JP6989894B2 - キチン分解酵素組成物、キチン分解反応液及び糖の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、キチン分解酵素組成物、キチン分解反応液及び糖の製造方法に関する。

キチンは生物界において昆虫や甲殻類の外骨格、菌類の細胞壁等に含まれており、その年間生産量は、地球上に豊富に存在するバイオマスであるセルロースに次ぐものと推定されている。このため、キチンはセルロースに次ぐバイオマス資源として関心が高まっている。

キチンは単糖であるＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンが結合した不溶性多糖であり、キチンの分解酵素（「キチン分解酵素」ともいう）であるキチナーゼを用いた酵素反応によって、低分子化されたキチン多糖（低分子化キチン多糖）、キチン多糖に由来するキチンオリゴ糖、単糖（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン）等に加水分解される。なお、これらの加水分解物は、キチンの酵素反応における生産物である。

キチンの酵素反応における生産物は、優れた抗菌性、保湿性、生体適合性、安全性、キレート性等を有している。このため、医用材料、医薬、化粧品、繊維、農業、水処理、食品等の各分野での利用が期待されており、研究開発が進められている。

例えば、非特許文献１には、シリカナノ粒子（ＳＮＰ）を用いたキチナーゼの酵素活性に関する技術について記載されている。具体的には、ＳＮＰの表面に、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来のキチナーゼ（Ｃｈｉ９６０２）を静電吸着によって固定化し、ナノスケールキチナーゼ（ＳＮＰＣ１）を調製し、調製したＳＮＰＣ１を用いてキチナーゼの酵素活性を測定したことが開示されている。なお、調製したＳＮＰＣ１におけるシリカの固定化率は、５５％程度である。

しかしながら、ＳＮＰＣ１のキチナーゼ活性は、Ｃｈｉ９６０２のキチナーゼ活性１００％に対して４３％程度であることから、シリカの固定化によって活性が５７％程度低下することが明らかとなった。即ち、シリカにキチナーゼを固定化した反応系においては、糖の製造は可能であるが、酵素活性が阻害されて糖化反応効率が低下することが判明し、当該反応系を用いる際には、かかる問題を解決することが必要となる。また、コスト性の観点から、煩雑な反応系は望ましくない。

Ｘ． Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， Ｖｏｌ．８２， ２０１６， ｐ．１３－ｐ．２１

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、キチン分解酵素を用いた反応系においてシリカを適用した場合に、簡便な工程でキチン分解酵素による糖化反応効率を向上させると共に、生産物の高収率化を実現することができるキチン分解酵素組成物、キチン分解反応液及び糖の製造方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成する本発明の第１の態様は、キチンを加水分解するキチン分解酵素であるキチナーゼと、シリカ又はシリカ含有物質と、窒素を含む複素環式化合物である窒素含有複素環式化合物と、を含有することを特徴とするキチン分解酵素組成物にある。

本発明の第２の態様は、前記キチナーゼが、少なくともキチナーゼＡを含有することを特徴とする第１の態様のキチン分解酵素組成物にある。

本発明の第３の態様は、前記窒素含有複素環式化合物が、窒素含有五員複素環式化合物であることを特徴とする第１の態様又は第２の態様のキチン分解酵素組成物にある。

本発明の第４の態様は、前記窒素含有五員複素環式化合物が、イミダゾール及び２－メチルイミダゾールから選択される何れか１つであることを特徴とする第３の態様のキチン分解酵素組成物にある。

上記目的を達成する本発明の第５の態様は、キチンと、第１の態様から第４の態様の何れかのキチン分解酵素組成物と、を含有することを特徴とするキチン分解反応液にある。

上記目的を達成する本発明の第６の態様は、第５の態様のキチン分解反応液を用いてキチンを加水分解することにより糖を製造することを特徴とする糖の製造方法にある。

本発明の第７の態様は、撹拌下にて前記キチン分解反応液を用いてキチンを加水分解することにより糖を製造することを特徴とする第６の態様の糖の製造方法にある。

本発明によれば、キチン分解酵素を用いた反応系においてシリカを適用した場合に、簡便な工程でキチン分解酵素による糖化反応効率を向上させると共に、生産物の高収率化を実現することができるキチン分解酵素組成物、キチン分解反応液及び糖の製造方法を提供することができる。

（キチン分解酵素組成物）
本発明のキチン分解酵素組成物は、キチン分解酵素であるキチナーゼを用いた酵素反応において、糖化反応効率を向上させて生産物であるオリゴ糖やＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン等の高収率化を実現するものである。以下、本発明のキチン分解酵素組成物の詳細について説明する。

本発明のキチン分解酵素組成物は、基質であるキチンを加水分解することができる組成物であり、キチン分解酵素と、シリカ又はシリカ含有物質と、窒素含有複素環式化合物と、を含有するものである。

ここで、基質であるキチンとは、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン残基が多数β－１，４結合した直線状の高分子アミノ糖であり、強固な結晶構造を持つ不溶性多糖である。キチンは、下記式（１）で表される化学構造を有している。

また、キチンの脱アセチル化物はキトサンと呼ばれ、下記式（２）で表される化学構造を有している。

一般的なキチンは、部分的にアセチル基を失ったキトサン構造を有しており、一方、キトサンは、部分的にアセチル基を有したキチン構造を有している。従って、本発明におけるキチンは、前述のキトサン構造を有するキチンや、キチン構造を有するキトサンも含む概念である。また、このようなキチンは、酵素反応における生産物が回収可能な程度にキチンを含有するキチン含有物質であってもよい。

上述のキチンの原料としては特に制限されないが、キチン系バイオマス由来の原料を用いることができる。そのような原料としては、例えばエビやカニ等の甲殻やイカ等の軟甲、或いは昆虫等の甲殻や外骨格、真菌類の細胞壁等が挙げられる。また、原料として天然物由来のものを用いてもよいし、市販品を用いてもよい。原料が天然物由来のものである場合には、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。

天然物由来の原料としては、例えば紅ズワイガニを用いることができる。紅ズワイガニを用いる場合には、乾燥した紅ズワイガニの殻のほか、身抜きした足やその付け根部分を３ｃｍ～５ｃｍに粉砕し、高温の希水酸化ナトリウム水溶液と室温の希塩酸水溶液に、それぞれ２時間～３時間浸してタンパク質や炭酸カルシウムを除去することで、キチンを得ることができる。なお、得られたキチンを高温の濃水酸化ナトリウム水溶液中で８時間～２０時間かけて脱アセチル化することにより、キトサンを得ることができる。脱アセチル化に要した時間が短い場合には、得られたキトサンは脱アセチル化度が低いもの、即ちキチン構造を有するキトサンとなる。このようにして得られたキチン、或いは必要に応じてキチン構造を有するキトサンは、本発明のキチン分解酵素組成物を用いて後述する手順により、酵素反応に供することができる。

また、自然界に存在するキチンには、α－キチンとβ－キチンの２種類の結晶構造が存在することが知られている。

本発明のキチン分解酵素組成物は、α－キチンとβ－キチンの何れの構造であっても加水分解することができ、或いは、これらの構造が混合して含まれたキチンであっても加水分解することができる。なお、キチンと同様に、キトサンにおいてもα，βの両構造が存在するものと考えられるが、何れの構造のキトサンであっても、キチン構造を有するであれば、加水分解することができる。

本発明では、キチン分解酵素として、キチナーゼを主体としたものが用いられる。かかるキチナーゼは、酵素反応において酵素として機能し、キチンを加水分解して低分子化されたキチン多糖（低分子化キチン多糖）、キチン多糖に由来するキチンオリゴ糖、単糖（Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン）等といった生産物が得られるものを意味している。

上述のキチナーゼの由来は特に限定されないが、例えば微生物由来、植物由来、昆虫由来等であってもよく、これらの中では微生物由来のキチナーゼが好ましい。キチナーゼを生産する微生物としては特に限定されないが、例えば、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、アルテロモナス（Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属等の細菌；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等の真菌類が挙げられる。

また、キチナーゼを生産する植物としては特に限定されないが、例えば、パラゴムノキ（Ｐａｒａ ｒｕｂｂｅｒ ｔｒｅｅ，Ｈｅｖｅａ ｂｒｉｓｉｌｉｅｎｎｓｉｓ）、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）、たばこ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）等が挙げられる。

また、キチナーゼを生産する昆虫としては特に限定されないが、例えば、蚕（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ）等が挙げられる。

これらの中では、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）にそれぞれ由来するキチナーゼが好ましい。

なお、これらのキチナーゼは、人工的に改変（例えば後述する実施例のクローン化）されていてもよい。また、これらのキチナーゼは、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。また、キチナーゼは、一連の酵素群であってもよい。かかる酵素群としては、キチナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１４）等が挙げられる。また、キチナーゼは、異なる由来のキチナーゼを混合して用いてもよい。

また、キチナーゼには複数の立体構造が存在することが知られているが、キチン分解酵素として用いる際には立体構造は特に限定されず、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよい。そのような立体構造を有するキチナーゼとしては、例えばセラチア・マルセッセンス由来のキチナーゼＡやキチナーゼＢ、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＷＬ－１２由来のキチナーゼＡ１、病原性糸状菌のコクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）由来のキチナーゼ、パラゴムノキ由来のヘバミン、超高熱菌のパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来のキチナーゼ、放線菌のストレプトマイセス・グリセウス由来のキチナーゼＣ等が挙げられる。

これらの中では、キチナーゼＡが好ましく、特に少なくともキチナーゼＡを含有しているものが好ましい。なお、微生物由来や植物由来のキチナーゼは、複数の構造が混合した状態にある。この場合、例えばサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）等の分離方法を用いてキチナーゼを精製することができる。精製されたキチナーゼを構造毎に分離するためには、例えばサイズ排除クロマトグラフィーのサンプリングのタイミングを、キチナーゼの分子量に応じて変更することで実現することができる。

キチナーゼの多くは、ｐＨ３以上、ｐＨ８以下の範囲で至適な酵素活性を有するものが一般的であるが、ｐＨ８～ｐＨ１０以上の範囲で至適な酵素活性を有するアルカリキチナーゼと呼ばれるものであってもよい。また、キチナーゼの多くは、反応温度が２５℃以上、５０℃以下の範囲で至適な酵素活性を有するものが多いが、７０℃以上、１００℃以下の範囲で至適な酵素活性を有する耐熱性キチナーゼと呼ばれるものであってもよい。

本発明では、シリカ又はシリカ含有物質として、シリカ、珪藻土、珪砂、石英、ガラス等を用いることができる。シリカ含有物質のうち、珪藻土及び珪砂は、シリカが主成分の天然物である。シリカは少なくとも二酸化ケイ素を含有する化合物の総称であり、表面の一部にシラノール基が存在しているのが一般的である。このシリカは、粒子形状が球状でも非球状でもよく、粒子構造が中実構造でも多孔質構造でもよく、結晶性が非晶質でも結晶質でもよく、粉末状、懸濁液、分散液等の何れの状態で使用してもよい。シリカ表面の一部がシラノール基以外の別の官能基で修飾されていてもよい。また、シランカップリング剤やシリコンアルコキシド、又はケイ酸イオン等でシリカ以外の化合物の表面に反応させてシリカの層が存在する形でもよい。その中でも特にコロイダルシリカ、珪藻土及び珪砂の適用が好ましい。

コロイダルシリカは、平均一次粒子径が１ｎｍ以上、４００ｎｍ以下、好ましくは、５ｎｍ以上、３５０ｎｍ以下であり、後述するキチン分解反応液中に存在させて用いられる。平均一次粒子径は、窒素吸着法（ＢＥＴ法）により測定される比表面積Ｓ（ｍ^２／ｇ）から換算式（Ｄ（ｎｍ）＝２７２０／Ｓ）により算出されたものである。なお、コロイダルシリカは、水、メタノール、エタノール、アセトン、メチルエチルケトン、エチレングリコール等の分散媒に分散させた分散液として用いられ、分散液は、コロイド液、ゾル等と呼ばれる。本発明では、酵素の活性を阻害しない範囲で分散媒を選択してよいが、水、エタノール等の分散媒の適用が好ましい。

コロイダルシリカの製造方法として、水ガラスを原料とする水ガラス法、金属アルコキシドを原料とするアルコキシド法、塩化ケイ素化合物を原料とする気相法等がある。どの製造法で得られたコロイダルシリカを用いてもよいが、水ガラス法により得られたコロイダルシリカの適用が好ましい。

本発明において、窒素含有複素環式化合物は、窒素を含む複素環式化合物である。このような窒素含有複素環式化合物としては、アジリジン－２－カルボン酸メチル、１－（２－ヒドロキシエチル）エチレンイミン等の三員複素環式化合物（窒素含有三員複素環式化合物）；ピロリジン、１Ｈ－ピロール、２Ｈ－ピロール、３Ｈ－ピロール、イミダゾール、Ｌ－ヒスチジン、２－メチルイミダゾール、２－エチルイミダゾール、ベンゾイミダゾール、ピラゾール、３，５－ジメチルピラゾール、１Ｈ－１，２，３－トリアゾール、１，２，４－トリアゾール、１Ｈ－テトラゾール等の五員複素環式化合物（窒素含有五員複素環式化合物）；ピペリジン、２－メチルピペリジン、４－メチルピペリジン、４－ヒドロキシ－１－メチルピペリジン、ピリジン、２－アミノピリジン、２－アミノ－６－メチルピリジン等の六員複素環式化合物（窒素含有六員複素環式化合物）；ε－カプロラクタム、ε－チオカプロラクタム、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン等の七員複素環式化合物（窒素含有七員複素環式化合物）が挙げられる。

これらの中では、安価で入手し易いことから、ピロリジン、イミダゾール、Ｌ－ヒスチジン、２－メチルイミダゾール、ピラゾール、３，５－ジメチルピラゾール、１，２，４－トリアゾール、２－メチルピペリジン、４－メチルピペリジン、２－アミノピリジン、２－アミノ－６－メチルピリジン、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセンが好ましく、特にイミダゾール、２－メチルイミダゾールが好ましい。

（キチン分解反応液及び糖の製造方法）
本発明において、キチンを加水分解する際にはキチン分解反応液を調製して用いる。本発明のキチン分解反応液は、原料であるキチンと、本発明のキチン分解酵素組成物とを含有するものである。詳細は後述するが、糖化反応効率の向上効果を享受する観点から、本発明のキチン分解反応液においては、シリカ又はシリカ含有物質及び窒素含有複素環式化合物を併用する。

一般に、酵素反応においては、基質濃度が高くなると反応速度が飽和する現象がみられ、この反応速度は飽和最大速度へ至る双曲線を描く。これは、酵素分子が基質に比べて巨大な場合が多く活性中心の範囲が狭いため、金属触媒等に比べて、基質と触媒（酵素）とが衝突しても（活性中心に適合し）反応を起こす頻度が小さいことが原因と考えられるためである。そして、基質濃度が高まると、少ない酵素の活性中心を基質が取り合うようになるので飽和現象が生じる。

従って、本発明のキチン分解反応液では、キチン分解酵素の濃度をキチンの含有量に応じて適宜決定すればよい。ただし、キチン分解反応液中のキチン分解酵素の濃度が低すぎると、キチン分解酵素の糖化反応効率が低下して好ましくない。一方、キチン分解酵素の濃度が高すぎると、飽和現象が生じるだけでなく、キチン分解酵素がキチン分解反応液に溶解し難くなり、経済的に不適である。

また、本発明のキチン分解反応液において、シリカ又はシリカ含有物質中のシリカの濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ以上、４００ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは、０．５ｍｇ／ｍＬ以上、１００ｍｇ／ｍＬ以下である。シリカ又はシリカ含有物質中のシリカの濃度が０．１ｍｇ／ｍＬより低いと、キチン分解酵素の糖化反応効率が低下して好ましくない。一方、これらのシリカの濃度が４００ｍｇ／ｍＬより高いと、キチン分解反応液の分散性が悪化するだけでなく、経済的に不適である。

また、キチン分解反応液において、キチン分解酵素とシリカ又はシリカ含有物質中のシリカとの質量比率（キチン分解酵素／シリカ）は、０．０００２以上、３００以下、好ましくは、０．００２以上、３０以下である。両者の質量比率が上記範囲を外れると、キチン分解酵素の糖化反応効率の向上が顕著ではなくなる。

また、キチン分解反応液において、窒素含有複素環式化合物の濃度は、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上、１００ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上、５０ｍｇ／ｍＬ以下である。更に好ましくは０．６８ｍｇ／ｍＬ以上、３４ｍｇ／ｍＬ以下である。最も好ましくは６．８ｍｇ／ｍＬ以上、３４ｍｇ／ｍＬ以下である。窒素含有複素環式化合物の濃度が０．００５ｍｇ／ｍＬより低いとキチン分解酵素の糖化反応効率が低下して好ましくなく、一方、１００ｍｇ／ｍＬより高いとキチン分解反応液の分散性が悪化するだけでなく、経済的に不適である。

また、キチン分解反応液において、シリカ又はシリカ含有物質中のシリカと窒素含有複素環式化合物との質量比率（窒素含有複素環式化合物／シリカ）は、０．０００１以上、１００以下、好ましくは、０．００１以上、１０以下である。両者の質量比率が上記範囲を外れると、キチン分解酵素の糖化反応効率の向上が顕著ではなくなる。

また、キチン分解反応液のｐＨは、４以上、８以下、好ましくは、５以上、７以下である。ｐＨが４より低いとシリカ又はシリカ含有物質の凝集が生じてキチン分解酵素の糖化反応効率が低下し、一方、ｐＨが８より高いとシリカ又はシリカ含有物質がキチン分解反応液に溶解しやすくなるため好ましくない。なお、キチン分解反応液にアルカリキチナーゼを用いる場合には、シリカ又はシリカ含有物質のキチン分解反応液に対する溶解性を調製する。これにより、ｐＨが８より高いキチン分解反応液として用いることができる。

キチン分解反応液のｐＨ調整剤として、硫酸、塩酸、硝酸等の鉱酸；酢酸、シュウ酸等のカルボン酸；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸等のヒドロキシ酸；リン酸；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物塩；アンモニア、尿素等の窒素含有化合物等が挙げられる。本発明の効果を阻害しない範囲であれば、特にその種類や濃度に使用制限はない。また、これらのｐＨ調整剤は、１種類を単独で用いても、２種類以上を混合して用いてもよく、或いは、緩衝作用を有する緩衝液の状態で使用してもよい。

また、キチン分解反応液の反応温度は、キチン分解酵素の至適温度に合わせて反応温度を設定することが好ましく、例えば１０℃以上、５０℃以下、特に２５℃以上、４０℃以下とするのが好ましい。一般的に、反応温度が１０℃より低いとキチン分解酵素の糖化反応効率が著しく低下し、５０℃より高いとキチン分解酵素が失活する虞があるため好ましくない。ただし、耐熱性キチナーゼを用いる場合には、７０℃以上、１００℃以下であっても失活しない。

なお、キチン系バイオマス由来の原料の前処理は、公知の処理方法を適用することにより行えばよい。例えば、カッターミル等による物理的な粉砕を行った後に、酸処理及び／又はアルカリ処理を行うことによってタンパク質や炭酸カルシウムを除去し、これをキチンの原料とすればよい。

また、キチン分解反応液の調製手順は特に制限されないが、キチン分解酵素を分散させた分散液に、シリカ又はシリカ含有物質及び窒素含有複素環式化合物を添加してキチン分解反応液としてもよい。或いは、シリカ又はシリカ含有物質及び窒素含有複素環式化合物を分散させた分散液に、キチン分解酵素を添加してキチン分解反応液としてもよい。これらの調整手順において、キチン分解酵素の糖化反応効率が低下しなければ添加順序は問わない。例えば、シリカ又はシリカ含有物質及び窒素含有複素環式化合物を同時に添加してもよいし、別々に添加してもよい。その際、窒素含有複素環式化合物を粉末状態で添加してもよいし、溶液状態で添加してもよい。なお、ｐＨ調整剤等のその他の添加剤は、本発明の効果を阻害しない範囲であれば任意の順序で添加すればよい。

以上で説明した通り、本発明のキチン分解酵素組成物を用いてキチン分解反応液を調整する際に、メカニズムは明らかでないが、シリカ又はシリカ含有物質及び窒素含有複素環式化合物を併用させることで、キチンの加水分解をより促進させてキチン分解酵素による糖化反応効率を向上させることができる。また、キチン分解酵素の糖化反応効率が向上することで、生産物である糖の収率を向上させて高収率化を実現することができる。また、このキチン分解反応液は、シリカ又はシリカ含有物質及び窒素含有複素環式化合物の併用により、キチン分解酵素の使用量を減少させることができるので、簡便な反応系でありコスト性にも優れている。

本発明のキチン分解酵素組成物を用いて調製したキチン分解反応液を使用してキチンを加水分解することにより、糖を製造することができる。糖を製造する際には、撹拌下で、キチン分解反応液を使用してキチンを加水分解してもよい。具体的な糖の製造方法は、後述の実施例において説明する。

以下、実施例に基づいて更に詳述するが、本発明はこの実施例により何ら限定されるものではない。

（１．実施例１）
（１－１．キチナーゼＡの調製）
キチン分解酵素として用いたキチナーゼＡは、以下の手順に従って調製した。
セラチア・マルセッセンスからクローン化されたキチナーゼＡ（以下「ＳｍＣｈｉＡ」とする）（Ｔ． Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， Ｖｏｌ．１７９， Ｎｏ．２２， １９９７， ｐ．７１１１－ｐ．７１１７参照）を、Ｔ７プロモーターを利用したタンパク大量発現系構築用プラスミドベクターｐＥＴ２７ｂ（ノバジェン社製）へクローン化した。クローン化の際に、ＳｍＣｈｉＡのカルボキシル末端側に６回反復ヒスチジンタグが付随するように構築した。

ＳｍＣｈｉＡのエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｅ． ｃｏｌｉ）を宿主とした大量発現を、以下の手順により行った。

上記プラスミドベクターを保持するＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えたＬＢ培地で、３７℃で一晩振とう培養して培養液を得た。翌日、この培養液を種菌として、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを加えたオーバーナイトエクスプレス（ＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標））ＬＢ培地（ノバジェン社製）へ植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。翌日、遠心分離器を用いて集菌して菌のペレットを作製し、このペレットをベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））（ノバジェン社製）を加えたバグバスター（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（登録商標））（ノバジェン社製）へ懸濁して懸濁液を得た。次いで、この懸濁液を室温で３０分間放置後、再び遠心し、その上清画分を回収した。

次に、上記上清画分からＳｍＣｈｉＡを精製・回収するため、当該上清画分を５×５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）へ添加した。その後、洗浄用緩衝液で上記ＨＰカラムを洗浄した。なお、洗浄用緩衝液は、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）、０．５Ｍの塩化ナトリウム、及び２５ｍＭのイミダゾールを混合して作製した。

次に、濃度が２５ｍＭから２５０ｍＭ（終濃度）になるように濃度勾配を付けながら、イミダゾールをカラムへ添加していき、ＳｍＣｈｉＡを溶出させて、ＳｍＣｈｉＡ溶出画分を回収した。このＳｍＣｈｉＡ溶出画分を、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標））２０を用いて遠心透析し、上記洗浄用緩衝液を５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）へと置換し、精製酵素（ＳｍＣｈｉＡ）を得た。得られた精製酵素の定量は、２８０ｎｍの吸光度を測定することにより行った。なお、ＳｍＣｈｉＡのモル吸光係数は、予測アミノ酸配列から「Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｊ． Ｍ． Ｗａｌｋｅｒ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， ２００５， ｐ．５７１－ｐ．６０７参照）を用いて算出した。

（１－２．キチン分解酵素組成物のキチナーゼ活性の測定）
上記（１－１．）で精製して得られた精製酵素であるＳｍＣｈｉＡに加えて、シリカ又はシリカ含有物質としてシリカ、及び窒素含有複素環式化合物としてイミダゾールを用いてキチン分解酵素組成物を調製し、酵素活性（キチナーゼ活性）を測定した。かかる反応系のキチナーゼ活性の測定は、以下の手順により行った。なお、調製したキチン分解酵素組成物の組成については、下記表１に示した。

まず、ガラスバイアルに回転子を一つ入れ、そこに、終濃度１２．５ｍｇ／ｍＬの結晶性キチン（純正化学株式会社製）、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）、０．１２５ｍｇ／ｍＬのＳｍＣｈｉＡ、終濃度１００ｍＭのイミダゾール、及び終濃度５０ｍｇ／ｍＬのシリカゾル（日産化学工業株式会社製、品名：ＳＴ－ＯＬ、酸性ゾル）をそれぞれ加えてキチン分解反応液を得た。このキチン分解反応液を加えたガラスバイアルを、バイアルスターラー（Ｖａｉａｌ Ｓｔｉｒｒｅｒ）ＨＳ－１０ＶＡ（アズワン株式会社製）に並べ、２５℃、２２時間、及び最大出力の条件で撹拌した。反応終了後は、直ちにキチナーゼ活性を以下の手順で測定した。

キチナーゼ活性の測定は、ＰＨＢＡＨ（ｐ－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）法（Ｍ． Ｌｅｖｅｒ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．４７， Ｎｏ．１， １９７２， ｐ．２７３－ｐ．２７９参照）を用いて、生産物であるキチンオリゴ糖及びＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの還元糖量を求めることで行った。具体的には、上記キチン分解反応液を遠心分離（４℃、最大遠心加速度１５７８０×ｇ、５分）にかけ、その上清を回収した。次に、回収した上清に、当該上清の２倍量のＰＨＢＡＨ溶液と、上記上清と等量の２Ｍの水酸化ナトリウムを加え、よく懸濁して懸濁液を得た。なお、ＰＨＢＡＨ溶液は、０．１ＭのＰＨＢＡＨ、０．２Ｍの酒石酸カリウムナトリウム、及び０．５Ｍの水酸化ナトリウムを混合して得られたものである。

得られた懸濁液を９８℃で１０分間反応させた後、１０分で２℃に急冷した。その後、波長４０５ｎｍのＯＤ値（ＯＤ：Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ；光学濃度、光学密度）を測定し、このＯＤ値を用いてブランクとの吸光度の差を求めた。また、検量線はＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを用いて作成し、上記上清における吸光度の上昇量から還元糖量を求め、下記表１に示した。なお、下記表１に示した還元糖量は、ｎ＝３における還元糖量の範囲とした。

（２．実施例２～４）
実施例２～４では、シリカ又はシリカ含有物質として、シリカゾル（日産化学工業株式会社製、品名：ＳＴ－ＯＺＬ－３５、酸性ゾル）、シリカゾル（日産化学工業株式会社製、品名：ＭＰ－４５４０Ｍ、Ｎａ安定型アルカリ性ゾル）、及びフュームドシリカ（エボニック社製、品名：ＡＥＲＯＳＩＬ（登録商標）ＯＸ５０、親水性フュームドシリカ）をそれぞれ適用したこと以外は実施例１と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、これらのキチナーゼ活性を測定した。各シリカの終濃度は、実施例１と同様にして５０ｍｇ／ｍＬとした。なお、各キチン分解酵素組成物の組成や求めた各還元糖量については、実施例１と同様にして下記表１に示した。また、下記表１に示した各還元糖量は、ｎ＝３における還元糖量の範囲とした。

（３．実施例５）
実施例５では、終濃度１００ｍＭの塩化ナトリウムを更に加えたこと以外は実施例２と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、これらのキチナーゼ活性を測定した。なお、キチン分解酵素組成物の組成や求めた還元糖量については、実施例１と同様にして下記表１に示した。また、下記表１に示した還元糖量は、ｎ＝３における還元糖量の範囲とした。

（４．実施例６）
実施例６では、イミダゾールの終濃度を５００ｍＭに変更した以外は実施例２と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、これらのキチナーゼ活性を測定した。なお、キチン分解酵素組成物の組成や求めた還元糖量については、実施例１と同様にして下記表１に示した。また、下記表１に示した還元糖量は、ｎ＝３における還元糖量の範囲とした。

（５．実施例７）
実施例７では、窒素含有複素環式化合物であるイミダゾールを２－メチルイミダゾールに変更した以外は実施例２と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、これらのキチナーゼ活性を測定した。なお、キチン分解酵素組成物の組成や求めた還元糖量については、実施例１と同様にして下記表１に示した。また、下記表１に示した還元糖量は、ｎ＝３における還元糖量の範囲とした。

（６．比較例１～１０）
比較例１では、シリカ、イミダゾール及び塩化ナトリウムを添加しなかったこと以外は実施例５と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、このキチナーゼ活性を測定した。

比較例２では、シリカ及び塩化ナトリウムを添加しなかったこと以外は実施例５と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、このキチナーゼ活性を測定した。

比較例３では、シリカを添加しなかったこと以外は実施例５と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、このキチナーゼ活性を測定した。

比較例４では、シリカ及びイミダゾールを添加しなかったこと以外は実施例５と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、このキチナーゼ活性を測定した。

比較例５～８では、それぞれイミダゾールを添加しなかったこと以外は実施例１～４と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、このキチナーゼ活性を測定した。

比較例９では、イミダゾールを添加しなかったこと以外は実施例５と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、このキチナーゼ活性を測定した。

比較例１０では、反応時に、回転子を用いた撹拌を行わずにそのまま２５℃で２２時間静置したこと以外は比較例３と同様にして、キチン分解酵素組成物を調製し、このキチナーゼ活性を測定した。

なお、比較例１～１０では、各キチン分解酵素組成物の組成や求めた各還元糖量については、実施例１と同様にして下記表１に示した。また、下記表１に示した各還元糖量は、ｎ＝３における還元糖量の範囲とした。

（７．キチナーゼ活性の評価）
（７－１．イミダゾール又は塩化ナトリウムの添加によるキチナーゼ活性の向上効果）
比較例１と比較例２～４のキチナーゼ活性を比較し、イミダゾール又は塩化ナトリウムの添加によるキチナーゼ活性の向上効果について検討した。

比較例１と比較例２～４の還元糖量をみると、比較例１に対して比較例２～４は、何れも還元糖量が微増していた。これは、比較例２～４ではキチンの加水分解反応が円滑に行われて糖化反応効率がやや向上したことを示しており、イミダゾール又は塩化ナトリウムの添加によりキチナーゼ活性がやや向上したことが明らかとなった。

（７－２．シリカの添加によるキチナーゼ活性の向上効果）
比較例１と比較例５～８のキチナーゼ活性を比較し、シリカの添加によるキチナーゼ活性の向上効果について検討した。

比較例１と比較例５～８の還元糖量をみると、比較例１に対して比較例５～８は、シリカの形態に応じて程度の差は見られるものの、何れも還元糖量が減少していた。これは、比較例５～８ではキチンの加水分解反応が円滑に行われなかったことを示しており、シリカの添加によりキチナーゼ活性が阻害されたことが明らかとなった。従って、ここでは比較例１に対する比較例５～８のキチナーゼ活性が阻害されたと評価し、キチナーゼ活性向上効果を「阻害」として下記表１に示した。

シリカがキチナーゼ活性の阻害要因となる理由として、非特許文献１の図５（ＳＮＰＣ１）の結果と整合していることから、キチナーゼとシリカが共存した状態では、シリカ表面にキチナーゼが物理吸着して固定化されてキチナーゼ活性が阻害されると考えられる。

（７－３．シリカ及びイミダゾールの併用によるキチナーゼ活性の向上効果）
上記（７－１．）及び上記（７－２．）の結果を踏まえて、実施例１～４、実施例６と比較例２、比較例５～８のキチナーゼ活性を比較し、シリカ及びイミダゾールの併用によるキチナーゼ活性の向上効果について検討した。

実施例１～４と比較例５～８の還元糖量をみると、比較例５～８に対して実施例１～４は、シリカの形態に応じて程度の差は見られるものの、何れも還元糖量が増加していた。更に、実施例１～４，６と比較例２の還元糖量をみると、比較例２に対して実施例１～４，６は、何れも還元糖量が増加していた。理由は明らかでないが、これは、実施例１～４，６ではキチンの加水分解反応が円滑に行われて糖化反応効率が向上したことを示しており、シリカ及びイミダゾールの併用によりキチナーゼ活性が向上したことが明らかとなった。従って、ここでは比較例５～８に対する実施例１～４，６のキチナーゼ活性が向上したと評価し、キチナーゼ活性向上効果を「有」として下記表１に示した。

（７－４．シリカと塩化ナトリウムの併用によるキチナーゼ活性の向上効果）
上記（７－１．）～上記（７－３．）の結果を踏まえて、実施例２，５と比較例３，９のキチナーゼ活性を比較し、シリカ及び塩化ナトリウムの併用によるキチナーゼ活性の向上効果について検討した。

実施例２，５の還元糖量をみると、両者の還元糖量は殆ど変化していなかった。次に、実施例５と比較例３の還元糖量をみると、比較例３に対して実施例５の還元糖量が増加していた。次に、実施例５と比較例９の還元糖量をみると、比較例９に対して実施例５の還元糖量が増加していた。これらのことから、実施例５でキチナーゼ活性が向上した要因はシリカとイミダゾールの併用にあり、シリカと塩化ナトリウムの併用ではないことが明らかとなった。従って、ここでは比較例９に対する実施例５のキチナーゼ活性が向上したと評価し、キチナーゼ活性向上効果を「有」として下記表１に示した。

（７－５．シリカ及び２－メチルイミダゾールの併用によるキチナーゼ活性の向上効果）
上記（７－１．）～上記（７－４．）の結果を踏まえて、実施例７と比較例２，６のキチナーゼ活性を比較し、シリカ及び２－メチルイミダゾールの併用によるキチナーゼ活性の向上効果について検討した。

実施例２，７と比較例２，６の還元糖量をみると、比較例２，６に対して実施例２，７は、何れも還元糖量が増加していた。このことは、イミダゾールを用いた実施例２と同様に、２－メチルイミダゾールを用いた実施例７でも、キチンの加水分解反応が円滑に行われて糖化反応効率が向上したことを示しており、シリカ及び２－メチルイミダゾールの併用によりキチナーゼ活性が向上したことが明らかとなった。従って、ここでは比較例６に対する実施例７のキチナーゼ活性が向上したと評価し、キチナーゼ活性向上効果を「有」として下記表１に示した。なお、この結果から、イミダゾールや２－メチルイミダゾール以外の窒素含有複素環式化合物についても、シリカとの併用によりキチナーゼ活性が向上する可能性が示唆された。

（７－６．撹拌の有無によるキチナーゼ活性の向上効果）
上記（７－１．）～上記（７－５．）の結果を踏まえて、比較例３と比較例１０のキチナーゼ活性を比較し、撹拌の有無によるキチナーゼ活性の向上効果について検討した。

比較例３と比較例１０の還元糖量をみると、比較例３に対して比較例１０の還元糖量が減少し、キチナーゼ活性が低下していた。撹拌の有無で酵素活性が変化することは、一般的な酵素反応系で起こり得る現象である。ここでは、比較例３に対する比較例１０のキチナーゼ活性が阻害されたと評価し、キチナーゼ活性向上効果を「阻害」として下記表１に示した。

なお、上記表１における窒素含有複素環式化合物の種類Ａ、Ｂは、以下に示した通りである。
Ａ：イミダゾール（分子量６８．０８）
Ｂ：２－メチルイミダゾール（分子量８２．１１）

以上の各実施例及び各比較例により、キチン分解酵素組成物を用いてキチン分解反応液を調整する際に、シリカと、イミダゾール又は２－メチルイミダゾールとを併用させることで、キチナーゼＡによる糖化反応効率を向上させ、生産物である糖の収率を向上させて高収率化を実現できることが明らかとなった。

本発明は、カニやエビ等の甲殻類、昆虫、菌類等に含まれるキチンを含むキチン系バイオマスから、低分子化キチン多糖、キチン多糖に由来するキチンオリゴ糖、単糖等といった糖に分解する技術が適用される産業分野、例えば、医用材料、医薬、化粧品、繊維、農業、水処理、食品等で利用することができる。

Claims (5)

1. キチンを加水分解するキチン分解酵素であるキチナーゼと、シリカ又はシリカ含有物質と、窒素を含む複素環式化合物である窒素含有複素環式化合物と、を含有し、前記窒素含有複素環式化合物は、窒素含有五員複素環式化合物であるイミダゾール及び２－メチルイミダゾールから選択される何れか１つであることを特徴とするキチン分解酵素組成物。
2. 前記キチナーゼは、少なくともキチナーゼＡを含有することを特徴とする請求項１に記載のキチン分解酵素組成物。
3. キチンと、請求項１又は２に記載のキチン分解酵素組成物と、を含有することを特徴とするキチン分解反応液。
4. 請求項３に記載のキチン分解反応液を用いてキチンを加水分解することにより糖を製造することを特徴とする糖の製造方法。
5. 撹拌下にて前記キチン分解反応液を用いてキチンを加水分解することにより糖を製造することを特徴とする請求項４に記載の糖の製造方法。