JPH0226638B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ビフイドバクテリウム菌の増殖促進
活性を有する新規なオリゴ糖及びその製造法に関
する。

ビフイドバクテリウム菌（以下ビフイズス菌と
称する）は人間の腸内に生育する有用菌であつ
て、それが人間に及ぼす生理学的及び栄養学的な
各種の有効作用が報告されている。例えば、腸内
腐敗の抑制作用、ビタミンB₁及びB₂の合成作用、
更にはタンパク質代謝に対する作用等が知られて
いる。

したがつて、人間の体内におけるビフイズス菌
の増殖を促進することが上述したごとき作用を向
上させるうえで重要となる。

従来、ビフイズス菌の増殖を促進する物質（以
下ビフイズス増殖因子と称する）については、古
くから多くの研究がなされており、その増殖因子
としてＮ―アセチルグルコサミン、人参エキス、
ラクチユロース等が報告されている。しかしこれ
らのビフイズス増殖因子はin vitroでは効果がみ
られるも、in vivoでの効果については未確認で
あるか又は極めて不十分な結果しか得られていな
い。

なお、近年ビフイズス増殖因子としてオリゴ糖
が注目されてきており、乳糖又は乳糖含有物にア
スペルギルス・オリゼの生産したβ―ガラクトシ
ターゼを作用させることにより得られる、一般式
Gal―（Gal）_o―Glc（式中Galはガラクトース残
基、Glcはグルコース残基、ｎは１〜４の整数を
表わす）で示されるオリゴ糖をビフイズス増殖因
子として用いることが提案されている（特開昭55
−104885号）。

本発明者は、ビフイズス増殖因子としてのオリ
ゴ糖の作用について検討した結果、下記に示す新
規なオリゴ糖が生体内のビフイズス菌に対しても
優れた増殖促進作用を示すことの知見を得て本発
明をなすに至つた。

したがつて、本発明は、ビフイズス増殖因子と
しての新規なオリゴ糖及びその製造法を提供する
ことを目的とする。以下本発明を詳しく説明す
る。

本発明に係るオリゴ糖は下記式（）を有する
新規な物質である。

オリゴ糖は乳糖にβ―ガラクトシダーゼを作用
させるときに起こるガラクトース転移反応（ガラ
クトシド結合の転移）によつて生成するものであ
つて、現在までのところの次のようなオリゴ糖が
分離、確認されている。

β―Gal―（１→２）―Glc，β―Gal―（１→
３）―Glc，β―Gal―（１→６）―Glc，β―
Gal―（１→３）―Gal，β―Gal―（１→６）―
Gal，β―Gal―（１→６）―β―Gal―（１→
４）―Glc及びβ―Gal―（１→６）―β―Gal―
（１→６）―Glc（式中Galはガラクトース、Glcは
グルコースを表わす）等。又前述したように最近
Gal―（Gal）_o―Glc（式中ｎは１〜４の整数）で
示されるオリゴ糖が報告されている（特開昭55−
104885号）。

これら公知のオリゴ糖と前記式（）を有する
本発明によるオリゴ糖との差異は、前者は全てグ
ルコース或はガラクトースが直鎖状に結合してい
るのに対して、後者は上記式（）にみられるご
とく、グルコースに２分子のガラクトースが枝分
れして結合している点にある。すなわち、本発明
によるオリゴ糖はグルコースの４位と６位の炭素
に２分子のガラクトースが結合している点で前掲
の公知オリゴ糖と構造上相違する新規なオリゴ糖
と言い得る。次に本発明によるオリゴ糖の構造に
ついて説明する。

(イ) 分子量 質量分析計による測定では分子量504を示し、
その結果から本オリゴ糖は３分子のヘキソースか
らなる３糖類であると推定される。

(ロ) 構成糖 本オリゴ糖を、0.5N―HClで100℃で４時間加
水分解して得られる生成糖のモル比は、グルコー
ス：ガラクトース＝１：２であるところから、本
オリゴ糖は１分子のグルコースと２分子のガラク
トースからなる３糖類であることが確認された。

(ハ) 構成糖の結合態様 本オリゴ糖を、0.1N―HClで100℃で20分間部
分加水分解し、得られる分解混合物を薄層クロマ
トグラフイにより解析したところ、添附の第１図
のごときパターンを示した。この結果から、本オ
リゴ糖についてＯ―β―Ｄ―ガラクトシル―（１
→４）―Ｄ―グルコースとＯ―β―Ｄ―ガラクト
シル―（１→６）―Ｄ―グルコースの２種類の２
糖類が確認された。

上記(イ)乃至(ハ)の結果から、本発明によるオリゴ
糖は前記式（）を有するＯ―β―Ｄ―ガラクト
ピラノシル―（１→４）―〔Ｏ―β―Ｄ―ガラク
トピラノシル―（１→６）〕―Ｄ―グルコースで
あると同定し得る。

又本オリゴ糖は下記のごとき理化学的性質を示
す。

１ 溶剤に対する溶解性： 水に易溶，アセトン，アルコール，クロロホル
ム，ベンゼンに不溶で、含水アルコールに難溶で
ある。

２ 呈色反応： アニリン・フタル酸反応は陽性，ニンヒドリン
反応は陰性である。

３ 塩基性，酸性，中性の区別： 中性 ４ 色調： 乾燥粉末化したものは白色を呈する。

次に、本発明によるオリゴ糖の製造法について
説明する。

本発明の製造法ではまず、乳糖又は乳糖含有物
にβ―ガラクトシダーゼを作用させてガラクトー
ス転移反応を行わせてオリゴ糖の混合物からなる
反応混合物を生成する。ここで出発原料として用
いる乳糖は市販のものでよく、又全乳、脱脂乳、
ホエーのごとき乳糖含有物も出発原料として用い
得る。

上記出発物質に作用させるβ―ガラクトシダー
ゼはその起源は特に限定する必要がなく、又高度
に精製されたものでなくてもよく、粗酵素の状態
でも使用し得る。

上記乳糖又は乳糖含有物にβ―ガラクトシダー
ゼを作用させるには、出発原料物質の乳糖濃度を
５〜50％にしたものを基質とし、これにPH２〜
８、酵素濃度0.1〜200単位／mlで10〜60℃の温度
下で酵素を作用させるのが適当である。なお、上
記酵素を作用させるための反応時間はオリゴ糖の
収量に大きな影響を及ぼすので、最適反応時間は
実験により確認することが必要である。すなわ
ち、上記酵素の作用により生成する反応混合物中
のオリゴ糖を高速液体クロマトグラフイにより定
量しながら、反応時間を調整する。

上記酵素反応により出発物質にガラクトース転
移反応が起つてオリゴ糖混合物が生成する。

本発明では上記酵素反応が終つた時点で反応液
を90℃以上で２〜30秒間加熱することにより酵素
を失活させた後、活性炭に通液して該反応液中の
３糖類以上のオリゴ糖のみを吸着させる。

この吸着処理は上記反応混合物中の未反応の乳
糖類、分解により生成した単糖類及び上記転移反
応により生成した種々のオリゴ糖を除去して目的
とするオリゴ糖の濃度を高めるためのものである
から、上記活性炭の通液に際しては反応混合物中
の３糖類以上のオリゴ糖のみを実質上吸着するよ
うにコントロールする必要がある。そのためには
活性炭１Kgに対して上記反応混合物中の３糖類以
上のオリゴ糖が50〜100ｇの割合になるように活
性炭カラムへの該反応混合物の通液量をコントロ
ールする。なお、上記範囲より低い量で通液する
と反応混合物中の２糖類も活性炭に吸着され、一
方この範囲より高い量で通液すると目的とするオ
リゴ糖の一部が吸着されずに溶出するので留意す
る必要がある。

上記吸着処理に用いる活性炭は通常市販されて
いるものでよく、又活性炭にセライトのごとき
過助剤を混合して用いてもよい。また、活性炭は
適量の水を加えてスラリー状となしたものをカラ
ムに充テンした後、これに十分量の水を通液して
水で平衡化した状態で用いることが好ましい。

次に、上述のごとくして活性炭に吸着させた３
糖類以上のオリゴ糖を溶出する。この溶出には通
常エタノールを15乃至50％の濃度で用いるとよ
く、これにより目的とするオリゴ糖が効率よく溶
出できる。

このようにして得られる溶出液には本発明の目
的とするオリゴ糖が含有されているが、その他の
３糖類以上のオリゴ糖も混在しているので、本発
明では更に次のような工程を加えて精製する。

すなわち、上記溶出液を減圧濃縮した液、又は
該液を乾燥（例えば噴霧乾燥）して粉末化したも
のを温水に溶解した液に再度β―ガラクトシダー
ゼを作用させて目的とするオリゴ糖以外のオリゴ
糖を分解する。次いでこのようにして酵素分解し
て得られる液を再び活性炭カラムへ通液して目的
とするオリゴ糖のみを活性炭に吸着させ、この吸
着オリゴ糖を前記と同様にして溶出して精製され
た本発明のオリゴ糖を得る。

このようにして得られた溶出液は減圧濃縮し、
必要に応じて更に乾燥して粉末化する。

得られる粉末は白色を呈し、約90％のＯ―β―
Ｄ―ガラクトピラノシル―（１→４）―〔Ｏ―β
―Ｄ―ガラクトピラノシル―（１→６）〕―Ｄ―
グルコースを含む。

本発明により上述のごとくして得られるオリゴ
糖はビフイズス菌に対して下記に示した試験結果
にみられるように、優れた増殖促進効果を示す。
なお、本発明によるオリゴ糖は粉末形態でも又上
記濃縮液の形態でもビフイズス増殖因子として用
い得る。

ビフイズス菌に対する増殖試験： 試験方法 10匹を一群とするカニクイザルを供試動物とし
て用い、その各々に乳糖を５重量％添加した市販
育児用粉乳を３週間与えた後、本発明によるオリ
ゴ糖（粉末形態）を５重量％添加した育児用粉乳
を更に３週間与え、その間各サルの糞便を採取し
て便中のビフイズス菌の割合を測定した。なお、
比較のために、本発明における第２段階の活性炭
吸着処理とそれに引続いて行われる溶出処理を施
さない、３糖類以上のオリゴ糖混合物（粉末形
態）を上記と同様にして他の群のサルに与えて糞
便中のビフイズス菌の割合を測定した。結果は添
付の第２図のとおりである。第２図にみられるご
とく、乳糖を添加して与えた期間中の糞質中のビ
フイズス菌に比しオリゴ糖混合物及び本発明のオ
リゴ糖を添加して与えた期間中の糞質中のビフイ
ズス菌の割合は著しく上昇しており、更に本発明
のオリゴ糖を添加して与えたものではオリゴ糖混
合物を与えたものに比しビフイズス菌の増殖が明
らかに向上している。

すなわち、本発明のオリゴ糖は生体内でもビフ
イズス菌の増殖促進に極めて優れた効果を奏する
ものであり、又人間の腸管内に生育する種々のビ
フイズス菌、例えばビフイドバクテリウム・ブリ
ーベ、ビフイドバクテリウム・ロンガム、ビフイ
ドバクテリウム・ビフイダム、ビフイドバクテリ
ウム・アドレスセンテイス、ビフイドバクテリウ
ム・インフアンテイス等の広範囲な種類のビフイ
ズス菌に対して高い増殖活性を示す。

したがつて、本発明によるオリゴ糖は粉乳、醗
酵乳のごとき乳製品に配合したり、又整腸剤のご
とき薬剤の成分として添加して用いることができ
る。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例 10Kgの乳糖を15Kgの温水に溶解した溶液にクエ
ン酸を加えてPHを4.5に調整したものに、β―ガ
ラクトシダーゼ45000単位を加えて40℃で２時間
反応させた。得られた反応混合液を105℃で２秒
間加熱して酵素を失活させた後、直径50cm×高さ
40cmの活性炭のカラム（活性炭25Kgとセライト
12.5Kg混合したものを水でスラリー形態にしたも
の）へ２Kg／時間の流速で通液した。この時活性
炭１Kgに対する３糖類以上のオリゴ糖は80ｇとな
つている。次いで十分量の水を通液して上記反応
混合液中の単糖類と２種類を溶出した後、20％濃
度のエタノールを用いて上記活性炭に吸着されて
いるオリゴ糖を溶出した。得られた溶出液を減圧
濃縮後、噴霧乾燥して白色の粉末（粗製品）を得
た。この粉末には本発明のオリゴ糖であるＯ―β
―Ｄ―ガラクトピラノシル―（１→４）―〔Ｏ―
β―Ｄ―ガラクトピラノシル―（１→６）〕―Ｄ
―グルコースが約20重量％含まれていた。

次いで上述のようにして得られた粉末の100ｇ
を温水５Kgに溶解し、この溶液にβ―ガラクトシ
ダーゼ100単位を加えて40℃で２時間反応させた。

得られた反応液を酵素の失活処理をした後10cm
×10cmの活性炭カラム（活性炭とセライトの２：
１の混合物）に通液してオリゴ糖を吸着させた。
次いでこの吸着オリゴ糖を20％濃度のエタノール
を用いて溶出し、得られた溶出液を減圧濃縮した
後、凍結乾燥して20ｇの白色粉末を得た。

この粉末中には約90重量％のＯ―β―Ｄ―ガラ
クトピアノシル―（１→４）―〔Ｏ―β―Ｄ―ガ
ラクトピラノシル―（１→６）〕―Ｄ―グルコー
スを含有していた。

上述のようにして得られた本発明のオリゴ糖粉
末を２％（重量）添加した育児用粉乳を調整し、
これを生後３ケ月以内の乳児30名に投与したとこ
ろ、それらの糞便中の全菌数に占めるビフイズス
菌の比率の増加は、乳糖２％（重量）を添加した
ものに比較して約２倍であることが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるオリゴ糖の部分加水分解
物の薄層クロマトグラフイのパターンを示したも
のであり、第２図は本発明によるオリゴ糖の生体
内におけるビフイズス菌の増殖促進作用をグラフ
で示したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 を有するＯ―β―Ｄ―ガラクトピラノシル―（１
   →４）―〔Ｏ―β―Ｄ―ガラクトピラノシル―
   （１→６）〕―Ｄ―グルコースから成るオリゴ糖。 ２ 乳糖又は乳糖含有物にβ―ガラクトシダーゼ
   を作用させてガラクトース転移反応を行わせてオ
   リゴ糖含有の反応混合物を生成する工程、上記反
   応混合物を活性炭カラムに通液して該反応混合物
   中の３種類以上のオリゴ糖混合物を活性炭に吸着
   させ、次いで吸着した上記オリゴ糖混合物を溶出
   する工程、この溶出したオリゴ糖混合物に更にβ
   ―ガラクトシダーゼを作用させて分解反応を行わ
   せる工程、得られる反応生成物を活性炭カラムに
   通液して目的のオリゴ糖を吸着させ、次いで吸着
   したオリゴ糖を溶出することを特徴とする式、 を有するＯ―β―Ｄ―ガラクトピラノシル―（１
   →４）―〔Ｏ―β―Ｄ―ガラクトピラノシル―
   （１→６）〕―Ｄ―グルコースから成るオリゴ糖の
   製造方法。 ３ 上記オリゴ糖含有の反応混合物を、水で平衡
   化した活性炭カラムに、活性炭１Kgに対して上記
   反応混合物中の３種類以上のオリゴ糖が50乃至
   100ｇの割合にあるごとく、通液する特許請求の
   範囲第２項記載の製造方法。 ４ 式 を有するＯ―β―Ｄ―ガラクトピラノシル―（１
   →４）―〔Ｏ―β―Ｄ―ガラクトピラノシル―
   （１→６）〕―Ｄ―グルコースから成るオリゴ糖を
   活性成分とするビフイドバクテリウム菌の増殖促
   進剤。