JPS6398395A

JPS6398395A - キトサンオリゴ糖の製造法

Info

Publication number: JPS6398395A
Application number: JP24425486A
Authority: JP
Inventors: Masato Izume; 正人井爪; Akira Taiho; 大宝　明
Original assignee: Katakura Chikkarin Co Ltd
Current assignee: Katakura Chikkarin Co Ltd
Priority date: 1986-10-16
Filing date: 1986-10-16
Publication date: 1988-04-28
Also published as: JPH0421477B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、Ｄ−グルコサミンをほとんど含むことなく、
Ｄ−グルコサミンおよびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンからなり、比較的高い重合度を有するキトサンオリゴ
糖の製造法に関する。

本発明により得られたキトサンオリゴ糖は、食品添加物
、化粧品成分、医薬品または医療材料などの広範な用途
に利用することができる。

〔技術の背景および従来技術の説明〕

キチンは、エビやカニなどの甲殻類の殻から得られる多
糖類であって、セルロースと極めてよく似た化学構造を
有していて、セルロースを構成するグルコースの２位の
水酸基がアセトアミド基で置換された２−アセトアミド
−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミン）がβ−１，４結合した直鎖状の多肥類で
ある。

一方において、キトサンの分解産物のキトサンオリゴ糖
、たとえば、キトビオース（ＧＩＣＮ）２、キトトリオ
ース（ＧＩＣＮ）３、キトテトラオース（ＧＩＣＮ）４
、キトペンタオース（ｃ、ＩｃＮ　）５、およびキトヘ
キサオース（ＧｌｅＮ）６　　などがアミノ糎（塩基外
の糖）であることから、これらのキトサンオリゴ糖を食
品添加物（増量剤）、化粧品成分または医薬品などの広
範な用途に利用することが考えられ、これらのキトサン
オリゴ糖を経済的に製造する技術の開発が要望されてい
る。

最近、キトサンオリゴ猜のうちのキトヘキサオース（Ｃ
＋ＣＮ）　　およびキトヘプタオース（（，１ｃＮ）７
　　に抗カビ性が見出され〔ディー・エフ・ケンドラお
よびり−・ニー・ハドウイガー：エクスペリメンタル・
マイコロジー（Ｄ、Ｆ、Ｋｅｎｄｒａａｎｄ　Ｌｅｅ　
Ａ、Ｈａｄｖｉｇｅｒ　：　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
　Ｍｙｃｏｌｏｇｙ）第８巻、第２７６−２８１頁（１
９８４年）〕、さらに、キトサンオリゴ糖の重合度の高
いものに免疫機能進効果が見出され〔鈴木ら：　「第８
回糖質シンポジウム講演要旨集」第５７〜５８ｍ（１９
８５年）〕、重合度が比較的大きいキトサンオリゴ糖の
製造技術の開発が要望されている。

これまでに、塩酸による加水分解法〔ニス・ティー・ホ
ロウイッツ他：ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイエティ　（Ｓ、Ｔ、　Ｈｏｒｏｗｉ　ｔｚｅ
ｔ　ａｌ　：　Ｊ−Ａ−Ｃ−５）第７９巻、第５０４６
−５０４９頁（１９５７年）〕、亜硝酸による酸化分解
法〔エフ・ヤク他：セルロース・ケミストリ・アンド・
テクノロジー（Ｆ−Ｙａｋｕ　ｅｔ　ａｌ　：　Ｃｅｌ
ｌｕｌｏｓｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ）第１１巻、第４２１−４３０頁（１９７７
年）〕、および塩素による酸化分解法（平野茂博ら：日
本農芸化学会、昭和５９年度大会、講演要旨実弟３３０
頁）がキトサンの化学的な分解法として知られている。

塩酸による加水分解法は、キトサンオリゴ糖を生産する
ことができるが、高濃度の塩酸および長時間の反応を必
要とし、また多量のＤ−グルコサミンの単糖類の生成に
より反応液からキトサンオリゴ糖を単離する工程を必要
とし、そのための操作がはん雑になり、そのコストも高
いという難点がある。また亜硝酸または塩素による酸化
分解法は、酸化による脱アミノ化のために、純粋なキト
サンオリゴ塘を得ることが困難であるという難点がある
。

これに対して、酵素法によるキトサンの分解では、酵素
の特異性を利用することができるので、Ｄ−グルコサミ
ンのような単糖類の生成を少なくして、目的とするキト
サンオリゴ糖を著量に生産することができる。これまで
に報告されているキトサンを分解する酵素には、バチル
ス（Ｂａｃｔｌｌｕｓ　Ｓｐ、　）　Ｒ−４の生産するキ
トサナ−ゼ〔トミナガおよびツジサカ：ビオヒミ力・工
・ビオフイジ力・アクタ　（Ｙ、Ｔｏｍｉｎａｇａ　＆
　Ｙ。

Ｔｓｕ］１ｓａｋａ　：　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ
　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　）第Ｉ０巻、第１
４５−１５５頁（１９７５年）〕、ペニシリウム・イス
ランデイクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｉｓｌａｎｄｉ
＋、＋ｉｍ　）の生産するキトサナーゼ〔ディー・エム
・フェントン等：ジャーナルオブ・ジェネラル・ミクロ
バイオロジー（Ｄ、Ｍ、Ｆｅｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ　：
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ）　、第１２６巻、第１５１−１６５ｍ（
１９８］年〕〕、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ｓｐ、
）　　９９−５の生産するキトサナーゼ（屈内：日本農
芸化学会、昭和５９年度大会、講演要旨実弟５５０頁）
、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｓ
ｐ−）　Ｎｏ、　６　（ジエイ・ニス・プライス等：ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｓ、Ｐｒ＋ｃ
ｅ　ｅｔ　ａｔ　：　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　）第１２４巻、第１５７４−１５８５
頁（１９７５年）〕およびストレプトマイセス・グリセ
ウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　）
の生産するキトサナーゼ〔オオタカラ：キチン、キトサ
ン・アンド・リレイテッド・エンザイムス（Ａ、０ｈｔａｋａｒａ　：　Ｃｈｉｔｉｎ、　Ｃｈｉ
ｔｏｓａｎ　ａｎｄ　ＲｅｌａｔｅｄＥｎｚｙｍｅｓ　
）第１４７−１６０頁（１９８５年）、アカデミツクプ
レス〕が知られている。

一方、キチナーゼは、キチンを分解するｗｌ素といわれ
、細菌、カビおよびａ物等に広く分布して存在している
。

これまでに、アスペルギルス・７ニガー（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　Ｋ　１４から得られるキチ
ナーゼはキチンを分解するが、粉末キトサンおよびグリ
コールキトサンは分解しないと報告され〔ニー・オオタ
カラ：アグリ力ルチュラル・アンド・バイオロジカル・
ケミストリ（Ａ、０ｈｔａｋａｒａ　：　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　）第２８巻第８１１〜８１８頁（１９６４年）〕、ま
たストレプトマイセスグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　）から得られるキチナーゼは
キトサンおよびキトサンオリゴ糖（２量体、３量体およ
び４量体）を分解しないと報告されていて〔エル・アー
ル・バーシャー他：ビオヒミ力・工・ビオフイジ力・ア
クタ　（Ｌ、Ｒ・Ｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ　：　Ｒ４
ｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔ
ａ　）第２９巻第５２２−５３４頁（１９５８年）〕、
キトサンはキチナーゼの良い基質とは考えられていない
が、キトサンをキチナーゼの基質として用いた例〔エム
・ブイ・トレシー；バイオケミカル・ジャーナル（Ｍ、
Ｖ、Ｔｒａｃｅｙ　：　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕ
ｒｎａｌ　）第６１巻第５７９〜５８５頁（１９５６年
）〕があるが、キトサンの粘度がバシドミセテス（Ｂａ
ｓｉｄｏｍｙｃｅｔｃｓ　）由来のキチナーゼにより低
下したことが述べられているにすぎない。すなわちキト
サンをキチナーゼにより分解し、重合度の高いキトサン
オリゴ糖を生産するという報告は見当らない。

またキチンは、水、希酸、希アルカリ等には全く溶解し
ないので、キチンにキチナーゼを作用させても、反応速
度が遅く、さらに重合度の高いオリゴ糖が得られない。

本発明者らは、キトサンオリゴ剪を経済的に生産する技
術の開発を企図して、市販の細菌またはカビに由来する
キチナーゼをキトサンに作用させると、高重合度のオリ
ゴ塘を含むが、Ｄ−グルコサミンのＩｎ塘類をほとんど
含まないキトサンオリゴ糖が得られることを見出し、こ
の知見に基づいて本発明に到達した。

〔発明の目的および発明の要約〕

本発明の目的は、キトサンオリゴ糖の製造法を提供する
ことにあり、詳しくは、Ｄ−グルコサミンの単糖類をほ
とんど含まないキトサンオリゴ糖の製造法を提供するこ
とにある。

本発明は、キトサンをキチナーゼにより分解して、Ｄ−
グルコサミンの単糖類をほとんど含まないオリゴ糖を得
ることを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造法である。

本発明のキトサンオリゴ糖の製造におけるキトサンは、
脱アセチル化度が５０〜９９％のキトサンを使用するこ
とができ、またコロイダルキトサンを使用することがで
きる。

キトサンをキトサナーゼにより分解して、キトサンオリ
ゴ粘をつくる場合、酵素作用の時間を延長すると、Ｄ−
グルコサミンのＩＩＬｔＩｌ類の含量が増大するから、
Ｄ−グルコサミンの単糖類の含量の少ないキトサンオリ
ゴ糖を得るには、その酵素作用の時間を厳密に調整する
ことを必要とするが、本発明のキチナーゼによるキトサ
ンの分解によると、酵素作用の時間を延長しても、Ｄ−
グルコサミンの単糖類を生成しないから、本発明では反
応における酵素作用の時間を厳密に調整しなくても、Ｄ
−グルコサミンのａｍ類を含まないキトサンオリゴ糖を
得ることができ、それによって本発明のキトサンオリゴ
糖の製造における工程管理は容易であるという利点、効
果がある。

〔発明の詳細な説明〕

本発明により製造されるキトサンオリゴ糖は、高重合度
のＤ−グルコサミンのオリゴ糎を含み、Ｄ−グルコサミ
ンのＡＭ類をほとんど含まないキトサンオリゴ糖である
。

このキトサンオリゴ粘は、陽イオンとして作用し、また
吸湿性を有するから、化粧品に使用したときに皮膚の保
湿剤として有用である。またキトサンオリゴ糖のうちの
比較的高重合度のものは、安全性が高く、かつ抗カビ性
および抗菌性を有するから、化粧品、食品等の防腐剤、
また土壌改良剤または種子コーティング剤などにおける
抗カビ剤および抗菌剤として使用するのに適している。

本発明のキトサンオリゴ糖の製蒔においては、先ずキト
サン溶液を調製する。キトサンは酸に溶けるので、キト
サンに酸水溶液を加えて、キトサン溶液とする。これと
は別に、キチナーゼ溶液を調製し、前に得られたキトサ
ン溶液とともに、反応温度においてブレインキュベート
した後、キチナーゼ溶液を、キトサン溶液に加え、反応
温度においてキトサンをキチナーゼによって分解する。

反応温度は、キチナーゼによって最適温度が異なるので
、それぞれのキチナーゼの最適温度にて反応するのが好
ましい。また、反応液のｐＨは、それぞれのキチナーゼ
の最適ｐＨで反応させることができる。本発明のキトサ
ンオリゴ糖の製造に使用するキトサンは、キチナーゼに
よって分解されるものであれば、いかなるものであって
もこれを使用することができるが、脱アセチル化度５０
〜１００％のキトサンを使用するのが好ましい。これら
のキトサンにキチナーゼを加えて分解する場合、前記の
キトサン溶液の他に、コロイダルキトサンを水に懸濁し
た状態におくこともできる。

キトサン溶液の調製に使用する酸は、キトサンを溶解し
うるものであれば、有機酸または無機酸のいかなるもの
であってもこれを使用することができるが、塩酸または
硝酸の希薄溶液、ギ酸、酢酸、乳酸、グルタミン酸また
はアスコルビン酸の希薄溶液を使用するのが好ましい。

キトサンオリゴ糖の重合度分布は、反応温度、反応時間
、反応ｐＨ等によって変化するから、予備実験において
、反応温度、反応時間、反応ｐＨと生成物のキトサンオ
リゴ塘の重合度分布の関係を実験的に求めておき、これ
に基づいて所望の重合度分布のキトサンオリゴ糖を得る
のに必要な反応時間とすることもできる。

所定の反応時間の経過後に、反応液中のキチナーゼを失
活して、反応を停止し、反応液の遠心分離または濾過に
よって上澄液を集め、これを常法のイオン交換樹脂によ
るクロマトグラフィー、ゲル濾過または活性炭による着
色物質の除去などを行なって、不純物を除去した後、乾
燥して、所望のキトサンオリゴ糖の粉末を得る。

６種のキチナーゼを使用して、コロイダルキチンおよび
脱アセチル化度が、１００．９１．９０．７９．７５．
６６および５９％のキトサンを分解して還元糖の生成量
を調べた試験例を記述する。

試験例１ストレプトマイセス・アンチビオチフス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　）由来のキチ
ナーゼを使用した試験例である。

（１）キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔カルビオヘム（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ　）
社製品〕を脱イオン水に溶解し、０．２■／−のキチナ
ーゼ溶液を調製した。

（２）試料の調製（２−１）コロイダルキチン懸濁液の調製水１１にキチ
ン４０ｇを加え、水冷しながら、これに濃硝酸１２８０
ｄを加えて溶解した径、ガラスフィルターで濾過し、濾
液を１ｏｌの水中に撹拌しながら加えた。生成した沈澱
を濾取し、充分に水洗して、コロイダルキチンを得て、
これに水を加え、撹拌して、０．５％コロイダルキチン
溶液を調製した。

（２−２）キトサン溶液の調製脱アセチル化度が１００．９１．９０，７９．７５．６
６および５９％のキトサン１ｇをそれぞれのビーカーに
取り、それぞれにＩＭ酢酸２５ｍ１を添加し、撹拌した
後、これに２Ｍ酢酸ナトリウム溶液２５−を加え、さら
に撹拌した移、水を加えて、全量を２００−にして、そ
れぞれの０．５％キトザン溶液を調製した。

（３）試験方法（３−１）　　ｐＨ５，０における酵素反応試′Ｂ１ｍ
１を試験管に取り、これにＯ，１Ｍ酢酸バッファー（ｐ
Ｈ：　５．０）　　２−を加え、３７℃においてブレイ
ンキュベートした後、あらかじめ３７℃においてブレイ
ンキュベートしたキチナーゼ溶液１ｍｌを加え、３７６
Ｃにおいて６時間反応させ、その後、試験管を加熱し、
３分間沸とうして、反応を停止させた。

反応液中の生成還元糖量をジャーレス（５ｈａｌｅＳ　）変法により測定した。

生成還元糖量の測定における標準は、コロイダルキチン
の試料では、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、また
キトサンの試料では、Ｄ−グルコサミンをそれぞれ使用
した。

（３−２）　　ｐＨ６，５における酵素反応（３−１）
における０、１Ｍ酢酸バッファー（ＴＩＨ：　５．０）
の代りに、０．１Ｍリン酸バッファーを使用し、（３−
１）と同様にして、反応を行ない、さらに生成還元糖量
を測定した。

（４）試験の結果第１表に示すとおりであった。

（以下余白）試験例２ストレプトマイセス属の微生物由来のキチナーゼを使用
した試験例である。

（１）キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔アイ・シー・エヌ（ＴＣＮ　）社製品〕を
脱イオン水に溶解し、０゜８ｆｎｇ／−のキチナーゼ溶
液を調製した。

（２）試料の調製（２−１）コロイダルキチン懸濁液の調製試験例１と同
様にして行なった。

（２−２）キトサン溶液の調製試験例１と同様にして行なった。

（３）試験方法（３−］　）　　ｐＨ５，０における酵素反応試験例１
のキチナーゼ溶液の代りに、試験例２のキチナーゼ溶液
を使用して、試験例１と同様にして行なった。

（３−２）　　ｐＨ６，５における酵素反応試験例１の
キチナーゼ溶液の代りに、試験例２のキチナーゼ溶液を
使用して、試験例１と同様にして行なフた。

（３−３）　　ｌｌ８５．Ｏにおける酵素反応における
分解曲線脱アセチル化度が６６％のキトサンについて、試験例１
のキチナーゼ溶液の代りに、試験例２のキチナーゼ溶液
を使用して、試験例１の（３−］）と同様にして、酵素
反応を行ない、第１図に示す時間の経過後に、試験管を
加熱し、３分間沸とうして、反応を停止させ、ジャーレ
ス（Ｓｈａｌｅｓ　）変法により生成還元着量を測定し
た。

（４）試験の結果（ａ−＋）および（３−２）の酵素反応の試験の結果は
第２表に示すとおりであった。

（３−３）の酵素反応における分解曲線の試験の結果は
第１図に示すとおりであった。

（以下余白）試験例３ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ　）由来
のキチナーゼを使用した試験例である。

（１）キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔シグマ（ＳＩＧＭＡ　）社製品〕を脱イオ
ン水に溶解し、ｏ、２ｍ９／ｄのキチナーゼ溶液を調製
した。

（３）試験方法（３−１）　　ｐＨ５，０における酵素反応試験例１の
キチナーゼ溶液の代りに試験例３のキチナーゼ溶液を使
用して、試験例１と同様にしてｔテなった。

（３−２）　　ｐＨ６，０における酵素反応試験例１の
キチナーゼ溶液の代りに、試験例３のキチナーゼ溶液を
使用し、また試験例１の０・１Ｍリン酸バッファー（ｐ
ｌ＋　：　６．５）の代りに、０．１Ｍリン酸バッファ
ー（ｐＨ：　６．Ｏ）を使用して、試験例１と同様にし
て行なった。

（４）試験の結果第３表に示すとおりであった。

（以下余白）誰 φ 試験例４アエロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙ
ｄｒｏｐｈｉｌａ　）由来のキチナーゼを使用した試験
例である。

（１）キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔合同酒精社製品〕を脱イオン水に溶解し、
１■／ｍｌのキチナーゼ溶液を調製した。

（３）試験方法（３−］）　　ｐＨ５，０における酵素反応試験例１の
キチナーゼ溶液の代りに試験例４のキチナーゼ溶液を使
用して、試験例１と同様にして行なった。

（３−２）　　ｐｎ　６．５における酵素反応試験例Ｉ
のキチナーゼ溶液の代りに試験例４のキチナーゼ溶液を
使用して、試験例１と同様にして行なった。

（４）試験の結果第４表に示すとおりであった。

（以下余白）試験例５セラチア・マルスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｅｅ
ｓｅｅｎｓ　）由来のキチナーゼを使用した試験例であ
る。

（１）キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔シグマ（ＳＩＧＭＡ　）　社製品〕を脱イ
オン水に溶解し、０．６７■／−のキチナーゼ溶液を調
製した。

（３）試験方法（３−１）　　ｐＨ５，０における酵素反応試験例１の
キチナーゼ溶液の代りに試験例５のキチナーゼ溶液を使
用し、試験例１と同様にして行なった。

（３−２）　　ｐＨ６，５における酵素反応試験例１の
キチナーゼ溶液の代りに、試験例５のキチナーゼ溶液を
使用し、試験例１と同様にして行なった。

（４）試験の結果第５表に示すとおりであった。

（以下余白）試験例６カビ由来のキチナーゼを使用した試験例である。

（１）キチナーゼ溶液の調製キチナーゼ〔コツホ−ライト（Ｋｏｃｈ　−Ｌｉｇｈｔ
　）社製品〕を脱イオン水に溶解して、ｏ、５７ｍｇ／
ｄのキチナーゼ溶液を調製した。

（３）試験方法（３−１）　　ＩＩＨ５，０における酵素反応試験例１
のキチナーゼ溶液の代りに、試験例６のキチナーゼ溶液
を使用し、試験例１と同様にして行なった。

（３−、−２）ｐＨ６，５における酵素反応試験例１の
キチナーゼ溶液の代りに、試験例６のキチナーゼ溶液を
使用し、試験例１と同様にして行なった。

（３−３）　　ｐＨ６，５における酵素反応における分
解曲線脱アセチル化度が６６％のキトサンの試料について、試
験例１のキチナーゼ溶液の代りに、試験例６のキチナー
ゼ溶液を使用して、試験例１の（３−２）と同様にして
、酵素反応を行ない、第２図に示す時間の経過後に、試
験管を加熱し、３分間沸とうして、反応を停止させ、ジ
ャーレス（５ｈａｌｅｓ　）変法により生成還元糖量を
測定した。

（４・）試験の結果（３−１）および（３−２）の酵素反応の試験の結果は
第６表に示すとおりであった。

（３−３）の酵素反応における分解曲線の試験の結果は
第２図に示すとおりであった。

（以下余白）〔試験例の結果の考察〕第２図によると、キトサンをキチナーゼによって分解す
ると、分解時間を長くしてもＤ−グルコサミンの生成量
は増加しないから、キトサンオリゴ精を生成することが
わかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は試験例２の（３−３）の試験の結果を示す図表
であり、第２図は試験例６の（３−３）の試験の結果を
示す図表である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）キトサンをキチナーゼで分解して、Ｄ−グルコサ
ミンの単糖類をほとんど含まないオリゴ糖を得ることを
特徴とするキトサンオリゴ糖の製造法。
（２）キトサンが、脱アセチル化度が５０〜９９％のキ
トサンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
記載のキトサンオリゴ糖の製造法。
（３）キトサンが、コロイダルキトサンであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載のキ
トサンオリゴ糖の製造法。