JPH01266102A - 低粘度ヒアルロン酸又はその塩の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は低粘度のヒアルロン酸又はその塩（以下、ヒア
ルロン酸（塩）と略記する）の製造方法に関するもので
ある。

（従来の技術） ヒアルロン酸は、関節、硝子体、偵帯、軟骨、皮膚、鳥
類のとさか等の結合組織中にその構成成分として存在し
、組織の柔軟性、構造維持、細胞の代謝調節等に重要な
機能を果している。また、ヒアルロン酸は高分子物質で
あり、その溶液は強い粘弾性を持ち、保水作用を有する
ところから、化粧品原料として広く使用されている。か
かるヒアルロン酸のうち特に粘度の低いものは、化粧品
として使用すると、皮膚に、つっばり感やべとつき感を
与えず、しかも長期間保存しても粘度低下が少なく、保
存安定性が良くなる。

従来、ヒアルロン酸（塩）を工業的に得る方法として、
にわとりのとさか、牛の目の硝子体、又は調帯等からの
抽出法、或いはヒアルロン酸（塩）を生産する能力を持
つ微生物を培地に培養して製造する方法（発酵法）が行
われている。

抽出法或いは発酵法によって得られたヒアルロン酸（塩
）を低粘度化することによって低粘度ヒアルロン酸（塩
）が得られるが、低粘度化の方法としては、従来ヒアル
ロニダーゼ、つまり酵素を用いて低粘度化する方法であ
る酵素分解法が行われていた。

抽出法或いは発酵法によって得られたヒアルロン酸（塩
）を低粘度化する要因としては、特開昭５８−３７００
１号に記載されているものが知られている。

これらの要因を次表に示す。

第１表 ヒアルロン酸の極限粘度と分子量の間には相関があって
、分子量が小さいと極限粘度も小さくなる。従って、低
粘度のヒアルロン酸（塩）を製造するためにはヒアルロ
ン酸（塩）の分子量を小さくすれば良い。

ヒアルロニダーゼは生体組織中に存在する酵素で、ヒア
ルロン酸のＮ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸の
β−１−４グリコシド結合を選択的に切断する作用を持
つ。従って、ヒアルロン酸にヒアルロニダーゼを作用さ
せるとヒアルロン酸の分子鎖が切断されて低分子化され
、その結果、低粘度のヒアルロン酸が得られる。ヒアル
ロニダーゼを用いて低粘度化させる方法は、ヒアルロン
酸のβ−１−４グリコシド結合のみを切断して他の官能
基、例えばＮ−アセチル基等は加水分解することがない
ので、従来は低粘度のヒアルロン酸く塩）を製造する方
法として、専らヒアルロニダーゼを用いる方法が行われ
ていた。

（発明が解決しようとする課題） しかし、この方法は酵素が高価であるため、製造コスト
が高くなる。また、酵素であるヒアルロニダーゼは、動
物組織等から抽出法によって生産されるため力価にばら
つきがある。このため、酵素の力価によって低粘度化処
理時間が変わり、目的の低粘度のヒアルロン酸（塩）を
得るには、非常に難しい工程管理が必要となる等の欠点
があった。

また、既に示した第１表からも認められるが、加熱処理
とアルカリ処理は低粘度化の方法として有望であると考
えられる。しかし、キチンを脱アセチル化してキトサン
を製造する場合、３０％以上の苛性ソーダ液を用い、１
００℃で３時間加熱処理するが、この方法では、ヒアル
ロン酸のβ−１−４グリコシド結合を切断するだけでな
く、Ｎ−アセチル基も切断してしまう。この為、アルカ
リ処理は低粘度ヒアルロン酸（塩）の製造方法としては
行われていなかった。

従って本発明は、Ｎ−アセチル基は切断せずβ−１−４
グリコシド結合のみを切断し、安価に工業的に低粘度の
ヒアルロン酸（塩）を製造するため、製造コストの高い
酵素を用いず、安価な薬剤を用い、処理工程管理の容易
な方法を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明は、ヒアルロン酸（塩）の水溶液に０．１規定以
下の酸又はアルカリを添加し、３０℃以上で５０℃より
低い温度の条件下で、均一に攪拌しつつ、脱アセチル化
することな（、ヒアルロン酸く塩）を低分子量化するこ
とを特徴とする。

酸は硫酸、塩酸、燐酸のうち１種もしくは２ｆ重以上の
酸であることが好ましい。

アルカリは、アルカリ金属水酸化物のうち１種もしくは
２種以上であることが好ましい。

低粘度ヒアルロン酸（塩）の極限粘度は１０ｄ！／ｇ以
下であることが好ましい。

ヒアルロン酸（塩）の０．５％水溶液について、０．１
規定苛性ソーダ水溶液、０．１規定希塩酸水溶液になる
ようにして、５０℃の温度条件下で撹拌しつつ反応させ
るとヒアルロン酸（塩）の分子量は第２表の如く変化す
る。

第２表 （分子量の単位二号） 第２表かられかるように０．１規定苛性ソーダ水溶液、
又は塩酸水溶液で処理すると、５０℃の条件下で時間の
経過と共にヒアルロン酸（塩）が低粘度化する。

ヒアルロン酸（塩）の如きＮ−アセチルグルコサミン類
は、酸又はアルカリ処理すると、アセチル基が加水分解
されてグルコサミンになることが知られている。そこで
種々の酸又はアルカリ濃度のヒアルロン酸水溶液を４５
℃で７時間処理したところ、ヒアルロン酸ナトリウム２
０ｍｇ中の酢酸量は第３表の如くであった。

第３表 注　ヒアルロン酸ナトリウム濃度：　０．０５％第３表
の結果から、４５℃で７時間処理という条件下で、は、
酸又はアルカリ濃度が０．ＩＮ以下であれば、脱アセチ
ル化反応が起こらないことが分る。

次いで、０．Ｉ　Ｎの酸又はアルカリ濃度条件下で、反
応温度を変えて７時間処理したところ、ヒアルロン酸ナ
トリウム２０■中の酢酸量は第４表の如くであった。

第４表 注　ヒアルロン酸ナトリウム濃度：　Ｏ，ＯＳ％第４表
の結果から、０．１規定の酸又はアルカリ濃度で７時間
処理という条件下では、５０℃より低い温度、好ましく
は４５℃以下の温度であれば、脱アセチル化反応は起こ
らないことが判る。

尚、ヒアルロン酸ナトリウム中の酢酸量の定量は次の如
く行った。

■　加水分解 ヒアルロン酸ナトリウムを乾燥物換算で２０■正確に採
る。２Ｎ塩酸１ｄを加え、沸騰水中で３時間加水分解反
応を行う。水冷後プロピオン酸０．１０−を加え、その
ｌμｌをそのままガスクロにかけて分析を行う。

■　検１′ＩＩＡ ０．１〜０．５％酢酸（２Ｎ塩酸中）１．０＊ｆに内部
標準として、プロピオン酸０．１００−を加え、そのｌ
μｌをガスクロにかける。プロピオン酸に対する酢酸の
ピーク面積比と酢酸の濃度から検量線を作成する。

■　ガスクロ条件 機種：島津製作所ＧＣ−６Ａ カラム：ポラパックＱ 温度：１７０℃〜１７２℃ 検出：ＴＣＤ（２００℃） ■　ヒアルロン酸ナトリウム２０ｍｇ中の酢酸量の理論
値は次式で算出される。

０．１規定の酸又はアルカリで処理したヒアルロン酸ナ
トリウムは、赤外吸収スペクトル、ＮＭＲチャートを調
べた結果、未処理品（ブランク）との差が認められなか
った。

低粘度化処理終了後、処理液から粉末状ヒアルロン酸ナ
トリウムを取得するには、低粘度化処理液をｐＨ約７に
中和した後、少量の食塩を添加溶解して、激しく攪拌し
つつ非溶媒であるエチルアルコール、メチルアルコール
、アセトンを添加して、ヒアルロン酸ナトリウムを析出
せしめる。母液を濾別した後、減圧下に乾燥して低粘度
化されたヒアルロン酸ナトリウムの粉末を得る。

（発明の効果） 本発明方法を用いることにより、大量のヒアルロンＣＩ
！（塩）を非常に安いコストで、再現性よく製造するこ
とができ、Ｎ−アセチル基は切断せずβ−１−４グリコ
シド結合のみを切断した目的の粘度を持った低粘度ヒア
ルロン酸（塩）が得られる。これにより、製造コストの
高い酵素を用いず、安価な薬剤を用いた処理工程管理の
容易な方法を提供することができる。

実施例１ ０．１規定塩酸水溶液２０Ｚに１００ｇのヒアルロン酸
ナトリウム（極限粘度−１４，１！７／ｇ）を加え、攪
拌を行って熔解させた。完全に溶解したヒアルロン酸ナ
トリウム０．５％溶液を攪拌しつつ、４５℃に昇温する
。以降、均一に攪拌しつつ４５℃で２４時間、低粘度化
処理を行った。

２４時間経過したところで、６規定苛性ソーダ水溶液を
添加してヒアルロン酸ナトリウム水溶液を中和した。溶
液温度を急速に室温まで冷却したのち、塩化ナトリウム
？Ｎｒ度が０．２モルになるように塩化ナトリウムを溶
解せしめた。

溶液全体を均一に撹拌しつつ、液量の３倍のエチルアル
コールを徐々に添加した。攪拌を停止して析出したヒア
ルロン酸ナトリウムを沈降せしめ、半量の上澄み液をデ
カンテーションで抜き出し、この液と同量のエチルアル
コールを添加して、再び攪拌した。３０分攪拌したとこ
ろで攪拌を停止し、吸引濾過でヒアルロン酸ナトリウム
の沈澱物を母液と分離した。濾布上のヒアルロン酸ナト
リウム沈澱物は、エタノールで再度洗浄したのち、減圧
下４０°Ｃで１２時間乾燥して、低粘度ヒアルロン酸ナ
トリウム８．４ｇを得た。

この低粘度ヒアルロン酸ナトリウムの純度は乾燥物とし
て９８．７％、極限粘度は２．１４１／ｇ、２０■中の
酢酸量は２．９１ｗｔであった。

実施例２ ０、Ｉ　Ｎ苛性ソーダ水溶液２０２にｌｏｏｇのヒアル
ロン酸ナトリウム（極限粘度−１４，ｂ／７／ｇ）を加
え攪拌を行って溶解させた。

完全に溶解したヒアルロン酸ナトリウム０．５％溶液を
撹拌しつつ、４５℃に昇温する。以降、均一に撹拌しつ
つ４５℃で２４時間低粘度処理を行った。

この時ヒアルロン酸ナトリウムの権限粘度は、時間と共
に次のように変化した。

第５表 ２４時間経過したところで６規定塩酸を添加してヒアル
ロン酸ナトリウム水溶液を中和した。溶液温度を急速に
室温まで冷却したのち、塩化ナトリウム濃度が０．２モ
ルになるよう塩化ナトリウムを）容解せしめた。

）容液全体を均一に撹拌しつつ、１ｆｆｌｆｆｌの３倍
のエチルアルコールを徐々に添加した。攪拌を停止して
析出したヒアルロン酸ナトリウムを沈降せしめ、半量の
上澄み液をデカンテーションで抜き出し、この液と同量
のエチルアルコールを添加して、再び攪拌した。３０分
撹拌したところで攪拌を停止し、吸引濾過でヒアルロン
酸ナトリウムの沈澱物を母液と分離した。濾布上のヒア
ルロン酸ナトリウム沈澱物は、エタノールで再度洗浄し
たのち、減圧下４０℃で１２時間乾燥して、低粘度ヒア
ルロン酸すＩ・リウム８．Ｏｇを得た。

この低粘度ヒアルロン酸ナトリウムの純度は乾履物とし
て９８．５％、極限粘度は１゜９　ｄｌ　／　ｇ、２０
ｍｇ中の酢酸量は２．９６■であった。

原料として用いたヒアルロン酸ナトリウムの赤外吸収ス
ペクトラムを第１図に、低粘度処理をしたヒアルロン酸
ナトリウムの赤外吸収スペクトラムを第２図に示す。赤
外吸収チャートでも差は認められなかった。

比較例 低粘度化処理を０．５規定苛性ソーダ水溶液で行った以
外は、実施例２と全く同じ条件で低粘度化処理を行った
。

得られたヒアルロン酸ナトリウムの純度は、乾燥物とし
て９７．９％、極限粘度は１．２　ｄｌ／ｇ、２０■中
の酢酸量は２．６８■であり、脱アセチル化反応が起こ
っていることが明らかであった。得られたヒアルロン酸
ナトリウムの赤外吸収スペクトラムは、第３図の如くで
あった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明実施例による原料のヒアルロン酸ナト
リウムの赤外吸収スペクトラム、第２図は、低粘度処理
をしたヒアルロン酸ナトリウムの赤外吸収スペクトラム
、 第３図は、比較例におけるヒアルロン酸すトリウムの赤
外吸収スペクトラムである。 特許出願人　チ　ッ　ソ　株　式　会　社？ｔ４１廠［
０，４＋ 博Ａ年Ｉ　Ｖ、、　１

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒアルロン酸又はその塩の水溶液に、０．１規定
   以下の酸又はアルカリを添加し、３０℃以上で５０℃よ
   り低い温度の条件下で、均一に攪拌して、ヒアルロン酸
   又はその塩を低分子量化することを特徴とする低粘度ヒ
   アルロン酸又はその塩の製造方法。
2. （２）酸が硫酸、塩酸、燐酸のうち１種もしくは２種以
   上の酸である請求項１記載の方法。
3. （３）アルカリが、アルカリ金属水酸化物のうち１種も
   しくは２種以上である請求項１記載の方法。
4. （４）低粘度ヒアルロン酸又はその塩の極限粘度が１０
   ｄｌ／ｇ以下である請求項１記載の方法。