KR20140126336A - 갈락토-올리고당-함유 조성물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 갈락토-올리고당들을 함유하는 조성물들뿐만 아니라 이와 같이 갈락토-올리고당-함유 조성물들의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 갈락토-올리고당-함유 조성물뿐만 아니라 이의 효율적인 제조방법에 관한 것이다.
인간 모유는 모유 수유 유아들의 유익한 건강 효과들 중 일부로 여겨지는 수많은 다양한 올리고당들을 함유하는 것이 알려져 있다. 예를 들면, FOS, GOS 또는 이눌린과 같은 일부 올리고당들은 소위 프리바이오틱스인데, 이는 이들이 위장계의 유익한 박테리아를 증진하고 해로운 박테리아를 물리치는 것을 의미하는 것이다. 올리고당들은 그 건강 증진 효과로 인하여 유아 분유 및 임상 영양과 같은 기능성 식품 제품들에 흔히 이용된다.
올리고당들의 제조에 몇 가지 접근법들이 있다. 한 가지 접근법은 자연적으로 발생하는 원천들로부터 올리고당들을 단리하는 것에 기초한다. 프럭토오스-올리고당(FOS) 및 이눌린은 예를 들면, 예루살렘 아티초크, 우엉, 치커리, 부추, 양파 및 아스파라거스에서 자연적으로 발견되며, 이 작물들로부터 단리될 수 있다. 치커리 뿌리로부터 이눌린의 제조는 예컨대, Frank(2002)에 기재되어 있다. 올리고당들의 제조에 대한 이러한 접근법은 적당한 작물들의 입수 가능성에 의해 제한되며, 더 복잡한 올리고당들을 구현하는 것이 불가능할 수 있다.
다른 접근법은 효소들이 올리고당들의 합성을 촉진하는 효소 합성에 기초한다. Yun (1996)은 프럭토실트란스퍼라아제 활성을 갖는 효소들을 이용하고 이 효소에 대한 기질로서 수크로오스를 이용하여 프럭토-올리고당들의 효소적 제조를 기재하고 있다.
효소적 합성의 다른 예는 특별한 베타-갈락토시다아제 효소 및 기질로서 락토오스를 이용하는 식 Gal-Gal-Glc의 갈락토-올리고당들(GOS)의 제조방법을 개시하는 WO 01/90,317 A2에 기재되어 있다.
EP 2 138 586 A1은 적어도 하나의 디알킬 아미드의 존재 하에 글리코시다아제의 존재 하에서 탄수화물 공여체 분자 및 글리코실 수용체 분자의 글리코오스이전반응 또는 가수 분해에 의하여 이당류들 또는 올리고당들의 위치-선택성 제조 공정을 개시한다. 그러나, EP 2 138 586 A1은 배양 도중에 글리코실 공여체로부터 방출된 자유 이탈기들의 제거를 개시하지 않는다.
WO 2009/113,030 A2는 직교류(cross flow) 중공사 마이크로 여과 시스템을 갖는 반응기에서 미생물 전세포를 이용하여 순수한 락토오스계 갈락토올리고당들의 제조 공정을 기재하고 있다. 그러나, WO 2009/113,030 A2는 공여체에 관계되지 않은 갈락토실 수용체를 이용하여 헤테로-갈락토-올리고당들의 제조에 관한 어떠한 교시도 포함하지 않는다.
WO 2012/010,597 A1은 갈락토-올리고당들을 함유하는 조성물들뿐만 아니라 이와 같이 갈락토-올리고당-함유 조성물들의 제조방법을 개시한다. 그러나, WO 2012/010,597 A1은 배양 도중에 갈락토실 공여체로부터 방출된 자유 이탈기들의 제거를 개시하지 않는다.
본 발명의 목적은 갈락토-올리고당들 및 특히, 제조하는 동안에 이용된 갈락토실 공여체와는 상이한 환원 말단을 갖는 갈락토-올리고당들의 개선된 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 놀랍게도 갈락토-올리고당들을 합성하는 동안에 공여체로부터 방출된 이탈기들이 경쟁하는 갈락토실 수용체들로 작용하며, 상기 언급된 갈락토-올리고당들의 수율을 감소시킨다는 것을 알게 되었다. 이는 발명자들에 의해 수행된 최초 시도들이 이탈기들 및 특히 글루코오스가 빈(poor) 갈락토실 수용체들이라는 것을 나타내기 때문에 특히 놀라운 것이다. 또한, 본 발명자들은 (갈락토실 공여체와는 상이한 환원 말단을 갖는) 상기 언급된 갈락토-올리고당들의 수율은 갈락토실 공여체, 갈락토실 수용체 및 베타-갈락토시다아제 효소를 배양하는 동안에 반응 혼합물로부터 방출된 이탈기들을 제거함으로써 증가될 수 있다는 것을 알게 되었다.
도 1, 2 및 3은 이를 더 상세히 설명한다.
도 1은 갈락토오스이전반응(transgalactosylation) 동안에 일어나는 반응의 주된 종류들의 개략도이다. 반응 a)는 원하는 반응이며 공여체(이 예에서는 락토오스)로부터 수용체(예컨대, 푸코오스)로 갈락토실기의 전이를 포함한다. 이 반응의 생성물들은 자유 이탈기(이 예에서는 글루코오스) 및 갈락토실 공여체와는 상이한 환원 말단을 갖는 소형 올리고당(예컨대, Gal-Fuc)이다.
반응 b)는 공여체의 소위 자가-갈락토실화, 예컨대, 공여체가 락토오스라면 더 갈락토실화되는 락토오스로 이어지는 원하지 않는 부반응이다. 이 부산물은 올리고당 생성물로부터 제거하기 힘들고 비싸다. 본 발명자들은 높은 갈락토오스이전반응 효율(낮은 T-수치)을 갖는 제1 효소를 상대적으로 낮은 농도의 갈락토실 공여체와 병용함으로써 자가-갈락토실화의 수준이 현저히 감소될 수 있음을 알게 되었다.
도 1의 반응 c)는 본 발명자들이 최근에 발견한 다른 원하지 않는 부반응이다. 본 발명자들은 갈락토-올리고당 조성물들 내에서 알로-락토오스의 높은 수준을 놀랍게도 관찰하였고, 자유 이탈기들 및 특히, 글루코오스는 그 농도가 충분히 높으면 수용체로도 작용한다는 결론에 이르게 되었다.
도 2는 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되지 않는 경우 갈락토-올리고당 조성물들 내에 존재하는 분자종들의 일부를 도시한 개략도이다. 갈락토실 수용체로부터 유도된 원하는 올리고당 생성물들에 더하여, 조성물은 자유 이탈기들의 갈락토실화로부터 유도된 원하지 않는 올리고당들, 예컨대, 알로-락토오스 및 더 갈락토실화된 알로-락토오스도 함유한다.
도 3는 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되는 경우 갈락토-올리고당 조성물들 내에 존재하는 분자종들의 일부를 도시한 개략도이다. 도 2에 도시된 갈락토-올리고당 조성물과는 달리, 본 갈락토-올리고당 조성물은 자유 이탈기들, 알로-락토오스 및 알로-락토오스로부터 유도된 올리고당들이 결핍되어 있다 (또는 이들을 적어도 현저하게 더 낮은 농도로 갖는다).
따라서, 본 발명의 일 양태는 하기 단계들을 포함하는 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)을 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다:
a) - 350 g/mol 이하의 몰중량을 갖는, 이탈기에 결합된 갈락토실기를 포함하는 갈락토실 공여체,
- 갈락토실 공여체와는 상이한 갈락토실 수용체로서, 상기 갈락토실 수용체는 당 또는 당-알코올인 갈락토실 수용체를 포함하는 혼합물로서,
갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체 사이의 몰비는 적어도 1:10이고, 혼합물은 갈락토실 수용체를 적어도 0.05 mol/L를 포함하는 것인 혼합물을 제공하는 단계,
b) 제1 효소를 제공하는 단계로서, 상기 제1 효소는 베타-갈락토시다아제 활성을 갖고, 상기 제1 효소는 혼합물과 접촉하는 단계, 및
c) 혼합물 및 제1 효소를 배양함으로써 제1 효소가 갈락토실 공여체의 이탈기를 방출시키고 갈락토실 공여체의 갈락토실기를 갈락토실 수용체로 전이하도록 하여, 갈락토-올리고당을 형성하는 단계로서, 단계 c)는 배양하는 혼합물로부터, 즉, 배양하는 동안에, 갈락토실 공여체로부터 방출된 이탈기를 제거하여, 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)을 포함하는 조성물을 획득하는 단계를 더 포함하는 단계.
“갈락토실 공여체로부터 방출된 이탈기를 제거하는 단계”라는 용어는 배양하는 혼합물로부터 자유 이탈기들의 물리적 제거 및/또는 자유 이탈기들을 배양하는 혼합물 내에 여전히 존재할 수 있는 하나 이상의 다른 화학종들로의 변환으로 이해되어야 한다. 그러한 화학종들은 갈락토실 수용체로서 작용하지 않는 것이 바람직하거나 적어도 이들이 자유 이탈기보다 덜 효율적인 갈락토실 수용체이다.
본 발명은 복잡한 갈락토-올리고당 조성물들을 높은 수율로 값싸고 효율적으로 제조하는 것이 가능하도록 한다. 또한, 본 발명은, 조성물로부터 제거하는데 비용이 많이 드는 원하지 않는 부산물들을 생성시키는, 갈락토실 공여체로부터 방출된 자유 이탈기들의 갈락토실화 뿐만 아니라 갈락토실 공여체의 자가-갈락토실화가 감소되는 것으로 보인다.
바람직하게는, 제1 효소는 베타-갈락토시다아제 활성에 더하여 갈락토오스이전반응 활성을 갖는다. 제1 효소는 0.9 이하의 T-수치를 갖는 것도 바람직할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 베타-갈락토시다아제 효소의 “갈락토오스이전반응 활성”이라는 용어는 공여체 분자, 예컨대, 락토오스 분자로부터 갈락토실기를 물이 아닌 분자, 예컨대, 다른 락토오스 분자로 전이시키는 효소의 능력에 관한 것이다.
T-수치는 갈락토실 공여체 및 수용체 양쪽 모두로서 락토오스를 이용하여 베타-갈락토시다아제 효소의 갈락토오스이전반응 효율의 척도이다. 베타-갈락토시다아제 효소의 T-수치의 측정은 실시예 3에 기재된 검사 및 식에 따라 수행된다. T-수치는 하기 식을 이용하여 계산된다:
어떠한 갈락토오스이전반응 활성도 없는 락타아제 효소는 각각의 사용된 락토오스 몰에 대하여 1 몰의 갈락토오스를 생성할 것이며, 1의 T-수치를 가질 것이다. 극도로 높은 갈락토오스이전반응 활성을 갖는 베타-갈락토시다아제는 갈락토오스를 발생시키는 대신에 갈락토오스이전반응에 대해 락토오스로부터 거의 모든 갈락토실기들을 이용하게 될 것이며, 그에 따라 0에 가까운 T-수치를 가질 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 방법에 의하여 획득될 수 있는, 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 목적들 및 장점들은 하기에 기재되어 있다.
도 1은 갈락토오스이전반응에 포함된 반응의 종류들의 개략적인 도시를 보여준다.
도 2는 자유 이탈기들이 이용되지 않는 경우 얻어진 반응 생성물들의 개략적인 표시를 보여준다.
도 3은 자유 이탈기들이 이용되지 않는 경우 얻어진 반응 생성물들의 개략적인 표시를 보여준다.
도 4는 배양하는 동안에 자유 이탈기들의 제거 유무에 따라 4 시간 배양한 이후에 갈락토실화된 푸코오스의 이당류, 삼당류 및 사당류의 통합된 반응의 플롯을 보여준다. 자유 이탈기들(글루코오스)은 효소적 변환에 의하여 제거된다. 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되는 경우 갈락토실화된 푸코오스의 함량은 증가한다는 것을 알게 된다.
도 5는 배양하는 동안에 자유 이탈기들의 제거 유무에 따라 5 시간 배양한 이후에 갈락토실화된 푸코오스의 이당류, 삼당류 및 사당류의 통합된 반응의 플롯을 보여준다. 다시, 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되는 경우 갈락토실화된 푸코오스의 함량은 증가한다는 것을 알게 된다.
도 6은 배양하는 동안에 자유 이탈기들의 제거 유무에 따라 갈락토실화된 공여체/이탈기의 전체 통합된 반응과 비교하여 갈락토실화된 푸코오스의 전체 통합된 반응의 플롯을 보여준다. 갈락토실화된 공여체/이탈기의 전체 통합된 반응은 Gal-Glc, Gal-Gal-Glc, 및 Gal-Gal-Gal-Glc 분자들의 통합된 반응들의 합계이다. 갈락토실화된 푸코오스의 전체 통합된 반응은 Gal-Fuc, Gal-Gal-Fuc, 및 Gal-Gal-Gal-Fuc 분자들의 반응들의 합계이다. 갈락토실화된 푸코오스의 전체 통합된 반응은 배양하는 동안에 자유 이탈기들이 제거되는 경우 현저하게 증가하는 반면에 갈락토실화된 공여체/이탈기의 전체 통합된 반응은 거의 변화되지 않는다는 것을 알았다.
도 2는 자유 이탈기들이 이용되지 않는 경우 얻어진 반응 생성물들의 개략적인 표시를 보여준다.
도 3은 자유 이탈기들이 이용되지 않는 경우 얻어진 반응 생성물들의 개략적인 표시를 보여준다.
도 4는 배양하는 동안에 자유 이탈기들의 제거 유무에 따라 4 시간 배양한 이후에 갈락토실화된 푸코오스의 이당류, 삼당류 및 사당류의 통합된 반응의 플롯을 보여준다. 자유 이탈기들(글루코오스)은 효소적 변환에 의하여 제거된다. 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되는 경우 갈락토실화된 푸코오스의 함량은 증가한다는 것을 알게 된다.
도 5는 배양하는 동안에 자유 이탈기들의 제거 유무에 따라 5 시간 배양한 이후에 갈락토실화된 푸코오스의 이당류, 삼당류 및 사당류의 통합된 반응의 플롯을 보여준다. 다시, 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되는 경우 갈락토실화된 푸코오스의 함량은 증가한다는 것을 알게 된다.
도 6은 배양하는 동안에 자유 이탈기들의 제거 유무에 따라 갈락토실화된 공여체/이탈기의 전체 통합된 반응과 비교하여 갈락토실화된 푸코오스의 전체 통합된 반응의 플롯을 보여준다. 갈락토실화된 공여체/이탈기의 전체 통합된 반응은 Gal-Glc, Gal-Gal-Glc, 및 Gal-Gal-Gal-Glc 분자들의 통합된 반응들의 합계이다. 갈락토실화된 푸코오스의 전체 통합된 반응은 Gal-Fuc, Gal-Gal-Fuc, 및 Gal-Gal-Gal-Fuc 분자들의 반응들의 합계이다. 갈락토실화된 푸코오스의 전체 통합된 반응은 배양하는 동안에 자유 이탈기들이 제거되는 경우 현저하게 증가하는 반면에 갈락토실화된 공여체/이탈기의 전체 통합된 반응은 거의 변화되지 않는다는 것을 알았다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 일 양태는 하기 단계들을 포함하는 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)을 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다:
a) - 350 g/mol 이하의 몰중량을 갖는, 이탈기에 결합된 갈락토실기를 포함하는 갈락토실 공여체,
- 갈락토실 공여체와는 상이한 갈락토실 수용체로서, 상기 갈락토실 수용체는 당 또는 당-알코올인 갈락토실 수용체를 포함하는 혼합물로서,
갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체 사이의 몰비는 적어도 1:10이고, 혼합물은 갈락토실 수용체를 적어도 0.05 mol/L를 포함하는 것인 혼합물을 제공하는 단계,
b) 제1 효소를 제공하는 단계로서, 상기 제1 효소는 베타-갈락토시다아제 활성을 갖고, 상기 제1 효소는 혼합물과 접촉하는 단계, 및
c) 혼합물 및 제1 효소를 배양함으로써 제1 효소가 갈락토실 공여체의 이탈기를 방출시키고 갈락토실 공여체의 갈락토실기를 갈락토실 수용체로 전이하도록 하여, 갈락토-올리고당을 형성하는 단계로서, 단계 c)는 배양하는 혼합물로부터, 즉, 배양하는 동안에, 갈락토실 공여체로부터 방출된 이탈기를 제거하여, 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)을 포함하는 조성물을 획득하는 단계를 더 포함하는 단계.
본 발명의 맥락에서, “글리코실기”라는 용어는 단당류 또는 이당류 또는 삼당류와 같은 저급 올리고당으로부터 또는 해당 당-알코올류로부터 하나 또는 두 개의 히드록실기들을 제거함으로써 획득되는 기에 관한 것이다.
용어는 갈락토실 공여체들, 갈락토실 수용체들 및 올리고당류의 다양한 빌딩 블록들을 기술하는 것이 본원에서 사용된다.
가장 흔한 당들 및 이들에 상응하는 글리코실기들의 약어들은 아래에 나타나 있다.
본 발명의 맥락에서, “올리고당”이라는 용어는 상이하거나 동일한 종류일 수 있는 적어도 두 개의 글리코실기들 및 바람직하게는, 적어도 세 개의 글리코실기들을 포함하는 분자에 관한 것이다. 적어도 두 개의 글리코실기들은 바람직하게는 O-글리코실 결합을 통해 결합된다. 올리고당은 글리코실기들의 선형 사슬일 수 있거나, 분지 구조를 가질 수 있다. 올리고당들은 예컨대, 화학량론식, 예컨대, (Gal)3Glc, 또는 일반식, 예컨대, Gal-Gal-Gal-Glc, Gal-Gal-Glc-Gal, 또는 Gal-(Gal-)Glc-Gal로 나타내질 수 있다. 화학량론식들은 어느 글리코실기들이 올리고당인지 또는 올리고당들의 기는 이들의 상대적 위치를 포함하지 않는 정보를 제공하는 반면에, 일반식들은 글리코실기들의 상대적 위치들에 관한 일반적인 정보도 포함한다.
본 발명의 맥락에서, “호모-올리고당”이라는 용어는 한 종류의 글리코실기만 포함하는 올리고당에 관한 것이다. 호모-올리고당들의 예는 Gal-Gal-Gal-Gal 및 Glc-Glc-Glc이다.
본 발명의 맥락에서, “헤테로-올리고당”이라는 용어는 상이한 글리코실기들, 예컨대, Gal-Gal-Glc, 또는 Gal-Gal-Fuc를 포함하는 올리고당에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, “올리고당”이라는 용어와 함께 사용된 “갈락토-“라는 접두사는 올리고당이 반복 단위로서 갈락토실기들을 포함한다는 것을 시사한다. “호모-“ 또는 “헤테로-“ 접두사는 “갈락토” 접두사와 함께 사용될 수 있다. Gal-Gal-Glc 및 Gal-Gal-Gal-Gal 양쪽 모두는 갈락토-올리고당들이다. Gal-Gal-Glc은 헤테로-갈락토-올리고당이며, Gal-Gal-Gal-Gal은 호모-갈락토-올리고당이다.
본 발명의 맥락에서, “X”는 본원에 정의된 바와 같이 갈락토실 수용체를 나타낸다. “-X”는 갈락토실 수용체에 상응하는 글리코실기, 및 특히 다른 기에 결합된 글리코실기를 나타낸다. “-“는 결합을 상징한다. 글리코실기는 바람직하게는 글리코실기의 3-, 4-, 5- 또는 6-위치를 통해 결합되고, 바람직하게는 O-글리코실 결합을 통해 결합된다.
본 발명의 맥락에서, “Gal-“은 바람직하게는 갈락토실기의 1-위치를 통해서, 그리고 O-글리코실 결합을 통해 다른 기에 결합된 갈락토실기를 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, “-Gal-“은 두 개의 다른 기들에 결합된 갈락토실기를 나타낸다. 왼쪽 결합은 바람직하게는 갈락토실기의 4- 또는 6-위치를 통해 이루어지고, 바람직하게는 O-글리코실 결합을 통해 이루어진다. 오른쪽 결합은 바람직하게는 갈락토실기의 1-위치를 통해 이루어지고, 바람직하게는 O-글리코실 결합을 통해 이루어진다.
두 개의 갈락토실기들 사이의 결합들은 통상적으로 1-4 또는 1-6 결합들이며, 주로 O-글리코실 결합들이다. 갈락토실기 및 질소-함유 수용체 사이의 결합은 대안적으로 N-글리코실 결합일 수 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 갈락토실 공여체 및 갈락토실 수용체를 이용하는 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)을 포함하는 조성물의 제조방법으로서, 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)은 갈락토실 수용체를 이의 환원 말단으로서 갖는 제조방법이다.
본 발명의 맥락에서, “방법” 및 “공정”이라는 용어들은 교환 가능하게 사용된다.
단계 a)는 올리고당들이 생성되는 혼합물을 제공하는 것을 포함한다.
혼합물은 바람직하게는 액체 혼합물이며, 예컨대, 갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체를 함유하는 수용액일 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 단계 a)의 혼합물의 갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체 사이의 몰비는 적어도 1:5, 바람직하게는 적어도 1:1, 및 더 바람직하게는 적어도 5:1이다. 예를 들면, 단계 a)의 혼합물의 갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체 사이의 몰비는 적어도 15:1과 같이 적어도 10:1일 수 있다.
단계 a)의 혼합물의 갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체 사이의 몰비는 예컨대, 1:10 내지 100:1의 범위에 있을 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 단계 a)의 혼합물의 갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체 사이의 몰비는 1:10 내지 50:1의 범위에 있고, 바람직하게는 1:5 내지 30:1의 범위에 있으며, 더 바람직하게는 1:1 내지 20:1의 범위에 있다. 예를 들면, 단계 a)의 혼합물의 갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체 사이의 몰비는 예컨대, 2:1 내지 40:1의 범위에 있을 수 있고, 바람직하게는 4:1 내지 30:1의 범위에 있을 수 있으며, 더 바람직하게는 10:1 내지 25:1의 범위에 있을 수 있다.
언급된 바와 같이, 갈락토실 공여체들은 이탈기에 공유적으로 결합된 갈락토실기를 함유한다. 갈락토실기는 바람직하게는 β-D-갈락토피라노실기이다. 또한, 갈락토실기는 갈락토실기의 1-위치로부터 O-글리코시드 결합을 통해 이탈기에 바람직하게 결합된다.
갈락토실 공여체의 이탈기는 예를 들면, 글리코실기 및/또는 당-알코올기일 수 있다. 갈락토실 공여체의 이탈기는 글루코실기, 즉, 글루코오스 잔기인 것이 특히 바람직하다.
만약 이탈기가 단당류 또는 이당류의 글리코실기이거나 상응하는 당-알코올이면, 갈락토실기는 바람직하게는 갈락토실기의 1-위치로부터 O-글리코시드 결합을 통해 이탈기에 결합되며, 결합은 단당류-형태 이탈기의 4-위치에 결합되거나 이당류-형태 이탈기의 4'-위치에 부착되어 있다.
본 발명의 맥락에서, “Y 및/또는 X”라는 어구는 “Y” 또는 “X” 또는 “Y 및 X”를 의미한다. 동일한 논리 라인을 따라, “X1, X2, ..., Xi-1, 및/또는 Xi”는 “ X1” 또는 “ X2” 또는 “Xi-1” 또는 “Xi” 또는 X1, X2,...Xi-1, 및 Xi 구성 요소들의 임의의 조합을 의미한다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 갈락토실 공여체는 1000 g/mol 이하의 몰중량을 갖는다. 예를 들면, 갈락토실 공여체는 500 g/mol 이하의 몰중량을 가질 수 있다. 갈락토실 공여체는 350 g/mol 이하의 몰중량을 갖는 것이 바람직할 수도 있다.
이당류들은 현재 갈락토실 공여체의 바람직한 종류이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 삼당류들은 갈락토실 공여체들로서도 이용될 수 있다. 따라서, 혼합물은 상이한 갈락토실 공여체들의 조합을 함유할 수 있다는 것이 상정된다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토실 공여체는 락토오스이다. 유용한 갈락토실 공여체의 다른 예는 락툴로오스이다. 유용한 갈락토실 공여체의 또 다른 예는 락티톨이다.
본 발명의 맥락에서, “락토오스”라는 용어는 유당이라고도 하며, 소젖의 가장 지배적인 당인 이당류 β-D-갈락토피라노실-(1→4)-D-글루코오스에 관한 것이다.
갈락토실 공여체는 정제된 락토오스와 같은 산업적 정제 원천들 및/또는 유장 투과물, 즉, 유장의 한외여과에 의하여 제조된 단백제거 유장과 같은 천연 원천이든지, 임의의 유용한 갈락토실 공여체 원천을 통해 제공될 수 있다.
갈락토실 수용체는 제1 효소로부터 갈락토실기를 수용할 수 있는 임의의 분자일 수 있으며, 히드록실기들 및 바람직하게는, 알코올성 히드록실기들을 통상적으로 함유한다. “수용하는”이라는 용어는 공여체의 갈락토실기는 예컨대, O-글리코실 결합을 통해 수용체에 공유적으로 결합되어야 된다는 것을 의미한다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 하나 이상의 알코올성 히드록실기(들)을 포함한다. 예를 들면, 갈락토실 수용체는 폴리올일 수 있다.
본 발명의 맥락에서, “폴리올”이라는 용어는 적어도 두 개의 알코올성 히드록실기들을 포함하는 분자에 관한 것이다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 락토오스가 아니다. 또한, 갈락토실 수용체는 글루코오스가 아닌 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 갈락토실 공여체와 상이하다. 갈락토실 원천으로서 락토오스와 같은 상대적으로 저렴한 갈락토실 공여체 및 갈락토실 수용체로서 푸코오스와 같은 생물학적으로 흥미있는 수용체를 이용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 락토오스, 갈락토오스 또는 글루코오스가 아니다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 글루코오스가 아니거나, i는 음의 정수가 아닌, 즉, 예를 들면, 0, 1, 2, 3 또는 4인 일반식 Gal-(Gal)i-Glc의 올리고당들이 아니다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 갈락토오스가 아니거나, i는 음의 정수가 아닌 일반식 Gal-(Gal)i-Gal의 올리고당들이 아니다.
다양한 몰중량들을 갖는 갈락토실 수용체들이 이용될 수 있지만, 적어도 100 g/mol의 몰중량을 갖는 갈락토실 수용체들이 현재 바람직하다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 1000 g/mol 이하의 몰중량을 갖는다. 예를 들면, 갈락토실 수용체는 500 g/mol 이하의 몰중량을 가질 수 있다. 갈락토실 수용체는 350 g/mol 이하의 몰중량을 갖는 것이 바람직할 수도 있다. 갈락토실 수용체는 예를 들면, 200 g/mol 이하의 몰중량을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 당이다. 갈락토실 수용체는 예를 들면, 단당류일 수 있다. 대안적으로, 갈락토실 수용체는 이당류일 수 있다.
예를 들면, 갈락토실 수용체는 오탄당일 수 있다. 갈락토실 수용체는 예컨대, 아라비노오스일 수 있다. 유용한 오탄당의 다른 예는 자일로오스이다. 유용한 오탄당의 또 다른 예는 리보오스이다. 갈락토실 수용체는 예를 들면, 아라비노오스, 자일로오스 및 리보오스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오탄당일 수 있다.
육탄당들은 유용한 갈락토실 수용체들의 다른 그룹이다. 갈락토실 수용체는 예컨대, 만노오스일 수 있다. 유용한 육탄당의 다른 예는 갈락토오스이다. 유용한 육탄당의 또 다른 예는 타가토오스이다. 유용한 육탄당의 또 다른 예는 프럭토오스이다. 갈락토실 수용체는 예를 들면, 만노오스, 갈락토오스, 타가토오스 및 프럭토오스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 육탄당일 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 디옥시-육탄당이다. 예를 들면, 갈락토실 수용체는 예컨대, D-푸코오스, L-푸코오스 또는 이들의 혼합물과 같은 푸코오스일 수 있다.
대안적으로, 갈락토실 수용체는 예컨대, 이당류 또는 삼당류와 같은 올리고당일 수 있다. 유용한 이당류의 예는 말토오스이다. 유용한 이당류의 다른 예는 락툴로오스이다.
갈락토실 수용체들의 다른 유용한 그룹은 당 유도체들이다.
본 발명의 맥락에서, “당 유도체”라는 용어는 하나 이상의 비-히드록실 기능기(들)을 함유하는 당에 속한다. 그러한 기능기들의 예는 카르복실기, 아미노기, N-아세틸아미노기 및/또는 티올기이다. 1-위치에서 알데히드기 또는 2-위치에서 케톤기를 함유하는 당들은 당들이 상기 언급된 비-히드록실 기능기들의 일부를 포함하지 않으면 이와 같은 당 유도체들로 간주되지 않는다.
유용한 당 유도체의 일례는 N-아세틸 갈락토사민이다. 유용한 당 유도체의 다른 예는 시알산이다. 유용한 당 유도체의 또 다른 예는 시알릴 락토오스이다. 따라서, 갈락토실 수용체는 N-아세틸 갈락토사민, 시알산 및 시알릴 락토오스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 당 유도체일 수 있다.
유용한 갈락토실 수용체들의 다른 그룹은 당 알코올들이다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 당 알코올이다. 유용한 당 알코올들의 예는 소르비톨, 자일리톨, 락티톨 및/또는 말티톨이다.
상기 언급된 갈락토실 수용체들과 달리, 본 발명자들은 N-아세틸 글루코사민 및 글루코오스는 덜 효율적인 갈락토실 수용체들이라는 것을 알게 되었다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토실 수용체는 글루코오스 또는 N-아세틸 글루코사민이 아니다.
혼합물은 제1 형의 갈락토실 수용체와는 상이한 하나 이상의 다른 갈락토실 수용체(들)을 함유할 수 있다. 혼합물의 상이한 종류의 갈락토실 수용체들은 예컨대, 본원에 언급된 갈락토실 수용체 종류들 사이에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 제조된 갈락토실화된 수용체들은 새로운 종류의 갈락토실 수용체로서 작용하며, 갈락토실화될 수도 있다. 이런 식으로, i는 음의 정수가 아닌 화학량론식 Gali+1X를 갖는 갈락토-올리고당들이 제조될 수 있다. 대체로, 가장 지배적인 종들은 GalX, Gal2X, 및 Gal3X이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태들에 있어서, 제조된 갈락토실화된 수용체들은 새로운 종류의 갈락토실 수용체로서 작용하며, 갈락토실화될 수도 있다. 이런 식으로, i는 음의 정수가 아닌 일반식 Gal-(Gal)i-X를 갖는 갈락토-올리고당들이 제조될 수 있다. 대체로, 가장 지배적인 종들은 Gal-X, Gal-Gal-X, 및 Gal-Gal-Gal-X이다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 단계 a)의 혼합물은 갈락토실 공여체를 0.7 mol/L이하, 바람직하게는 0.4 mol/L 이하 및 더 바람직하게는 0.2 mol/L 이하의 농도로 포함한다. 혼합물은 예컨대, 갈락토실 공여체를 0.001 내지 0.7 mol/L의 범위, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mol/L 범위 및 더 바람직하게는 0.02 내지 0.2 mol/L의 범위의 농도로 포함할 수 있다.
대안적으로, 단계 a)의 혼합물은 갈락토실 공여체를 0.3 mol/L이하, 바람직하게는 0.1 mol/L 이하 및 더 바람직하게는 0.05 mol/L 이하의 농도로 포함할 수 있다. 혼합물은 예컨대, 갈락토실 공여체를 0.001 내지 0.2 mol/L의 범위, 바람직하게는 0.005 내지 0.1 mol/L 범위 및 더 바람직하게는 0.01 내지 0.05 mol/L의 범위의 농도로 포함할 수 있다.
갈락토실화된 갈락토실 수용체 및 갈락토실화된 갈락토실 공여체는 제한된 정도로 갈락토실 공여체로서 작용할 수 있지만, 갈락토실화된 갈락토실 수용체 및 갈락토실화된 갈락토실 공여체는 본 발명의 맥락에서 갈락토실 공여체로 간주되지 않으며, 본원에 언급된 갈락토실 공여체의 농도들 또는 비율들에 기여하지 않는다는 것에 주목하여야 한다.
갈락토실 수용체는 상이한 농도들의 범위에서 이용될 수 있다. 그러나, 과량의 갈락토실 수용체는 대체적으로 본 발명의 갈락토-올리고당-함유 조성물로부터 제거되어야 하기 때문에, 혼합물을 갈락토실 수용체로 포화시키는 것을 회피하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 단계 a)의 혼합물은 갈락토실 수용체를 적어도 0.05 mol/L, 바람직하게는 적어도 0.10 mol/L 및 더 바람직하게는 적어도 0.30 mol/L의 양으로 포함한다. 갈락토실 수용체의 더 높은 농도는 바람직할 수 있어서, 단계 a)의 혼합물은 예컨대, 갈락토실 수용체를 적어도 0.5 mol/L, 바람직하게는 적어도 0.7 mol/L 및 더 바람직하게는 적어도 1 mol/L의 양으로 포함할 수 있다.
혼합물은 예컨대, 갈락토실 수용체를 0.05 mol/L 내지 5 mol/L의 범위, 바람직하게는 0.1 mol/L 내지 2 mol/L의 범위 및 더 바람직하게는 0.3 mol/L 내지 1 mol/L의 범위의 농도로 포함할 수 있다.
그러나, 일부 실시형태들에 있어서, 혼합물이 예컨대, 갈락토실 수용체를 2 mol/L 이하, 바람직하게는 0.5 mol/L 이하, 및 더 바람직하게는 0.2 mol/L 이하의 농도로 포함할 수 있는 경우, 상대적으로 낮은 농도의 갈락토실 수용체가 바람직하다. 예를 들면, 혼합물은 갈락토실 수용체를 0.05 mol/L 내지 2 mol/L의 범위, 바람직하게는 0.06 mol/L 내지 1 mol/L의 범위 및 더 바람직하게는 0.08 mol/L 내지 0.8 mol/L의 범위의 농도로 포함할 수 있다.
갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체에 더하여, 혼합물은 효소 반응을 위한 조건들을 최적화하기 위한 다양한 첨가제들을 더 함유할 수 있다.
혼합물은 예를 들면, 혼합물의 pH를 제1 효소의 pH 최적으로 조절시키기 위한 하나 이상의 pH 완충제(들)을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 혼합물은 하나 이상의 금속 이온들을 함유하는 수용성 염들을 포함할 수 있다. 특정한 제1 효소에 따라서, 예컨대, Ca2+, Zn2+, 또는 Mg2+와 같은 금속 이온들이 이용될 수 있다. 그러나, 일부 제1 효소들은 혼합물 내에서 금속 이온들의 존재에 무감하다는 것에 주목하라.
종래 올리고당들의 합성방법들은 예컨대, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜(PEG)와 같은 물-활성-감소 작용제(water-activity-lowering agent)들을 종종 채용한다. 본 발명은 유리하게는 그러한 물-활성-감소 작용제들의 사용 없이 갈락토-올리고당들의 효율적인 합성을 수행하는 것이 가능하도록 한다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 혼합물은 물-활성-감소 작용제를 혼합물의 중량에 대하여 5 중량% 이하, 바람직하게는 1 중량% 이하, 및 더 바람직하게는 0.1 중량% 이하의 양으로 함유한다. 예를 들면, 혼합물은 물-활성-감소 작용제를 혼합물의 중량에 대하여 0.05 중량%이하의 양으로 함유할 수 있다.
단계 a)의 혼합물 또는 혼합물을 형성하는 성분들은 제1 효소와의 반응 전에 열처리되어 반응이 일어나는 동안에 미생물 성장을 회피할 수 있다. 저온살균(예컨대, 72℃에서 15 초 동안), 높은 저온살균(예컨대, 90℃에서 15 초 동안) 또는 UHT 처리(예컨대, 140℃에서 4 초 동안)와 같은 통상적인 열처리 공정들이 이용될 수 있다. 온도에 불안정한 효소들을 열처리 하는 경우 주의를 기울여야 한다.
단계 b)는 바람직하게는 베타-갈락토시다아제 활성을 갖는 제1 효소를 제공하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 제1 효소는 베타-갈락토시다아제 활성에 더하여 갈락토오스이전반응 활성을 갖는다. 제1 효소는 0.9 이하의 T-수치를 갖는 것도 바람직할 수 있다. 방법은 추가적인 효소들을 이용하는 것을 포함할 수도 있는데, 예컨대, 효소는 베타-갈락토시다아제 활성 또는 갈락토오스이전반응 활성과는 상이한 효소 활성을 갖는다는 것에 주목해야 된다.
본 발명의 맥락에서, “베타-갈락토시다아제 활성”이라는 용어는 락토오스와 같이 β-D-갈락토시다아제들 내에서 말단 비-환원성 β-D-갈락토오스 잔기들의 가수분해의 효소적 촉매에 관한 것이다. 본 발명에 이용된 제1 효소는 바람직하게는 클래스 EC 3.2.1.23에 속한다.
제1 효소는 0.9 이하의 T-수치를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 제1 효소의 T-수치는 0.8 이하, 바람직하게는 0.7 이하 및 더 바람직하게는 0.6 이하이다. 예를 들면, 제1 효소의 T-수치는 0.5 이하일 수 있다. 바람직하게는, 제1 효소의 T-수치는 0.4 이하일 수 있다. 제1 효소의 T-수치는 0.3 이하인 것이 더 바람직할 수도 있다.
0.2 이하와 같은 더 낮은 T-수치들도 바람직할 수 있다.
유용한 제1 효소들은 예컨대, SEQ ID NO. 1의 DNA 서열에 의하여 인코딩되는 펩티드로부터 유도될 수 있다. 그러한 펩티드로부터 유용한 제1 효소들이 예컨대, 유도될 수 있는 펩티드의 예는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.
SEQ ID NO. 1 및 SEQ ID NO. 2는 PCT 출원에서 찾을 수 있다.
이들이 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2으로 불리는 WO 01/90,317 A2. 추가적으로, 다른 유용한 제1 효소들도 WO 01/90,317 A2에서 찾을 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 펩티드에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 펩티드에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 펩티드에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, “서열 동일성”이라는 용어는 동일한 길이의 두 개의 아미노산 서열들 사이 또는 동일한 길이의 두 개의 핵산 서열들 사이에 동일성의 정도의 수량적 척도에 관한 것이다.
비교 대상인 두 개의 서열들이 동일한 길이가 아니면, 이들은 가능한 최선의 맞춤(fit)이 되도록 정렬되어야 한다. 서열 동일성은 하기와 같이 계산될 수 있다
(Nref-Ndif)*100)/(Nref),
여기서, Ndif는 두 개의 서열들이 정렬되는 경우 두 개의 서열 내에 동일하지 않은 잔기들의 총숫자이고, Nref는 서열들 중 하나에서 잔기들의 숫자이다. 그러므로, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC와 75%의 서열 동일성을 가질 것이다(Ndif=2 및 Nref=8). 갭은 특정 잔기(들)의 비-동일성으로 계산되는데, 즉, DNA 서열 AGTGTC는 DNA 서열 AGTCAGTC와 75%의 서열 동일성을 가질 것이다(Ndif=2 및 Nref=8). 서열 동일성은 예를 들면, 미국 국립생물공학정보센터(NCBI)에 의하여 제공된 BLAST-알고리즘과 같은 적절한 BLAST-프로그램들을 이용하여 계산될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 펩티드에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들면, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 펩티드에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 펩티드에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들면, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 제1 효소는 예컨대, SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들면, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 제1 효소는 예컨대, SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들면, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 현재 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)를 갖는다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들면, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들면, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95% 및 더 바람직하게는 적어도 97.5%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 제1 효소의 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 제1 효소는 예컨대, SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)을 가질 수 있다.
본 발명의 일부 현재 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)를 갖는다.
제1 효소는 예를 들면, 하기 사항을 포함할 수 있다:
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
대안적으로, 제1 효소는 예컨대, 하기 사항으로 이루어질 수 있다:
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
제1 효소는 예를 들면, 하기 사항을 포함할 수 있다:
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
대안적으로, 제1 효소는 예컨대, 하기 사항으로 이루어질 수 있다:
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 예컨대, 표 1에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제1 효소는 예를 들면, 표 1에 나타난 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제1 효소의 아미노산 서열은 표 1에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 제1 효소는 예를 들면, 표 1에 나타난 아미노산 서열을 가질 수 있다. 유용한 아미노산 서열들(AAS).
| 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | |||
| 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | |||
| 1 | 25 | 1122 | 26 | 27 | 1122 | 51 | 30 | 1122 |
| 2 | 25 | 1132 | 27 | 27 | 1132 | 52 | 30 | 1132 |
| 3 | 25 | 1142 | 28 | 27 | 1142 | 53 | 30 | 1142 |
| 4 | 25 | 1152 | 29 | 27 | 1152 | 54 | 30 | 1152 |
| 5 | 25 | 1162 | 30 | 27 | 1162 | 55 | 30 | 1162 |
| 6 | 25 | 1167 | 31 | 27 | 1167 | 56 | 30 | 1167 |
| 7 | 25 | 1168 | 32 | 27 | 1168 | 57 | 30 | 1168 |
| 8 | 25 | 1169 | 33 | 27 | 1169 | 58 | 30 | 1169 |
| 9 | 25 | 1170 | 34 | 27 | 1170 | 59 | 30 | 1170 |
| 10 | 25 | 1171 | 35 | 27 | 1171 | 60 | 30 | 1171 |
| 11 | 25 | 1172 | 36 | 27 | 1172 | 61 | 30 | 1172 |
| 12 | 25 | 1173 | 37 | 27 | 1173 | 62 | 30 | 1173 |
| 13 | 25 | 1174 | 38 | 27 | 1174 | 63 | 30 | 1174 |
| 14 | 25 | 1175 | 39 | 27 | 1175 | 64 | 30 | 1175 |
| 15 | 25 | 1176 | 40 | 27 | 1176 | 65 | 30 | 1176 |
| 16 | 25 | 1177 | 41 | 27 | 1177 | 66 | 30 | 1177 |
| 17 | 25 | 1178 | 42 | 27 | 1178 | 67 | 30 | 1178 |
| 18 | 25 | 1179 | 43 | 27 | 1179 | 68 | 30 | 1179 |
| 19 | 25 | 1180 | 44 | 27 | 1180 | 69 | 30 | 1180 |
| 20 | 25 | 1181 | 45 | 27 | 1181 | 70 | 30 | 1181 |
| 21 | 25 | 1186 | 46 | 27 | 1186 | 71 | 30 | 1186 |
| 22 | 25 | 1196 | 47 | 27 | 1196 | 72 | 30 | 1196 |
| 23 | 25 | 1206 | 48 | 27 | 1206 | 73 | 30 | 1206 |
| 24 | 25 | 1216 | 49 | 27 | 1216 | 74 | 30 | 1216 |
| 25 | 25 | 1226 | 50 | 27 | 1226 | 75 | 30 | 1226 |
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 효소는 예컨대, 표 2에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 효소는 예를 들면, 표 2에 나타난 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 효소의 아미노산 서열은 표 2에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 효소는 예를 들면, 표 2에 나타난 아미노산 서열을 가질 수 있다. 유용한 아미노산 서열들(AAS).
| 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | |||||
| 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | |||||
| 76 | 31 | 1122 | 101 | 32 | 1122 | 126 | 33 | 1122 | ||
| 77 | 31 | 1132 | 102 | 32 | 1132 | 127 | 33 | 1132 | ||
| 78 | 31 | 1142 | 103 | 32 | 1142 | 128 | 33 | 1142 | ||
| 79 | 31 | 1152 | 104 | 32 | 1152 | 129 | 33 | 1152 | ||
| 80 | 31 | 1162 | 105 | 32 | 1162 | 130 | 33 | 1162 | ||
| 81 | 31 | 1167 | 106 | 32 | 1167 | 131 | 33 | 1167 | ||
| 82 | 31 | 1168 | 107 | 32 | 1168 | 132 | 33 | 1168 | ||
| 83 | 31 | 1169 | 108 | 32 | 1169 | 133 | 33 | 1169 | ||
| 84 | 31 | 1170 | 109 | 32 | 1170 | 134 | 33 | 1170 | ||
| 85 | 31 | 1171 | 110 | 32 | 1171 | 135 | 33 | 1171 | ||
| 86 | 31 | 1172 | 111 | 32 | 1172 | 136 | 33 | 1172 | ||
| 87 | 31 | 1173 | 112 | 32 | 1173 | 137 | 33 | 1173 | ||
| 88 | 31 | 1174 | 113 | 32 | 1174 | 138 | 33 | 1174 | ||
| 89 | 31 | 1175 | 114 | 32 | 1175 | 139 | 33 | 1175 | ||
| 90 | 31 | 1176 | 115 | 32 | 1176 | 140 | 33 | 1176 | ||
| 91 | 31 | 1177 | 116 | 32 | 1177 | 141 | 33 | 1177 | ||
| 92 | 31 | 1178 | 117 | 32 | 1178 | 142 | 33 | 1178 | ||
| 93 | 31 | 1179 | 118 | 32 | 1179 | 143 | 33 | 1179 | ||
| 94 | 31 | 1180 | 119 | 32 | 1180 | 144 | 33 | 1180 | ||
| 95 | 31 | 1181 | 120 | 32 | 1181 | 145 | 33 | 1181 | ||
| 96 | 31 | 1186 | 121 | 32 | 1186 | 146 | 33 | 1186 | ||
| 97 | 31 | 1196 | 122 | 32 | 1196 | 147 | 33 | 1196 | ||
| 98 | 31 | 1206 | 123 | 32 | 1206 | 148 | 33 | 1206 | ||
| 99 | 31 | 1216 | 124 | 32 | 1216 | 149 | 33 | 1216 | ||
| 100 | 31 | 1226 | 125 | 32 | 1226 | 150 | 33 | 1226 | ||
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 효소는 예컨대, 표 3에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 효소는 예를 들면, 표 3에 나타난 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 효소의 아미노산 서열은 표 3에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 효소는 예를 들면, 표 3에 나타난 아미노산 서열을 가질 수 있다. 유용한 아미노산 서열들(AAS).
| 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | |||||
| 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | |||||
| 151 | 34 | 1122 | 176 | 35 | 1122 | 201 | 36 | 1122 | ||
| 152 | 34 | 1132 | 177 | 35 | 1132 | 202 | 36 | 1132 | ||
| 153 | 34 | 1142 | 178 | 35 | 1142 | 203 | 36 | 1142 | ||
| 154 | 34 | 1152 | 179 | 35 | 1152 | 204 | 36 | 1152 | ||
| 155 | 34 | 1162 | 180 | 35 | 1162 | 205 | 36 | 1162 | ||
| 156 | 34 | 1167 | 181 | 35 | 1167 | 206 | 36 | 1167 | ||
| 157 | 34 | 1168 | 182 | 35 | 1168 | 207 | 36 | 1168 | ||
| 158 | 34 | 1169 | 183 | 35 | 1169 | 208 | 36 | 1169 | ||
| 159 | 34 | 1170 | 184 | 35 | 1170 | 209 | 36 | 1170 | ||
| 160 | 34 | 1171 | 185 | 35 | 1171 | 210 | 36 | 1171 | ||
| 161 | 34 | 1172 | 186 | 35 | 1172 | 211 | 36 | 1172 | ||
| 162 | 34 | 1173 | 187 | 35 | 1173 | 212 | 36 | 1173 | ||
| 163 | 34 | 1174 | 188 | 35 | 1174 | 213 | 36 | 1174 | ||
| 164 | 34 | 1175 | 189 | 35 | 1175 | 214 | 36 | 1175 | ||
| 165 | 34 | 1176 | 190 | 35 | 1176 | 215 | 36 | 1176 | ||
| 166 | 34 | 1177 | 191 | 35 | 1177 | 216 | 36 | 1177 | ||
| 167 | 34 | 1178 | 192 | 35 | 1178 | 217 | 36 | 1178 | ||
| 168 | 34 | 1179 | 193 | 35 | 1179 | 218 | 36 | 1179 | ||
| 169 | 34 | 1180 | 194 | 35 | 1180 | 219 | 36 | 1180 | ||
| 170 | 34 | 1181 | 195 | 35 | 1181 | 220 | 36 | 1181 | ||
| 171 | 34 | 1186 | 196 | 35 | 1186 | 221 | 36 | 1186 | ||
| 172 | 34 | 1196 | 197 | 35 | 1196 | 222 | 36 | 1196 | ||
| 173 | 34 | 1206 | 198 | 35 | 1206 | 223 | 36 | 1206 | ||
| 174 | 34 | 1216 | 199 | 35 | 1216 | 224 | 36 | 1216 | ||
| 175 | 34 | 1226 | 200 | 35 | 1226 | 225 | 36 | 1226 | ||
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 효소는 예컨대, 표 4에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 효소는 예를 들면, 표 4에 나타난 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 효소의 아미노산 서열은 표 4에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 효소는 예를 들면, 표 4에 나타난 아미노산 서열을 가질 수 있다. 유용한 아미노산 서열들(AAS).
| 아미노산 서열 번호 |
SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 |
SEQ ID NO. 2에서의 위치 | ||
| 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | ||
| 226 | 39 | 1122 | 251 | 42 | 1122 |
| 227 | 39 | 1132 | 252 | 42 | 1132 |
| 228 | 39 | 1142 | 253 | 42 | 1142 |
| 229 | 39 | 1152 | 254 | 42 | 1152 |
| 230 | 39 | 1162 | 255 | 42 | 1162 |
| 231 | 39 | 1167 | 256 | 42 | 1167 |
| 232 | 39 | 1168 | 257 | 42 | 1168 |
| 233 | 39 | 1169 | 258 | 42 | 1169 |
| 234 | 39 | 1170 | 259 | 42 | 1170 |
| 235 | 39 | 1171 | 260 | 42 | 1171 |
| 236 | 39 | 1172 | 261 | 42 | 1172 |
| 237 | 39 | 1173 | 262 | 42 | 1173 |
| 238 | 39 | 1174 | 263 | 42 | 1174 |
| 239 | 39 | 1175 | 264 | 42 | 1175 |
| 240 | 39 | 1176 | 265 | 42 | 1176 |
| 241 | 39 | 1177 | 266 | 42 | 1177 |
| 242 | 39 | 1178 | 267 | 42 | 1178 |
| 243 | 39 | 1179 | 268 | 42 | 1179 |
| 244 | 39 | 1180 | 269 | 42 | 1180 |
| 245 | 39 | 1181 | 270 | 42 | 1181 |
| 246 | 39 | 1186 | 271 | 42 | 1186 |
| 247 | 39 | 1196 | 272 | 42 | 1196 |
| 248 | 39 | 1206 | 273 | 42 | 1206 |
| 249 | 39 | 1216 | 274 | 42 | 1216 |
| 250 | 39 | 1226 | 275 | 42 | 1226 |
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 예컨대, 표 5에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제1 효소는 예를 들면, 표 5에 나타난 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제1 효소의 아미노산 서열은 표 5에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 제1 효소는 예를 들면, 표 5에 나타난 아미노산 서열을 가질 수 있다.유용한 아미노산 서열들(AAS).
| 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | |||
| 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | |||
| 276 | 31 | 898 | 301 | 33 | 898 | 326 | 37 | 898 |
| 277 | 31 | 908 | 302 | 33 | 908 | 327 | 37 | 908 |
| 278 | 31 | 918 | 303 | 33 | 918 | 328 | 37 | 918 |
| 279 | 31 | 928 | 304 | 33 | 928 | 329 | 37 | 928 |
| 280 | 31 | 938 | 305 | 33 | 938 | 330 | 37 | 938 |
| 281 | 31 | 943 | 306 | 33 | 943 | 331 | 37 | 943 |
| 282 | 31 | 944 | 307 | 33 | 944 | 332 | 37 | 944 |
| 283 | 31 | 945 | 308 | 33 | 945 | 333 | 37 | 945 |
| 284 | 31 | 946 | 309 | 33 | 946 | 334 | 37 | 946 |
| 285 | 31 | 947 | 310 | 33 | 947 | 335 | 37 | 947 |
| 286 | 31 | 948 | 311 | 33 | 948 | 336 | 37 | 948 |
| 287 | 31 | 949 | 312 | 33 | 949 | 337 | 37 | 949 |
| 288 | 31 | 950 | 313 | 33 | 950 | 338 | 37 | 950 |
| 289 | 31 | 951 | 314 | 33 | 951 | 339 | 37 | 951 |
| 290 | 31 | 952 | 315 | 33 | 952 | 340 | 37 | 952 |
| 291 | 31 | 953 | 316 | 33 | 953 | 341 | 37 | 953 |
| 292 | 31 | 954 | 317 | 33 | 954 | 342 | 37 | 954 |
| 293 | 31 | 955 | 318 | 33 | 955 | 343 | 37 | 955 |
| 294 | 31 | 956 | 319 | 33 | 956 | 344 | 37 | 956 |
| 295 | 31 | 957 | 320 | 33 | 957 | 345 | 37 | 957 |
| 296 | 31 | 962 | 321 | 33 | 962 | 346 | 37 | 962 |
| 297 | 31 | 972 | 322 | 33 | 972 | 347 | 37 | 972 |
| 298 | 31 | 982 | 323 | 33 | 982 | 348 | 37 | 982 |
| 299 | 31 | 992 | 324 | 33 | 992 | 349 | 37 | 992 |
| 300 | 31 | 1002 | 325 | 33 | 1002 | 350 | 37 | 1002 |
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 예컨대, 표 6에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제1 효소는 예를 들면, 표 6에 나타난 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제1 효소의 아미노산 서열은 표 6에 나타난 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 제1 효소는 예를 들면, 표 6에 나타난 아미노산 서열을 가질 수 있다. 유용한 아미노산 서열들(AAS).
| 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | 아미노산 서열 번호 | SEQ ID NO. 2에서의 위치 | |||
| 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | 시작 | 끝 | |||
| 351 | 31 | 865 | 376 | 33 | 865 | 401 | 35 | 865 |
| 352 | 31 | 875 | 377 | 33 | 875 | 402 | 35 | 875 |
| 353 | 31 | 885 | 378 | 33 | 885 | 403 | 35 | 885 |
| 354 | 31 | 895 | 379 | 33 | 895 | 404 | 35 | 895 |
| 355 | 31 | 905 | 380 | 33 | 905 | 405 | 35 | 905 |
| 356 | 31 | 910 | 381 | 33 | 910 | 406 | 35 | 910 |
| 357 | 31 | 911 | 382 | 33 | 911 | 407 | 35 | 911 |
| 358 | 31 | 912 | 383 | 33 | 912 | 408 | 35 | 912 |
| 359 | 31 | 913 | 384 | 33 | 913 | 409 | 35 | 913 |
| 360 | 31 | 914 | 385 | 33 | 914 | 410 | 35 | 914 |
| 361 | 31 | 915 | 386 | 33 | 915 | 411 | 35 | 915 |
| 362 | 31 | 916 | 387 | 33 | 916 | 412 | 35 | 916 |
| 363 | 31 | 917 | 388 | 33 | 917 | 413 | 35 | 917 |
| 364 | 31 | 918 | 389 | 33 | 918 | 414 | 35 | 918 |
| 365 | 31 | 919 | 390 | 33 | 919 | 415 | 35 | 919 |
| 366 | 31 | 920 | 391 | 33 | 920 | 416 | 35 | 920 |
| 367 | 31 | 921 | 392 | 33 | 921 | 417 | 35 | 921 |
| 368 | 31 | 922 | 393 | 33 | 922 | 418 | 35 | 922 |
| 369 | 31 | 923 | 394 | 33 | 923 | 419 | 35 | 923 |
| 370 | 31 | 924 | 395 | 33 | 924 | 420 | 35 | 924 |
| 371 | 31 | 929 | 396 | 33 | 929 | 421 | 35 | 929 |
| 372 | 31 | 939 | 397 | 33 | 939 | 422 | 35 | 939 |
| 373 | 31 | 949 | 398 | 33 | 949 | 423 | 35 | 949 |
| 374 | 31 | 959 | 399 | 33 | 959 | 424 | 35 | 959 |
| 375 | 31 | 969 | 400 | 33 | 969 | 425 | 35 | 969 |
갈락토오스이전반응 활성을 갖는 유용한 제1 효소들의 다른 예들은 본원에 참고로 포함된 WO 2011/120993 A1에서 찾을 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 하나 이상의 글리코실화된 아미노산(들)을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제1 효소는 하나 이상의 인산화된 아미노산(들)을 함유할 수 있다. 대안적으로, 제1 효소의 아미노산들 중 어느 것도 글리코실화되거나 인산화되지 않는다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 제1 효소는 적어도 두 개의 서브-유닛들을 포함하며, 각각의 서브-유닛은 상기에 정의된 바와 같이 제1 효소로 이루어져 있다.
제1 효소는 바람직하게는 혼합물과 접촉하고 이에 의하여 갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체와 접촉하게 된다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 혼합물은 제1 효소 및/또는 제2 효소를 포함한다. 제1 효소 및/또는 제2 효소는 예컨대, 혼합물 내에서 용해된 형태로, 예컨대, 단일 효소 분자들로서 또는 효소 분자들의 가용성 응집체로서 존재할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태들에 있어서, 제1 효소 및/또는 제2 효소는 혼합물로부터 분리되지만, 제1 효소 및/또는 제2 효소를 혼합물과 접촉시킴으로써 갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체와 접촉하게 된다. 예를 들면, 정지 고체상(stationary solid phase) 상에 고정된 제1 효소 및/또는 제2 효소가 이용될 수 있다. 유용한 정지 고체상들의 예는 예컨대, 필터, 제1 효소-함유 입자들의 충진층, 또는 유사한 구조들이다.
대안적으로, 고체상은 예컨대, 혼합물의 일부를 형성하는 자유 유동하는 미립자 고체상, 예컨대, 유기 또는 무기 비드들일 수 있다.
고정화 기술들 및 적당한 고체상 유형들을 포함하는 효소들의 산업적 이용에 관한 상세사항들은 모든 목적들을 위해 본원에 참고로 포함된 Buchholz(2005)에서 찾을 수 있다.
제1 효소는 바람직하게는 갈락토-올리고당들의 허용가능한 수율을 얻는데 충분한 활성으로 이용된다. 최적 활성은 공정의 특정 구현에 의존하며 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.
높은 전환율(turn-over)의 갈락토실 공여체 및 높은 수율의 갈락토-올리고당이 필요하다면, 상대적으로 높은 활성의 제1 효소를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 제1 효소의 활성은 갈락토실 공여체의 전환율이 적어도 0.02 mol/(L*h), 바람직하게는 적어도 0.2 mol/(L*h) 및 더 바람직하게는 적어도 2 mol/(L*h)이도록 하는 것일 수 있다.
효소 반응은 단계 c)의 배양 도중에 일어난다. 거의 갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체가 제1 효소와 접촉되는 때일 수 있는, 혼합물이 적당한 조건들에 노출되는 즉시, 갈락토오스이전반응은 주로 시작하고, 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 단계 b) 및 단계 c)는 동시에 일어난다.
제1 효소는 갈락토실 공여체의 이탈기를 방출할 수 있으며, 갈락토실 공여체의 갈락토실기를 갈락토실 수용체로 이전할 수 있다. 예를 들면, 갈락토실 공여체가 락토오스이면, 글루코오스가 방출되며, 갈락토실기는 수용체로 이전된다. 제1 효소는 효소 반응이 일어나는 동안에 촉매로서 작용한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 또한, 제1 효소는 갈락토실기들을 이미 갈락토실화된 갈락토실 수용체들로 이전시켜, 둘, 셋 또는 그 이상의 갈락토실기들을 함유하는 갈락토실 수용체들을 발생시킨다.
배양하는 혼합물의 pH는 바람직하게는 제1 효소의 최적 pH에 가깝다. 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 단계 c) 동안에 배양하는 혼합물의 pH는 pH 3 내지 9의 범위에 있다. 예를 들면, 단계 c) 동안에 배양하는 혼합물의 pH는 pH 5 내지 7.5의 범위에서와 같이, pH 4 내지 8의 범위에 있을 수 있다.
pH에 유사하게, 배양하는 혼합물의 온도는 바람직하게는 사용된 제1 효소의 최적 온도로 조절된다. 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 단계 c)의 배양하는 혼합물의 온도는 10 내지 80℃의 범위에 있다. 배양하는 혼합물의 온도는 예컨대, 20 내지 70℃의 범위, 바람직하게는 25 내지 60℃의 범위 및 더 바람직하게는 30 내지 50℃의 범위에 있을 수 있다.
본 발명의 맥락에서, “제1 효소의 최적 pH”라는 용어는 제1 효소가 최고의 갈락토오스이전반응 활성을 갖는 pH에 관한 것이다. 동일한 선상을 따라, “제1 효소의 최적 온도”라는 용어는 제1 효소가 최고의 갈락토오스이전반응 활성을 갖는 온도에 관한 것이다.
단계 c)는 배양하는 혼합물을 교반하는 단계를 더 포함할 수 있다.
자유 이탈기들의 제거는 단계 c)의 배양하는 동안에 일어난다. 제거는 예를 들면, 단계 c)가 시작하는 즉시 시작할 수 있거나, 현저한 양의 자유 이탈기들이 배양하는 혼합물 내에서 축적하기 시작할 때까지 연기될 수 있다.
자유 이탈기들은 예를 들면, 배양하는 혼합물 내에 존재하는 미생물들에 의하여 배양하는 혼합물로부터 제거될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 방법은 갈락토실 공여체로부터 방출된 자유 이탈기들을 변환할 수 있는 미생물을 제공하는 단계, 및 배양하는 동안에 상기 미생물이 갈락토실 공여체로부터 방출된 이탈기를 제거하도록 하는 단계를 더 포함한다.
유용한 미생물들은 바람직하게는 배양하는 혼합물로부터 자유 이탈기들을 선택적으로 제거하고, 예컨대 이들을 이탈기보다 갈락토-올리고당들의 합성에 덜 간섭하는 변환 생성물들로 대사시키거나 변환시킬 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 10 배 더 높다.
예를 들면, 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 102 배 더 높을 수 있고, 바람직하게는 적어도 103 배 더 높을 수 있으며, 더 바람직하게는 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 104 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 예컨대, 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 105 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 갈락토실 수용체에 대하여 이의 제거율보다 적어도 106 배 더 높은 것도 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 적어도 107 배 더 높을 수 있다.
본 발명의 맥락에서, “제거율”이라는 용어는 미생물이 배양하는 혼합물로부터 분당 제거할 수 있는 자유 이탈기, 공여체, 수용체 또는 모노-갈락토실화된 수용체의 몰 수에 관한 것이다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 갈락토실 공여체에 대한 이의 제거율보다 적어도 10 배 더 높다.
예를 들면, 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 갈락토실 공여체에 대한 이의 제거율보다 적어도 102 배 더 높을 수 있고, 바람직하게는 적어도 103 배 더 높을 수 있으며, 더 바람직하게는 갈락토실 공여체에 대한 이의 제거율보다 적어도 104 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 예컨대, 갈락토실 공여체에 대한 이의 제거율보다 적어도 105 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 갈락토실 공여체에 대하여 이의 제거율보다 적어도 106 배 더 높은 것도 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 적어도 107 배 더 높을 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 10 배 더 높다.
예를 들면, 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 102 배 더 높을 수 있고, 바람직하게는 적어도 103 배 더 높을 수 있으며, 더 바람직하게는 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 104 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 예컨대, 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 105 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 미생물의 제거율은 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대하여 이의 제거율보다 적어도 106 배 더 높은 것도 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 적어도 107 배 더 높을 수 있다.
미생물은 바람직하게는 효모 또는 박테리아이다.
사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 유용한 효모의 일례이며, 유용한 박테리아는 예를 들면, Lac Z-음성 대장균(E. coli) 균주들이거나 글루코오스를 대사시킬 수 있지만, 락토오스는 대사시킬 수 없는 다른 박테리아일 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 자유 이탈기들은 이탈기들을 다른 화학종들로 변환시키는 특정 효소들에 의하여 배양하는 혼합물로부터 제거될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 방법은 갈락토실 공여체로부터 방출된 자유 이탈기들을 변환할 수 있는 제2 효소를 제공하는 단계, 및 배양하는 동안에 상기 효소가 갈락토실 공여체로부터 방출된 이탈기를 변환하도록 하는 단계를 더 포함한다.
“자유 이탈기들을 변환하는”이라는 용어는 자유 이탈기들을 바람직하게는 이와 같이 자유 이탈기들보다 더 빈약한 갈락토실 수용체들인 화학종들로 변환시키는 공정에 관한 것이다. 변환은 자유 이탈기를 몇 개의 더 작은 화학종들로 분해하는 것을 포함할 수 있거나, 단순히 자유 이탈기를 상이한 화학종으로 변환하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 예를 들면, 하기 단계들을 포함하는 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)을 포함하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다:
a) - 350 g/mol 이하의 몰중량을 갖는, 이탈기에 결합된 갈락토실기를 포함하는 갈락토실 공여체,
- 갈락토실 공여체와는 상이한 갈락토실 수용체로서, 상기 갈락토실 수용체는 당 또는 당-알코올인 갈락토실 수용체를 포함하는 혼합물로서,
갈락토실 수용체 및 갈락토실 공여체 사이의 몰비는 적어도 1:10이고, 혼합물은 갈락토실 수용체를 적어도 0.05 mol/L를 포함하는 것인 혼합물을 제공하는 단계,
b) 제1 효소 및 제2 효소를 제공하는 단계로서, 상기 제1 효소는 베타-갈락토시다아제 활성 및 0.9 이하의 T-수치를 가지고, 상기 제2 효소는 갈락토실 공여체로부터 방출된 자유 이탈기들을 변환할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 효소들은 혼합물과 접촉하는 단계, 및
c) 제1 효소가 갈락토실 공여체의 이탈기를 방출하도록 시키고 갈락토실 공여체의 갈락토실기를 갈락토실 수용체로 전이하도록 하여, 갈락토-올리고당을 형성하며, 제2 효소가 갈락토실 공여체로부터 방출된 이탈기를 변환시키도록 하여, 갈락토-올리고당을 포함하는 조성물을 획득하는 단계.
제2 효소는 예를 들면, 육탄당 옥시다아제 활성을 가질 수 있다, 즉, 효소 클래스 EC 1.1.3.5에 속하며, 베타-D-글루코오스가 O2와 산화하는 것을 촉진하여 D-글루코노-1,5-락톤 및 과산화수소를 형성하는 능력을 갖는다.
제2 효소는 글루코오스 옥시다아제 활성을 갖는 것, 즉, 효소 클래스 EC 1.1.3.4에 속하며, 베타-D-글루코오스가 O2와 산화하는 것을 촉진하여 락토오스와 같은 글루코오스-함유 이당들의 현저한 산화 없이 D-글루코노-1,5-락톤 및 과산화수소를 형성하는 능력을 갖는 것이 더 바람직하다.
수용성 산성 환경에서, D-글루코노-1,5-락톤은 통상적으로 가수 분해하여 글루콘산을 형성한다.
대안적으로, 제2 효소는 헥소키나아제 활성(EC 2.7.1.1) 또는 글루코키나아제 활성(EC 2.7.1.2)을 가질 수 있다.
다른 유용한 제2 효소들은 예컨대, 당업자에게 입수 가능한 핸드북들에서 찾을 수 있다.
제2 효소는 이의 자유 이탈기들을 변환시키는 것에 있어서 선택적이며, 갈락토실 공여체, 갈락토실 수용체 및/또는 갈락토-올리고당들을 제한된 정도로만 그리고 바람직하게는 전혀 변환시키지 않는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 10배 더 높다.
예를 들면, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 102 배 더 높을 수 있고, 바람직하게는 적어도 103 배 더 높을 수 있으며, 더 바람직하게는 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 104 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 예컨대, 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 105 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 갈락토실 수용체에 대하여 이의 특이성 상수보다 적어도 106 배 더 높은 것도 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 적어도 107 배 더 높을 수 있다.
“특이성 상수”라는 용어는 kcat/Km로 측정되며, 반응에서 모든 단계들에 대한 속도 상수들을 포함한다. 특이성 상수는 친화성 및 촉매능 양쪽 모두를 반영하기 때문에, 상이한 효소들을 서로 비교하거나, 상이한 기질들을 갖는 동일한 효소를 비교하는 것이 유용하다. 특이성 상수에 대한 이론적 최대치는 확산 제한이라고 하며, 약 108 내지 109 (M?1 s?1)이다. 이 점에서, 효소를 이의 기질과 충돌시킬 때 마다 촉매현상으로 이어질 것이며, 생성물 형성 속도는 반응 속도에 의해서가 아니라 확산 속도에 의하여 제한된다.
제2 효소의 kcat 및 Km은 pH 6.5로 조절된 50 mM Na3PO4 완충제를 이용하여 37 도에서 측정된다. 완충제는 효소의 최적 성능에 요구되는 염들 및 보조인자들(co-factors)을 더 함유한다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 10 배 더 높다.
예를 들면, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 102 배 더 높을 수 있고, 바람직하게는 적어도 103 배 더 높을 수 있으며, 더 바람직하게는 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 104 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 예컨대, 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 105 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 갈락토실 공여체에 대하여 이의 특이성 상수보다 적어도 106 배 더 높은 것도 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 적어도 107 배 더 높을 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체(Gal-X)에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 10 배 더 높다.
예를 들면, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 102 배 더 높을 수 있고, 바람직하게는 적어도 103 배 더 높을 수 있으며, 더 바람직하게는 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 104 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 예컨대, 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 105 배 더 높을 수 있다. 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대하여 이의 특이성 상수보다 적어도 106 배 더 높은 것도 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 적어도 107 배 더 높을 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는
- 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 10 배 더 높고,
- 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 10 배 더 높으며,
- 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 10 배 더 높다.
예를 들면, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는:
- 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 102 배 더 높을 수 있고,
- 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 102 배 더 높을 수 있으며,
- 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 102 배 더 높을 수 있다.
바람직하게는, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는:
- 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 103 배 더 높을 수 있고,
- 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 103 배 더 높을 수 있으며,
- 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 103 배 더 높을 수 있다.
대안적으로, 자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는:
- 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 104 배 더 높을 수 있고,
- 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 104 배 더 높을 수 있으며,
- 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 104 배 더 높을 수 있다.
자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는:
- 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 105 배 더 높을 수 있고,
- 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 105 배 더 높을 수 있으며,
- 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 105 배 더 높을 수 있다.
자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는:
- 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 106 배 더 높고,
- 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 106 배 더 높으며,
- 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 106 배 더 높은 것이 더 바람직하다.
자유 이탈기에 대한 제2 효소의 특이성 상수는 예를 들면:
- 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 107 배 더 높을 수 있고,
- 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 107 배 더 높을 수 있으며,
- 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 107 배 더 높을 수 있다.
제2 효소는 글루코오스 옥시다아제 활성을 가지며, 갈락토실 공여체의 이탈기는 자유 이탈기가 글루코오스인 경우 글루코실기인 것이 특히 바람직하다. 제2 효소가 글루코오스 옥시다아제 활성을 가지면, 락토오스는 바람직한 갈락토실 공여체이다.
글루코오스 옥시다아제는 산화제로서 O2를 요구하며, 물에 용해된 O2의 정상적인 양이 부족하다면 배양하는 혼합물에 여분의 O2(g)를 첨가하는 것이 필요할 수 있다. 필요하다면, 배양하는 혼합물에 FAD(플라빈 아데닌 디뉴클레오티드) 또는 NAD(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드)와 같은 보조-인자들을 첨가하는 것도 가능하다.
상기에 언급된 바와 같이, 글루코오스 옥시다아제는 글루코오스의 D-글루코노-1,5-락톤으로의 산화를 촉진하는 경우, H2O2가 형성되며, 높은 수준의 H2O2는 예컨대, 사용된 효소들의 원하지 않는 산화로 인하여, 공정에 대해 문제가 있을 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 방법은 배양하는 혼합물과 접촉하고, H2O2를 예컨대, H20 및 O2로 분해하는 것을 촉진하는 퍼옥시다아제 또는 카탈라아제 제공하는 단계를 더 포함한다. 글루코오스 옥시다아제들 및 카탈라아제들은 양쪽 모두는 선행기술에 주지되어 있으며, 상업적으로 이용가능하다. 유용한 글루코오스 옥시다아제의 일례는 Glyzyme BG(Novozymes, 덴마크)이다. 유용한 카탈라아제 효소의 일례는 Catazyme 25L(Novozymes, 덴마크)이다. 다른 예는 마이크로코쿠스 리소데익티쿠스(Micrococcus lysodeikticus)(Sigma-Aldrich, 덴마크)로부터 나온 카탈라아제 효소이다.
방법은 배양하는 혼합물을 락토나아제 및 바람직하게는 글루코노락토나아제(EC 3.1.1.17), 즉, D-글루코노-1,5-락톤을 글루콘산 또는 이에 상응하는 염기 글루콘산염으로 가수 분해할 수 있는 효소와 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 배양하는 혼합물은 글루코오스 옥시다아제 활성을 갖는 촉매, 글루코오스 옥시다아제 활성 카탈라아제 활성을 갖는 효소 및 글루코노락토나아제 활성을 갖는 효소와 접촉된다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 방법은 이탈기를 제2 효소를 사용해서 변환시킴으로써 획득되는 변환 생성물의 적어도 일부를 제거할 수 있는 제거제를 제공하는 단계 및 배양하는 동안에 제거제가 변환 생성물의 적어도 일부를 제거하도록 하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 맥락에서, “제거제”라는 용어는 변환 생성물을 포집하고, 예컨대, 침전에 의하여 이를 배양하는 혼합물로부터 제거할 수 있는 미립자 또는 분자 작용제에 관한 것이다.
제거제는 예를 들면, 2가 또는 3가 금속 이온의 염을 포함하거나 이로 구성될 수도 있다. 유용한 금속 이온들의 예들은 Ca2+, Fe2+, Al3+, 또는 Zn2+이다.
본 발명의 바람직한 실시형태들에 있어서, 제거제는 CaCO3를 포함하거나 이로 구성되기도 한다.
예컨대, 글루콘산의 단백제거된 형태인 글루콘산염과 같은 음으로 대전된 변환 생성물들은 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 제거될 수 있다.
따라서, 제거제는 음이온 교환 물질을 포함하거나 이로 구성될 수도 있다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 음이온 교환 물질은 고체상 및 하나 이상의 양이온기(들)을 포함한다.
바람직하게는, 양이온기들의 적어도 일부는 고체상의 외표면에 부착되고/되거나 고체상의 표면을 통하여 접근할 수 있는 기공들의 표면에 부착된다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 음이온 교환 물질의 고체상은 복수개의 입자들, 필터 및 막으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 구성성분들을 포함한다.
고체상은 예를 들면, 다당류를 포함하거나 이로 구성될 수도 있다. 교차결합된 다당들은 특히 바람직하다. 유용한 다당들의 예는 셀룰로오스, 아가로오스 및/또는 덱스트란이다. 대안적으로, 고체상은 비-탄수화물 중합체를 포함하거나 이로 구성될 수도 있다. 유용한 비-탄수화물 중합체들의 예는 메타크릴레이트, 폴리스티렌 및/또는 스티렌-디비닐벤젠이다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 양이온기들은 아미노기들을 포함하거나 이로 구성되기도 한다. 3차 아미노기들은 특히 바람직하며, 적절한 pH 조건들 하에서 4차 암모늄기들이 된다. 4차 암모늄기들은 음이온 교환 물질에 강한 음이온 교환 특성들을 제공한다.
대안적으로 또는 추가적으로, 양이온기들은 하나 이상의 1차 또는 2차 아미노기들을 포함할 수 있다. 실질적인 양의 1차 또는 2차 아미노기들은 통상적으로 음이온 교환 물질에 약한 음이온 교환 특성들을 제공한다.
음이온 교환 크로마토그래피 및 이의 산업적 수행에 관한 더 상세한 사항들은 모든 목적들을 위하여 본원에 참조로 포함된 Scopes에서 찾을 수 있다.
음이온 교환 물질이 변환 생성물을 포집하기 위해 이용되는 경우, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 예컨대, 배양하는 동안에 생성된 변환 생성물의 총량에 대하여 적어도 30%(mol/mol)일 수 있다. 예를 들면, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 배양하는 동안에 생성된 변환 생성물의 총량에 대하여 적어도 50%(mol/mol)일 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 배양하는 동안에 생성된 변환 생성물의 총량에 대하여 적어도 80%(mol/mol)일 수 있다.
제거제는 이를 채용하는 경우, 바람직하게는 합성 공정 동안에 형성된 변환된 이탈기의 이론적 양을 침전시키거나 포집하는데 충분한 양으로 존재한다.
따라서, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 예컨대, 배양하는 동안에 생성된 변환 생성물의 총량에 대하여 적어도 100%(mol/mol)일 수 있다. 예를 들면, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 배양하는 동안에 생성된 변환 생성물의 총량에 대하여 적어도 150%(mol/mol)일 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 배양하는 동안에 생성된 변환 생성물의 총량에 대하여 적어도 200%(mol/mol)일 수 있다.
배양하는 동안에 생성된 변환 생성물의 총량은 예를 들면, 계획된 공정 조건들 및 사용된 효소(들)에 관한 운동학적 데이터로부터 추정될 수 있다.
대안적으로, 방출된 이탈기들의 예상량은 음이온 교환 물질을 투여하는 지침으로 이용될 수 있다. 따라서, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 예컨대, 배양하는 동안에 방출된 이탈기들의 총량에 대하여 적어도 30%(mol/mol)일 수 있다. 예를 들면, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 배양하는 동안에 방출된 이탈기들의 총량에 대하여 적어도 50%(mol/mol)일 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 배양하는 동안에 방출된 이탈기들의 총량에 대하여 적어도 80%(mol/mol)일 수 있다.
음이온 교환 물질의 총 결합능은 예컨대, 배양하는 동안에 방출된 이탈기들의 총량에 대하여 적어도 100%(mol/mol)일 수 있다. 예를 들면, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 배양하는 동안에 방출된 이탈기들의 총량에 대하여 적어도 150%(mol/mol)일 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 물질의 총 결합능은 배양하는 동안에 방출된 이탈기들의 총량에 대하여 적어도 200%(mol/mol)일 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 방법은 상대적으로 낮은 농도의 갈락토실 공여체가 이용되더라도 갈락토-올리고당들의 높은 수율을 놀랍게도 제공한다는 것을 알게 되었다. 상대적으로 낮은 농도의 갈락토실 공여체는 공여체의 자가-갈락토실화의 정도를 추가적으로 감소시키는데, 즉, 제1 갈락토실 공여체의 갈락토실기가 갈락토실 수용체 대신에 제2 갈락토실 공여체로 이전되는 경우 그러하다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 단계 c)는 혼합물에 갈락토실 공여체를 더 첨가하는 것을 포함한다. 이는 상대적으로 낮은 농도의 갈락토실 공여체가 이용되는 경우 특히 바람직하다. 갈락토실 공여체를 더 첨가함으로써, 혼합물 내에서 갈락토실 공여체가 고갈되고 있는 것을 회피하며, 갈락토실 공여체의 농도는 효소 반응 동안에 조절될 수 있다.
갈락토실 공여체를 더 첨가하는 것은 갈락토실 공여체를, 예컨대, 효소 반응 동안에 적어도 1회 별개로 첨가하는 것(들)을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 갈락토실 공여체를 더 첨가하는 것은 효소 반응 동안에 연속으로 첨가하는 것일 수 있다. 추가적인 갈락토실 공여체는 바람직하게는 단계 a)에 사용된 것과 동일한 종류이다.
단계 c)는 예를 들면, 배양하는 동안에 갈락토실 공여체의 농도를 측정하는 단계 및 농도가 너무 낮다면 여분의 갈락토실 공여체를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 단계 c) 동안에 혼합물의 갈락토실 공여체의 농도는 0.01 내지 1 mol/L의 범위, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mol/L의 범위 및 바람직하게는 0.03 내지 0.3 mol/L의 범위의 농도에서 유지된다.
예를 들면, 단계 c) 동안에 혼합물의 갈락토실 공여체의 농도는 0.02 내지 0.1 mol/L의 범위의 농도에서 유지될 수 있다.
단계 c)는 갈락토실 수용체를 더 첨가하는 것을 더 포함할 수 있다. 이는 단계 c) 동안에 혼합물의 갈락토실 수용체의 농도를 조절하고, 예컨대, 이를 원한다면 갈락토실 수용체 농도를 실질적으로 일정하게 유지하는 것이 가능하게 한다.
둘 또는 세 개의 이전된 갈락토실기들을 함유하는 갈락토-올리고당들의 현저한 양을 생성하기 위하여, 공정은 갈락토실 수용체보다 더 많은 갈락토실 공여체를 소비하여야 한다. 이에 의하여, 더 많은 갈락토실 수용체들은 2 배 또는 3 배 갈락토실화될 것이다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 소비된 갈락토실 공여체 및 소비된 갈락토실 수용체 사이의 몰비는 적어도 1:1 및 바람직하게는 적어도 5:1 및 더 바람직하게는 적어도 10:1이다.
단계 c)는 통상적으로 효소들을 비활성화시킴으로써, 예컨대, 제1 효소를 열처리에 의하여 변성시키거나, 제1 효소와 배양된 혼합물의 탄수화물들 사이의 접촉을 단절시킴으로써 종료한다. 제1 효소가 고체상에 고정된 효소라면, 접촉은 예컨대, 고체상 및 배양된 혼합물을 분리시킴으로써 단절될 수 있다. 제1 효소가 혼합물에 용해되었다면, 제1 효소는 제1 효소를 보유하지만, 올리고당들의 통과를 허용하는 필터를 이용하여 한외여과에 의하여 배양된 혼합물로부터 분리될 수 있다.
종종, 조성물의 갈락토-올리고당들을 강화시키고(enrich)/시키거나 정제하며, 갈락토실 수용체, 갈락토실 공여체 및 방출된 이탈기의 농도를 감소시키는 것이 요구된다.
따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 방법은: d) 단계 c)의 조성물의 갈락토-올리고당들을 강화시키는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 맥락에서, “갈락토-올리고당들을 강화시키는 단계”라는 용어는 건조 중량 기준으로 조성물의 갈락토-올리고당들의 상대적 양을 증가시키는 것에 관한 것이다. 이는 조성물의 다른 고체들 중 일부, 예컨대, 저급 당들, 및 선택적으로는 필요한 경우에 제1 효소도 제거함으로써 수행된다.
단계 d)의 강화시키는 것은 예를 들면, 크로마토그래피적 분리 및/또는 나노여과를 포함할 수 있다. 그러한 공정들에 관한 상세사항들은 모든 목적들을 위해 본원에 참조로 포함된 Walstra 등(2006)에 기재되어 있다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 강화시키는 것은 200 g/mol 이하의 몰중량을 갖는 분자들의 적어도 50%(w/w, 건조 중량 기준)는 단계 c)의 조성물로부터 제거되는 것을 포함한다. 예를 들면, 강화시키는 것은 200 g/mol 이하의 몰중량을 갖는 분자들의 적어도 80%(w/w, 건조 중량 기준)는 단계 c)의 조성물로부터 제거되는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태들에 있어서, 강화시키는 것은 350 g/mol 이하의 몰중량을 갖는 분자들의 적어도 50%(w/w, 건조 중량 기준)는 단계 c)의 조성물로부터 제거되는 것을 포함한다. 예를 들면, 강화시키는 것은 350 g/mol 이하의 몰중량을 갖는 분자들의 적어도 80%(w/w, 건조 중량 기준)는 단계 c)의 조성물로부터 제거되는 것을 포함할 수 있다.
대안으로서 또는 추가적으로, 강화시키는 것에, 단계 d)는 조성물 내에 갈락토-올리고당들의 농도를 증가시키는 하나 이상의 공정들을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 유용한 농도 단계들의 예는 예컨대, 역삼투, 증발 및/또는 분사-건조이다.
단계 d)는 제거제 및/또는 제거제에 결합된 변환된 이탈기들을 단계 c)의 조성물로부터 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 그러한 제거하는 것은 예컨대, 여과, 침강 또는 원심분리에 의하여 수행될 수 있다.
방법에 의하여 제공된 갈락토-올리고당-함유 조성물은 예를 들면, 건조한 분말의 형태이거나 시럽의 형태일 수 있다.
건조 분말의 제조는 통상적으로 농축(concentrating), 증발, 및/또는 분사-건조와 같은 하나 이상의 공정 단계들을 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 단계 d)는 액체 형태의 조성물을 농축, 증발 및/또는 분사-건조시켜 분말 형태의 조성물을 획득하는 단계를 더 포함한다. 단계 d)의 액체 조성물을 분사-건조시켜 분말된 조성물을 획득하는 것이 특히 바람직하다. 단계 d)는 예를 들면, 강화시키는 단계 이후에 농축시키는 단계, 예컨대, 나노여과, 역삼투, 또는 증발 이후에, 분사-건조시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 단계 d)는 농축시키는 단계 이후에, 강화시키는 단계, 이후에 분사-건조시키는 단계를 포함할 수 있다. 강화시키는 것 이전에 조성물의 갈락토-올리고당들을 농축시키는 것은 이후 강화시키는 공정을 더 비용-효율적으로 만들 수 있다.
효율적인 분사-건조하는 단계는 말토덱스트린, 유단백질, 카제인염, 유당 단백질 농축물 및/또는 탈지-유 분말과 같은 하나 이상의 보조제(들)을 첨가하는 것을 요구할 수 있다.
본 공정은 예컨대, 배치 공정으로 구현될 수 있다. 본 공정은 대안적으로, 페드(fed)-배치 공정으로 구현될 수 있다. 본 공정은 대안적으로, 연속 공정으로 구현될 수 있다.
본 공정은 제1 효소 및/또는 미사용된 갈락토실 수용체의 혼합물로 다시 재순환하는 것을 더 포함할 수 있다. 재순환은 예컨대, 단계 d)의 부분을 형성할 수 있다. 예를 들면, 단계 d)는 갈락토실 수용체 및/또는 제1 효소를 갈락토-올리고당-함유 조성물로부터 분리하는 단계 및 갈락토실 수용체 및/또는 제1 효소를 단계 a) 또는 c)로 재순환시키는 공정을 포함할 수 있다. 배치 공정 또는 페드-배치 공정의 경우, 갈락토실 수용체 및/또는 제1 효소는 다음번 배치의 혼합물로 재순환될 수 있다.
연속 공정의 경우, 갈락토실 수용체는 단계 a) 또는 단계 c)에 상응하는 공정 라인의 부분으로 다시 재순환될 수 있다. 제1 효소는 단계 b) 또는 단계 c)에 상응하는 공정 라인의 부분으로 다시 재순환될 수 있다.
단계 a) 및 단계 b)에 관련된 상세사항들 및 특징들은 제조 공정의 실제적 시작에 관련될 필요가 없지만, 공정이 진행되는 동안에 언젠가 적어도 일어나야 된다는 것에 주목해야 된다. 그러나, 본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 갈락토실 공여체의 농도는 단계 c)가 전체적으로 지속하는 동안에 단계 a)에 기재된 범위 내에서 유지된다.
만약 방법이 배치 또는 피드 배치 공정으로 구현되면, 단계 a)는 바람직하게는 합성이 시작되는 경우 혼합물의 조성물에 관한 것이다. 만약 방법이 연속 공정이면, 단계 a)는 바람직하게는 정상 상태 운전 하에서 합성이 진행되는 동안에 혼합물의 조성물에 관한 것이다.
갈락토실화된 갈락토실 공여체는 갈락토실화된 갈락토실 수용체로부터 분리하기 까다로운 원하지 않는 불순물로서 인식될 수 있기 때문에, 갈락토실화된 갈락토실 공여체의 수준이 가능한 한 낮게 유지되는 것은 바람직하다고 인식될 수 있다. 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 단계 c)의 배양하는 혼합물은 갈락토실화된 갈락토실 공여체를 0.5 mol/L 이하 함유한다. 단계 c)의 배양하는 혼합물은 예를 들면, 갈락토실화된 갈락토실 공여체를 0.1 mol/L 이하 함유할 수 있다. 더 바람직하게는, 단계 c)의 배양하는 혼합물은 갈락토실화된 갈락토실 공여체를 0.01 mol/L 이하, 및 바람직하게는 갈락토실화된 갈락토실 공여체를 실질적으로 함유하지 않는다.
공여체가 락토오스인 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 알로-락토오스 및 갈락토실화된 알로-락토오스의 총 농도는 가능한 한 낮게 유지되는데, 이는 이러한 화합물들도 갈락토실화된 갈락토실 수용체로부터 분리하기 어려운 원하지 않는 불순물들로 인식되기 때문이다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 단계 c)의 배양하는 혼합물은 알로-락토오스 및 갈락토실화된 알로-락토오스의 총량을 0.5 mol/L 이하로 함유한다. 단계 c)의 배양하는 혼합물은 예를 들면, 알로-락토오스 및 갈락토실화된 알로-락토오스의 총량을 0.1 mol/L 이하로 함유할 수 있다. 더 바람직하게는, 단계 c)의 배양하는 혼합물은 알로-락토오스 및 갈락토실화된 알로-락토오스의 총량을 0.01 mol/L 이하로 함유하며, 바람직하게는 실질적으로 알로-락토오스 및 갈락토실화된 알로-락토오스를 전혀 함유하지 않는다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 정의된 방법에 의하여 획득될 수 있는, 갈락토-올리고당들을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 갈락토-올리고당-함유 조성물, 예컨대, 상기-언급된 조성물, 하기 사항들을 포함하는 상기 갈락토-올리고당-함유 조성물이다:
- 일반식 Gal-X를 갖는 제1 갈락토-올리고당,
- 예컨대, 일반식 Gal-Gal-X와 같은 화학량론식 (Gal)2X를 갖는 제2 갈락토-올리고당,
- 예컨대, 일반식 Gal-Gal-Gal-X와 같은 화학량론식 (Gal)3X를 갖는 제3 갈락토-올리고당으로서,
X는 락토실 또는 글루코실이 아닌 글리코실기이다.
본원에 기재된 갈락토-올리고당-함유 조성물은 예를 들면, 식품 성분일 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, “X” 또는 “-X”는 바람직하게는 본원에 언급된 갈락토실 수용체들의 하나의 글리코실기이다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, “X” 또는 “-X”는 글루코오스가 아닌 단당류의 글리코실기이다. 본 발명의 다른 실시형태들에 있어서, “-X”는 락토오스가 아닌 이당류의 글리코실기이다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, “X” 또는 “-X”는 푸코실기이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시형태들에 있어서, “X” 또는 “-X”는 갈락토실기이다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토-올리고당-함유 조성물은 - 갈락토-올리고당들 Gal-X, (Gal)2X, 및 (Gal)3X의 총량 및 - 갈락토-올리고당들 Gal-Glc, Gal2Glc, Gal3Glc의 총량 사이에 적어도 5:95의 몰비를 갖는다.
예를 들면, 상기-언급된 몰비는 적어도 1:4, 바람직하게는 적어도 1:1 및 더 바람직하게는 적어도 2:1일 수 있다. 상기 언급된 몰비는 적어도 5:1, 바람직하게는 적어도 10:1 및 더 바람직하게는 적어도 20:1인 것도 바람직할 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토-올리고당-함유 조성물은 - 갈락토-올리고당들 Gal-X, Gal-Gal-X, 및 Gal-Gal-Gal-X의 총량 및 - 갈락토-올리고당들 Gal-Glc, Gal-Gal-Glc, Gal-Gal-Gal-Glc의 총량 사이에 적어도 5:95의 몰비를 갖는다.
예를 들면, 상기-언급된 몰비는 적어도 1:4, 바람직하게는 적어도 1:1 및 더 바람직하게는 적어도 2:1일 수 있다. 상기 언급된 몰비는 적어도 5:1, 바람직하게는 적어도 10:1 및 더 바람직하게는 적어도 20:1인 것도 바람직할 수 있다.
갈락토-올리고당-함유 조성물은 식 Gal-Glc, Gal-Gal-Glc, 및 Gal-Gal-Gal-Glc의 갈락토-올리고당들을 전혀 함유하지 않는 것도 가능하다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 갈락토-올리고당-함유 조성물은 제1 갈락토-올리고당, 제2 갈락토-올리고당 및 제3 갈락토-올리고당을 50 내지 99: 1 내지 45: 0.5 내지 25의 범위에 있는 몰비를 갖는다.
본 발명의 다른 실시형태들에 있어서, 갈락토-올리고당-함유 조성물은 제1 갈락토-올리고당, 제2 갈락토-올리고당 및 제3 갈락토-올리고당을 20 내지 45: 20 내지 45: 20 내지 45의 범위에 있는 몰비를 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시형태들에 있어서, 갈락토-올리고당-함유 조성물은 제1 갈락토-올리고당, 제2 갈락토-올리고당 및 제3 갈락토-올리고당을 0.5 내지 25: 1 내지 45: 50 내지 98의 범위에 있는 몰비를 갖는다.
본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토-올리고당-함유 조성물은 제1 갈락토-올리고당, 제2 갈락토-올리고당 및 제3 갈락토-올리고당의 총량을 갈락토-올리고당-함유 조성물의 총 중량에 대하여 적어도 10 중량%로 포함한다. 예를 들면, 갈락토-올리고당-함유 조성물은 제1 갈락토-올리고당, 제2 갈락토-올리고당 및 제3 갈락토-올리고당의 총량을 갈락토-올리고당-함유 조성물의 총 중량에 대하여 적어도 20 중량%, 바람직하게는 적어도 30 중량%, 더욱 바람직하게는 갈락토-올리고당-함유 조성물의 총 중량에 대하여 적어도 40%로 포함할 수 있다.
훨씬 더 높은 수준의 제1, 제2 및 제3 갈락토-올리고당들이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 바람직한 실시형태들에 있어서, 갈락토-올리고당-함유 조성물은 제1 갈락토-올리고당, 제2 갈락토-올리고당 및 제3 갈락토-올리고당의 총량을 갈락토-올리고당-함유 조성물의 총 중량에 대하여 적어도 50 중량%로 포함한다. 예를 들면, 갈락토-올리고당-함유 조성물은 제1 갈락토-올리고당, 제2 갈락토-올리고당 및 제3 갈락토-올리고당의 총량을 갈락토-올리고당-함유 조성물의 총 중량에 대하여 적어도 60 중량%, 바람직하게는 적어도 70 중량%, 더욱 바람직하게는 갈락토-올리고당-함유 조성물의 총 중량에 대하여 적어도 80%로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본원에 기재된 갈락토-올리고당-함유 조성물을 포함하는 식품 제품에 관한 것이다.
본 발명의 일부 실시형태들에 있어서, 식품 제품은 유아 분유 또는 임상 영양용 제품과 같은 기능성 식품 제품이다.
본 발명의 다른 실시형태들에 있어서, 식품 제품은 예컨대, 빵 또는 유사 제품들과 같은 구운 도우(dough)를 포함하는 구운 제품이다.
본 발명의 다른 실시형태들에 있어서, 식품 제품은 유제품, 예컨대, 우유와 같은 신선한 유제품, 또는 요구르트와 같은 발효된 유제품이다.
본 발명의 또 다른 실시형태들에 있어서, 식품 제품은 애완동물 식품 제품이다.
본 발명의 양태들 중 하나의 맥락에서 기재된 실시형태들 및 특징들도 본 발명의 다른 양태들에 적용된다는 것에 주목해야 된다.
본 발명은 이제 하기 비-한정 예들에서 더 상세히 기재될 것이다.
실시예
갈락토오스이전반응 활성을 갖는 베타-갈락토시다아제의 제조
750 mL의 작동 부피의 발효 매질은 12 시간 동안 성장시킨 3.0의 OD600를 갖는 100 mg/L 암피실린으로 보충한 용원성 육즙(Lysogeny broth: LB) 배지의 2 mL 출발 배양물로 접종되었다. 발효는 2%(w/v) 효모 추출물, 2%(w/v) 대두 펩톤, 1%(w/v) 글루코오스 및 100 mg/L 암피실린을 함유하는 EC 매질에서 수행되었다. (SEQ ID NO 2의 Val(33) 내지 Ile(1174)의 서열을 갖는) OLGA347 β-갈락토시다아제를 발현하는 대장균 균주는 앞에서 기재된 바와 같이 제조되었다(JØrgensen 등, 미국 특허 번호 제6,555,348 B2호, 실시예 1 및 2). 발효기는 총 부피 2 L의 유리 접시 바닥 용기들을 가진 Applikon 사로부터 구입한 것으로서, 2 개의 러쉬톤(Rushton) 임펠러들을 구비하였다. 발효가 진행되는 동안에, pH는 2 M NaOH 및 2 M H3PO4를 적절히 첨가하여 pH 6.5에서 유지되었으며, 온도는 37℃로 조절되었다. 산소는 1 내지 2 L/분의 속도로 공기로 버블링함으로써 공급되었으며, pO2는 교반 속도를 증가시킴으로써 30%에서 유지되었다. 성장시킨 이후에 OD600을 오프라인 판독하였다. 배양물은 29.7의 OD600 수치에서 대략 10 시간 동안 성장시킨 이후에 원심분리에 의하여 채취되었다. 650 mL 배양 상청액은 -20℃에서 저장되었다. 원형질막주위(periplasmic) 단백질들은 세포 펠릿을 200 mL 수크로오스 완충제(30 mM Tris-HCl, 40% 수크로오스, 2 mM EDTA, pH 7.5)에 재현탁시키고 실온에서 10 분 동안 배양시킴으로써 삼투압 충격에 의하여 세포 펠릿으로부터 단리되었다. 원심분리 이후에, 상청액은 폐기되었으며, 펠릿은 200 mL 냉수에 재현탁되었다. 포화 MgCl2 용액 83 ㎕가 첨가되었으며, 원형질막주위 단백질들을 함유하는 상청액은 원심분리 단계에 의하여 수집되었다. 원형질막주위 분획은 0.2 ㎛ Millipak 40 필터를 통해 필터 살균되었으며, -20℃에서 저장되었다.
200 mL 원형질막주위 분획 및 650 mL 배양 상청액의 β-갈락토시다아제 활성은 프로토콜(J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning - A laboratory manual, 3rd edition (2001), pp. 17.48-17.51)에 따라 기질로서 o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드를 이용하여 측정되었다. 활성의 대부분은 원형질막주위 분획(525 단위, 98%에 해당)에서 발견되었다.
갈락토오스이전반응 활성을 갖는 제2 베타-갈락토시다아제의 제조
제2 베타-갈락토시다아제(OLGA917)는 실시예 1에 기재된 라인을 따르지만, SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)의 발현에 기초하여 제조되었다.
베타-갈락토시다아제 효소의 T-수치의 측정
베타-갈락토시다아제 효소의 T-수치는 아래에 주어진 시험 및 식에 따라서 측정된다.
시험:
시험 대상인 베타-갈락토시다아제 효소, 10 mM 시트르산 나트륨, 1 mM 시트르산 마그네슘, 1 mM 시트르산 칼슘, Milli-Q 물(Millipore, 미국)으로 구성되며 6.5의 pH를 갖는 효소 용액 3.3 mL를 제조하라. 효소 용액은 현재 시험 조건 하에서 1 시간 내에 첨가된 락토오스의 33%(w/w)를 사용하기 충분한 양으로 베타-갈락토시다아제 효소를 함유하여야 한다. 효소 용액의 온도는 37℃여야 한다.
시간 = T0에서, 82.5 mg 락토오스 일수화물(생화학용, 독일 Merck 사)이 효소 용액에 첨가되고 혼합되었으며, 이후, 혼합물은 37℃에서 4 시간 동안 배양된다. T0에서 정확히 1 시간 이후에, 100 ㎕ 표본이 수거되었고, Milli-Q 수로 1:5로 희석되었으며, 85℃로 10 분 동안 가열함으로써 비활성된다. 비활성화된 혼합물은 특성화 되기까지 -20℃에서 유지된다.
특성화:
생성된 갈락토오스의 양(mol) 및 사용된 락토오스의 양(mol)의 측정은 임의의 적당한 분석 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 희석된 혼합물은 Richmond 등(1982) 및 Simms 등(1994)에 의하여 기재된 방법에 따라 HPLC에 의하여 분석될 수 있다. 다른 유용한 분석 기법들은 El Razzi(2002)에 기재되어 있다.
적당한 분석 기법의 다른 예는 ISO 5765-2:2002(IDF 79-2: 2002) “건조된 우유, 건조된 얼음-믹스들 및 가공 치즈 - 락토오스 함량의 측정 - 파트 2: 락토오스의 갈락토오스 부위를 활용한 효소 방법”이다.
T-수치의 계산:
T-수치는 시험의 희석된 혼합물의 특성화로부터 획득된 데이터를 이용하여 하기 식에 따라 계산된다:
실시예 - OLGA347 효소의 T-수치:
상기-언급된 시험은 실시예 1의 OLGA347 효소를 이용하여 수행되었다.
시험으로부터 획득한 희석된 혼합물은 분석 HPLC를 통해 변환된(즉, 사용된) 락토오스 및 발생된 갈락토오스에 대하여 분석되었다. HPLC 장치는 Waters 사로부터 구입하였으며, 시차 굴절계(RI-검출기) 및 BioRad Aminex HPX-87C 칼럼(300x7.8 mm, 125-0055)를 구비하였다. 당들의 용출은 0.05 g/L CaAcetate, 0.3 mL/분의 유량 및 20 ㎕의 주입 부피로 등용매적으로(isocratically) 수행되었다.
획득된 데이터는 자동화된 소프트웨어에 의하여 적절히 기준선 보정되었고, 피크들은 개별적으로 확인되고 통합되었다. 정량화는 락토오스 일수화물(생화학용, 독일 Merck 사), D-(+)-글루코오스 일수화물(생화학용, 프랑스 Merck Eurolab 사) 및 D-(+)-갈락토오스(≥99%, 이태리 Sigma-Aldrich 사)의 외부 표준화들을 이용하여 수행되었다.
각 시간 T에서의 락토오스의 변환 및 갈락토오스의 형성은 정량화된 데이터로부터 계산되었다. 시간 T=1 h에서, 수거된 100 ㎕ 표본 내의 락토오스의 29%는 변환되었으며, 이는 2.3 μmol 락토오스에 해당한다. 시간 T=1에서, 0.5 μmol 갈락토오스가 수거된 100 ㎕ 표본 내에서 형성되었다. 그러므로, T-수치는 0.5 μmol / 2.3 μmol = 0.2로 계산될 수 있다.
시험으로부터 획득한 희석된 혼합물도 효소 방법 ISO 5765-2를 통해 변환된(즉, 사용된) 락토오스 및 발생된 갈락토오스에 대하여 분석되었다. R-Biopharm 사로부터 구입한 베링거 만하임(Boehringer Mannheim) 락토오스/D-갈락토오스 시험-키트(카탈로그 번호. 10 176 303 035)가 사용되었으며, 프로토콜에 따라 시험이 수행되었다. 효소 방법은 OLGA347-효소의 T-수치가 0.2임을 확인하였다.
실시예 - OLGA917 효소의 T-수치:
상기-언급된 T-수치 시험은 실시예 2에서 제조된 OLGA917 효소를 이용하여 수행되었으며, T-수치는 상기 설명된 절차를 따라 측정되었다.
OLGA917 효소의 T-수치는 0.3으로 측정되었다.
실시예 - 종래 락타아제 효소의 T-수치:
상기-언급된 시험은 상업적으로 이용가능한 종래 락타아제 효소 Lactozym Pure 2600L(Novozymes, 덴마크)을 이용하여 수행되었다. 시험으로부터 획득한 희석된 혼합물은 OLGA347 효소에 대하여 기재된 바와 같이 분석되었다. 삼당류 및 사당류는 검출가능한 양으로 존재하지 않았으며, 글루코오스 및 갈락토오스는 동일한 양을 보였다. 이에 상응하는 T-수치는 1이다.
대장균(제품 번호: G6008, Sigma-Aldrich 사, 독일) 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)(제품 번호: G5160, Sigma-Aldrich 사, 독일)로부터 상업적으로 이용가능한 베타-갈락토시다아제의 T-수치들도 측정되었으며, 양 효소들은 대략 1.0)의 T-수치를 갖는다.
공여체 분자들의 순차 첨가 및 글루코오스 이탈기들의 변환에 의한 L-푸코실-함유 헤테로-갈락토-올리고당들의 합성
표 7에서 나타난 바와 같은 양의 L-(-)-푸코오스 및 락토오스 일수화물은 100 mL MilliQ 물에 용해되었다. 각각의 표본은 37℃의 온도에서 유지되었으며, pH는 NaOH를 연속적으로 첨가하여 6.5에서 유지된다. 공기는 100 L/분의 속도로 혼합물을 통해 연속적으로 펌핑되었다. 글루코오스 옥시다아제 효소(GOX, DuPont 사, 덴마크)는 표본 2에 첨가되었다. 글루코오스 옥시다아제 효소(Gluzyme, Novozymes 사, 덴마크)는 표본 3에 첨가되었다. 마이크로코쿠스 리소데익티쿠스(Micrococcus lysodeikticus)(Sigma-Aldrich 사, 덴마크)로부터 얻은 카탈라아제 효소는 표본 2 및 3에 첨가되었다. 실시예 2의 OLGA917 효소는 각각의 표본에 첨가되었다. MilliQ 물은 250 mL의 총 공정 부피에 첨가되었다. 이 시간은 T=0으로 정의하였다. 락토오스 일수화물은 30 분의 간격으로 5 시간의 기간에 걸쳐서 표본들에 첨가되었다.
| 표본 | 1(대조군) | 2 | 3 |
| L-푸코오스의 시작 농도 | 10 % | 10 % | 10 % |
| 락토오스 일수화물의 시작 농도 | 5 % | 5% | 5% |
| 락토오스의 첨가 / 30 분 | 2.63 g | 2.63 g | 2.63 g |
| 글루코오스 옥시다아제의 양 | - | 100.45 mg |
110.50 mg |
| 글루코오스 옥시다아제의 특이 활성 | - | 11,000 U/g | 10,000 U/g |
| 카탈라아제의 양 | - | 20 ㎕ | 20 ㎕ |
| 카탈라아제의 특이 활성 | - | 170,000 U/mL | 170,000 U/mL |
| OLGA 효소의 양 | 5 mL | 5 mL | 5 mL |
T=4h 및 T=5h로부터 얻은 시험 표본들은 실시예 7에 따라 HPLC에 의하여 분석되었으며, 갈락토실화된 푸코오스를 현저한 양으로 함유한다는 것을 알게 되었다.
L-푸코실-함유 헤테로-갈락토-올리고당들의 합성 및 공여체 분자들의 순차 첨가 없는 글루코오스 이탈기들의 변환 및 제거
표 8에서 나타난 바와 같은 양의 L-(-)-푸코오스 및 락토오스 일수화물은 100 mL MilliQ 물에 용해되었다. 각각의 표본은 37℃의 온도에서 유지되었으며, pH는 NaOH를 연속적으로 첨가하여 6.5에서 유지되었다. 공기는 100 L/분의 속도로 혼합물을 통해 연속적으로 펌핑되었다. 음이온 교환 수지(Dowex 66, Sigma-Aldrich 사, 미국)는 제조되고 표본 3에 첨가되었다. 글루코오스 옥시다아제 효소(GOX, DuPont 사, 덴마크)는 표본 2 및 3에 첨가되었다. 마이크로코쿠스 리소데익티쿠스(Micrococcus lysodeikticus)(Sigma-Aldrich 사, 덴마크)로부터 얻은 카탈라아제 효소는 표본 2 및 3에 첨가되었다. 실시예 2의 OLGA917 효소는 각각의 표본에 첨가되었다. MilliQ 물은 표 8에 나타낸 바와 같이 총 공정 부피에 첨가되었다. 이 시간은 T=0으로 정의하였다.
| 표본 | 1(대조군) | 2 | 3 |
| L-푸코오스의 시작 농도 | 10 % | 10 % | 10 % |
| 락토오스 일수화물의 시작 농도 | 15 % | 15% | 15% |
| 글루코오스 옥시다아제의 양 | - | 100.45 mg | 100.45 mg |
| 글루코오스 옥시다아제의 특이 활성 | - | 11,000 U/g | 11,000 U/g |
| 카탈라아제의 양 | - | 20 ㎕ | 20 ㎕ |
| 카탈라아제의 특이 활성 | - | 170,000 U/mL | 170,000 U/mL |
| 이온 교환 수지의 부피 | - | - | 40 mL |
| 약염기 교환 용량 | - | - | 1.35 meq/mL |
| OLGA 효소의 양 | 5 mL | 5 mL | 5 mL |
| 총 공정 부피 | 250 mL | 250 mL | 250 mL |
T=4h 및 T=5h로부터 얻은 시험 표본들은 실시예 7에 따라 HPLC에 의하여 분석되었으며, 갈락토실화된 푸코오스를 현저한 양으로 함유한다는 것을 알게 되었다.
공여체 분자들의 순차 첨가에 의한 L-푸코실-함유 헤테로-갈락토-올리고당들의 합성, 글루코오스 이탈기들의 변환 및 변환된 이탈기들의 제거
표 9에서 나타난 바와 같은 양의 L-(-)-푸코오스 및 락토오스 일수화물은 100 mL MilliQ 물에 용해되었다. 각각의 표본은 37℃의 온도에서 유지되었으며, pH는 NaOH를 연속적으로 첨가하여 6.5에서 유지되었다. 공기는 100 L/분의 속도로 혼합물을 통해 연속적으로 펌핑되었다. 음이온 교환 수지(Dowex 66, Sigma-Aldrich 사, 미국)는 제조되고 각각의 표본에 첨가되었다. 글루코오스 옥시다아제 효소(GOX, Danisco/DuPont 사, 덴마크)는 표본 2에 첨가되었다. 글루코오스 옥시다아제 효소(Gluzyme, Novozymes, 덴마크)는 표본 3에 첨가되었다. 마이크로코쿠스 리소데익티쿠스(Micrococcus lysodeikticus)(Sigma-Aldrich 사, 덴마크)로부터 얻은 카탈라아제 효소는 표본 2 및 3에 첨가되었다. 실시예 2의 OLGA917 효소는 각각의 표본에 첨가되었다. MilliQ 물은 250 mL의 총 공정 부피에 첨가되었다. 이 시간은 T=0으로 정의하였다. 락토오스 일수화물은 30 분의 간격으로 5 시간의 기간에 걸쳐서 표본들에 첨가되었다.
| 표본 | 1(대조군) | 2 | 3 |
| L-푸코오스의 시작 농도 | 10 % | 10 % | 10 % |
| 락토오스 일수화물의 시작 농도 | 5 % | 5% | 5% |
| 락토오스의 첨가 / 30 분 | 1,06 g | 1,06 g | 1,06 g |
| 글루코오스 옥시다아제의 양 | - | 40 mg | 45 mg |
| 글루코오스 옥시다아제의 특이 활성 | - | 11,000 U/g | 10,000 U/g |
| 카탈라아제의 양 | - | 10 ㎕ | 10 ㎕ |
| 카탈라아제의 특이 활성 | - | 170,000 U/mL | 170,000 U/mL |
| 이온 교환 수지의 부피 | 40 mL | 40 mL | 40 mL |
| 약염기 교환 용량 | 1.35 meq/mL | 1.35 meq/mL | 1.35 meq/mL |
| OLGA 효소의 양 | 2 mL | 2 mL | 2 mL |
T=4 및 5 h의 시간에서, 1500 ㎕ 시험 표본들을 취해 실시예 7에 따라 HPLC 및 질량 분광법에 의하여 분석하였다. 표본들은 갈락토실화된 푸코오스를 현저한 양으로 함유한다는 것을 알게 되었다. 질량 분광법의 결과들은 도 4 내지 6에 도시되어 있다.
도 4는 배양하는 동안에 자유 이탈기들의 제거 유무에 따라 4 시간 배양한 이후에 갈락토실화된 푸코오스의 이당류, 삼당류 및 사당류의 통합된 반응의 플롯을 보여준다. 자유 이탈기들(글루코오스)은 효소적 변환에 의하여 제거된다. 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되는 경우 갈락토실화된 푸코오스의 함량은 증가한다는 것을 알게 된다.
도 5는 배양하는 동안에 자유 이탈기들의 제거 유무에 따라 5 시간 배양한 이후에 갈락토실화된 푸코오스의 이당류, 삼당류 및 사당류의 통합된 반응의 플롯을 보여준다. 다시, 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되는 경우 갈락토실화된 푸코오스의 함량은 증가한다는 것을 알게 된다.
도 6은 배양하는 동안에 자유 이탈기들의 제거 유무에 따라 갈락토실화된 공여체/이탈기의 전체 통합된 반응(전체 GOS)과 비교하여 갈락토실화된 푸코오스의 전체 통합된 반응(전체 HOS)의 플롯을 보여준다. 갈락토실화된 공여체/이탈기의 전체 통합된 반응은 Gal-Glc, Gal-Gal-Glc, 및 Gal-Gal-Gal-Glc 분자들의 통합된 반응들의 합계이다. 갈락토실화된 푸코오스의 전체 통합된 반응은 Gal-Fuc, Gal-Gal-Fuc, 및 Gal-Gal-Gal-Fuc 분자들의 반응들의 합계이다. 갈락토실화된 공여체/이탈기의 전체 통합된 반응이 거의 변하지 않으면서, 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되는 경우 갈락토실화된 푸코오스의 전체 통합된 반응은 현저하게 증가한다는 것을 알게 된다.
결론:
이 예는 갈락토실화된 수용체(의도된 생성물) 및 갈락토실화된 공여체/이탈기들(부산물) 사이의 비율이 자유 이탈기들이 배양하는 동안에 제거되는 경우 현저히 증가된다는 것을 입증한다.
L-푸코실-함유 헤테로-갈락토-올리고당들을 함유하는 표본들의 특성화
수거된 표본들은 Milli-Q 물과 1:10 희석되었으며, 85℃로 15 분 동안 가열함으로써 비활성된다. 비활성화된 혼합물은 특성화 되기까지 -20℃에서 유지되었다.
표본들은 분석 HPLC의 이용에 의하여 특성화된다. 표본들은 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 여과되었다. HPLC 장치는 Waters 사로부터 구입하였으며, 시차 굴절계(RI-검출기) 및 BioRad Aminex HPX-87C 칼럼(300x7.8 mm, 125-0055)를 구비하였다. 당들의 용출은 0.05 g/L CaAcetate, 0.3 mL/분의 유량 및 20 ㎕의 주입 부피로 등용매적으로 수행되었다.
질량 분광법 분석이 100 및 1000 amu(가스 온도: 350℃, 건조 가스 흐름: 13.0 L/분, 분무기 압력: 40 psig) 사이의 Agilent 1200 API-ES LC/MSD Quadropole 6410 스캐닝 질량들로 수행되었다. LC 분리용으로 이용된 칼럼은 25℃에서 작동하는 Thermo Scientific, 덴마크로부터 입수한 HyperCarb 2.1x150 mm이다. 용출은 5 mM AcNH4 수용액 및 아세토니트릴로 수행되었다.
이온 크로마토그램들은 전기분무 인터페이스로부터 공통적인 이온화 패턴들에 기초하여 추출되었다. 추출된 크로마토그램들에서의 피크들은 질량 스펙트럼들에 기초하여 평가되었으며, 이후 통합되어서, 시험 표본의 다양한 탄수화물 종들에 대한 통합된 반응들을 제공하였다.
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atgcgttgcg ttgcgatttt tccggccctg tatgggggat acaggattgg cgatggcgac 60
acgccgtttt tgttaatggc atttacatga aatacaggta atgagatatc attctcatga 120
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Met Ala Val Arg Arg Leu Gly
1 5
ggc cgc atc gtg gct ttc gcc gcc aca gtg gcc ttg tca ata ccg tta 280
Gly Arg Ile Val Ala Phe Ala Ala Thr Val Ala Leu Ser Ile Pro Leu
10 15 20
ggg ttg tta aca aat tca gcg tgg gcg gtc gag gac gcc acc cga tcc 328
Gly Leu Leu Thr Asn Ser Ala Trp Ala Val Glu Asp Ala Thr Arg Ser
25 30 35
gac tcc acc acg cag atg agc tcc acg ccg gag gtg gtc tac tcc agc 376
Asp Ser Thr Thr Gln Met Ser Ser Thr Pro Glu Val Val Tyr Ser Ser
40 45 50 55
gcc gtg gat tcc aag cag aat cgc acc tcg gat ttc gac gcc aac tgg 424
Ala Val Asp Ser Lys Gln Asn Arg Thr Ser Asp Phe Asp Ala Asn Trp
60 65 70
aag ttc atg ctg tcc gat tcc gtg cag gcg cag gat ccg gcg ttc gac 472
Lys Phe Met Leu Ser Asp Ser Val Gln Ala Gln Asp Pro Ala Phe Asp
75 80 85
gat tcg gcc tgg cag cag gtc gac ctg ccg cat gac tac agc atc acg 520
Asp Ser Ala Trp Gln Gln Val Asp Leu Pro His Asp Tyr Ser Ile Thr
90 95 100
cag aag tat tcg cag agc aac gag gcc gaa agc gca tac ctt ccc ggc 568
Gln Lys Tyr Ser Gln Ser Asn Glu Ala Glu Ser Ala Tyr Leu Pro Gly
105 110 115
ggc acc ggc tgg tac cgc aag tcc ttc acc atc gac cgg gac ctc gcc 616
Gly Thr Gly Trp Tyr Arg Lys Ser Phe Thr Ile Asp Arg Asp Leu Ala
120 125 130 135
ggc aag cgc atc gcc atc aac ttc gac ggc gtg tac atg aac gcc acc 664
Gly Lys Arg Ile Ala Ile Asn Phe Asp Gly Val Tyr Met Asn Ala Thr
140 145 150
gtc tgg ttc aac ggc gtc aag ctc ggc acc cat ccg tac ggc tac tcg 712
Val Trp Phe Asn Gly Val Lys Leu Gly Thr His Pro Tyr Gly Tyr Ser
155 160 165
ccg ttc tcc ttc gac ctg acc ggc aac gcc aag ttc ggt ggg gag aac 760
Pro Phe Ser Phe Asp Leu Thr Gly Asn Ala Lys Phe Gly Gly Glu Asn
170 175 180
acc atc gtc gtc aag gtc gag aac agg ctg ccg tcc agc cgc tgg tac 808
Thr Ile Val Val Lys Val Glu Asn Arg Leu Pro Ser Ser Arg Trp Tyr
185 190 195
tcc ggc tcc ggc atc tac cgc gac gtc acc ctc acc gtc acc gac ggc 856
Ser Gly Ser Gly Ile Tyr Arg Asp Val Thr Leu Thr Val Thr Asp Gly
200 205 210 215
gtg cac gtc ggc aat aac ggc gtg gcc atc aag acc ccg agc ctc gcc 904
Val His Val Gly Asn Asn Gly Val Ala Ile Lys Thr Pro Ser Leu Ala
220 225 230
acc caa aac ggc ggc gac gtg acg atg aac ctc acc acc aag gtc gcc 952
Thr Gln Asn Gly Gly Asp Val Thr Met Asn Leu Thr Thr Lys Val Ala
235 240 245
aac gac acc gag gcc gcg gcg aac atc acc ctc aag cag acc gtg ttc 1000
Asn Asp Thr Glu Ala Ala Ala Asn Ile Thr Leu Lys Gln Thr Val Phe
250 255 260
ccc aag gga ggc aag acc gac gcc gcc atc ggc acc gtc acc acc gca 1048
Pro Lys Gly Gly Lys Thr Asp Ala Ala Ile Gly Thr Val Thr Thr Ala
265 270 275
tcc aag tcc atc gcg gcc ggt gcc agc gcg gac gtg acc tcc acg atc 1096
Ser Lys Ser Ile Ala Ala Gly Ala Ser Ala Asp Val Thr Ser Thr Ile
280 285 290 295
acc gcc gct tcg ccc aag ctg tgg agc atc aag aac ccg aac ctg tac 1144
Thr Ala Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ser Ile Lys Asn Pro Asn Leu Tyr
300 305 310
acc gtg cgc acc gaa gtg ctc aac ggc ggc aag gtg ctc gac act tac 1192
Thr Val Arg Thr Glu Val Leu Asn Gly Gly Lys Val Leu Asp Thr Tyr
315 320 325
gac acc gaa tat ggc ttc cgc tgg acc ggc ttc gat gcg acc agc ggt 1240
Asp Thr Glu Tyr Gly Phe Arg Trp Thr Gly Phe Asp Ala Thr Ser Gly
330 335 340
ttc tcg ctc aac ggc gag aaa gtc aag ctc aag ggc gtc tca atg cat 1288
Phe Ser Leu Asn Gly Glu Lys Val Lys Leu Lys Gly Val Ser Met His
345 350 355
cat gac cag gga tcg ctc ggc gcg gtc gcc aac cgc cgc gcc atc gag 1336
His Asp Gln Gly Ser Leu Gly Ala Val Ala Asn Arg Arg Ala Ile Glu
360 365 370 375
cgc cag gtc gag att ctc cag aag atg ggc gtc aac tcg atc cgc acc 1384
Arg Gln Val Glu Ile Leu Gln Lys Met Gly Val Asn Ser Ile Arg Thr
380 385 390
acg cac aac ccc gca gcc aag gcg ctg att gac gtc tgc aac gag aag 1432
Thr His Asn Pro Ala Ala Lys Ala Leu Ile Asp Val Cys Asn Glu Lys
395 400 405
ggc gtc ctc gtg gtc gaa gag gtc ttc gac atg tgg aac cgg tcg aag 1480
Gly Val Leu Val Val Glu Glu Val Phe Asp Met Trp Asn Arg Ser Lys
410 415 420
aac ggc aac acc gag gat tac ggc aag tgg ttc ggc cag gcc atc gcc 1528
Asn Gly Asn Thr Glu Asp Tyr Gly Lys Trp Phe Gly Gln Ala Ile Ala
425 430 435
ggt gac aac gcc gtc ctg ggt ggc gac aag gac gag acc tgg gcc aag 1576
Gly Asp Asn Ala Val Leu Gly Gly Asp Lys Asp Glu Thr Trp Ala Lys
440 445 450 455
ttc gac ctg acc agc acc atc aac cgt gac agg aac gcc ccg tcc gtc 1624
Phe Asp Leu Thr Ser Thr Ile Asn Arg Asp Arg Asn Ala Pro Ser Val
460 465 470
atc atg tgg tcg ctc ggc aac gag atg atg gaa ggc atc agc ggc agc 1672
Ile Met Trp Ser Leu Gly Asn Glu Met Met Glu Gly Ile Ser Gly Ser
475 480 485
gtc tcg ggc ttc ccg gct acc tcc gcc aag ctg gtc gca tgg acg aag 1720
Val Ser Gly Phe Pro Ala Thr Ser Ala Lys Leu Val Ala Trp Thr Lys
490 495 500
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Ala Ala Asp Ser Thr Arg Pro Met Thr Tyr Gly Asp Asn Lys Ile Lys
505 510 515
gcc aac tgg aac gag tcg aac acc atg ggc gac aac ctg acc gcc aac 1816
Ala Asn Trp Asn Glu Ser Asn Thr Met Gly Asp Asn Leu Thr Ala Asn
520 525 530 535
ggc ggc gtg gtc ggc acc aac tac tcc gac ggc gcg aac tac gac aag 1864
Gly Gly Val Val Gly Thr Asn Tyr Ser Asp Gly Ala Asn Tyr Asp Lys
540 545 550
atc cgc acg acc cac ccc tca tgg gcc atc tat ggt tcc gag acg gcg 1912
Ile Arg Thr Thr His Pro Ser Trp Ala Ile Tyr Gly Ser Glu Thr Ala
555 560 565
tcc gcc atc aac agc cga ggc atc tac aac cgc acc acc ggc ggc gcc 1960
Ser Ala Ile Asn Ser Arg Gly Ile Tyr Asn Arg Thr Thr Gly Gly Ala
570 575 580
cag tca agc gac aag cag ctg acc agc tat gac aat tcc gca gtc ggc 2008
Gln Ser Ser Asp Lys Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Asn Ser Ala Val Gly
585 590 595
tgg ggc gcc gtc gcc agc tcc gcc tgg tac gac gtg gtc cag cgc gat 2056
Trp Gly Ala Val Ala Ser Ser Ala Trp Tyr Asp Val Val Gln Arg Asp
600 605 610 615
ttc gtc gcc ggc aca tac gtg tgg acc ggc ttc gac tac ctc ggc gaa 2104
Phe Val Ala Gly Thr Tyr Val Trp Thr Gly Phe Asp Tyr Leu Gly Glu
620 625 630
ccc acc ccg tgg aac ggc acc ggc tcc ggc gcc gtg ggc tcc ttg gcc 2152
Pro Thr Pro Trp Asn Gly Thr Gly Ser Gly Ala Val Gly Ser Leu Ala
635 640 645
gtc gcc gaa gaa ctc gta ctt cgg cat cgt cga cac cgc agg ctt ccc 2200
Val Ala Glu Glu Leu Val Leu Arg His Arg Arg His Arg Arg Leu Pro
650 655 660
gaa gac acc tat tac ttc tat cag agc cag tgg aac gac gac gtg cac 2248
Glu Asp Thr Tyr Tyr Phe Tyr Gln Ser Gln Trp Asn Asp Asp Val His
665 670 675
acg ctg cac atc ctc ccc gca tgg aac gag aac gtc gtc gcc aag ggc 2296
Thr Leu His Ile Leu Pro Ala Trp Asn Glu Asn Val Val Ala Lys Gly
680 685 690 695
tcc ggc aac aac gtg ccg gtc gtc gtc tac acc gac gcg gcc aag gtc 2344
Ser Gly Asn Asn Val Pro Val Val Val Tyr Thr Asp Ala Ala Lys Val
700 705 710
aag ctg tac ttc aca ccg aag ggc agt acc gaa aag cga ctg atc gga 2392
Lys Leu Tyr Phe Thr Pro Lys Gly Ser Thr Glu Lys Arg Leu Ile Gly
715 720 725
gag aag tcc ttc acc aag aag acc acc gcg gcc gga tac acc tat cag 2440
Glu Lys Ser Phe Thr Lys Lys Thr Thr Ala Ala Gly Tyr Thr Tyr Gln
730 735 740
gtc tac gag ggc tcc gac aag gac tcc acc gcc cac aag aac atg tac 2488
Val Tyr Glu Gly Ser Asp Lys Asp Ser Thr Ala His Lys Asn Met Tyr
745 750 755
ctg acc tgg aac gtg ccg tgg gcc gag ggc acc atc tcc gcc gaa gca 2536
Leu Thr Trp Asn Val Pro Trp Ala Glu Gly Thr Ile Ser Ala Glu Ala
760 765 770 775
tac gac gag aac aac agg ctg atc ccc gag ggg tcc acc gag ggc aac 2584
Tyr Asp Glu Asn Asn Arg Leu Ile Pro Glu Gly Ser Thr Glu Gly Asn
780 785 790
gcg tcg gtg acc acc acc ggc aag gcc gcg aag ctt aaa gcc gat gcc 2632
Ala Ser Val Thr Thr Thr Gly Lys Ala Ala Lys Leu Lys Ala Asp Ala
795 800 805
gac cgc aag acg atc acc gcg gac ggc aag gac ctg tcg tac atc gag 2680
Asp Arg Lys Thr Ile Thr Ala Asp Gly Lys Asp Leu Ser Tyr Ile Glu
810 815 820
gtc gac gtg acc gac gcc aac ggc cat atc gtc ccc gat gcc gcc aac 2728
Val Asp Val Thr Asp Ala Asn Gly His Ile Val Pro Asp Ala Ala Asn
825 830 835
cgc gtc acc ttc gac gtc aag ggc gcc ggc aaa ctg gtc ggc gtc gac 2776
Arg Val Thr Phe Asp Val Lys Gly Ala Gly Lys Leu Val Gly Val Asp
840 845 850 855
aac ggc agc tcg ccg gat cac gac tcc tat cag gcc gac aac cgc aag 2824
Asn Gly Ser Ser Pro Asp His Asp Ser Tyr Gln Ala Asp Asn Arg Lys
860 865 870
gcg ttc agc ggc aag gtg ctc gcc atc gtc cag tcc acc aag gag gcg 2872
Ala Phe Ser Gly Lys Val Leu Ala Ile Val Gln Ser Thr Lys Glu Ala
875 880 885
ggc gag atc acc gtc acc gcc aag gcc gac ggt ctg caa tca tcc aca 2920
Gly Glu Ile Thr Val Thr Ala Lys Ala Asp Gly Leu Gln Ser Ser Thr
890 895 900
gtg aag atc gcc acc acc gcc gtc ccc ggc acc agc acc gag aag acg 2968
Val Lys Ile Ala Thr Thr Ala Val Pro Gly Thr Ser Thr Glu Lys Thr
905 910 915
gtc cgc agc ttc tac tac tcg cgc aac tac tac gtc aag acc ggc aac 3016
Val Arg Ser Phe Tyr Tyr Ser Arg Asn Tyr Tyr Val Lys Thr Gly Asn
920 925 930 935
aag ccg att ctg ccg agt gat gtc gag gtg cgc tac tcc gac ggc acg 3064
Lys Pro Ile Leu Pro Ser Asp Val Glu Val Arg Tyr Ser Asp Gly Thr
940 945 950
tcg gac cgt cag aac gtc aca tgg gac gca gtc agc gac gac cag atc 3112
Ser Asp Arg Gln Asn Val Thr Trp Asp Ala Val Ser Asp Asp Gln Ile
955 960 965
gcc aag gcc ggt tcg ttc agc gtg gcc ggc acg gtc gcc ggg cag aag 3160
Ala Lys Ala Gly Ser Phe Ser Val Ala Gly Thr Val Ala Gly Gln Lys
970 975 980
atc tcc gtg cgc gtg acg atg atc gac gag atc ggt gcg ctg ctc aac 3208
Ile Ser Val Arg Val Thr Met Ile Asp Glu Ile Gly Ala Leu Leu Asn
985 990 995
tat tcg gcc agc aca ccg gtc ggc acg ccc gcc gtg ctg cct ggc 3253
Tyr Ser Ala Ser Thr Pro Val Gly Thr Pro Ala Val Leu Pro Gly
1000 1005 1010
tcg cgt ccg gcc gtg ctg ccc gac ggc acc gtg acc agc gcg aac 3298
Ser Arg Pro Ala Val Leu Pro Asp Gly Thr Val Thr Ser Ala Asn
1015 1020 1025
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Phe Ala Val His Trp Thr Lys Pro Ala Asp Thr Val Tyr Asn Thr
1030 1035 1040
gcc ggc acc gtc aag gtc ccc ggc acc gcc acc gtc ttc ggc aag 3388
Ala Gly Thr Val Lys Val Pro Gly Thr Ala Thr Val Phe Gly Lys
1045 1050 1055
gag ttc aag gtc acc gcg acg att cgc gtg cag cgg tcg cag gtc 3433
Glu Phe Lys Val Thr Ala Thr Ile Arg Val Gln Arg Ser Gln Val
1060 1065 1070
acc atc ggc agc agc gtc tcc ggc aat gcg ctg cgc ctg act cag 3478
Thr Ile Gly Ser Ser Val Ser Gly Asn Ala Leu Arg Leu Thr Gln
1075 1080 1085
aac atc ccc gcc gac aag cag tcc gac acg ctg gac gcc atc aag 3523
Asn Ile Pro Ala Asp Lys Gln Ser Asp Thr Leu Asp Ala Ile Lys
1090 1095 1100
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Asp Gly Ser Thr Thr Val Asp Ala Asn Thr Gly Gly Gly Ala Asn
1105 1110 1115
ccg tca gca tgg acc aac tgg gcg tac tcg aag gcc ggc cac aac 3613
Pro Ser Ala Trp Thr Asn Trp Ala Tyr Ser Lys Ala Gly His Asn
1120 1125 1130
acc gcc gag atc acc ttc gag tac gcg acc gag cag cag ctc ggc 3658
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1135 1140 1145
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Gln Ile Val Met Tyr Phe Phe Arg Asp Ser Asn Ala Val Arg Phe
1150 1155 1160
ccc gac gcc ggc aag acg aag atc cag atc tcc gcg gac ggc aag 3748
Pro Asp Ala Gly Lys Thr Lys Ile Gln Ile Ser Ala Asp Gly Lys
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aac tgg acg gat ctc gct gcc acg gag acc atc gcg gcc cag gag 3793
Asn Trp Thr Asp Leu Ala Ala Thr Glu Thr Ile Ala Ala Gln Glu
1180 1185 1190
tcg tcc gac cga gtc aag ccg tac acc tat gac ttc gct ccg gtg 3838
Ser Ser Asp Arg Val Lys Pro Tyr Thr Tyr Asp Phe Ala Pro Val
1195 1200 1205
gga gcc acg ttc gtc aag gtc acg gtc acc aac gcc gac acc aca 3883
Gly Ala Thr Phe Val Lys Val Thr Val Thr Asn Ala Asp Thr Thr
1210 1215 1220
acc ccc agc ggc gtg gtc tgc gcc ggc ctg acc gag atc gag ctg 3928
Thr Pro Ser Gly Val Val Cys Ala Gly Leu Thr Glu Ile Glu Leu
1225 1230 1235
aag acc gcg acc agc aag ttc gtc acg aac acg tcc gcc gcg ctc 3973
Lys Thr Ala Thr Ser Lys Phe Val Thr Asn Thr Ser Ala Ala Leu
1240 1245 1250
tcg tcg ctg aca gtg aac ggc acg aag gtc tcc gac tcc gtg ctc 4018
Ser Ser Leu Thr Val Asn Gly Thr Lys Val Ser Asp Ser Val Leu
1255 1260 1265
gcc gcc ggc tcc tac aac acg ccc gcg atc atc gcg gac gtc aaa 4063
Ala Ala Gly Ser Tyr Asn Thr Pro Ala Ile Ile Ala Asp Val Lys
1270 1275 1280
gcc gag ggc gaa ggc aac gcc agc gtc acc gtg ctg ccc gcg cac 4108
Ala Glu Gly Glu Gly Asn Ala Ser Val Thr Val Leu Pro Ala His
1285 1290 1295
gac aac gtg atc cgc gtg atc acc gag tcc gag gac cac gtc acg 4153
Asp Asn Val Ile Arg Val Ile Thr Glu Ser Glu Asp His Val Thr
1300 1305 1310
cgc aag acc ttc acc atc aac ctg ggc acg gag cag gaa ttc ccc 4198
Arg Lys Thr Phe Thr Ile Asn Leu Gly Thr Glu Gln Glu Phe Pro
1315 1320 1325
gca gac tcc gat gaa cgc gac tac ccg gcc gcc gac atg acg gtc 4243
Ala Asp Ser Asp Glu Arg Asp Tyr Pro Ala Ala Asp Met Thr Val
1330 1335 1340
acc gtg ggc agc gaa cag acg tcc ggc acc gcg acc gaa ggc ccg 4288
Thr Val Gly Ser Glu Gln Thr Ser Gly Thr Ala Thr Glu Gly Pro
1345 1350 1355
aag aaa ttc gcg gtc gac ggc aac acc agc acg tac tgg cat tcc 4333
Lys Lys Phe Ala Val Asp Gly Asn Thr Ser Thr Tyr Trp His Ser
1360 1365 1370
aac tgg acg ccc acc acc gtg aac gac ctg tgg atc gcc ttc gag 4378
Asn Trp Thr Pro Thr Thr Val Asn Asp Leu Trp Ile Ala Phe Glu
1375 1380 1385
ctc cag aaa ccc acc aag ctc gac gcg ctg cgc tac ctg ccg cgc 4423
Leu Gln Lys Pro Thr Lys Leu Asp Ala Leu Arg Tyr Leu Pro Arg
1390 1395 1400
ccc gcg ggc agc aag aac ggc tcc gtc acc gaa tac aag gtt cag 4468
Pro Ala Gly Ser Lys Asn Gly Ser Val Thr Glu Tyr Lys Val Gln
1405 1410 1415
gtc agc gat gac ggc acc aac tgg acc gac gcg ggc tcc ggc aca 4513
Val Ser Asp Asp Gly Thr Asn Trp Thr Asp Ala Gly Ser Gly Thr
1420 1425 1430
tgg acc acc gat tac ggc tgg aag ctc gcc gag ttc aat cag ccg 4558
Trp Thr Thr Asp Tyr Gly Trp Lys Leu Ala Glu Phe Asn Gln Pro
1435 1440 1445
gtg acc acc aag cac gtg cgg ctc aag gcc gtc cac acc tat gcg 4603
Val Thr Thr Lys His Val Arg Leu Lys Ala Val His Thr Tyr Ala
1450 1455 1460
gat tcc ggc aac gac aag ttc atg tcc gcc tcc gaa atc cgc ctg 4648
Asp Ser Gly Asn Asp Lys Phe Met Ser Ala Ser Glu Ile Arg Leu
1465 1470 1475
cgc aag gcc gtc gac acc acc gac atc agc ggc gcg acc gtg acc 4693
Arg Lys Ala Val Asp Thr Thr Asp Ile Ser Gly Ala Thr Val Thr
1480 1485 1490
gtg ccc gcc aag ctg acc gtc gac cgg gtg gac gcc gac cat ccc 4738
Val Pro Ala Lys Leu Thr Val Asp Arg Val Asp Ala Asp His Pro
1495 1500 1505
gcc acc ttc gcc acg aag gac gtg acg gtg acg ttg ggc gac gcc 4783
Ala Thr Phe Ala Thr Lys Asp Val Thr Val Thr Leu Gly Asp Ala
1510 1515 1520
acg ctg cgc tac ggc gtg gac tac ctg ctc gac tac gcg ggc aac 4828
Thr Leu Arg Tyr Gly Val Asp Tyr Leu Leu Asp Tyr Ala Gly Asn
1525 1530 1535
acc gcc gtc ggc aag gcc acg gtg acc gtg cgc ggc atc gac aag 4873
Thr Ala Val Gly Lys Ala Thr Val Thr Val Arg Gly Ile Asp Lys
1540 1545 1550
tac tcc ggc acc gtc gcc aag acg ttc acc atc gaa ctg aag aac 4918
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1585 1590 1595
gca gga ctg gtg ctg cag cac gac aga cag gcc gat cgc ccc cca 5053
Ala Gly Leu Val Leu Gln His Asp Arg Gln Ala Asp Arg Pro Pro
1600 1605 1610
cag cca ctt gtt gga gaa cag gcc gac gaa cgc gga ctg acg tgc 5098
Gln Pro Leu Val Gly Glu Gln Ala Asp Glu Arg Gly Leu Thr Cys
1615 1620 1625
gga acg cga tgc gat cgc gtt gaa cag ctg cgc aaa cac gag aat 5143
Gly Thr Arg Cys Asp Arg Val Glu Gln Leu Arg Lys His Glu Asn
1630 1635 1640
cgt gaa gcc cat cgt acg ggc ctc gat cat ctg gaa ttc gtg ggt 5188
Arg Glu Ala His Arg Thr Gly Leu Asp His Leu Glu Phe Val Gly
1645 1650 1655
gcc gcc gat gga gcg gtc ggt gaa cag gcc acc ttc aag gtg cat 5233
Ala Ala Asp Gly Ala Val Gly Glu Gln Ala Thr Phe Lys Val His
1660 1665 1670
gtc cat gcc gat caa ggt gac ggc cgc cat gat gat gcc gat gaa 5278
Val His Ala Asp Gln Gly Asp Gly Arg His Asp Asp Ala Asp Glu
1675 1680 1685
cgc gat atc gat cca cat gtc cct gtc gat cac gcg gtc ggt gag 5323
Arg Asp Ile Asp Pro His Val Pro Val Asp His Ala Val Gly Glu
1690 1695 1700
ctt gcg cgg gct gcg tgc cat cac gtc atc ggt ctg cgg gtc gac 5368
Leu Ala Arg Ala Ala Cys His His Val Ile Gly Leu Arg Val Asp
1705 1710 1715
acc cat cgc ctc aag gca tcc ggc ttc cag atc ccc gcc gac gac 5413
Thr His Arg Leu Lys Ala Ser Gly Phe Gln Ile Pro Ala Asp Asp
1720 1725 1730
atg gcc gag atc gac cgc atc acc ggc ttc cac cgc ttc gag cgc 5458
Met Ala Glu Ile Asp Arg Ile Thr Gly Phe His Arg Phe Glu Arg
1735 1740 1745
cac gtc ggc tga cgtgattggg cttccccgct gtctggtgcc ggctcgcga 5509
His Val Gly
1750
<210> 2
<211> 1752
<212> PRT
<213> Bifidobacterium bifidum
<400> 2
Met Ala Val Arg Arg Leu Gly Gly Arg Ile Val Ala Phe Ala Ala Thr
1 5 10 15
Val Ala Leu Ser Ile Pro Leu Gly Leu Leu Thr Asn Ser Ala Trp Ala
20 25 30
Val Glu Asp Ala Thr Arg Ser Asp Ser Thr Thr Gln Met Ser Ser Thr
35 40 45
Pro Glu Val Val Tyr Ser Ser Ala Val Asp Ser Lys Gln Asn Arg Thr
50 55 60
Ser Asp Phe Asp Ala Asn Trp Lys Phe Met Leu Ser Asp Ser Val Gln
65 70 75 80
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85 90 95
Pro His Asp Tyr Ser Ile Thr Gln Lys Tyr Ser Gln Ser Asn Glu Ala
100 105 110
Glu Ser Ala Tyr Leu Pro Gly Gly Thr Gly Trp Tyr Arg Lys Ser Phe
115 120 125
Thr Ile Asp Arg Asp Leu Ala Gly Lys Arg Ile Ala Ile Asn Phe Asp
130 135 140
Gly Val Tyr Met Asn Ala Thr Val Trp Phe Asn Gly Val Lys Leu Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Ile Lys Thr Pro Ser Leu Ala Thr Gln Asn Gly Gly Asp Val Thr Met
225 230 235 240
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340 345 350
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355 360 365
Ala Asn Arg Arg Ala Ile Glu Arg Gln Val Glu Ile Leu Gln Lys Met
370 375 380
Gly Val Asn Ser Ile Arg Thr Thr His Asn Pro Ala Ala Lys Ala Leu
385 390 395 400
Ile Asp Val Cys Asn Glu Lys Gly Val Leu Val Val Glu Glu Val Phe
405 410 415
Asp Met Trp Asn Arg Ser Lys Asn Gly Asn Thr Glu Asp Tyr Gly Lys
420 425 430
Trp Phe Gly Gln Ala Ile Ala Gly Asp Asn Ala Val Leu Gly Gly Asp
435 440 445
Lys Asp Glu Thr Trp Ala Lys Phe Asp Leu Thr Ser Thr Ile Asn Arg
450 455 460
Asp Arg Asn Ala Pro Ser Val Ile Met Trp Ser Leu Gly Asn Glu Met
465 470 475 480
Met Glu Gly Ile Ser Gly Ser Val Ser Gly Phe Pro Ala Thr Ser Ala
485 490 495
Lys Leu Val Ala Trp Thr Lys Ala Ala Asp Ser Thr Arg Pro Met Thr
500 505 510
Tyr Gly Asp Asn Lys Ile Lys Ala Asn Trp Asn Glu Ser Asn Thr Met
515 520 525
Gly Asp Asn Leu Thr Ala Asn Gly Gly Val Val Gly Thr Asn Tyr Ser
530 535 540
Asp Gly Ala Asn Tyr Asp Lys Ile Arg Thr Thr His Pro Ser Trp Ala
545 550 555 560
Ile Tyr Gly Ser Glu Thr Ala Ser Ala Ile Asn Ser Arg Gly Ile Tyr
565 570 575
Asn Arg Thr Thr Gly Gly Ala Gln Ser Ser Asp Lys Gln Leu Thr Ser
580 585 590
Tyr Asp Asn Ser Ala Val Gly Trp Gly Ala Val Ala Ser Ser Ala Trp
595 600 605
Tyr Asp Val Val Gln Arg Asp Phe Val Ala Gly Thr Tyr Val Trp Thr
610 615 620
Gly Phe Asp Tyr Leu Gly Glu Pro Thr Pro Trp Asn Gly Thr Gly Ser
625 630 635 640
Gly Ala Val Gly Ser Leu Ala Val Ala Glu Glu Leu Val Leu Arg His
645 650 655
Arg Arg His Arg Arg Leu Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr Phe Tyr Gln Ser
660 665 670
Gln Trp Asn Asp Asp Val His Thr Leu His Ile Leu Pro Ala Trp Asn
675 680 685
Glu Asn Val Val Ala Lys Gly Ser Gly Asn Asn Val Pro Val Val Val
690 695 700
Tyr Thr Asp Ala Ala Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Pro Lys Gly Ser
705 710 715 720
Thr Glu Lys Arg Leu Ile Gly Glu Lys Ser Phe Thr Lys Lys Thr Thr
725 730 735
Ala Ala Gly Tyr Thr Tyr Gln Val Tyr Glu Gly Ser Asp Lys Asp Ser
740 745 750
Thr Ala His Lys Asn Met Tyr Leu Thr Trp Asn Val Pro Trp Ala Glu
755 760 765
Gly Thr Ile Ser Ala Glu Ala Tyr Asp Glu Asn Asn Arg Leu Ile Pro
770 775 780
Glu Gly Ser Thr Glu Gly Asn Ala Ser Val Thr Thr Thr Gly Lys Ala
785 790 795 800
Ala Lys Leu Lys Ala Asp Ala Asp Arg Lys Thr Ile Thr Ala Asp Gly
805 810 815
Lys Asp Leu Ser Tyr Ile Glu Val Asp Val Thr Asp Ala Asn Gly His
820 825 830
Ile Val Pro Asp Ala Ala Asn Arg Val Thr Phe Asp Val Lys Gly Ala
835 840 845
Gly Lys Leu Val Gly Val Asp Asn Gly Ser Ser Pro Asp His Asp Ser
850 855 860
Tyr Gln Ala Asp Asn Arg Lys Ala Phe Ser Gly Lys Val Leu Ala Ile
865 870 875 880
Val Gln Ser Thr Lys Glu Ala Gly Glu Ile Thr Val Thr Ala Lys Ala
885 890 895
Asp Gly Leu Gln Ser Ser Thr Val Lys Ile Ala Thr Thr Ala Val Pro
900 905 910
Gly Thr Ser Thr Glu Lys Thr Val Arg Ser Phe Tyr Tyr Ser Arg Asn
915 920 925
Tyr Tyr Val Lys Thr Gly Asn Lys Pro Ile Leu Pro Ser Asp Val Glu
930 935 940
Val Arg Tyr Ser Asp Gly Thr Ser Asp Arg Gln Asn Val Thr Trp Asp
945 950 955 960
Ala Val Ser Asp Asp Gln Ile Ala Lys Ala Gly Ser Phe Ser Val Ala
965 970 975
Gly Thr Val Ala Gly Gln Lys Ile Ser Val Arg Val Thr Met Ile Asp
980 985 990
Glu Ile Gly Ala Leu Leu Asn Tyr Ser Ala Ser Thr Pro Val Gly Thr
995 1000 1005
Pro Ala Val Leu Pro Gly Ser Arg Pro Ala Val Leu Pro Asp Gly
1010 1015 1020
Thr Val Thr Ser Ala Asn Phe Ala Val His Trp Thr Lys Pro Ala
1025 1030 1035
Asp Thr Val Tyr Asn Thr Ala Gly Thr Val Lys Val Pro Gly Thr
1040 1045 1050
Ala Thr Val Phe Gly Lys Glu Phe Lys Val Thr Ala Thr Ile Arg
1055 1060 1065
Val Gln Arg Ser Gln Val Thr Ile Gly Ser Ser Val Ser Gly Asn
1070 1075 1080
Ala Leu Arg Leu Thr Gln Asn Ile Pro Ala Asp Lys Gln Ser Asp
1085 1090 1095
Thr Leu Asp Ala Ile Lys Asp Gly Ser Thr Thr Val Asp Ala Asn
1100 1105 1110
Thr Gly Gly Gly Ala Asn Pro Ser Ala Trp Thr Asn Trp Ala Tyr
1115 1120 1125
Ser Lys Ala Gly His Asn Thr Ala Glu Ile Thr Phe Glu Tyr Ala
1130 1135 1140
Thr Glu Gln Gln Leu Gly Gln Ile Val Met Tyr Phe Phe Arg Asp
1145 1150 1155
Ser Asn Ala Val Arg Phe Pro Asp Ala Gly Lys Thr Lys Ile Gln
1160 1165 1170
Ile Ser Ala Asp Gly Lys Asn Trp Thr Asp Leu Ala Ala Thr Glu
1175 1180 1185
Thr Ile Ala Ala Gln Glu Ser Ser Asp Arg Val Lys Pro Tyr Thr
1190 1195 1200
Tyr Asp Phe Ala Pro Val Gly Ala Thr Phe Val Lys Val Thr Val
1205 1210 1215
Thr Asn Ala Asp Thr Thr Thr Pro Ser Gly Val Val Cys Ala Gly
1220 1225 1230
Leu Thr Glu Ile Glu Leu Lys Thr Ala Thr Ser Lys Phe Val Thr
1235 1240 1245
Asn Thr Ser Ala Ala Leu Ser Ser Leu Thr Val Asn Gly Thr Lys
1250 1255 1260
Val Ser Asp Ser Val Leu Ala Ala Gly Ser Tyr Asn Thr Pro Ala
1265 1270 1275
Ile Ile Ala Asp Val Lys Ala Glu Gly Glu Gly Asn Ala Ser Val
1280 1285 1290
Thr Val Leu Pro Ala His Asp Asn Val Ile Arg Val Ile Thr Glu
1295 1300 1305
Ser Glu Asp His Val Thr Arg Lys Thr Phe Thr Ile Asn Leu Gly
1310 1315 1320
Thr Glu Gln Glu Phe Pro Ala Asp Ser Asp Glu Arg Asp Tyr Pro
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1340 1345 1350
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Ser Thr Tyr Trp His Ser Asn Trp Thr Pro Thr Thr Val Asn Asp
1370 1375 1380
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Leu Arg Tyr Leu Pro Arg Pro Ala Gly Ser Lys Asn Gly Ser Val
1400 1405 1410
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1415 1420 1425
Asp Ala Gly Ser Gly Thr Trp Thr Thr Asp Tyr Gly Trp Lys Leu
1430 1435 1440
Ala Glu Phe Asn Gln Pro Val Thr Thr Lys His Val Arg Leu Lys
1445 1450 1455
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1460 1465 1470
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1475 1480 1485
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1490 1495 1500
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1505 1510 1515
Val Thr Leu Gly Asp Ala Thr Leu Arg Tyr Gly Val Asp Tyr Leu
1520 1525 1530
Leu Asp Tyr Ala Gly Asn Thr Ala Val Gly Lys Ala Thr Val Thr
1535 1540 1545
Val Arg Gly Ile Asp Lys Tyr Ser Gly Thr Val Ala Lys Thr Phe
1550 1555 1560
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1565 1570 1575
Ser Val Ser Val Lys Thr Lys Pro Ser Lys Leu Thr Tyr Val Val
1580 1585 1590
Gly Asp Ala Phe Asp Pro Ala Gly Leu Val Leu Gln His Asp Arg
1595 1600 1605
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1610 1615 1620
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1625 1630 1635
Leu Arg Lys His Glu Asn Arg Glu Ala His Arg Thr Gly Leu Asp
1640 1645 1650
His Leu Glu Phe Val Gly Ala Ala Asp Gly Ala Val Gly Glu Gln
1655 1660 1665
Ala Thr Phe Lys Val His Val His Ala Asp Gln Gly Asp Gly Arg
1670 1675 1680
His Asp Asp Ala Asp Glu Arg Asp Ile Asp Pro His Val Pro Val
1685 1690 1695
Asp His Ala Val Gly Glu Leu Ala Arg Ala Ala Cys His His Val
1700 1705 1710
Ile Gly Leu Arg Val Asp Thr His Arg Leu Lys Ala Ser Gly Phe
1715 1720 1725
Gln Ile Pro Ala Asp Asp Met Ala Glu Ile Asp Arg Ile Thr Gly
1730 1735 1740
Phe His Arg Phe Glu Arg His Val Gly
1745 1750
Claims (23)
- 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)을 포함하는 조성물의 제조방법에 있어서,
a) - 350 g/mol 이하의 몰중량을 갖는, 이탈기에 결합된 갈락토실기를 포함하는 갈락토실 공여체,
- 상기 갈락토실 공여체와는 상이한 갈락토실 수용체로서, 상기 갈락토실 수용체는 당 또는 당-알코올인 갈락토실 수용체를 포함하는 혼합물로서,
상기 갈락토실 수용체 및 상기 갈락토실 공여체 사이의 몰비는 적어도 1:10이고, 상기 혼합물은 상기 갈락토실 수용체를 적어도 0.05 mol/L를 포함하는 것인 혼합물을 제공하는 단계,
b) 제1 효소를 제공하는 단계로서, 상기 제1 효소는 베타-갈락토시다아제 활성 및 갈락토오스이전반응 활성을 갖고, 상기 제1 효소는 상기 혼합물과 접촉하는 단계, 및
c) 상기 혼합물 및 상기 제1 효소를 배양함으로써 상기 제1 효소가 상기 갈락토실 공여체의 이탈기를 방출시키고 상기 갈락토실 공여체의 갈락토실기를 상기 갈락토실 수용체로 전이하도록 하여, 상기 갈락토-올리고당을 형성하는 단계로서, 단계 c)는 배양하는 혼합물로부터, 상기 갈락토실 공여체로부터 방출된 이탈기를 제거하여, 상기 하나 이상의 갈락토-올리고당(들)을 포함하는 조성물을 획득하는 단계를 더 포함하는 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 갈락토실 공여체의 이탈기는 글리코실기인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 갈락토실 공여체는 락토오스 또는 락티톨인 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 효소는 0.9 이하의 T-수치를 갖는 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 효소는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Met(1) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Gly(950)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
- SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Ile(1174)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 효소는 SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열 Val(33) 내지 Glu(917)에 대하여 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 효소는
- 표 1에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성, 또는
- 표 2에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성, 또는
- 표 3에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성, 또는
- 표 4에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성, 또는
- 표 5에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성, 또는
- 표 6에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 갈락토실 공여체로부터 방출된 자유 이탈기들을 변환할 수 있는 미생물을 제공하는 단계, 및 배양하는 동안에 상기 미생물이 상기 갈락토실 공여체로부터 방출된 이탈기를 제거하도록 하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제9항에 있어서,
a) 상기 자유 이탈기에 대한 상기 미생물의 제거율은 상기 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 10 배 더 높고,
b) 상기 자유 이탈기에 대한 상기 미생물의 제거율은 상기 갈락토실 공여체에 대한 이의 제거율보다 적어도 10 배 더 높고, 또는
c) 상기 자유 이탈기에 대한 상기 미생물의 제거율은 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 제거율보다 적어도 10 배 더 높은 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 갈락토실 공여체로부터 방출된 자유 이탈기들을 변환할 수 있는 제2 효소를 제공하는 단계, 및 배양하는 동안에 상기 제2 효소가 상기 갈락토실 공여체로부터 방출된 이탈기를 제거하도록 하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제11항에 있어서,
상기 제2 효소는 글루코오스 옥시다아제 활성을 갖는 방법. - 제11항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 상기 자유 이탈기에 대한 상기 제2 효소의 특이성 상수는 상기 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 10 배 더 높고,
b) 상기 자유 이탈기에 대한 상기 제2 효소의 특이성 상수는 상기 갈락토실 공여체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 10 배 더 높고, 또는
c) 상기 자유 이탈기에 대한 상기 제2 효소의 특이성 상수는 상기 모노-갈락토실화된 갈락토실 수용체에 대한 이의 특이성 상수보다 적어도 10 배 더 높은 방법. - 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제2 효소는 글루코오스 옥시다아제 활성을 가지며, 상기 갈락토실 공여체의 이탈기는 글루코오스인 방법. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 카탈라아제 활성을 갖는 효소를 제공하여, 상기 효소가 배양하는 혼합물과 접촉하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 이탈기를 상기 제2 효소를 사용해서 변환시킴으로써 획득되는 변환 생성물의 적어도 일부를 제거할 수 있는 제거제를 제공하는 단계 및 배양하는 동안에 상기 제거제가 상기 변환 생성물의 적어도 일부를 제거하도록 하는 단계를 더 포함하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 제거제는 2가 또는 3가 금속 이온의 염을 포함하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 제거제는 음이온 교환 물질을 포함하거나 이로 구성되기도 하는 방법. - 제18항에 있어서,
상기 음이온 교환 물질의 총 결합능은 배양하는 동안에 생성된 변환 생성물의 총량에 대하여 적어도 30%(mol/mol)인 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)는 갈락토실 공여체를 더 첨가하는 것을 포함하는 방법. - 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c) 동안에 상기 혼합물의 갈락토실 공여체의 농도는 0.01 내지 1 mol/L의 범위에 있는 농도에서 유지되는 방법. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 c)의 조성물의 갈락토-올리고당을 농축시키는 단계 d)를 더 포함하는 방법. - 제22항에 있어서,
상기 단계 d)는 제거제 및/또는 상기 제거제에 결합된 변환된 이탈기들을 단계 c)의 조성물로부터 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
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