JPS6283897A

JPS6283897A - 新規ヘテロ多糖類の製造方法

Info

Publication number: JPS6283897A
Application number: JP61211362A
Authority: JP
Inventors: ゴードン・タウル; デービス・アイ・スターリング
Original assignee: Celanese Corp
Current assignee: Celanese Corp
Priority date: 1985-09-09
Filing date: 1986-09-08
Publication date: 1987-04-17
Also published as: EP0215623A2; KR870003193A; EP0215623A3; KR890001287B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、メチロフィルス・ビスコゲネス（Ｍｅｔｈｙ
ｌｏｐｈｉｌｕｓ　ｖｉｓｃｏｇｅｎｅｓ）の菌株を増
殖条件下に好気培養して、新規種類のエキソ多＄１！　
（ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、たとえばヘ
テロ多糖ポリ５４を蓄積した量で生成させ、このエキソ
多糖をアルカリ性条件下で処理して、水溶液に大きなＩ
Ｍ僚塑性およびチキソトロピー性を付与することのでき
る脱アセチル化ヘテロ多糖を得ることを包含する方法に
関する。

（従来の技術）Ｃ１化合物からの単細胞タンパク賞（ＳＣＰ）の製造に
ついては、この１０年間に学術的もしくは工業的な実験
室で広く研究されてきた。三菱瓦斯化学■、ヘキスト社
、＋（１社などの企業がバイロフトプラントでの研究を
行ってきたが、現在ではＩＣ１社のみが本格規模のＳＣ
Ｐ工場を稼動させている。１０１社のこの製品は「プル
ティーン（Ｐｒｕ　ｔｅｅｎ）　Ｊなる登録商標で呼ば
れ、この製品は絶対メチロトローフ性の細菌であるメチ
ロフィルス・メチロトロフス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌ
ｕｓ　＋５ｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）の醗酵により
製造され、これは最終的に分離・乾燥されて粉末もしく
は顆粒状で得ている。

メチロフィルス・メチロトロフスはホルムアルデヒド固
定のりブロース−リン酸経Ｆｌ（ＲＭＰ）を利用する絶
対メチロトローフである。メチロフィルス・メチロトロ
フスの菌株Ａｓ−１は、単一の極性鞭毛を持ったダラム
陰性の無着色桿菌である。

メタノールおよびその他のＣ６化合物は一般に単細胞タ
ンパク質製造用の基質として検討されているが、Ｃ１化
合物をｓｅｐ製造に適格とする因子により、これはまた
エキソ多１１Ｍのような蓄積された細胞外代謝産物の製
造用の供給原料としても利用可能であることが認められ
ている。メタノールを付加価値のある製品に転化させる
多くの微生物学的方法が発表されているが、それらは一
般にアミノ酸のような低容積／高価格の化合物である。

たとえば、Ｊ、　ＢｏｌｂｏｔおよびＣ０＾ｎｔｈｏｎ
ｙは、プロシーディング・オブ・ソサイエティ・ゼネラ
ル・マイクロバイアル（ｐｒ□（，５６ｃ、Ｇｅｎ、　
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、　５．４３　（１９７Ｂ）にお
いて、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　Ａ
　Ｍ　Ｉのピルビン酸デヒドロゲナーゼ欠乏変異株が、
メタノールでの増殖中にアミノ酸であるアラニンとバリ
ンを蓄積できることを見出した。　Ｙ、　Ｔａｎ１　ら
は、アグリカルチユラル・アンド・バイオロジカル・ケ
ミストリー（＾ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、ン
、　４２．２２７５　（１９７８）に、アルスロバクタ
−・グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｏｒ　ｇ
ｌｏｂｉｆ。

ｒｍｉｓ）の菌株を使用してメタノールから５．２　ｇ
／ｌまでのＬ−セリンが製造されることを述べている。

しかし、日常消費型の大量化学物質へのＣＩ化合物の生
物学的転化に関しては現在まだ報告がない。

（発明が解決しようとする問題点）よって、本発明の目的は、増殖炭素源を蓄積した量の細
胞外代謝産物に生物転化させる醗酵方法を提供すること
である。

本発明の別の目的は、Ｃ１化合物を蓄積した量のエキソ
多糖に生物酸化させ、生成したエキソ多糖を新規なヘテ
ロ多糖に化学的に変性させる方法を提供することである
。

本発明のさらに別の目的は、水溶液に擬偵塑性およびチ
キソトロピー性を付与するのに適した特性を示す新規な
ヘテロ多糖を提供することである。

本発明のその他の目的および利点は、以下の詳細な説明
および実施例から明らかとなろう。

（問題点を解決するための手段）本発明の目的は、増殖炭素ｆＪ（例、Ｃ１化合物もしく
はフルクトース）を含有する水性栄養培地中でメチロフ
ィルス・ビスコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　
ｖｉｓｃｏｇｅｎｅｓ）の菌株を好気培養して、この醗
酵培地中に蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖を生成させる
こと、前記醗酵培地から培養微生物を分離して、ヘテロ
多糖の無細胞水溶液を得ること、およびこの水溶液のｐ
Ｈをアルカリ性範囲内に調整して、得られたヘテロ多糖
を脱アセチル化すること、からなる醗酵方法の提供によ
り達成される。

本発明により得られる脱アセチル化ヘテロ多糖生成物は
、新規物質である。

菌体を遠心分離、限外口過もしくは加熱滅菌などの常法
により醗酵ブロスからすべて取り除（ことができ、得ら
れたエキソ多糖代謝産物の無細胞水溶液は次いで後続の
脱アセチル化および生成物回収の処理工程を受けさせる
ことができる。

本明細書で使用したｒｃ＋化合物」なる用語は、メタノ
ール、ホルムアルデヒド、ギ酸、ホルムアミド、−酸化
炭素、ジメチルエーテル、メチルアミン、ジメチルアミ
ン、トリメチルアミンおよびトリメチルアミンＮ−オキ
シドなどの、炭素−炭素結合を全く含有しない有機化合
物を意味する。

本明細書において、「エキソ多糖」とは、醗酵培地中に
細胞外代謝産物として蓄積する多糖を意味し、その例と
しては、キサン（キサンタン・ガム）、多ＩＪｉｓ−６
０（米国特許第４，３２６，０５２号）、およびヘテロ
多糖ポリ５４がある。

本明細書において、「ヘテロ多糖」とは、少なくとも２
種類の異なる単糖単位、たとえばマンノースおよびガラ
クトース、から構成される多糖を意味する。

別の態様において、本発明は、増殖炭素源としてメタノ
ールを含有する栄養培地中でメチロフィルス・ビスコゲ
ネスの＾ＴＣＣ３９８９３菌株ｔ＋　＋、　＜はその変
異株を好気培養して、この醗酵培地中に蓄積した量の細
胞外ヘテロ多糖ポリ５４を生成させること、および生成
したヘテロ多糖ポリ５４をアルカリ性条件下で反応させ
て、脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４を生成させること
、からなる醗酵方法を提供する。

本発明による脱アセチル化ヘテロ多糖生成物の別の製造
手段は、醗酵により生成した細胞外ヘテロ多零店中間生
成物（例、ヘテロ多糖ポリ５４）を固体材料として回収
し、次いで回収した固体材料を水性媒質中に再溶解させ
ることであり、この媒質中でアルカリ性条件下に処理し
て前記エキソ多糖を変性させることにより、目的とする
脱アセチル化ヘテロ多糖生成物を得ることができる。

エキソ多糖中間生成物を変性させるためのアルカリ性処
理は、エキソ多糖中間生成物の水溶液のｐＨを、約２０
〜１０Ｏ℃の温度でエキソ多糖の加水分解による変性を
行うのに十分な時間にわたって、アルカリ性試薬により
約７〜１３、好ましくは約８〜１２の範囲内のｐＨ値に
調整することにより達成できる。典型的な反応時間は約
０．１〜２時間である。アルカリ性試薬としては、アン
モニアもしくは有機アミン、または水酸化ナトリウム、
炭酸カリウムなどの塩基性無機化合物を使用することが
できる。

脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４などの本発明の生成物
は、水性培地から、常法、たとえば水性培地を水混和性
有機溶剤で希釈して生成物を析出させることにより、固
体生成物として回収することができる。適当な希釈用有
機溶剤の例は、メタノール、エタノール、プロパツール
、アセトン、テトラヒドロフランなどである。

脱アセチル化ヘテロ多糖はまた、水溶液をカルシウム塩
で処理することによっても析出させることができる。

本発明の脱アセチル化ヘテロ多糖生成物はカルボン酸基
を含有しており、金属塩として、または遊離の酸形態、
のいずれでも存在することができる。

本発明のさらに別の態様において、本発明は、増殖炭素
源を含有する水性栄養培地中でメチロフィルス・ビスコ
ゲネスの菌株を好気培養して、この水性培地中に蓄積し
た量の細胞外ヘテロ多糖を生成させること、前記水性培
地を水混和性有機溶剤で希釈して、ヘテロ多糖を析出さ
せ、水性スラリー媒質を形成すること、およびこの水性
スラリー媒質をアルカリ性試薬で処理して、脱アセチル
化ヘテロ多糖の水性スラリーを得ること、からなる醗酵
方法を提供する。

この態様の方法は、生成した脱アセチル化ヘテロ多糖が
、その回収された粗製形態において着色がより少なく、
より高純度の生成物が得られるという利点がある。

沈殿形態の粗製脱アセチル化ヘテロ多糖を水に再溶解さ
せ、得られた水溶液を次いで透析および凍結乾燥して、
精製された生成物を得ることができる。

本発明による脱アセチル化ヘテロ多糖生成物の製造方法
の別の態様にあっては、ポリ５４のような細胞外ヘテロ
多糖中間生成物を固体材料として回収し、次いでこの固
体材料をアルカリ性溶液（例、苛性アルカリの水性アル
コール溶液）で処理して、該固体材料の脱アセチル化を
行う。この不均一相脱アセチル化法は、操作が容易であ
り、ヘテロ多＃Ｍ基質の分解が起こりにくいという別の
利点がある。

本発明によって得られる新規な脱アセチル化ヘテロ多糖
ポリ５４の平均分子量は、約ａｏｏ、ｏｏｏ〜１．５０
０，０００の範囲内である。

脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の粘度は、代表的には
、ブルックフィールド・スピンドル１ｌｈ４により２５
°Ｃで測定して、５０　ｒｐｍで少なくとも約１０００
　ｃｐｓ、たとえば５０　ｒｐｍで約１０５０　ｃｐｓ
の０．５χ粘度を示す。脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５
４の水溶液は無色透明で、擬似塑性およびチキソトロピ
ー性の粘度特性を示す。この水溶液の粘度特性は、１３
０℃までの温度、および約１２までのｐ　Ｈ値で安定で
ある。

低セン断速度条件下で、脱アセチル化ヘテロ多季唐ポリ
５４は、−ｇに市販のキサンタン・ガムの約１０〜３０
倍という見掛は粘度を示す、脱アセチル化ヘテロ多糖ポ
リ５４および市販のキサンタン・ガム（ケルザン、にｅ
ｌｚａｎ）のセン断条件下での粘度特性の比較データを
、添付の第１図に示す。

脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４のその他の物理化学的
および構造上の特徴は次の通りである。

Ａ、Ｆの譬成（モル％）グルコース　　５０ガラクトース　３０マンノース　　１０グルクロン　　ＩＯ脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４は、ピルビン酸もしく
はタンパク質を含有しておらず、アセチル基の含存量は
４車糖単位あたり約１未満である。

通常、アルカリ処理により、ヘテロ多糖ポリ５４にもと
もと存在していたアセチル基はすべて除去されてしまう
。不完全に脱アセチル化されたポリ５４も製造すること
ができる。

Ｂ、五１Ｊ」Ｌふ埃Ｌ゛Ｃ３８，２２Ｈ５，５７０４０，４１Ｎ　　　　　１．５８本灰分補正済Ｃ９融点はっきりした融点は示さず、約１５０℃以上で分解する
。

Ｄ、赤外困二久土工１７４０ｃｍ”で吸収帯ｉ脂肪族エステル基を示す）。

１６５０ｃｍ−’および１５４０ｃｍ−’で吸収帯（ア
ミド基を示す）。

Ｅ５−外　収スペクトル２５４慴μでブロードな極大ピーク。

Ｆ９貫解皮片作水に可溶であるが、−Ｍ有機溶剤のすべてに不溶性。

Ｇ、１崖人皮測定可能な比旋光度を示さず。

ｆ重の壬ｉメチロトローフ本発明はその態様において、下記の同定特徴を有する新
規な細菌菌株を使用することにより達成される。

（ａｌ好気性、ダラム陰性、桿状、運動性で、極性鞭毛
を持った細胞；山）リブロース−リン＃Ｉ経路によりメタノールを同化
することができるメチロトローフ性；＋ｃ＋フルクトー
スにより増殖可能；およびｆｄ１３５〜４０℃の培地温
度で最適増殖速度を示す。

■態様において、本発明は、菌株ＡＴＣＣ３９８９３の
同定特徴を有する培養細菌を使用する。この培養閑は、
メタノールもしくはその他の０１化合物を細胞外Ｍ積す
るヘテロ多糖に好気的に生物転化させることができる。

寄託番号ＡＴＣＣ３９８９３の菌株の二次培養物は、米
国メリーランド州ロフクビル所在のアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）の永久微生物
コレクションから請求により入手することができる。

菌株ＡＴＣｅ　３９８９３の同定特徴を有する細菌菌株
は、メチロフィルス・メチロトローフのような既知のメ
チロトローフ性菌種に属するものではない。

分類学的同定のために、ＡＴＣＣ３９８９３菌株の同定
特徴を有する細菌菌株を包含するこの新規な任意メチロ
トローフ性の菌種はメチロフィルス・ビスコゲネスと命
名された。

本明細書で使用し「メチロトローフ」なる用語は、ｌも
しくは２以上の炭素原子を含有するが、炭素−炭素結合
を含有していない炭素化合物により非独立栄養的に増殖
することのできる微生物を意味する。「独立栄養的」と
は、二酸化炭素基質による増殖を意味する。

本明細書において「任意メチロトローフ」とは、１種も
しくは２種以上の従属栄養基質（例、フルクトース）上
で増殖できるメチロトローフを意味する。

本明細書で使用した［リブロース−リン酸経路Ｊ（ＲＭ
Ｐ）とは、ホルムアルデヒド３分子が縮合してピルビン
酸１分子か、またはジヒドロキシアセトンリン酸１分子
のいずれかを生成する生化学回路を意味する。

リブロース−リン酸経路およびその変形例の解明に関す
る生化学の文献には、Ｊ、　５ｔｒｏｅｎ＋　ｅｔ　ａ
ｔ、。

バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、
）＋　１４４、４６５　（１９７４）　　；　　Ｃ，”
Ａｎｔｈｏｎｙ、サイエンティフィツク・プログレス（
Ｓｃｉ、　Ｐｒｏｇ、）、　６２．１６７　（１９７５
）；およびＣｏ１ｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、バイオケミカル
・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）、　１４８．
５１３　（１９７５）がある。

リブロース−リン酸経路には、Ｇ−ホスホグルコン酸デ
ヒドラーゼ／ホスホ−２−ケト−３−ジグルコン酸アル
ドラーゼ；フルクトースニリン酸アルドラーゼ；グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ；３−ヘキスロース
リン酸シンターゼ；ホスホフルクトキｔ−ゼ；ホスボグ
ルコイソメラーゼ；ホスホ−３−ヘキスロースイソメラ
ーゼ；ホスホリボイソメラーゼ；リブロース−５−リン
酸３−エピメラーゼ；トランスアルドラーゼ；トランス
ケトラーゼ：セドヘプクロースニリン酸アルドラーゼ；
およびセドヘプツロース−１，フージホスフアターゼを
包含する酵素が関与している。

ＲＭＰ回路においては、３分子のホルムアルデヒドが３
分子のりブロース５−リン酸と効果的に縮合されて３分
子のフルクトース６−リン酸が生成し、次いでこの生成
物からこの回路により３分子のりブロース５−リン酸が
再生されるので、全体としては１分子のジヒドロキシア
セトンリン酸もしくはピルビン酸が生産される。かかる
代謝産物は、細胞生合成の基質として機能する。

この回路の２つの重要な酵素は、ホルムアルデヒドとり
ブロース５−リン酸との縮合、およびこの生成物のフル
クトース６−リン酸への転化の各反応を触媒する酵素で
あるヘキスロースリン酸シンターゼおよびヘキスロース
リン酸イソメラーゼであると考えられる。ＲＭＰ回路の
２つの認められた変異回路、すなわちジヒドロキシアセ
トンリン酸を生成するフルクトースビスリン酸変異回路
と、ピルビン酸を生成するエントナー・ドウドロフ変異
回路がある。

メチロフィルス・ビスコゲネス米国テキサス州ビショップ所在のメタノール製造工場の
操業部付近で採取した土壌および水の試料を使用して一
連の分離を行った。試料をまずメタノール利用微生物の
存在についてスクリーニングした。

各試料の一部を、メタノール（０，５χｖ／ｖ）ならび
に適当な栄養培地、たとえば第１表に例示した無機塩：
ＩＱ（ＭＳ）培地＋塩化アンモニウム１ｇ／ｌを入れた
２５０　ｍｌの三角フラスコに播種した。このフラスコ
を、３０〜５５℃の範囲内の各種温度で保温して培養を
行った。増殖の表示となる検出可能な混濁が認められた
ら、各試料を２ｍｌづつ取り出し、これを使用して上と
同様の培地を入れた滅菌フラスコにそれぞれ接種した。

最初の各試料について、次代の二次培養液を多数採取し
、次いでこの培養液を平板寒天培地で画線培養して、独
立した微生物誘導コロニーを得、これからメタノール同
化微生物の純粋培養菌を得た。このようにしてＡＴＣＣ
３９８９３菌株を単離し、これを生物学的に純粋な培養
菌として得た。

メチロフィルス・ビスコゲネスの各菌株は新規な組合せ
の特性を示し、それによりこれらは他のメチロトローフ
性細菌から区別される。ＡＴＣＣ３９８９３閉株などの
メチロフィルス・ビスコゲネス種の細菌は、０１同化の
りブロース−リン酸経路を利用し、３５〜４０℃で典型
的には１〜３時間の増殖速度倍加時間を有する任意メチ
ロトローフである。

ＡＴＣＣ３９８９３菌株はメタノール、フルクトースお
よびグルコースを基質として増殖する。また、ギ酸もし
くはメタノールの形態の外来エネルギー供給が存在する
場合には、この菌株はより広範囲の従属栄養基質（例、
コハク酸およびピルビン酸）でも増殖しよう。これは、
既知のどの微生物についても報告されたことのない特性
である。同定のために、この現象を示す細菌を、ここに
「潜在的任意メチロトローフ」と呼ぶことにする。

ＡＴＣＣ３９８９３菌株の特徴を包含する特徴を有する
細菌はさらに、固体培地での淡橙色コロニーの非粘液性
増殖によっても同定される。　　ＡＴＣＣ３９８９３型
菌株のメチロトローフ性細菌の別の同定用特徴は、ヘキ
スロースリン酸シンターゼ／ヘキスロースリン酸イソメ
ラーゼ活性が、タンパク質１■につき１分間のＮＡＤＨ
生成量で少なくとも約４００ナノモルであることである
。

任意メチロトローフであるＡＴＣＣ３９８９３型菌株の
顕著な別の特性は、メタノール基質を生物転化して、水
溶液に擬似塑性とチキソトロピー性を付与するエキソ多
糖を蓄積した量で生成する能力である。ＡＴＣＣ３９８
９３菌株の細菌は、細胞増殖の存無にかかわらず多様な
培養条件下で培地中に多量の蓄積したエキソ多糖を製造
することができる点で特に顕著である。ＡＴＣＣ３９８
９３菌株の細菌は、利用可能な炭素源のうちエキソ多糖
の生合成に利用される割合が大きいという固有の能力を
有している。

＾ＴＣＣ３９８９３型の細菌菌株の別の特徴は、増殖の
対数パターンが重数増殖期とは異なることである。

ＡＴＣＣ３９８９３菌株の培養菌は、無制限増殖を阻止
する自然の代謝機能不全を示す。醗酵培地にビタミン、
アミノ酸、もしくは酵母エキスなどの多様な増殖因子を
補給しても、この対数増殖は影響されない。

メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株は、炭素源、窒素
源、塩類、および各種増殖促進物質を含有する栄養培地
中で好気培養できる。

適当な窒素源には、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、アンモニア、リン酸ニアンモニウム、硝酸アンモニ
ウム、硝酸ナトリウム、尿素、コーン浸出液、カゼイン
、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどがある。

好適な無機塩類としては、カルシウム塩、マグネシウム
塩、カリウム塩、リン酸塩、鉄塩、マンガン塩、亜鉛塩
、銅塩などがある。細菌増殖促進物質としては、大豆タ
ンパク質加水分解物、酵母エキス、ビタミンおよびアミ
ノ酸が挙げられる。

栄養培地中での微生物の培養は、典型的には振盪培養も
しくは液内培養により３５〜４０℃の温度および約６．
７〜７．１のｐＨで好気的に行われる。

前述の培養条件を使用すると、メチロフィルス・ビスコ
ゲネスの菌株は高濃度のエキソ多糖を高い炭素源利用率
で生産および蓄積する。

ＡＴＣＣ３９８９３菌株は、増殖炭素源としてメタノー
ルを使用した場合に、培養基に基いて約１．５ｇ／ｊ！
までの量のエキソ多糖を生産することができる。

エキソ多糖の収率は、典型的にはメタノールの使用量に
基づいて約３０〜５０χの範囲内となろう。

この新規菌種メチロフィルス・ビスコゲネスについての
詳細は、１９８５年２月１１日出願の米国特許出願ｍ　
７００，５６２に説明されているので、参照されたい。

以下の実施例は本発明をさらに例示するためのものであ
る。使用した要素および具体的成分は代表例として示し
たものであって、本発明の範囲内で以上の説明に基づい
て各種の変更をなすことができる。

メタノール同化細菌の増殖に対しては、無機塩類培地（
ＭＳ）（第１表）を使用した。この培地に、１　ｇ／　
１２の硝酸カリウムを補給して硝酸無機塩類培地（ＮＭ
Ｓ）とするか、またはＩｇ／ｊ！の塩化アンモニウムを
補給してアンモニウム無機塩類培地（ＡＭＳ）とした。

炭素源のメタノールは０．２〜０．５χ（ｖ／ｖ）の濃
度で使用するのが好ましい。

固体培地に対しては、滅菌の前に１”１ｇ／Ｉｔのジフ
コ社製細菌用寒天（バタトアガー）を基本の無機塩類培
地（リン酸塩は存在させず）に添加する。

次いで、滅菌した無機塩類培地に冷却後に滅菌リン酸塩
溶液を無菌添加する。

醗酵操作は、Ｂ、　Ｂｒａｕｎ社製装置のバイオスタッ
トＳ［Ｉ９酵装置（容量６１）を使用して行う。使用容
積は３１とし、醗酵装置の滅菌後にメタノールを無菌添
加する。４６０　ｍｌ／ｍｉｎの空気供給速度で、５０
０　ｒｐｍの攪拌速度を恒常的に使用する。この醗酵装
置は、ｐ）（および溶解酸素制御手段を備えている。

ヘキスロースリン酸シンターゼの触媒作用の生成物であ
るヘキスロース６−リン酸の分析法がないので、ヘキス
ロースリン酸シンターゼ／ヘキスロースリン酸イソメラ
ーゼを同時に分析する。ヘキスロースリン酸イソメラー
ゼにより、ヘキスロース６−リン酸はグルコース６−リ
ン酸に転化され、このグルコース６−リン酸はグルコー
ス６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用し、同時に起こる
ＮＡＤＰ”還元を３４Ｏｒ＋ｎ＋で追跡することにより
測定することができる。この酵素分析溶液は次の成分を
含有する（最終濃度）ニリン酸緩衝ＦｔＪ、５０　ｍＭ
、　ｐＨ７，２；塩化マグネシウム２．５ｍＭ；グルコ
ース６−リン酸デヒドロゲナーゼ０．７単位；ホスホグ
ルコイソメラーゼ０．７５単位；ホスホリボースイソメ
ラーゼ１．７５単位；リボース５−リン酸５　ｍＭ　；
　ＮＡＤＰ”　０．２５　ｍＭ　　；ならびにホルムア
ルデヒド５ｍＭ。

少しでもヒドロキシピルビン酸しグクターゼが存在する
ことは、微生物においてセリン経路のホルムアルデヒド
同化が起こったことを示す。この酵素は、次の成分を含
有する（最終濃度）酵素分析？ｇ　液により測定できる
ニリン酸カリウム１門。

ｐｌ＋　６．３　；ヒドロキシピルビン酸リチウム０．
０１１’１；およびＮＡＤＨ２ｓＭ　、　ＮＡＤＩ（の
消失を３４０　ｎｏ＋で測定する。

グリセロールおよびジヒドロキシアセトンの測定は、グ
リセロールデヒドロゲナーゼ／ジヒドロキシアセトンレ
ダクターゼ（グリセロール：ＮＡＤ”２−オキシドレダ
クターゼ、　ＥＣ１，１，１，６）により行われる。こ
の酵素は、エンテロバクタ−・アエロゲネス（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）から誘導され
、シグマ・バイオケミカルズ社より入手できる。

グリセロールの測定に対しては、反応混合物（１，０ｍ
ｌ）は、５＾ルのトリス−ＨＣｌ　緩衝液（シグマ・バ
イオケミカルズ社）、　ｐｌ＋　９．７　　；０．２．
ｕモルのＮＡＧ’　　；　１単位の酵素；およびｔＡル
のグリセロール（もしくは試験／８液／醗酵プロス、２
０〜５０１）を含有する。分析は、基質の添加により開
始され、その後、ペックマン２５型ＵＶ分光光度計によ
り３４０　ｎｍでの吸光度の増大を監視する。

ジヒドロキシアセトンの測定に対しては、反応混合物（
０，１ｍｌ）は、５々ルのリン酸緩衝液、　ｐＨ６，０
；　０．５ＰＬモルのＮＡＤＨ；　１単位の酵素；およ
びｔＡルのジヒドロキシアセトン（も′シ＜は試験溶液
／醗酵プロス、２０〜５０　ｍｌ）を含有する。分析は
、基質の添加により開始され、その後３４０　ｎｎ＋で
の吸光度の減少を監視する。

生成したエキソ多Ｗ（例、ヘテロ多糖ポリ５４６　　　
　　　　　）は、メチ・フィルス・ビスコゲネスの菌株
の培養作業が完了してから回収する。醗酵装置からブロ
スを取り出し、全菌体を遠心分離（１３，０００Ｘ　ｇ
で１０分間）により取り除く。生成したエキソ多糖を析
出させて単離し、この生成物をアルカリ性処理に付して
、脱アセチル化ヘテロ多糖を生成させる。本明細書に述
べたヘテロ多糖の別の脱アセチル化法も採用できる。

各種多糖類の水？８液のレオロジー特性の測定を、ウェ
ルズ（Ｗｅｌｌｓ）／ブルックフィールド・コーン／プ
レート・ディジクルビスコメータ、あるいは同軸シリン
ダ・センサ・システムを取りつけたレオマット　（Ｒｈ
ｅｏｍａｔ）　３０ビスコメータにより行う。

比較用粘度測定に使用したキサンタンガムは、米国カリ
フォルニア州すンジエゴ所在のケルコ社（Ｋｅｌｃｏ　
Ｃｏ、）から市販の製品であるケルザンである。

エキソ多糖の華糖含有量の分析は、加水分解−気液クロ
マトグラフィー法により行う。

大施開よ本実施例は、メチロフィルス・ビスコゲネスの菌株の培
養による蓄積した量のエキソ多糖代謝産物の生産と、そ
の後のアルカリ性処理による脱アセチル化ヘテロ多糖の
生成とを例示する。

＾ＴＣＣ３９８９３菌株の接種液５００　＋ｗｌを、Ｍ
Ｓ培地、１ｇ／（ｌの塩化アンモニウムおよび増殖炭素
源として０．５％（ｖ／ν）のメタノールを使用して増
殖させる。フラスコは３７℃で２日間インキュベーショ
ンする。こうして得られた培養液を使用して、ＭＳ培地
１０１、塩化アンモニウム１ｇ／ｌ、およびメタノール
０．５％（ｖ／ｖ）を入れた容１１４　Ａのニュー・プ
ランズウィソク・マイクロファーム醗酵装置を接種する
。

最初の醗酵条件は次の通りである＝３７℃、攪拌２００
　ｒｐｍ、空気流ＩＪ　２１　／ｍｉｎ、およびｐＨ７
，０゜ｐＨは醗酵中はぼ７．０に制御する。醗酵培地中
の炭素が消耗してきたらメタノールを断続的に追加して
、０．５％（ｖ／ｖ）の濃度を保持する。メタノールの
濃度は気液クロマトグラフィーにより測定する。２４〜
３６時間の醗酵後、攪拌速度を４０Ｏｒｐｍに増す。

メタノールが培養液により利用されなくなったら（通常
５〜７日後）、醗酵を終了させる。次いで、得られた非
常に粘稠な醗酵ブロスをイソプロパツールで希釈して（
アルコールニブロス；２：１）、エキソ多糖の析出を助
長する。得られたスラリーを窒素雰囲気中に保持する。

このスラリーのｐＨを水酸化ナトリウムによりｐＨ１２
に調整し、脱アセチル化反応を行わせる。

必要に応じてさらにＮａＯＨを追加してｐＨを１２に保
持しながら２時間の反応時間が経過した後、水性媒質を
塩酸でｐ　Ｈ７に中和し、脱アセチル化エキソ多Ｉ！（
すなわち、脱アセチル化ヘテロ多糖）の沈殿を濾別する
。この沈殿をほぼ同容積のイソプロパツールで洗浄し、
次いで自然乾燥させるか、あるいは強制空気循環式乾燥
器により５５℃で乾燥させる。乾燥した固体を次いでウ
ィリーミルもしくはハンマーミルで粉砕して粉末状とす
る。か（して得られた脱アセチル化ヘテロ多糖生成物の
物理化学的性質は、脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４に
ついて上に述べたものと一致している。

上述した培養法を繰り返して、蓄積した量のヘテロ多糖
ポリ５４をン容液状で含有する醗酵ブロスを得る。この
水性醗酵培地のｐＨを水酸化ナトリウムによりｐＨ１２
に調整し、ｐＨ１２に２時間保持した後、醗酵培地を塩
酸で中和する。以後は上述した方法に従って、脱アセチ
ル化ヘテロ多糖ポリ５４生成物を沈殿させ、回収する。

門ｇｓｏ、・７Ｈｚ０　　　　　１　ｇＣａＣＩｚ　　
　　　　　　　Ｏ，２ｇＮａ２１１ＰＯａ　　　　　　
　　０．３３　ｇＫＨｚＰＯｎ　　　　　　　　０．２
６　ｇＦｅＥＤＴＡ　　　　　　　　５．ＯｍｇＣｕＣ
１２Ｈｌｈｏ　　　　　　２．ＯｍｇＮａＪｏ０４・２
１１ｔ０　　　　２．ＯｔａｇＰｅＳＯａ　・７８．０
　　　　５００　ｐｇＺｎＳＯ４・７ＨｚＯ４００／’
　ｇＭｎＣＩｚ　・４ＨｔＯ２０１１ｇＩｈＢｏ、　　　　　　　　１５μｇＣｏＣ１，・６Ｈｚ０　　　　５０　ｐｇＮｉＣｈ・６
８１０　　　　１０μｇＥＤＴＡ　　　　　　　　２５０μｇＨ！０　　　　　　１１．　ｐＨ６，８ス財Ｉ鉗１本実施例は、本発明による方法の別の態様を例示する。

実施例１に記載の一般的な方法に従ってヘテロ多糖ポリ
５４を生成させ、固体生成物として回収する。

０．５ｇの量のポリ５４を水５０　ｍｌに溶解させる。

このポリ５４の水溶液に窒素をバブリングさせながら、
この水溶液に水酸化カリウム水溶液を加えてｐＨを１２
に調整する。溶液粘度は柔らかいゲル状のコンシスチン
シーにまで増大する。

塩酸の水溶液をこのゲル化溶液に添加して、アルカリ性
から６．８〜７のｐＨまで中和する。中和溶液を水性イ
ンプロパツール（１：　１）に投入して、脱アセチル化
ヘテロ多糖ポリ５４を析出させる。

沈殿を濾別し、７０％イソプロパツールで洗浄し、５５
℃の乾燥器で乾燥させる。乾燥した生成物を粉砕機によ
り微粉末状に粉砕する。

脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の粉末を脱、イオン水
および１％塩化ナトリウム溶液に別個に溶解させ、それ
ぞれ０．２５％の溶液を形成する。同様にして、ヘテロ
多糖ポリ５４の０．２５％溶液も調製する。

この溶液の粘度をブルックフィールドＲＶＴ　（回転式
粘度計）、スピンドル隘４を使用し、回転速度（ｒｐｍ
）を変えて測定する。得られた比較粘度測定の結果を第
２表にまとめて示す。

第２表に示した粘度のデータは、本発明により製造した
脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４は、対応するアセチル
化ヘテロ多糖ポリ５４より水溶液中においてより大きな
増粘力を示すことを実証している。

脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４ば、水溶液にｆＥＦ（
以塑性およびチキソトロピー性を付与スる。

第１図は、脱アセチル化ポリ５４、キサンタン・ガム、
および脱アセチル化キサンタン・ガムの各０．２５％溶
液について、スピンドル１１ｈ４を使用して測定した粘
度の比較を示すグラフである。このデータは水溶液中に
おける脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４の顕著な粘度増
強特性を実証している。

芽−」Ｌ−聚」朋　輩度μ戸　　」堕　蛮度豆戸脱イオン水　０．５　　８００　　　０．５　１３６０
０１　　　　１４００　　　　　　＋　　　　　９２０
０２．５　　　１０００　　　　　２．５　　　６２０
０ＩχＮａＣ１Ｏ，５−０，５３２００２，５２００２，５１６００

【図面の簡単な説明】

第１図は、脱アセチル化ポリ５４、キサンタン・ガム、
および脱アセチル化キサンタン・ガムの各０．２５％溶
液について、スピンドル陽４を使用して測定した粘度の
比較を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）増殖炭素源を含有する水性栄養培地中でメチロフ
ィルス・ビスコゲネス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ　
ｖｉｓｃｏｇｅｎｅｓ）の菌株を好気培養して、この醗
酵培地中に蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖を生成させる
こと、前記醗酵培地から培養微生物を分離して、ヘテロ
多糖の無細胞水溶液を得ること、およびこの水溶液のｐ
Ｈをアルカリ性範囲内に調整して、得られたヘテロ多糖
を脱アセチル化すること、からなる醗酵方法。
（２）増殖炭素源がＣ＿１化合物である、特許請求の範
囲第１項記載の醗酵方法。
（３）増殖炭素源がメタノールである、特許請求の範囲
第１項記載の醗酵方法。
（４）増殖炭素源がフルクトースである、特許請求の範
囲第１項記載の醗酵方法。
（５）使用菌株がＡＴＣＣ３９８９３である、特許請求
の範囲第１項記載の醗酵方法。
（６）特許請求の範囲第１項記載の醗酵方法により製造
された脱アセチル化ヘテロ多糖。
（７）特許請求の範囲第５項記載の醗酵方法により製造
された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４。
（８）増殖炭素源としてメタノールを含有する栄養培地
中でメチロフィルス・ビスコゲネスのＡＴＣＣ３９８９
３菌株もしくはその変異株を好気培養して、この醗酵培
地中に蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖ポリ５４を生成さ
せること、および生成したヘテロ多糖ポリ５４をアルカ
リ性条件下で反応させて、脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ
５４を生成させること、からなる醗酵方法。
（９）脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４を水性培地から
固体生成物として回収する、特許請求の範囲第８項記載
の醗酵方法。
（１０）特許請求の範囲第８項記載の醗酵方法により製
造された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４。
（１１）ヘテロ多糖ポリ５４を水性媒質中においてアル
カリ性ｐＨ条件下に加水分解して脱アセチル化ヘテロ多
糖ポリ５４を生成させることからなる方法。
（１２）アルカリ性処理を、約８〜１２の溶液ｐＨで約
２５〜１００℃の反応温度において行う、特許請求の範
囲第１１項記載の方法。
（１３）増殖炭素源を含有する水性栄養培地中でメチロ
フィルス・ビスコゲネスの菌株を好気培養して、この水
性培地中に蓄積した量の細胞外ヘテロ多糖を生成させる
こと、前記水性培地を水混和性有機溶剤で希釈して、ヘ
テロ多糖を析出させ、水性スラリー媒質を形成すること
、およびこの水性スラリー媒質をアルカリ性試薬で処理
して、脱アセチル化ヘテロ多糖の水性スラリーを得るこ
と、からなる醗酵方法。
（１４）増殖炭素源がＣ＿１化合物である、特許請求の
範囲第１３項記載の醗酵方法。
（１５）増殖炭素源がメタノールである、特許請求の範
囲第１３項記載の醗酵方法。
（１６）増殖炭素源がフルクトースである、特許請求の
範囲第１３項記載の醗酵方法。
（１７）使用菌株がＡＴＣＣ３９８９３である、特許請
求の範囲第１３項記載の醗酵方法。
（１８）特許請求の範囲第１３項記載の醗酵方法により
製造された脱アセチル化ヘテロ多糖。
（１９）特許請求の範囲第１７項記載の醗酵方法により
製造された脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５４。
（２０）固体のヘテロ多糖ポリ５４をアルカリ性溶液と
接触させて、固体形態の脱アセチル化ヘテロ多糖ポリ５
４を生成させることからなる方法。
（２１）ブルックフィールド・スピンドルＮｏ．４によ
り２５℃で測定して５０ｒｐｍで少なくとも約１０００
ｃｐｓの０．５％粘度を示す、脱アセチル化ヘテロ多糖
ポリ５４。