(強力な酸素極限の指標となるNH4OHの完全消費)が検出されるまでこの供給量を継続する。
次にフィードポンプのスイッチを切り、発酵槽の温度を10℃に下げる。この間に、pHはK5多糖酵素リアーゼの活性に好ましい7.5−9(好ましくは8.5)という値まで自然に上昇するかまたはこのような値に調節できる。これらの条件を0−10時間維持する。
発酵槽が10℃まで冷えた後、バイオハザードレベル2の作業条件下でバイオマスを気密容器に採集する。ブロスを遠心してバイオマスを培地上清から分離する。分離後、80℃で1時間30分の熱処理によって撹拌しながら上清を除染する。バイオマス自体は80℃で2時間30分の処理によって除染する。上清およびバイオマスを−20℃で保存する。
−COL5K000/001:30℃のバッチ増殖段階/30℃で行う指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階/冷却段階;
−COL5K002:30℃のバッチ増殖段階/30℃で行う指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階/2回目の30℃の指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階/冷却段階;
−COL5K003/004:30℃のバッチ増殖段階/30℃で行う指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階/25℃で行う2回目の指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階/冷却段階;
−COL5K005/006:30℃のバッチ増殖段階/30℃で行う指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階/25℃で行う2回目の指数増加量の基質フィードを伴う増殖段階/25℃で行う一定量の基質フィードを伴う増殖段階/冷却段階。
多糖の分析は2工程で行う。
1.最初に多糖をその構成二糖に解重合する。
2.二糖混合物をHPLCによって分析する。
分析すべき約40mgのサンプルを2mlのpH7の酢酸塩バッファ(0.29mlの酢酸、5mgのBSA、15.8mgの酢酸カルシウム、総量を50mlにする量の脱イオン水、2Nの水酸化ナトリウムでpHを7に調整)に再懸濁させ、20mg/mlを含有する溶液を得る。
勾配HPLCを使用し当業者に公知の方法に従って前項の混合物を分析する。以下の分析条件を使用する:
−カラム:Spherisorb SAX 5μm、250×3mm、Waters、
−カラム温度:40℃、
−流速:0.5ml/分、
−注入量:10μl、
−234nmでUV検出、
−移動相:
溶媒A:NaH2PO4、2.5mM pH=2.9
溶媒B:NaClO4、M、NaH2PO4 2.5mM pH=3
勾配:
−炭素源としてグルコースの代わりにグリセロールを使用する:
−酸素移動の極限が出現したときに、低下させた増殖率の基質フィード段階(2回目および3回目のフィード段階)を付加することによって発酵総時間を延長する:
−フィード溶液のグリセロール濃度を増加する(500g.l−1を750g.l−1にする):
−処理終了時のpHを上げ、これによってK5多糖リアーゼの活性に有利な条件を成立させ、培養培地中に得られる多糖の量を増加させる。
以下に記載の抽出工程は、上記で得られた発酵上清からK5多糖を単離するために行った。
実施例2で単離した生成物の力価が低かったので(わずか54%)、追加の精製工程を実施した。
実施例1の発酵槽COL5K002から粗K5多糖を抽出して精製した。
実施例4の発酵槽COL5K003から粗K5多糖を抽出して精製した。
先行の試験では上清だけを抽出して精製した。遠心沈降物中に存在するK5多糖を回収するために、実施例1の発酵槽COL5K002から得られたペレット(31.9gのK5多糖を含有する5kg)を等容量の脱イオン水に再懸濁させ、5NのNaOHでpHを7.2に調整した。次に混合物を室温で2時間撹拌し、次いで4700×gで90分間遠心した。
実施例1の発酵槽COL5K003から得られたペレット(28.5gのK5多糖を含有する4.75kg)を4.75リットルの脱イオン水に再懸濁させ、5NのNaOHでpHを7.2に調整した。次に混合物を室温で2時間撹拌し、次いで4700×gで2時間遠心した。
最終生成物の純度を改善するために酵素による除タンパク工程を実施した。
2種類の処理の相対的有効性を評価するために、実施例7で得られた5gのK5多糖を過酸化水素またはアルカリ性アルカラーゼによって処理した。
Claims (40)
- a)発酵槽で行うことができ、
−バッチ増殖段階と、
−1回または数回のフェッドバッチ増殖段階と、
−温度を下げ、培地のpHを9までの値に上げる冷却段階と、
−バイオマスを培養培地から分離する段階と、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階と、
を含む、K5多糖を産生する大腸菌株の発酵工程と、
b)培養培地および/またはバイオマスを使用する精製工程と、
を含むK5多糖の製造方法。 - 培養培地および/またはバイオマスを出発材料とする精製工程が、
−約7−約11の値へのpHの調整、
−第一回目の沈殿、
−沈殿物の溶解、
−得られた懸濁液の濾過、および、
−アルコール沈殿、
を含む請求項1に記載のK5多糖の製造方法。 - バッチ増殖段階後に、指数増加量の基質フィードを伴う2回のバッチ増殖段階を含む請求項1または2に記載の方法。
- 冷却段階の前に、一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階を含む請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- バッチ増殖段階で培地中の炭素源が消耗したときに一回目のフェッドバッチ増殖段階を開始することを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- −バッチ増殖段階で培地中の炭素源が消耗したときに一回目のフェッドバッチ増殖段階を開始すること、
−必要ならば、酸素移動の極限の結果として溶存酸素の濃度が有意に低下したときに、その後のフェッドバッチ増殖段階を開始すること、
を特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - −バッチ増殖段階中の培地中の炭素源が消耗したときに一回目のフェッドバッチ増殖段階を開始すること、
−必要ならば、酸素移動の極限の結果として溶存酸素の濃度が有意に低下したときに、その後のフェッドバッチ増殖段階を開始すること、
−全部の培養フィード培地が発酵槽に注入されたかまたはpHの変化が検出されたときに、冷却段階を開始すること、
を特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 炭素源がグルコースまたはグリセロールであることを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 炭素源がグリセロールであることを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 炭素源がグリセロールであり、その濃度がバッチ増殖段階の出発培養培地中で約10−約90g/lの範囲であり、フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中では約250−約1200g/lの範囲であることを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- バッチ増殖段階の培地の窒素源が酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン、NH4OH、NH3または(NH4)2HPO4から成ることを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- バッチ増殖段階の出発培養培地中の窒素源がNH4OH、NH3または(NH4)2HPO4であることを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- バッチ増殖段階の出発培養培地中の窒素源の濃度が約1−約10g/lの範囲であることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階のpHを調整するために、窒素源がNH4OHまたはNH3によって供給されることを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階のpHを調整するために、窒素源が約20%濃度のNH4OHまたはNH3によって供給されることを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- バッチ増殖段階の培地の窒素源が、出発培養培地では約1−約10g/lの範囲の濃度のNH4OH、NH3または(NH4)2HPO4であり、バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではpHを調整するために約20%濃度のNH4OHまたはNH3によって供給されることを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 増殖温度が約10℃−約40℃の範囲であることを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 増殖温度は、バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階では約30℃であり、必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約25℃であることを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- −炭素源がグリセロールであり、グリセロールの濃度は、
−バッチ増殖段階では出発培養培地中に約10−約90g/lの範囲であり、
−フェッドバッチ増殖段階ではフィード培地中に約250−約1200g/lの範囲であり、
−増殖温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階では約30℃であり、
−必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約25℃である
ことを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。 - −炭素源がグリセロールであり、グリセロールの濃度が、
−バッチ増殖段階では出発培養培地中に約10−約90g/lの範囲であり、
−フェッドバッチ増殖段階ではフィード培地中に約250−約1200g/lの範囲であり、
−バッチ増殖段階の培地の窒素源が
−出発培養培地では約1−約10g/lの範囲の濃度のNH4OH、NH3または(NH4)2HPO4であり、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではpHを調整するために約20%濃度のNH4OHまたはNH3によって供給される
ことを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。 - −バッチ増殖段階の培地の窒素源が、
−出発培養培地では約1−約10g/lの範囲の濃度のNH4OH、NH3または(NH4)2HPO4であり、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階ではpHを調整するために約20%濃度のNH4OHまたはNH3によって供給され、
−増殖温度が、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階では約30℃であり、
−必要ならば行う他のフェッドバッチ増殖段階では約25℃である、
ことを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。 - 発酵工程が、以下の段階、すなわち、
−バッチ増殖段階、
−先行段階の培地中の炭素源が完全消耗したときに開始する指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する二回目の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル、
−温度を約12℃に下げpHを約7.5−約9の範囲の値に上げる冷却段階、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階、
を記載の順序で含むこと、および、
前記工程を以下のパラメーターで行うこと、すなわち、
−温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階中は約30℃、
−他の2回のフェッドバッチ増殖段階中は約25℃
であり、
−窒素源は、
−出発培養培地には約1−約10g/lの範囲の濃度の(NH4)2HPO4、NH4OHまたはNH3によって供給され、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階にはpHを調整するために約20%の濃縮NH4OHまたはNH3の添加によって供給され、
−炭素源はグリセロールであり、その濃度は、
−最初のバッチ増殖段階の出発培養培地中で約10−約90g/lの範囲の濃度であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中で約250−約1200g/lの範囲の濃度である、
ことを特徴とする請求項1または2に記載の方法。 - バッチ増殖段階、フェッドバッチ増殖段階および冷却段階の後で遠心によってバイオマスを培養培地から分離することを特徴とする請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 分離後に、バイオマスと培養培地とを約80℃の温度で約1時間−約3時間の範囲の期間維持することによって失活させることを特徴とする請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
- 精製工程の一回目の沈殿は第四級アンモニウム塩を用いて行うことを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 第四級アンモニウム塩が塩化ベンゼトニウムである請求項25に記載の方法。
- 精製工程の最初の沈殿物を、特に10%濃度で使用する酢酸ナトリウムに再溶解させることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 精製工程で生じた濾液をメタノール沈殿させることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 精製工程の一回目の沈殿が塩化ベンゼトニウムを用いて行われること、この沈殿物を酢酸ナトリウムに再溶解させ、濾別し、精製工程で生じた濾液をメタノール沈殿させることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 精製後に得られた生成物を過酸化水素によって1回または数回脱色することを特徴とする請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
- 精製後に得られた生成物を過酸化水素によって3回脱色することを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 精製し過酸化水素で3回脱色した後に得られた生成物に過酸化水素による脱色処理をもう一度行うことを特徴とする請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼで処理する工程を含むことを特徴とする請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
- 使用されるプロテアーゼがアルカラーゼであることを特徴とする請求項33に記載の方法。
- 精製工程が以下の段階:
−バイオマスから培養培地を分離するために培養物を遠心する段階;
−発酵ブロスの遠心上清を使用して
−pHを約7−約11の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を10%酢酸ナトリウムに溶解し、
−10%酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって3回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階;
−同時に、発酵ブロスの遠心によって得られたペレットを使用して
−ペレットを再懸濁化し、
−pHを約7−約11の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を10%酢酸ナトリウムに再溶解し、
−10%酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって3回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階;
−各々の精製で得られた2つの調製物を合せる段階;
−K5多糖の沈殿、遠心および乾燥を行う段階;
を含むことを特徴とする請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。 - 発酵工程が、以下の段階:
−バッチ増殖段階、
−先行段階の培地中の炭素源が完全消耗したときに開始する指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する二回目の指数増加量の基質フィードを伴うバッチ増殖段階、
−酸素移動の極限の結果として先行段階の培養培地中の酸素濃度が有意に低下したときに開始する一定量の基質フィードを伴うバッチ増殖サイクル、
−温度を約12℃に下げpHを約7.5−約9の範囲の値に上げる冷却段階、
−バイオマスから混入培養培地を除去する段階、
を記載の順序で含むこと、および、
前記工程を以下のパラメーターで行うこと:
−温度は、
−バッチ増殖段階および一回目のフェッドバッチ増殖段階中は約30℃、
−他の2回のフェッドバッチ増殖段階中は約25℃
であり、
−窒素源は、
−出発培養培地には約1−約10g/lの範囲の濃度の(NH4)2HPO4、NH4OHまたはNH3によって供給され、
−バッチ増殖段階およびフェッドバッチ増殖段階にはpHを調整するために約20%の濃縮NH4OHまたはNH3の添加によって供給され、
−炭素源はグリセロールであり、その濃度は、
−最初のバッチ増殖段階の出発培養培地中で約10−約90g/lの範囲の濃度であり、
−フェッドバッチ増殖段階のフィード培地中で約250−約1200g/lの範囲の濃度であること、および、
精製工程が以下の段階:
−バイオマスから培養培地を分離するために培養物を遠心する段階;
−発酵ブロスの遠心上清を使用して
−pHを約7−約11の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を10%酢酸ナトリウムに溶解し、
−10%酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって3回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階;
−同時に、発酵ブロスの遠心によって得られたペレットを使用して
−ペレットを再懸濁化し、
−pHを約7−約11の値に調整し、
−塩化ベンゼトニウムで沈殿させ、
−沈殿物を洗浄し、
−沈殿物を10%酢酸ナトリウムに再溶解し、
−10%酢酸ナトリウム溶液を濾過し、
−濾液をメタノール沈殿させ、
−濾液を過酸化水素によって3回脱色し、
−アルカラーゼ処理する段階;
−各々の精製で得られた2つの調製物を合せる段階;
−K5多糖の沈殿、遠心および乾燥を行う段階;
を含むことを特徴とする請求項1または2に記載の方法。 - 請求項1から36のいずれか一項に記載の方法によって産生された多糖が酵素的および/または化学的な脱アセチル化、N−再硫酸化、C−5エピマー化および/またはO−硫酸化の反応基質として使用されることを特徴とする方法。
- 請求項1から36のいずれか一項に記載の方法によって産生された多糖が半合成ヘパリン(バイオヘパリン)を得るための基質として使用されることを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 得られたバイオヘパリンを次に約1500−約6500Daの範囲の分子量をもつLMWH(低分子量ヘパリン)を得るためのフラグメンテーション反応で基質として使用することを特徴とする請求項38に記載の方法。
- LMWHが、より特定的に約3500−約5500Daの範囲の分子量をもつ低分子量ヘパリンであるか、または、より特定的に約1500−約3000Daの範囲の分子量をもつ超低分子量ヘパリンであることを特徴とする請求項39に記載の方法。
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