CN111035581A - 一种维持唾液酸溶液高温时稳定的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种维持唾液酸溶液高温时稳定的方法及其应用，所述方法是将壳聚糖与唾液酸溶液混合来维持唾液酸的稳定。本发明创造性地发现将壳聚糖与唾液酸溶液进行混合后能够显著增强唾液酸的稳定性，经高温灭菌后，唾液酸的含量下降程度较小，且该方法操作简单，易于在工业化中应用。
Description
技术领域
本发明属于唾液酸加工技术领域，具体涉及一种维持唾液酸溶液高温时稳定的方法及其应用。
背景技术
唾液酸(Sialic Acid，SA)是一系列含有氨基的九碳单糖衍生物，是所有神经氨酸及其衍生物的总称。人体自身合成的唾液酸均为N-乙酰神经氨酸，在未特别说明的情况下，唾液酸(SA)特指N-乙酰神经氨酸。唾液酸已经被证明参与了体内细胞识别、信号转导等多种生理过程，具有调节血蛋白半衰期、对抗各种毒素、细胞粘附、糖蛋白裂解保护、抗氧化性、促进大脑发育和提高记忆力等生理功能。近年来，在食品、化妆品、药品领域得到应用。
在工业上，唾液酸通常是通过发酵、酶法或者燕窝水解法制得，申请人由大肠杆菌发酵得到唾液酸，解决了唾液酸工业化生产的问题，降低了唾液酸的生产成本，并获得质量稳定的唾液酸，满足了化妆品领域和食品领域的应用需求，具体的制备方法已在CN201811372409.0等系列专利中公开。
通常经过高温灭菌前处理后，唾液酸的含量会发生急剧下降，其损失率甚至会超过50％，由于前处理过程中，唾液酸含量的降低影响其生理功效的发挥，限制了其应用。
CN108659095A提出了一种使唾液酸含量稳定的方法，能使细胞培养澄清收获液中唾液酸含量稳定，避免在下一捕获步骤操作的多个循环时间内唾液酸的下降。其采用的方法是使用碱性试剂调节细胞培养澄清收获液的pH值≥8.0，所述碱性试剂优选Tris-HCl缓冲液。
CN109771316A中公开了一种提高唾液酸水溶液稳定性的方法及其应用，所述方法为使用强碱和/或盐酸将含有唾液酸的水溶液的pH调至5-9，该方法虽然可有效提高唾液酸水溶液的稳定性，且操作简单，但是在实际的一些应用领域中需要保持环境酸性的条件，这就使得该方法的应用范围受到限制。
现有技术中关于如何提高或维持唾液酸稳定性的研究和策略还很少，因此开发出一种能维持前处理过程中唾液酸的良好稳定性的新策略是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种维持唾液酸溶液高温时稳定的方法及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种维持唾液酸溶液高温时稳定的方法，所述方法将壳聚糖与唾液酸混合来维持唾液酸的稳定。
唾液酸在经过高温灭菌处理后，唾液酸的含量会发生急剧下降，并且在唾液酸水溶液状态，溶液的颜色会变深，因此对应用造成了很大的负面影响。壳聚糖(chitosan，CS)又称脱乙酰壳多糖、乙酰甲壳素，是由几丁质经过脱乙酰作用得到的，化学名为聚葡萄糖胺(1-4)-2氨基-B-D葡萄糖，是唯一的碱性多糖，具有抗菌活性、生物相容性以及可食用性等特点，因此在化妆品、生物医药、食品等领域有广泛的应用。本发明创造性地发现将壳聚糖与唾液酸进行混合后能够显著增强其稳定性，经高温灭菌后唾液酸的含量损失能够控制在令人能够接受的范围内。该方法操作简单，易于在工业化中应用。
优选地，所述唾液酸溶液为唾液酸水溶液。
优选地，所述唾液酸水溶液的质量分数为0.01-5％，例如0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.8％、1％、2％、3％或5％等。
所述唾液酸水溶液的质量分数特定选择为0.01-5％是因为若质量分数过大会使得溶液酸性太强，严重影响口感或使用质感，限制应用范围，若质量分数过小则无法发挥其应用功效。
优选地，所述壳聚糖的粘度不高于0.30Pa·s，例如0.30Pa·s、0.25Pa·s、0.22Pa·s、0.20Pa·s、0.18Pa·s、0.15Pa·s或0.10Pa·s等。
所述壳聚糖的粘度选择不高于0.30Pa·s即低粘度范围，是因为粘度对应了壳聚糖的分子量和浓度，粘度低表明分子量小、浓度也相对低，确保壳聚糖可以很好地溶解在溶剂中。
优选地，所述壳聚糖为水溶性壳聚糖。
优选地，所述水溶性壳聚糖包括壳聚糖衍生物、壳聚糖盐类、壳聚糖寡糖、低聚壳聚糖或类透明质酸壳聚糖中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如壳聚糖衍生物和壳聚糖盐类的组合、壳聚糖盐类和壳聚糖寡糖的组合、壳聚糖衍生物和类透明质酸壳聚糖的组合等，其他任意可行的组合方式便不在此一一赘述。优选地，可选择低聚壳聚糖，其分子量≤3200Da。
壳聚糖大分子链上有丰富的羟基和氨基使其容易进行羧基化、酰基化、季铵化、醚化等化学修饰，得到壳聚糖衍生物或壳聚糖盐类。
优选地，所述壳聚糖衍生物包括羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或羧丁基壳聚糖中的任意一种或至少两种的组合，优选羧甲基壳聚糖。
优选地，所述壳聚糖盐类包括壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖PCA盐、壳聚糖单琥珀酰胺、壳聚糖甘醇酸盐、壳聚糖乳酸盐或壳聚糖谷氨酸盐中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如壳聚糖盐酸盐和壳聚糖季铵盐的组合、壳聚糖季铵盐和壳聚糖单琥珀酰胺的组合、壳聚糖甘醇酸盐和壳聚糖谷氨酸盐的组合等，优选壳聚糖季铵盐。
优选地，所述水溶性壳聚糖与唾液酸水溶液混合后，其质量分数为0.01-1％，例如0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％等。
所述水溶性壳聚糖与唾液酸水溶液混合后的质量分数特定选择在0.01-1％范围内，是因为若质量分数过高在应用中不适宜高温条件下的灭菌，而且考虑到后续检测水溶液中唾液酸的含量时，如果壳聚糖浓度较大，会干扰唾液酸衍生化试剂对唾液酸的作用，从而加大样品前处理的工作量，质量分数过低会达不到稳定的目的。
所述唾液酸来源可以是天然大肠杆菌的发酵，产生聚唾液酸，再经由聚唾液酸的水解提纯制得；可以是大肠杆菌工程菌的发酵，所述大肠杆菌工程菌为将6-磷酸葡萄糖胺乙酰化酶基因、N-乙酰葡萄糖胺-2-异构酶基因、唾液酸合成酶基因和6-磷酸葡萄糖胺脱氨酶基因导入大肠杆菌表达构建而成的重组大肠杆菌；可以是酶法合成；可以是天然燕窝的水解。
作为本发明的优选技术方案，所述提高唾液酸稳定性的方法为：将水溶性壳聚糖与唾液酸水溶液混合，使水溶性壳聚糖的质量分数为0.01-1％，唾液酸的质量分数为0.01-5％，所述壳聚糖与所述唾液酸的质量比不小于0.45，从而提高唾液酸的稳定性；所述壳聚糖与所述唾液酸的质量比可以为0.45、0.5、1、3、6、10等。
优选地，所述水溶性壳聚糖的质量分数为0.01-1％，唾液酸的质量分数为0.01-2％。
优选地，所述水溶性壳聚糖的质量分数为0.01-1％，唾液酸的质量分数为0.01-1％。
优选地，所述水溶性壳聚糖的质量分数为0.05-1％，唾液酸的质量分数为0.01-1％。
优选地，所述水溶性壳聚糖的质量分数为0.1-1％，唾液酸的质量分数为0.01-1％。
另一方面，本发明提供一种唾液酸水溶液，所述唾液酸水溶液包括唾液酸、水溶性壳聚糖和水。
再一方面，本发明提供如上所述的方法在提高食品添加剂或化妆品中唾液酸稳定性的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地发现将壳聚糖与唾液酸进行混合后能够显著增强其稳定性，经高温灭菌后，唾液酸的含量损失能够控制在令人能够接受的范围内。且该方法操作简单，易于在工业化中应用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。本发明仅以发酵生产聚唾液酸水解得到唾液酸为例来体现本发明的发明目的，下述实施例所涉及的唾液酸均来源于申请人通过微生物发酵制备得到的，具体为通过大肠杆菌发酵得到聚唾液酸，首先过滤除去发酵液中的菌体，然后对滤液进行除菌、水解、脱色和过滤，再进行浓缩和水解结晶分离，最后洗涤烘干即得到唾液酸。
实施例1
本实施例提供一种提高唾液酸前处理稳定性的方法，所述方法为：将低聚壳聚糖(MW＝3000)与唾液酸水溶液混合，从而提高唾液酸的稳定性。具体包括如下步骤：
(1)配制母液：称取唾液酸加入超纯水，配制成质量分数为10％的母液，将壳聚糖加入超纯水，配制成质量分数为2％的母液；
(2)再将两种母液进行稀释混合，制成六种不同的唾液酸/壳聚糖混合溶液，分别为(a)0.1％唾液酸+0.01％壳聚糖；(b)0.1％唾液酸+0.05％壳聚糖；(c)0.1％唾液酸+0.1％壳聚糖；(d)0.1％唾液酸+0.3％壳聚糖；(e)0.1％唾液酸+0.6％壳聚糖；(f)0.1％唾液酸+1％壳聚糖；(质量百分含量均以混合溶液为100％计算，且六组溶液体积相同)。
(3)然后将七组唾液酸/壳聚糖混合溶液分别进行121℃高压灭菌20min，测定灭菌前后唾液酸的含量(以0.1％唾液酸溶液为对照组，与上述六组溶液体积相同)。测定方法为水解壳聚糖后，高效液相色谱(HPLC)检测法：仪器是岛津Lc-15c；检测柱是Bio-Rad AMINEXHPX 87H Organic Analysis Column(300×7.8mm)；柱温是60℃；流动相是6mmol硫酸；流速是0.6mL/min；检测波长是210nm(所有实验数均均重复3次，结果为3次平均值)。
结果如表1所示，由表1可知：低聚壳聚糖的添加使唾液酸溶液的稳定性显著提高。
表1
实施例2
本实施例提供一种提高唾液酸前处理稳定性的方法，所述方法为：将羧甲基壳聚糖与唾液酸水溶液混合，从而提高唾液酸的稳定性(所采用的羧甲基壳聚糖为N,O-羧甲基壳聚糖，取代度为≥80.0，分子量10-20万Da，购于绿神生物)。具体包括如下步骤：
(1)配制母液：称取唾液酸加入超纯水，配制成质量分数为10％的母液，将羧甲基壳聚糖加入超纯水，配制成质量分数为2％的母液；
(2)再将两种母液进行稀释混合，制成六种不同的唾液酸/羧甲基壳聚糖混合溶液，分别为(a)0.1％唾液酸+0.01％羧甲基壳聚糖；(b)0.1％唾液酸+0.05％羧甲基壳聚糖；(c)0.1％唾液酸+0.1％羧甲基壳聚糖；(d)0.1％唾液酸+0.3％羧甲基壳聚糖；(e)0.1％唾液酸+0.6％羧甲基壳聚糖；(f)0.1％唾液酸+1.0％羧甲基壳聚糖；(质量百分含量均以混合溶液为100％计算，且六组溶液体积相同)。
(3)然后将七组唾液酸/羧甲基壳聚糖混合溶液分别进行121℃高压灭菌20min，测定灭菌前后唾液酸的含量(以0.1％唾液酸溶液为对照组，与上述六组溶液体积相同)。测定方法与实施例1相同(所有实验数均均重复3次，结果为3次平均值)。
结果如表2所示，由表2可知：羧甲基壳聚糖的添加使唾液酸溶液的稳定性有所提高。
表2
| 组别 | 初始含量(mg/L) | 加热灭菌后含量(mg/L) | 损失率(％) |
| (a) | 1003.3 | 616.6 | 38.54％ |
| (b) | 1002.5 | 708.3 | 29.35％ |
| (c) | 1000 | 716.8 | 28.32％ |
| (d) | 998.7 | 710.1 | 28.90％ |
| (e) | 1003.1 | 732.0 | 27.03％ |
| (f) | 999.4 | 758.0 | 24.15％ |
| 对照组 | 989 | 479.7 | 51.50％ |
实施例3
本实施例提供一种提高唾液酸前处理稳定性的方法，所述方法为：将壳聚糖季铵盐与唾液酸水溶液混合，从而提高唾液酸的稳定性(采用的壳聚糖季铵盐取代度≥90，购于绿神生物工程)。具体包括如下步骤：
(1)配制母液：称取唾液酸加入超纯水，配制成质量分数为10％的母液，将壳聚糖季铵盐加入超纯水，配制成质量分数为2％的母液；
(2)再将两种母液进行稀释混合，制成六种不同的唾液酸/壳聚糖季铵盐混合溶液，分别为(a)0.1％唾液酸+0.01％壳聚糖季铵盐；(b)0.1％唾液酸+0.05％壳聚糖季铵盐；(c)0.1％唾液酸+0.1％壳聚糖季铵盐；(d)0.1％唾液酸+0.3％壳聚糖季铵盐；(e)0.1％唾液酸+0.6％壳聚糖季铵盐；(f)0.1％唾液酸+1.0％壳聚糖季铵盐；(质量百分含量均以混合溶液为100％计算，且六组溶液体积相同)。
(3)然后将七组唾液酸/壳聚糖季铵盐混合溶液分别进行121℃高压灭菌20min，测定灭菌前后唾液酸的含量(以0.1％唾液酸溶液为对照组，与上述六组溶液体积相同)。测定方法与实施例1相同(所有实验数均均重复3次，结果为3次平均值)。
结果如表3所示，由表3可知：壳聚糖季铵盐的添加使唾液酸溶液的稳定性显著提高，且壳聚糖季铵盐的浓度在0.1-1％的浓度范围内，其稳定效果更佳。
表3
| 组别 | 初始含量(mg/L) | 加热灭菌后含量(mg/L) | 损失率(％) |
| (a) | 1003.30 | 645.6 | 35.65％ |
| (b) | 1002.5 | 755.4 | 24.65％ |
| (c) | 1000.00 | 787.0 | 21.30％ |
| (d) | 998.70 | 786.5 | 21.25％ |
| (e) | 1003.10 | 802.1 | 20.04％ |
| (f) | 999.40 | 805.3 | 19.42％ |
| 对照组 | 989.00 | 479.7 | 51.50％ |
同时，实施例1-3的数据结果还表明，虽然三种壳聚糖在维持唾液酸的稳定性上有所差异，但是在维持唾液酸高温时稳定中均表现出了正面效果，在实施例1和实施例3中，当低聚壳聚糖或壳聚糖季铵盐与唾液酸的质量比大于0.45时，唾液酸的损失能够减小到25％之内。当低聚壳聚糖的浓度在0.1-1％的浓度范围内，其稳定效果更佳。
实施例4
本实施例提供一种提高唾液酸前处理稳定性的方法，所述方法为：将低聚壳聚糖(MW＝3000)与唾液酸水溶液混合，从而提高唾液酸的稳定性。具体包括如下步骤：
(1)配制母液：称取唾液酸加入超纯水，配制成质量分数为10％的母液，将壳聚糖加入超纯水，配制成质量分数为2％的母液；
(2)再将两种母液进行稀释混合，制成四种唾液酸/壳聚糖混合溶液，为(a)0.01％唾液酸+0.01％壳聚糖；(b)0.01％唾液酸+0.05％壳聚糖；(c)0.01％唾液酸+0.1％壳聚糖(d)0.01％唾液酸+1％壳聚糖(质量百分含量均以混合溶液为100％计算，三者体积相同)。
(3)然后将混合溶液进行121℃高压灭菌20min，测定灭菌前后唾液酸的含量(以0.01％唾液酸溶液为对照组，与上述溶液体积相同)。测定方法与实施例1相同(所有实验数均均重复3次，结果为3次平均值)。
结果如表4所示：唾液酸含量较少的情况下，壳聚糖含量需要在0.05％以上，其稳定效果才能发挥的更好，在0.1％以上能使唾液酸损失降低至20％以内。
表4
| 组别 | 初始含量(mg/L) | 加热灭菌后含量(mg/L) | 损失率(％) |
| (a) | 101.7 | 70.07 | 31.10％ |
| (b) | 100.7 | 75.4 | 25.10％ |
| (c) | 101.2 | 81.5 | 19.50％ |
| (d) | 100.5 | 82.1 | 18.30％ |
| 对照组 | 100.2 | 56.8 | 43.30％ |
实施例5
本实施例提供一种提高唾液酸前处理稳定性的方法，所述方法为：将低聚壳聚糖(与实施例1相同，MW＝3000)与唾液酸水溶液混合，从而提高唾液酸的稳定性。具体包括如下步骤：
(1)配制母液：称取唾液酸加入超纯水，配制成质量分数为10％的母液，将壳聚糖加入超纯水，配制成质量分数为2％的母液；
(2)再将两种母液进行稀释混合，制成四种唾液酸/壳聚糖混合溶液，为(a)1％唾液酸+0.01％壳聚糖；(b)1％唾液酸+0.1％壳聚糖；(c)1％唾液酸+0.5％壳聚糖；(d)1％唾液酸+1％壳聚糖(质量百分含量均以混合溶液为100％计算，三者体积相同)。
(3)然后将混合溶液进行121℃高压灭菌20min，测定灭菌前后唾液酸的含量(以1％唾液酸溶液为对照组，与上述溶液体积相同)。测定方法与实施例1相同(所有实验数均均重复3次，结果为3次平均值)。
结果如表5所示：
表5
| 组别 | 初始含量(g/L) | 加热灭菌后含量(g/L) | 损失率(％) |
| (a) | 10001.5 | 6490.9 | 38.10％ |
| (b) | 10000.3 | 7150.2 | 31.50％ |
| (c) | 10000.3 | 7750.2 | 22.50％ |
| (d) | 9998.8 | 7979.0 | 20.20％ |
| 对照组 | 10001.7 | 4440.7 | 55.60％ |
实施例6
本实施例提供一种提高唾液酸前处理稳定性的方法，所述方法为：将低聚壳聚糖(与实施例1相同，MW＝3000)与唾液酸水溶液混合，从而提高唾液酸的稳定性。具体包括如下步骤：
(1)配制母液：称取唾液酸加入超纯水，配制成质量分数为10％的母液，将壳聚糖加入超纯水，配制成质量分数为2％的母液；
(2)再将两种母液进行稀释混合，制成三种唾液酸/壳聚糖混合溶液，为(a)2％唾液酸+0.01％壳聚糖(b)2％唾液酸+0.1％壳聚糖(c)2％唾液酸+1％壳聚糖(质量百分含量均以混合溶液为100％计算，三者体积相同)。
(3)然后将混合溶液进行121℃高压灭菌20min，测定灭菌前后唾液酸的含量(以2％唾液酸溶液为对照组，与上述溶液体积相同)。测定方法与实施例1相同(所有实验数均均重复3次，结果为3次平均值)。
结果如表6所示：
表6
| 组别 | 初始含量(g/L) | 加热灭菌后含量(g/L) | 损失率(％) |
| (a) | 20001.5 | 12000.9 | 40.20％ |
| (b) | 20000.5 | 12860.3 | 35.70％ |
| (c) | 20002.2 | 14221.6 | 28.90％ |
| 对照组 | 20000.3 | 8280.1 | 58.60％ |
实施例4-6的数据结果表明：在壳聚糖水溶液适宜的应用范围内，唾液酸的含量越高，其稳定性越容易受到影响。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种维持唾液酸溶液高温时稳定的方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种维持唾液酸溶液高温时稳定的方法，其特征在于，所述方法是将壳聚糖与唾液酸溶液混合来维持唾液酸的稳定。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述唾液酸溶液为唾液酸水溶液。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述唾液酸水溶液的质量分数为0.01-5％。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖的粘度不高于0.30Pa·s。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖为水溶性壳聚糖；
优选地，所述水溶性壳聚糖包括壳聚糖衍生物、壳聚糖盐类、壳聚糖寡糖、低聚壳聚糖或类透明质酸壳聚糖中的任意一种或至少两种的组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述壳聚糖衍生物包括羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟乙基壳聚糖或羧丁基壳聚糖中的任意一种或至少两种的组合，优选羧甲基壳聚糖；
优选地，所述壳聚糖盐类包括壳聚糖盐酸盐、壳聚糖季铵盐、壳聚糖PCA盐、壳聚糖单琥珀酰胺、壳聚糖甘醇酸盐、壳聚糖乳酸盐或壳聚糖谷氨酸盐中的任意一种或至少两种的组合，优选壳聚糖季铵盐。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，所述水溶性壳聚糖与唾液酸水溶液混合后，其质量分数为0.01-1％。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法为：将水溶性壳聚糖与唾液酸水溶液混合，使水溶性壳聚糖的质量分数为0.01-1％，唾液酸的质量分数为0.01-5％，所述壳聚糖与所述唾液酸的质量比不小于0.45；
优选地，所述水溶性壳聚糖的质量分数为0.01-1％，唾液酸的质量分数为0.01-2％；
优选地，所述水溶性壳聚糖的质量分数为0.01-1％，唾液酸的质量分数为0.01-1％；
优选地，所述水溶性壳聚糖的质量分数为0.05-1％，唾液酸的质量分数为0.01-1％；
优选地，所述水溶性壳聚糖的质量分数为0.1-1％，唾液酸的质量分数为0.01-1％。
9.一种唾液酸水溶液，其特征在于，所述唾液酸水溶液包括唾液酸、水溶性壳聚糖和水。
10.如权利要求1-8中任一项所述的方法在提高食品添加剂或化妆品中唾液酸稳定性的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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