JPS5911190A

JPS5911190A - 新規なオリゴ糖、その製造法及びオリゴ糖を活性成分とするビフイドバクテリウム菌の増殖促進剤

Info

Publication number: JPS5911190A
Application number: JP57118050A
Authority: JP
Inventors: Sakanori Ideie; 栄記出家; Mieko Amaya; 天谷　三枝子; Kaoru Nojiri; 野尻　かおる; Seiichiro Igarashi; 五十嵐　清一郎
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1982-07-07
Filing date: 1982-07-07
Publication date: 1984-01-20
Also published as: JPS6146479B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規なオリゴ糖、その製造法及び該オリゴ糖
を活性成分とするビフィドバクテリウム菌の増殖促進剤
に関する。

ビフイド／々クテリウム菌（以下ビフィズス菌と称する
）は、大腸内に生育する有用細菌であって、その生理的
活性として腸内の腐敗抑制作用、ビタミンＢ１及び亀の
合成能及びタン／Ｑり質代謝作用等が知られている。し
たがって、生体内におけるビフィズス菌の増殖を促進す
る物質の提供が強く要望されている。

従来、ビフィズス菌の増殖を促進する物質（以下ビフィ
ズス増殖因子と称する）について多くの研究がなされて
おり、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコザミン、人参エキス、
ラクチュロース等がビフィズス増殖因子として知られて
いる。

しかしながら、これらのビフィズス増殖因子の効果につ
いてはその多くはｉｎ　ｖｉｔｒｏで確認されたもので
あって、１ｎｖｉｖｏでの効果については未確認かもし
くは極めて不十分である。

本発明者は上述したような現状に鑑み、生体内で優れた
活性を示すビフィズス増殖促進物質について検討した結
果、新規なオリサ糖が上記活性を示すことの知見を得て
本発明をなすに至った。

したがって、本発明は、生体内で活性を示すビフィズス
増殖因子としてのオリゴ糖、その製造法及び該オリゴ糖
を活性成分として含有するビフィズス増殖促進剤を提供
することを目的とする。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明におけるビフィズス増殖因子としてのオリゴ糖は
、一般式％式％（１）（式中ＧＪｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
を表わし、ＧａＪはガラクトースを表わし、Ｇｉａはグ
ルコースを表わす。ｎはＯ又は１〜３の整数を表わす）
で示される新規物質であって、各式（ＩＩ〜Ｖ）で示さ
れるオリゴ糖を包含する。

式で示される（上記一般式（１）でｎ　＝　Ｏのもの）β
−Ｄ−ガラクトげラフ／ルー（１→４）（２−アセトア
ミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→２）〕−〕Ｄ−グルコース式で示される（上記一般式（Ｉ）でｎ＝１のもの）β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−（１→４）−［：２−アセトア
ミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グ
ルコピラノシル−（１→２））−Ｄ−グルコース。

で示される（上記一般式（Ｉ）でｎ＝２のもの）β−Ｄ
−ガ２クトぎラノシルー（１→４）−［：２−アセトア
ミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１
→４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−ゲ
ルコピ２ノシルー（１→４）−２−アセトアミド−２−
デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２　）　
：］　−Ｄ　Ｉ”ルコース。

式で示される（上記一般式（Ｉ）でｎ＝３のもの）β−Ｄ
−ガ２クトピラノシルー（１→４）−［：２−アセトア
ミｙ−２−７”オキシ−β−Ｄ−グルコピラノシル−（
１−４）−２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−
グルコピラノシル−（１→４）−２−アセトアミド−２
−デオキシ−β−Ｄ−グルコぎラノシル−（１→４）−
２−アセトアミド−２−デオキシ−β−Ｄ−グクコピラ
ノシル−（１→初−Ｄ−グルコース。

これらのオリゴ糖の理化学的性質を示すと次のとおシで
ある。

理化学的性質：１）溶剤に対する溶解性式（Ｉｔ）〜（Ｖ）の各オリゴ糖とも水に可溶性でおる
カ、アセトン、クロロホルム及びベンゼンに不溶であり
、含水アルコールには難溶性である。

２）呈色反応式（ＩＩ）〜（Ｖ）の各オリゴ糖ともアニリン・ジフェ
ニルアミン反応及びアンモニア・硝酸銀反応では陽性を
示し、ニンヒドリン反応及び塩化２．３．５−　）　Ｉ
Ｊフェニルテトラゾリウム−苛性ソーダ反応では陰性を
示す。

３）色　調上記各オリゴ糖は乾燥粉末の形態でいずれも白色を呈す
る。

４）酸性、塩基性、中性の別上記各オリゴ糖はいずれも中性である。

本発明に係るオリゴ糖は、キチンと乳糖又は乳糖含有物
との混合物もしくはキチンの部分加水分解物と乳糖又は
乳糖含有物との混合物に、キチン及びキチンの部分加水
分解物に対して加水分解能を有する酵素を作用させるこ
とにより調製し得る。

ここで出発物質として用いるキチンは動物界に広く存在
する多糖類の一種であって、Ｎ−アセテルーＤ−グルコ
サミンがβ−１，４で結合した直鎖分子から成る。本発
明では市販のキチンを濃塩酸に溶解した後、これに大量
の水を加えて沈殿させて得られるコロイダルキチンを用
いることが好ましい。

又、本発明では、キチンのほかに、キチンの部分加水分
解物も出発原料として使用し得る。このキチンの部分加
水分解物は、濃塩酸に溶解したキチンを、４０℃で２〜
３時間加水分解後、アルカリで中和し、生成した分解物
を活性炭に吸着させた後、アルコールで溶出することに
よ）調製し得る。このようにして調製したキチンの部分
加水分解物は、２〜１０分子のＮ−アセチル−Ｄ−グル
コサミンが結合したオリゴ糖を含む。

本発明で一方の出発原料として用いる乳糖はガラクトー
スとグルコースがβ−１，４で結合した２糖類であって
、市販品をそのまま用いることができ、更に全乳、脱脂
乳のような乳糖を一成分として含有する物質も上記出発
原料として使用し得る。

本発明で上記両方の出発原料の混合物の加水分解に用い
る酵素は、キチン又はキチンの部分加水分解物に対して
加水分解能（活性）を有するものであればよく、その種
類及び起源は問わない。このような酵素としては、卵白
から調製したリゾチーム、微生物から調製したキチナー
ゼやβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ等を例示し得
るが、このほかに各種の細胞壁溶解酵素も使用し得る。

本発明で上記出発原料としての混合物に上記酵素を作用
させるには、キチンを２〜１０重量％と乳糖１０〜５０
重量％を含むもの、或はキチンの部分加水分解物１０〜
５０重量％と乳糖１０〜５０重量％を含むものをそれぞ
れ基質とし、基質のｐｌｌを３〜７に調整し、これに酵
素を５〜２０〜７ｍｌの濃度で作用させるとよい。酵素
を作用させる反応温度は２０〜５０℃が適当であり、又
反応時間は、反応混合物中のオリゴ糖の収量に大きく影
響するので、実験に基いてコントロールすることが望ま
しい。上記酵素反応を所望時間行った後は、得られる反
応混合物を９０’Ｃ以上の温度で２〜３０秒間加熱して
反応を停止させる。

（以下余白）上記酵素反応によりキチン又はその部分加水分解物から
遊離した〔β−Ｄ　−ＧｈＮＡＣ）　ｎ　（ただし、Ｇ
ｌｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを、ｎは
１〜４の整数を表わす）の一部が乳糖に転移して前記一
般式（Ｉ）のオリ！糖が生成する。

因みに、キチンの酵素による糖転移反応によって得られ
るオリゴ糖についての報告は未だ見当らない。

このようにして得られる反応混合物は、そのまま濃縮後
乾燥して粉末化することによりビフィズス増殖因子とし
て適用し得るが、活性成分であるオリゴ糖の濃度を高め
るために、上記反応混合物を粉末化に先立って精製して
もよい。

この精製には種々の方法が適用でき、例えば反応混合物
を、水で平衡化処理した活性炭のカラムに通して該反応
混合物中のオリ！糖を活性炭に吸着させ、次いでアルコ
ール水溶液で吸着オリゴ糖を溶出させるとよい。

上述のようにして得られるオリゴ糖の分析例を示すと添
付の第１図のとおシである。第１図は標準的な東件下で
の製造法を例示した後記実施例１によυ得られた反応混
合物についての薄層クロマトグラムを示したものであっ
て、同図にみられるように４種類（式（ＴＩ）〜式（Ｖ
）のオリゴ糖）の転移オリゴ糖が確認される。

この各オリゴ糖を高速クロマトグラフィにより分離、精
製後マススペクトルにより分子量測定と、塩酸加水分解
により構成糖測定を行った結果を表１に示す。

表１表１にみられるごとく、上記反応混合物には、乳糖に１
分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが結合した３清
類（弐σＤのオリゴ糖）、乳糖に２分子のＮ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンが結合した４糖類（式（１１Ｄのオ
リゴ糖）、乳糖に３分子のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンが結合した５糖類（式（ｆｆ）のオリゴ糖）及び乳
糖に４分子のＮ−アセチルーＤ−グルコサミンが結合し
た６糖類（式（Ｖ）のオリゴ糖）の存在が確認される。

因み罠、本発明の製造法によシ得られる上記反応混合物
中のオリゴ糖の種類及び生成量は、使用する出発物質及
び製造条件によって変動するが、前記式（ＩＩ）〜（Ｖ
）で示されるオリヒ糖の少くとも１種が生成する。

これらのオリゴ糖は前記一般式（Ｉ）で示され、その各
構成糖の結合様式については、式（ＩＩ）のオリゴ糖を
メチル化分析することによって２，３゜４．６−チトラ
ーＯ−メチルーＤ−ガラクチトールと３　、６−：、’
−０−メチルーＤ−グルシトールという２種のアルジト
ールアセテートが検出されたことから解析した。Ｇｌｃ
　ＮＡｃと乳糖の結合位置については、３，６−ジ−メ
チル−Ｄ−グルシトールのアセチル化部分がそれを示し
ている。すなわち、第１位の炭素は還元末端となってお
シ、第４位の炭素はガラクトースとβ−１→４結合して
うｐｈ−、ｘｋ影形成、第５位の炭素はピラノース環を
形成し、第２位の炭素は（ＪＪｃＮＡ　ｃと結合してい
るコトカラ、Ｃｉ！ｃＮＡｃと乳糖のグルコース間カβ
−（１→２）結合していることを示す。

又、式（１■）〜（Ｖ）の各オリゴ糖の［有］ｃＮＡｃ
間の結合については、これらオリゴ糖を部分加水分解し
たものについて薄層クロマトグラフィで処理したところ
、キトビオース（ＧｌｃＮＡｃ　）ｚ　、キトトリオー
ス（Ｇ１１！ｃＮＡｃ）ｎ及びキトテトラオース（Ｇｌ
ｃＮＡｃ　）４がそれぞれ確認されたので、上記［有］
（！ＮＡｃ間はβ−（１→４）結合であることが分る。

本発明に従って得られる前記一般式（Ｉ）で示されるオ
リゴ糖のビフィズス増殖因子としての特徴は、生体内で
顕著な増殖促進作用を示すことである。

本発明による上記オリゴ糖は、ビフィドバクテリウム菌
の種類に関係なく優れた増殖作用を示すものであって１
例えばビフィドバクテリウム・ブリーイ、ビンイドバク
テリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダ
ム、ビフィドバクテリウム・インファンテイス、ビフィ
ドバクテリウム・アドレスセンチイス等の大腸内定着性
ビフィドバクテリウム菌に対して活性を示す。

本発明による上記オリゴ糖は前述したように、それを含
有する反応混合物をそのまま乾燥粉末化してビフィズス
増殖因子として適用し得るが、また、粉乳、発酵乳のよ
うな飲食物に添加して、さらには経口薬剤の一成分とし
て添加して適用することも可能である。

以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例１乳糖１００ｇとキチンを濃塩酸を用いて４０ｃで２時間
部分加水分吊゛シて得られる生成物５０＆’ｃ、９００
１１０Ｒ水に溶解稜、この混合溶液にクエン酸を加えて
そのＰＨを５．０１Ｃ調整後、市販卵白リゾチームＩＩ
を加えて、３７ｃで５時間反応させた。

次いで、得られた反応混合液を、ｉ　ｏｏｃで３０秒間
加熱して反応を停止後、直径１０　ｃｍ　Ｘ高さ２００
Ｉの活性炭カラムに通して、上記反応混合液中に生成し
たオリー？糖を吸着させた上記カラムに十分量の水を流
して、上記反応で副生じた単糖類を溶出後、上記吸着オ
リゴ糖を５％エタノール１０１、次いで、５０チエタノ
ールＩｏｎで溶出した。５０チ工タノール溶出区分を減
圧濃縮後、凍結乾燥して白色のオリゴ糖粉末１０Ｆをｉ
ｉＡ製した。このオリゴ糖は前記衣１に示した式（ｎ）
〜式（Ｖ’）の４種類のオリゴ糖から成っている。

実施例２卵白リゾチームの代りに市販の細胞壁溶解酵素（Ｌｙｔ
ｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ　、協和醗酵に、に、製）を用いる
ほかは実施例１に記載と同様の手順でオリゴ糖粉末を調
製した。

得られたオリゴ糖粉末中には式（ｎ）で示される３糖類
、式（【■）で示される４糖類、式（ＩＶ）で示される
５糖類及び式（Ｖ）で示される６糖類が各ｈ５０重量％
、２５重ｆチ、１５重量％及び１０重量％含まれていた
。

実施例３本例は本発明によるオリゴ糖を活性成分とするビフィズ
ス増殖促進剤の効果を示したものである。

生後６ケ月以内のカニクイザルの３匹から成る群をそれ
ぞれ試験動物として用い、その各群に。

最初乳糖を５重量％添加した市販育児用粉乳を３週間与
えた後、１群には実施例１によシ得られたオリゴ糖粉末
を５重量％添加した育児用粉乳を他の群には乳糖とＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンの等景況合物を５重量％添
加した育児用粉乳をそれぞれ引き続き３週間与えた。そ
の間各群のサルの糞便を採取して糞便中のビフィドバク
テリウム菌を測定した。その結果は添附の第２図に示す
とおシである。第２図にみられるごとく、オリゴ糖の投
与によシ糞便中の全菌数に占めるビフィドバクテリウム
菌の比率が約４倍に増加し、比較例としての乳糖とＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンの混合物の投与区に比して
約３倍増加する。

実施例４本例も本発明によるオリゴ糖のビフィズス増殖活性を示
したものである。

年令６才以上の成長サルの３匹から成る群を試験動物と
して用い、最初の３週間乳糖を１日当９４ｇ投与し、次
いで１群には実施例１で得られたオリゴ糖粉末を１日当
シ４ｙ投与し、他の群には乳糖とＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンの等景況合物を同じく４Ｉ／日投与し、その
間各群のサルの糞便を採取し、糞便中のビフィドバクテ
リウム菌を測定した。その結果は添附の第３Ｍに示すと
おシである。第３図にみられるごとく、乳糖の投与期間
、並びに乳糖とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの混合
物の投与区ではビフィドバクテリウム菌がｔｌとんど検
出されなかったが、オリゴ糖の投与によシ上記菌の著し
い増殖がみられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の製造法によシ得られる反応混合物中
に生成した転移オリゴ糖の分析例を示す薄層クロマトグ
ラムを示したものであり、第２図及び第３図は本発明に
よるオリゴ糖のビフィズス増殖促進活性をそれぞれ示し
たものである。代理人　　　川　　　口　　　義　　雄第１図シリ１と縫橙＾

Claims

【特許請求の範囲】（１）一般式％式％）（１）（式中Ｇ）ｃＮＡｃはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
を表わし＊　ＧａＪはガラクトースを表わし、０４Ｃけ
グルコースを表わす。ｎは０又は１〜３の整数を表わす
）で示される新規なオリゴ糖。（２）式％式％で示される化合物である特許請求の範囲第１項記載のオ
リゴ糖。（３）式で示される化合物である特許請求の範囲第１項記載のオ
リゴ糖。で示される化合物である特許請求の範囲第１項記載のオ
リゴ糖。（５）式で示される化合物である特許請求の範囲第１項記載のオ
リゴ糖。（６）キチン又はキチンの部分加水分解物と、乳糖又は
乳糖含有物との混合物に、キチン及びキチンの部分加水
分解物に対して加水分解能を有する酵素を作用させるこ
とを特徴とする前記一般式（１）で示されるオリゴ糖を
製造する方法。（力　前記一般式（１）で示されるオリゴ糖を活性成分
として含有するビフィドバクテリウム菌の増殖促進剤。