JPH05230092A - Ｎ−アセチルグルコサミン結合オリゴ糖及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規Ｎ−アセチルグルコサミン結合オリゴ糖
及びその製造方法の提供。 【構成】 キチンの部分加水分解物のキチンオリゴ糖
と、乳糖あるいは乳糖含有物との混合物に、ヘキソサミ
ニダーゼを作用させることにより得られた乳糖に１分子
のＮ−アセチルグルコサミンがβ結合したＮ−アセチル
グルコサミン結合オリゴ糖及びその製造方法。 【効果】 得られたＮ−アセチルグルコサミン結合オリ
ゴ糖はビフィズス菌増殖作用を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン結合オリゴ糖及びその製造方法に関する。更に詳し
くは、キチンの部分加水分解物のキトサンオリゴ糖と、
乳糖あるいは乳糖含有物を原料とし、ヘキソサミニダー
ゼの糖転移反応により得られるＮ−アセチルグルコサミ
ン結合オリゴ糖及びその製造方法に関する。本発明のＮ
−アセチルグルコサミン結合オリゴ糖は、ビフィドバク
テリウム菌（以下ビフィズス菌と称する）の増殖因子と
して有用である。

【０００２】

【従来の技術】近年、糖加水分解酵素の糖転移反応を利
用して合成された種々のオリゴ糖が、食品の機能性素材
として利用されている。とりわけヒトの腸内の有用な細
菌として知られているビフィズス菌の生育に重要な因子
は糖類であるとの認識のもとに、各種のオリゴ糖をビフ
ィズス菌増殖因子として利用する研究が盛んになってき
ている。例えば、ガラクトース−グルコース系のオリゴ
糖のガラクトオリゴ糖をはじめ、フラクトオリゴ糖、イ
ソマルトオリゴ糖、ある種のＮ−アセチルグルコサミン
結合オリゴ糖などが、ビフィズス菌を増殖させる作用を
有し、広く食品に利用されると共に、このような、生理
活性を有するオリゴ糖の酵素合成に関する研究が、盛ん
になってきている。また、古くから人の乳に含まれてい
るＮ−アセチルグルコサミンと結合するオリゴ糖に、ビ
フィズス菌を増殖させる作用があることも知られてい
る。

【０００３】これらのうち、Ｎ−アセチルグルコサミン
結合オリゴ糖の製造方法については、乳糖とＮ−アセチ
ルグルコサミンの混合物にβ−ガラクトシダーゼを作用
させる方法が提案されている（特開平３−４９６９
２）。

【０００４】しかしながら、これまでに、ヘキソサミニ
ダーゼを用いたＮ−アセチルグルコサミン結合オリゴ糖
の製造方法に関する提案はなされておらず、キチンの部
分加水分解物と、乳糖あるいは乳糖含有物を原料として
安価にこれらＮ−アセチルグルコサミンを結合するオリ
ゴ糖を製造する方法は、未だ報告されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述し
た状況に鑑み、Ｎ−アセチルグルコサミンを結合するオ
リゴ糖の酵素合成について、鋭意研究を行った結果、キ
チンの部分加水分解物のキチンオリゴ糖と、乳糖あるい
は乳糖含有物との混合物に、ヘキソサミニダーゼを作用
させることにより、下記（Ｉ）、（ＩＩ）で示されるＮ
−アセチルグルコサミン結合オリゴ糖を効率的に生成し
得るとの知見を得た。そして本発明の方法は、工業的規
模でこれらのＮ−アセチルグルコサミン結合オリゴ糖の
製造方法として有用であることを見出し、本発明を完成
するに至った。 β−ＧｌｃＮＡｃ−（１→３）−β−Ｇａｌ−（１→４）−Ｇｌｃ （Ｉ） β−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−β−Ｇａｌ−（１→４）−Ｇｌｃ （ＩＩ） （ただし、式中ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミ
ンを、Ｇａｌはガラクトースを、また、Ｇｌｃはグルコ
ースを表す。またβは、β結合を示す。）

【０００６】すなわち、本発明は、ビフィズス菌増殖因
子として新規で有用なＮ−アセチルグルコサミンを結合
するオリゴ糖及びその新規製造方法を提供することを目
的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の式（Ｉ）及び式
（ＩＩ）で示されるＮ−アセチルグルコサミン結合オリ
ゴ糖は、乳糖にＮ−アセチルグルコサミンがβ結合した
三糖類である。

【０００８】次に、本発明に係わるＮ−アセチルグルコ
サミン結合オリゴ糖の製造方法について説明しながら、
本発明を詳細に説明する。本発明のＮ−アセチルグルコ
サミン結合オリゴ糖は、キチンの部分加水分解によって
調製したキチンオリゴ糖と乳糖あるいは乳糖結合物との
混合物に、ヘキソサミニダーゼを作用させて、キチンオ
リゴ糖分子中のＮ−アセチルグルコサミン１分子を乳糖
に転移させることにより得られる。

【０００９】ここで用いるヘキソサミニダーゼは、β結
合したＮ−アセチルグルコサミンを加水分解する酵素
で、微生物あるいは動物由来のものが好ましい。その起
源としては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergilus ory
zae)およびイカの肝臓を例示できる。また本酵素は高度
に精製されたものでなくてもよく、粗酵素の状態でも使
用し得る。キチンオリゴ糖は、キチンを塩酸を用いて４
０℃で２〜３時間加水分解後、アルカリで中和し、生成
した分解物を活性炭に吸着させた後、アルコールで溶出
することにより調製し得る。このようにして調製したキ
チンの部分加水分解物は、２〜５分子のＮ−アセチルグ
ルコサミンが結合したオリゴ糖を含む。なお、出発原料
のキチンは、エビ、カニなどの甲殻類、カブトムシ、コ
オロギなどの昆虫類や真菌類の細胞壁などに含まれるＮ
−アセチルグルコサミンを構成単位とする天然界に広く
存在する多糖類の一種であり、市販の製品が使用され
る。

【００１０】本発明で一方の出発原料として用いる乳糖
は、ガラクトースとグルコースがβ−1,4で結合した２
糖類で、市販品をそのまま用いることができるが、さら
に全乳、脱脂乳やチーズホエーのような乳糖を一成分と
して含有する物質も上記出発物質として使用し得る。上
記キチンオリゴ糖および乳糖または乳糖結合物にヘキソ
サミニダーゼを作用させるには、キチンオリゴ糖１０〜
５０％と乳糖１０〜５０％を含む溶液を基質として、pH
を３〜８に調整し、これにヘキソサミニダーゼを0.1〜
２００単位／ｍｌの濃度で作用させるとよい。反応温度
は２０〜５０℃が適当であり、また反応時間は生成され
るオリゴ糖の収率に大きな影響を及ぼすので、最適反応
時間は反応温度などに応じて実験により確認することが
必要である。上記酵素反応を所望時間行った後は、得ら
れる反応混合物を９０℃以上の温度で２〜３０秒間加熱
して反応を停止させる。

【００１１】上記酵素反応によりキチンオリゴ糖から遊
離したＮ−アセチルグルコサミンが乳糖に転移して、乳
糖に１分子のＮ−アセチルグルコサミンがβ結合したＮ
−アセチルグルコサミン結合オリゴ糖が生成する。この
ようにして得られる反応混合物は、乾燥して粉末化する
ことによりそのまま利用できるが、活性成分であるＮ−
アセチルグルコサミン結合オリゴ糖の濃度を高めるため
に、必要に応じて活性炭カラムクロマトグラフィーなど
通常行われるオリゴ糖の分離、精製法に従い精製して利
用してもよい。式（Ｉ）のＮ−アセチルグルコサミン結
合オリゴ糖と式（ＩＩ）のアセチルグルコサミン結合オ
リゴ糖との分離は、活性炭カラム及び高速液体クロマト
グラフィー等を使って行うことができる。

【００１２】

【発明の効果】本発明のＮ−アセチルグルコサミン結合
オリゴ糖はビフィズス菌の増殖を著しく促進する点で有
用である。また本発明の方法によると、このようなＮ−
アセチルグルコサミン結合オリゴ糖を収率よく、生産す
ることができる。

【００１３】以下に実施例を示して、本発明を具体的に
説明する。

【実施例】乳糖２００ｇと、キチンを濃塩酸で４０℃で
２時間部分加水分解して得られる生成物１００ｇを、７
００ｇの温水に溶解後、この溶液にクエン酸を加えてpH
を5.0に調整後、イカの肝臓から調製したヘキソサミニ
ダーゼ１０ｍｇを加えて、３７℃で５時間反応させた。
次いで、得られた反応混合液を、１００℃で３０秒間加
熱して反応を停止後、直径１０ｃｍ×高さ２０ｃｍの活
性炭カラムに通じて、上記反応混合液中に生成したオリ
ゴ糖を吸着させた。十分量の水を流して、上記反応で副
生した単糖類を溶出後、上記吸着オリゴ糖を１０％エタ
ノールで溶出した。

【００１４】得られた溶出画分を減圧濃縮後凍結乾燥し
て白色のオリゴ糖粉末２０ｇを調製した。この粉末をさ
らに高速液体クロマトグラフィーで分離精製し、構成
糖、メチル化分析、ＮＭＲなどで構造解析した結果、本
発明の目的生産物である前記Ｎ−アセチルグルコサミン
結合オリゴ糖であることが確認された。すなわち、高速
液体クロマトグラフィーで、分離、精製した式（Ｉ）及
び式（ＩＩ) のオリゴ糖に、１Ｎ−トリフルオロ酢酸を
加え１００℃で３ｈｒ加水分解し、構成糖の分析を行な
った。その結果を次に示す。

【００１５】

【表１】 単位 (Mol％) ───────────────────────── 生成単糖 式（Ｉ） 式（ＩＩ） ───────────────────────── グルコース 1.0 1.0 ガラクトース 1.0 1.0 グルコサミン 0.7 0.70 ───────────────────────── また、メチル化分析を行なったところ次の結果が得られ
た。

【００１６】

【表２】 単位 (Mol％) ──────────────────────────────────── 生 成 物 式（Ｉ） 式（ＩＩ） ──────────────────────────────────── ３，４，６−トリ−Ｏ−メチル−１，５− 0.7 0.7 ジ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮ（Ｍｅ）Ａｃ ２，４，６−トリ−Ｏ−メチル−１，３，５− 1.1 ─ トリ−Ｏ−アセチル−Ｇａｌ ２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−１，４，５− ─ 1.0 トリ−Ｏ−アセチル−Ｇａｌ ２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−１，４，５− 1.0 1.0 トリ−Ｏ−アセチル−Ｇｌｃ ────────────────────────────────────

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の式で表されるＮ−アセチルグルコサ
   ミン結合オリゴ糖。 β−ＧｌｃＮＡｃ−β−Ｇａｌ−（１→４）−Ｇｌｃ （ただし、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン
   を、Ｇａｌはガラクトースを、Ｇｌｃはグルコースを表
   わす。また、βは、β結合を表わす。）
2. 【請求項２】 Ｎ−アセチルグルコサミン結合オリゴ糖
   が、下記式（Ｉ） β−ＧｌｃＮＡｃ−（１→３）−β−Ｇａｌ−（１→４）−Ｇｌｃ （Ｉ） （ただし、式中ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミ
   ンを、Ｇａｌはガラクトースを、また、Ｇｌｃはグルコ
   ースを表す。また、βは、β結合を表わす。）で示され
   る請求項１記載のＮ−アセチルグルコサミン結合オリゴ
   糖。
3. 【請求項３】 Ｎ−アセチルグルコサミン結合オリゴ糖
   が、下記式（ＩＩ） β−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−β−Ｇａｌ−（１→４）−Ｇｌｃ （ＩＩ） （ただし、式中ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミ
   ンを、Ｇａｌはガラクトースを、また、Ｇｌｃはグルコ
   ースを表す。また、βは、β結合を表わす。）で示され
   る請求項１記載のＮ−アセチルグルコサミン結合オリゴ
   糖。
4. 【請求項４】 キチンの部分加水分解物のキチンオリゴ
   糖と、乳糖あるいは乳糖含有物との混合物に、ヘキソサ
   ミニダーゼを作用させて請求項１で示されるＮ−アセチ
   ルグルコサミン結合オリゴ糖を生成させ、これを採取す
   ることを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン結合オリ
   ゴ糖の製造方法。
5. 【請求項５】 ヘキソサミニダーゼが、アスペルギルス
   ・オリゼー（Aspergilus oryzae)由来のヘキソサミニダ
   ーゼである請求項４記載のＮ−アセチルグルコサミン結
   合オリゴ糖の製造方法。
6. 【請求項６】 ヘキソサミニダーゼが、イカの肝臓由来
   のヘキソサミニダーゼである請求項１記載のＮ−アセチ
   ルグルコサミン結合オリゴ糖の製造方法。