CN104136618A - 一种包含低聚半乳糖的组合物的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产包含低聚半乳糖的组合物的方法并且涉及照此的包含低聚半乳糖的组合物。
Description
发明领域
本发明涉及一种包含低聚半乳糖的组合物以及一种生产它的有效方法。
背景
已知人类母乳包含多种不同的低聚糖,将其归因于母乳喂养婴儿的一些有益的健康效应(Kunz(孔兹)等人(2000))。例如,一些低聚糖(如FOS、GOS或菊粉)是所谓的益生元,这意指它们促进胃肠系统的有益细菌并且不利于有害细菌。归因于其健康促进效应,低聚糖经常被用于功能性食物产品中,如婴儿配方以及临床营养。
存在多种用于生产低聚糖的途径。一个途径基于从天然存在的来源分离低聚糖。低聚果糖(FOS)和菊粉例如天然地发现于洋姜、牛蒡、菊苣、韭菜、洋葱以及芦笋中并且可以分离自这些作物。从菊苣根中制备菊粉例如描述于Frank(弗兰克)(2002)中。这一用于生产低聚糖的途径受限于适合的作物的可获得性并且可能对于更加复杂的低聚糖的实现是不可能的。
另一种途径基于酶催化合成,其中酶类催化低聚糖的合成。Yun(尤恩)(1996)描述了使用具有果糖基转移酶活性的酶并且使用蔗糖作为该酶的底物的低聚果糖的酶催化生产。
酶催化合成的又一个实例描述于WO 01/90,317A2中,A2披露了一种使用特定的酶β-半乳糖苷酶和乳糖作为底物生产具有式Gal-Gal-Glc的低聚半乳糖(GOS)的方法。
EP 2 138 586 A1披露了在一种糖苷酶的存在下,在至少一种二烷基酰胺的存在下,通过碳水化合物供体分子和糖基受体分子的转糖基作用或水解,用于部位-选择性制造二糖或低聚糖的工艺。然而,EP 2 138 586 A1没有披露在孵育的过程中,除去从糖基供体释放的游离的离去基团。
WO 2009/113,030A2描述了一种使用微生物全细胞在具有横流式中空纤维微滤系统的反应器中生产基于纯乳糖的低聚半乳糖的工艺。然而,WO2009/113,030A2不包含任何关于使用一种与供体不相关的半乳糖基受体生产杂-低聚半乳糖的教导。
WO 2012/010,597A1披露了一种生产包含低聚半乳糖的组合物的方法以及照此包含低聚半乳糖的组合物。然而,WO 2012/010,597A1没有披露在孵育的过程中,除去从半乳糖基供体释放的游离的离去基团。
发明概述
本发明的一个目的是提供生产低聚半乳糖,并且特别是具有一个与在生产过程中使用的半乳糖基供体不同的还原端的低聚半乳糖的方法。
诸位发明人已经出人意料地发现在合成低聚半乳糖的过程中从供体释放的离去基团充当竞争性半乳糖基受体并且减少上述低聚半乳糖的收率。作为由诸位发明人进行的初始试验,已经特别出人意料地表明离去基团,并且特别是葡萄糖是弱的半乳糖基受体。此外,诸位发明人已经发现可以通过在半乳糖基供体、半乳糖基受体以及酶β-半乳糖苷酶的孵育过程中从反应混合物中除去释放的离去基团增加上述低聚半乳糖(具有一个与半乳糖基供体不同的还原端)的收率。
图1、2和3进行了进一步详细解释。
图1是在转半乳糖基作用过程中发生的主要反应类型的示意图。反应a)是所希望的反应并且涉及半乳糖基基团由供体(在这一实例中是乳糖)转移至受体(例如海藻糖)。这一反应的产物是一个游离的离去基团(在这一实例中是葡萄糖)以及一个小的具有一个与半乳糖基供体不同的还原端的低聚糖(例如Gal-Fuc)。
反应b)是一个导致供体的所谓的自我半乳糖基化的不希望的副反应,例如如果该供体是乳糖则是进一步被半乳糖基化的乳糖。这一副产物难于从低聚糖产物中除去并且是昂贵的。诸位发明人已经发现可以通过使用一种具有高的转半乳糖基作用效率(较低的T-值)的第一酶与一个相对较低的半乳糖基供体浓度组合显著地降低自我半乳糖基化的水平。
图1的反应c)是诸位发明人近来发现的另一个不希望的副反应。诸位发明人已经出人意料地在低聚半乳糖组合物中观察到高水平的别位乳糖并且已经得出以下结论:如果其浓度足够高,游离的离去基团并且特别是葡萄糖也充当受体。
图2是当在孵育过程中未除去游离的离去基团时,存在于低聚半乳糖组合物中的一些分子种类的示意性图解。除了来源于半乳糖基受体的所希望的低聚糖产物以外,该组合物进一步包含来源于游离的离去基团的半乳糖基化作用的不希望的低聚糖,例如别位乳糖以及进一步被半乳糖基化的别位乳糖。
图3是当在孵育过程中除去游离的离去基团时,存在于低聚半乳糖组合物中的一些分子种类的示意性图解。与示例于图2中的低聚半乳糖组合物相反,该低聚半乳糖组合物缺乏(或具有至少一个显著较低浓度的)游离的离去基团、别位乳糖以及来源于别位乳糖的低聚糖。
因此,本发明的一个方面涉及一种生产包括一种或多种低聚半乳糖的组合物的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一种混合物,该混合物包括
-一种半乳糖基供体,包括结合至离去基团的半乳糖基基团,该半乳糖基供体具有至多350g/mol的摩尔量,
-一种与该半乳糖基供体不同的半乳糖基受体,
所述半乳糖基受体是一种糖或糖醇,并且
其中该半乳糖基受体与该半乳糖基供体之间的摩尔比是至少1:10,并且其中该混合物包括至少0.05mol/L的半乳糖基受体,
b)提供一种第一酶,所述第一酶具有β-半乳糖苷酶活性,所述第一酶与该混合物接触,并且
c)孵育该混合物和该第一酶,从而允许该第一酶释放该半乳糖基供体的离去基团并且将该半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至该半乳糖基受体,以此方式形成低聚半乳糖,步骤c)进一步包括从该孵育混合物中(即在孵育过程中)除去从该半乳糖基供体释放的离去基团,由此获得包括一种或多种低聚半乳糖的组合物。
术语“除去从该半乳糖基供体释放的离去基团”应该被理解为从该孵育混合物中物理除去游离的离去基团和/或将游离的离去基团转化为一种或多种其他的可以仍存在于该孵育混合物中的化学物质种类。优选的是此类化学物质种类不充当半乳糖基受体,或至少它们是比游离的离去基团较不有效的半乳糖基受体。
本发明开创了高收率地廉价且有效生产复杂的低聚半乳糖组合物。本发明此外似乎减少从半乳糖基供体释放的游离的离去基团的半乳糖基化作用以及半乳糖基供体的自我半乳糖基化作用,这两者均形成对于从组合物中除去而言是昂贵的不希望的副产物。
优选地,除了β-半乳糖苷酶活性以外,该第一酶还具有转半乳糖基化活性。还可以优选的是该第一酶具有一个至多0.9的T-值。
在本发明的上下文中,术语一种酶β-半乳糖苷酶的“转半乳糖基化活性”涉及该酶将来自供体分子(例如乳糖分子)的半乳糖基基团转移至非水分子(例如另一个乳糖分子)的能力。
T-值是将乳糖用作半乳糖基供体和半乳糖基受体两者的一种酶β-半乳糖苷酶的转半乳糖基化效率的量度。根据描述于实例3中的测定和公式确定一种酶β-半乳糖苷酶的T-值。使用以下公式计算T-值:
一种不具有任何转半乳糖基化活性的乳糖酶针对每摩尔使用的乳糖将产生一摩尔半乳糖并且将具有1的T-值。一种具有极高转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶将使用几乎所有来自乳糖的半乳糖基基团用于转半乳糖基化而非产生半乳糖,并且将因此具有一个接近0的T-值。
本发明的又一个方面涉及一种包括一种或多种低聚半乳糖的组合物,该组合物通过如在此描述的方法是可获得的。
下面描述了本发明的另外的目的和优势。
附图简要说明
图1示出了在转半乳糖基作用中涉及的反应类型的示意性图解。
图2示出了当未使用游离的离去基团时获得的反应产物的示意性图示。
图3示出了当未使用游离的离去基团时获得的反应产物的示意性图示。
图4示出了孵育4小时之后,半乳糖基化的海藻糖的二糖、三糖以及四糖的整合的响应图—在孵育过程中除去以及未除去游离的离去基团。借助酶促转化除去游离的离去基团(葡萄糖)。可以看出当在孵育过程中除去游离的离去基团时,半乳糖基化的海藻糖的含量增加。
图5示出了孵育5小时之后,半乳糖基化的海藻糖的二糖、三糖以及四糖的整合的响应图—在孵育过程中除去以及未除去游离的离去基团。再次,可以看出当在孵育过程中除去游离的离去基团时,半乳糖基化的海藻糖的含量增加。
图6示出了与半乳糖基化的供体/离去基团的整体的整合的响应相比的半乳糖基化的海藻糖的整体的整合的响应图—在孵育过程中除去以及未除去游离的离去基团。半乳糖基化的供体/离去基团的整体的整合的响应是Gal-Glc、Gal-Gal-Glc以及Gal-Gal-Gal-Glc分子的整合的响应的总和。半乳糖基化的海藻糖的整体的整合的响应是Gal-Fuc、Gal-Gal-Fuc以及Gal-Gal-Gal-Fuc分子的响应的总和。可以看出,当在孵育过程中除去游离的离去基团时,半乳糖基化的海藻糖的整体的整合的响应显著增加而半乳糖基化的供体/离去基团的整体的整合的响应几乎未变。
发明详细说明
正如所述,本发明的一个方面涉及一种生产包括一种或多种低聚半乳糖的组合物的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一种混合物,该混合物包括
-一种半乳糖基供体,包括结合至离去基团的半乳糖基基团,该半乳糖基供体具有至多350g/mol的摩尔量,
-一种与该半乳糖基供体不同的半乳糖基受体,
所述半乳糖基受体是一种糖或糖醇,并且
其中该半乳糖基受体与该半乳糖基供体之间的摩尔比是至少1:10,并且其中该混合物包括至少0.05mol/L的半乳糖基受体,
b)提供一种第一酶,所述第一酶具有β-半乳糖苷酶活性,所述第一酶与该混合物接触,并且
c)孵育该混合物和该第一酶,从而允许该第一酶释放该半乳糖基供体的离去基团并且将该半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至该半乳糖基受体,以此方式形成低聚半乳糖,步骤c)进一步包括从该孵育混合物中(即在孵育过程中)除去从该半乳糖基供体释放的离去基团,由此获得包括一种或多种低聚半乳糖的组合物。
在本发明的上下文中,术语“糖基基团”涉及一种通过从单糖或低级低聚糖(如二糖或三糖)或从对应的糖醇中除去一个或两个羟基基团获得的基团。在此使用该术语描述半乳糖基供体、半乳糖基受体以及低聚糖的各种结构单元。
下面示出了最常见的糖及其对应的糖基基团的缩写。
在本发明的上下文中,术语“低聚糖”涉及一种包括至少两个,并且优选至少三个糖基基团的分子,这些糖基基团可以是不同或相同类型。这至少两个糖基基团优选经由O-糖苷键结合。低聚糖可以是糖基基团的直链或它可以具有支化结构。低聚糖可以例如被表示为化学计量式,例如(Gal)3Glc,或表示为通式,例如Gal-Gal-Gal-Glc、Gal-Gal-Glc-Gal或Gal-(Gal-)Glc-Gal。化学计量式提供关于低聚糖或低聚糖组包含哪种糖基基团的信息,但是不提供关于这些糖基基团的相对位置的信息,然而通式还包含关于这些糖基基团的相对位置的一般信息。
在本发明的上下文中,术语“同-低聚糖”涉及一种仅包含一种类型的糖基基团的低聚糖。同-低聚糖的实例是Gal-Gal-Gal-Gal和Glc-Glc-Glc。
在本发明的上下文中,术语“杂-低聚糖”涉及一种包含不同的糖基基团的低聚糖,例如Gal-Gal-Glc或Gal-Gal-Fuc。
在本发明的上下文中,与术语“低聚糖”一起使用的前缀“半乳糖的”指示该低聚糖包含半乳糖基基团作为重复单位。前缀“同”或“杂”可以与前缀“半乳糖的”一起使用。Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Gal两者均是低聚半乳糖。Gal-Gal-Glc是一种杂-低聚半乳糖而Gal-Gal-Gal-Gal是一种同-低聚半乳糖。
在本发明的上下文中,“X”表示一种如在此所定义的半乳糖基受体。“-X”表示与该半乳糖基受体对应的糖基基团,并且特别是结合至另一个基团的糖基基团。“-”象征键。糖基基团优选地经由该糖基基团的3位、4位、5位或6位结合,并且优选地经由O-糖苷键结合。在本发明的上下文中,“Gal-”表示结合至另一个基团的半乳糖基基团,优选经由该半乳糖基基团的1位,并且优选经由O-糖苷键。
在本发明的上下文中,“-Gal-”表示结合至两个其他基团的半乳糖基基团。左键优选经由该半乳糖基基团的4位或6位,并且优选经由O-糖苷键形成。右键优选经由该半乳糖基基团的1位,并且优选经由O-糖苷键形成。
两个半乳糖基基团之间的键典型地是1-4或1-6键,并且通常是O-糖苷键。半乳糖基基团与一种包含氮的受体之间的键可以可替代地是N-糖苷键。
本发明的方法优选是一种使用半乳糖基供体和半乳糖基受体生产包括一种或多种低聚半乳糖的组合物的方法,该一种或多种低聚半乳糖具有该半乳糖基受体作为其还原端。
在本发明的上下文中,术语“方法”和“工艺”可互换地使用。
步骤a)涉及提供有待在其中生产低聚糖的混合物。
该混合物优选是一种液体混合物并且可以例如是一种包含该半乳糖基受体和该半乳糖基供体的水溶液。
在本发明的一些实施例中,步骤a)的该混合物的半乳糖基受体与半乳糖基供体之间的摩尔比是至少1:5,优选是至少1:1,并且甚至更优选是至少5:1。例如,步骤a)的该混合物的半乳糖基受体与半乳糖基供体之间的摩尔比可以是至少10:1,例如至少15:1。
步骤a)的该混合物的半乳糖基受体与半乳糖基供体之间的摩尔比可以处于1:10-100:1的范围内。
在本发明的一些实施例中,步骤a)的该混合物的半乳糖基受体与半乳糖基供体之间的摩尔比处于1:10-50:1的范围内,优选处于1:5-30:1的范围内,并且甚至更优选处于1:1-20:1的范围内。例如,步骤a)的该混合物的半乳糖基受体与半乳糖基供体之间的摩尔比可以例如处于2:1-40:1的范围内,优选处于4:1-30:1的范围内,并且甚至更优选处于10:1-25:1的范围内。
正如所述,半乳糖基供体包含一个共价结合至离去基团的半乳糖基基团。该半乳糖基基团优选是β-D-吡喃半乳糖基基团。此外,该半乳糖基基团优选经由来自该半乳糖基基团的1位的O-糖苷键结合至该离去基团。
该半乳糖基供体的离去基团可以例如是糖基基团和/或糖醇基团。特别优选的是该半乳糖基供体的离去基团是葡糖基基团,即葡萄糖残基。
如果该离去基团是一种单糖或二糖或对应的糖醇的糖基基团,那么该半乳糖基基团优选经由来自该半乳糖基基团的1位的O-糖苷键结合至该离去基团,该键附接至单糖型离去基团的4位或二糖型离去基团的4’位。
在本发明的上下文中,短语“Y和/或X”意指“Y”或“X”或“Y和X”。沿着同一逻辑线路,短语“X1、X2、...、Xi-1和/或Xi”意指“X1”或“X2”或“Xi-1”或“Xi”或这些组分X、X2、...Xi-1以及Xi的任何组合。
在本发明的一些实施例中,该半乳糖基供体具有至多1000g/mol的摩尔量。例如,该半乳糖基供体可以具有至多500g/mol的摩尔量。甚至可以优选的是,该半乳糖基供体具有至多350g/mol的摩尔量。
二糖是一种目前优选类型的半乳糖基供体。可替代地或另外地,三糖也可以用作半乳糖基供体。因此,可以预期的是该混合物可以包含不同半乳糖基供体的组合。
在本发明的一些优选实施例中,该半乳糖基供体是乳糖。有用的半乳糖基供体的另一个实例是乳果糖。有用的半乳糖基供体的又一个实例是乳糖醇。
在本发明的上下文中,术语“乳糖”涉及二糖β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-D-葡萄糖,它也被称为乳糖(milk sugar)并且它是牛乳中最主要的糖。
可以经由任何有用的半乳糖基供体来源提供该半乳糖基供体,工业精制来源,例如纯化的乳糖,和/或天然来源,例如乳清渗透物,即通过超滤乳清制备的脱蛋白的乳清。
该半乳糖基受体可以是能够从该第一酶接受半乳糖基基团的任何分子并且典型地包含羟基基团,并且优选是醇式羟基基团。术语“接受”意指该供体的半乳糖基基团应该例如经由O-糖苷键共价地结合至该受体。
在本发明的一些实施例中,该半乳糖基受体包括一个或多个醇式羟基基团。例如,该半乳糖基受体可以是一种多元醇。
在本发明的上下文中,术语“多元醇”涉及一种包括至少两个醇式羟基基团的分子。
在本发明的一些优选实施例中,该半乳糖基受体不是乳糖。此外,可以优选的是该半乳糖基受体不是葡萄糖。
在本发明的一些优选实施例中,该半乳糖基受体不同于该半乳糖基供体。特别优选的是使用一种相对价廉的半乳糖基供体(如乳糖)作为半乳糖基来源并且使用一种生物学上感兴趣的受体(如海藻糖)作为半乳糖基受体。
在本发明的一些实施例中,该半乳糖基受体不是乳糖、半乳糖或葡萄糖。
在本发明的一些实施例中,该半乳糖基受体不是葡萄糖或具有通式Gal-(Gal)i-Glc的低聚糖,其中i是一个非负整数,即例如0、1、2、3或4。
在本发明的一些实施例中,该半乳糖基受体不是半乳糖或具有通式Gal-(Gal)i-Gal的低聚糖,其中i是一个非负整数。
可以使用具有不同摩尔量的半乳糖基受体,但是目前优选的是具有至少100g/mol的摩尔量的半乳糖基受体。
在本发明的一些实施例中,该半乳糖基受体具有至多1000g/mol的摩尔量。例如,该半乳糖基受体可以具有至多500g/mol的摩尔量。甚至可以优选的是,该半乳糖基受体具有至多350g/mol的摩尔量。该半乳糖基受体可以例如具有至多200g/mol的摩尔量。
在本发明的一些优选实施例中,该半乳糖基受体是一种糖。该半乳糖基受体可以例如是一种单糖。可替代地,该半乳糖基受体可以是一种二糖。
例如,该半乳糖基受体可以是一种戊糖。该半乳糖基受体可以例如是阿拉伯糖。有用的戊糖的另一个实例是木糖。有用的戊糖的又一个实例是核糖。该半乳糖基受体可以例如是一种选自下组的戊糖,该组由以下各项组成:阿拉伯糖、木糖以及核糖。
己糖是另一组有用的半乳糖基受体。该半乳糖基受体可以例如是甘露糖。有用的己糖的另一个实例是半乳糖。有用的己糖的又一个实例是塔格糖。有用的己糖的另一个实例是果糖。该半乳糖基受体可以例如是一种选自下组的己糖,该组由以下各项组成:甘露糖、半乳糖、塔格糖以及果糖。
在本发明的一些优选实施例中,该半乳糖基受体是一种脱氧-己糖。该半乳糖基受体可以例如是海藻糖,例如像D-海藻糖、L-海藻糖或其混合物。
可替代地,该半乳糖基受体可以是一种低聚糖,例如像二糖或三糖。有用的二糖的一个实例是麦芽糖。有用的二糖的另一个实例是乳果糖。
半乳糖基受体的又一个有用的组是糖衍生物。
在本发明的上下文中,术语“糖衍生物”涉及一种包含一个或多个非羟基官能团的糖。此类官能团的实例是羧基基团、氨基基团、N-乙酰氨基基团和/或巯基基团。在1位包含醛基基团或在2位包含酮基基团的糖本身不被认为是糖衍生物,除非这些糖包括一些上面提及的非羟基官能团。
有用的糖衍生物的一个实例是N-乙酰半乳糖胺。有用的糖衍生物的另一个实例是唾液酸。有用的糖衍生物的又一个实例是唾液乳糖(sialyllactose)。因此,该半乳糖基受体可以是一种选自下组的糖衍生物,该组由以下各项组成:N-乙酰半乳糖胺、唾液酸以及唾液乳糖。
另一组有用的半乳糖基受体是糖醇。因此,在本发明的一些实施例中,该半乳糖基受体是一种糖醇。有用的糖醇的实例是山梨糖醇、木糖醇、乳糖醇和/或麦芽糖醇。
与上述半乳糖基受体相反,诸位发明人已经发现N-乙酰基葡糖胺和葡萄糖是较不有效的半乳糖基受体。因此,在本发明的一些实施例中,该半乳糖基受体不是葡萄糖或N-乙酰基葡糖胺。
该混合物可以包含一种或多种与第一类型的半乳糖基受体不同的另外的半乳糖基受体。该混合物的不同类型的半乳糖基受体可以例如选自在此提及的这些半乳糖基受体类型。
在本发明的一些优选实施例中,产生的半乳糖基化的受体充当一种新型的半乳糖基受体并且还可以被半乳糖基化。以此方式,可以生产具有化学计量式Gali+1X的低聚半乳糖,其中i是一个非负整数。通常,最主要的种类是GalX、Gal2X和Gal3X。
在本发明的其他优选实施例中,产生的半乳糖基化的受体充当一种新型的半乳糖基受体并且还可以被半乳糖基化。以此方式,可以生产具有通式Gal-(Gal)i-X的低聚半乳糖,其中i是一个非负整数。通常,最主要的种类是Gal-X、Gal-Gal-X和Gal-Gal-Gal-X。
在本发明的一些实施例中,步骤a)的混合物包括处于至多0.7mol/L,优选至多0.4mol/L,并且甚至更优选至多0.2mol/L的浓度的半乳糖基供体。该混合物可以例如包括处于0.001-0.7mol/L的范围内,优选处于0.01-0.5mol/L的范围内,并且甚至更优选处于0.02-0.2mol/L的范围内的浓度的半乳糖基供体。
可替代地,步骤a)的混合物可以包括处于至多0.3mol/L,优选至多0.1mol/L,并且甚至更优选至多0.05mol/L的浓度的半乳糖基供体。该混合物可以例如包括处于0.001-0.2mol/L的范围内,优选处于0.005-0.1mol/L的范围内,并且甚至更优选处于0.01-0.05mol/L的范围内的浓度的半乳糖基供体。
应该指出的是,半乳糖基化的半乳糖基受体和半乳糖基化的半乳糖基供体可以在一定程度上充当半乳糖基供体,但是在本发明的上下文中半乳糖基化的半乳糖基受体和半乳糖基化的半乳糖基供体不被认为是半乳糖基供体并且无助于在此提及的半乳糖基供体的浓度或比例。
可以使用处于不同浓度范围内的半乳糖基受体。然而,优选的是避免用该半乳糖基受体饱和该混合物,因为通常必须从本发明的包含低聚半乳糖的组合物中除去过量的半乳糖基受体。
在本发明的一些实施例中,步骤a)的混合物包括处于至少0.05mol/L,优选至少0.10mol/L,并且甚至更优选至少0.30mol/L的量的半乳糖基受体。甚至更高浓度的半乳糖基受体可以是优选的,因此步骤a)的混合物可以例如包括处于至少0.5mol/L,优选至少0.7mol/L,并且甚至更优选至少1mol/L的量的半乳糖基受体。
该混合物可以例如包括处于0.05mol/L-5mol/L的范围内,优选处于0.1mol/L-2mol/L的范围内,并且甚至更优选处于0.3mol/L-1mol/L的范围内的浓度的半乳糖基受体。
然而,在一些实施例中,相对较低浓度的半乳糖基受体是优选的,在这种情况下,该混合物可以例如包括处于至多2mol/L,优选至多0.5mol/L,并且甚至更优选至多0.2mol/L的浓度的半乳糖基受体。例如,该混合物可以包括处于0.05mol/L-2mol/L的范围内,优选处于0.06mol/L-1mol/L的范围内,并且甚至更优选处于0.08mol/L-0.8mol/L的范围内的浓度的半乳糖基受体。
除了半乳糖基受体和半乳糖基供体以外,该混合物可以进一步包含用于优化酶促反应条件的不同添加剂。
该混合物可以例如一种或多种用于将该混合物的pH调节至该第一酶的pH最佳值的pH缓冲液。可替代地或另外,该混合物可以包括包含一种或多种金属离子的水溶性盐。取决于特定的第一酶,可以例如使用金属离子,如Ca2+、Zn2+或Mg2+。然而,注意一些第一酶对于存在于该混合物中的金属离子是不敏感的。
合成低聚糖的常规方法通常利用水活性降低试剂,例如像甘油、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇(PEG)。本发明有利地使得不使用此类水活性降低试剂而有效合成低聚半乳糖成为可能。因此,在本发明的一些优选实施例中,该混合物包含处于相对于该混合物的重量按重量计至多5%,优选按重量计至多1%,并且甚至更优选按重量计至多0.1%的量的水活性降低试剂。例如,该混合物可以包含处于相对于该混合物的重量按重量计至多0.05%的量的水活性降低试剂。
步骤a)的混合物或形成该混合物的成分在与第一酶反应之前已经加热处理,以避免在反应过程中的微生物生长。可以使用平常的加热处理工艺,如巴氏灭菌法(例如,72℃,持续15秒钟)、较高巴氏灭菌法(例如,90℃,持续15秒钟)或UHT处理(例如,140℃,持续4秒钟)。当加热温度不稳定的酶时,应该谨慎。
步骤b)涉及提供一种第一酶,该酶优选具有β-半乳糖苷酶活性。优选地,除了β-半乳糖苷酶活性以外,该第一酶还具有转半乳糖基化活性。还可以优选的是该第一酶具有至多0.9的T-值。应该指出的是,该方法可以进一步涉及使用另外的酶,例如具有不同于β-半乳糖苷酶活性或转半乳糖基化活性的酶活性的酶。
在本发明的上下文中,术语“β-半乳糖苷酶活性”涉及酶促催化β-D-半乳糖苷(如乳糖)中的末端非还原β-D-半乳糖残基的水解。在本发明中使用的第一酶优选属于EC3.2.1.23类别。
优选的是该第一酶具有至多0.9的T-值。在本发明的一些实施例中,该第一酶的T-值是至多0.8,优选是至多0.7,并且甚至更优选是至多0.6。例如,该第一酶的T-值可以是至多0.5。优选地,该第一酶的T-值可以是至多0.4。甚至可以更优选的是,该第一酶的T-值是至多0.3。
甚至更低的T-值可以是优选的,如至多0.2。
有用的第一酶可以例如来源于由SEQ ID NO.1的DNA序列编码的肽。有用的第一酶可以例如来源于其中的这样的一种肽的实例是具有SEQ IDNO.2的氨基酸序列的肽。
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2可以发现于PCT申请WO 01/90,317A2中,其中它们被称为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。另外地,另外有用的第一酶也可以发现于WO 01/90,317A2中。
在本发明的一些优选实施例中,该第一酶包括一个相对于SEQ ID NO.2的肽具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。例如,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的肽具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性的氨基酸序列。在一些情况下,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的肽具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。
在本发明的上下文中,术语“序列一致性”涉及两个具有相同长度的氨基酸序列之间或两个具有相同长度的核酸序列之间的一致性程度的定量量度。如果两个有待比较的序列的长度不相等,那么它们必须被比对至最可能拟合。序列一致性可以被计算为
(Nref-Ndif)*100)/(Nref),
其中Ndif是当比对时,两个序列中的非一致残基的总数,并且其中Nref是这些序列之一中的残基的数目。由此可见,DNA序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC具有一个75%的序列一致性(Ndif=2并且Nref=8)。将空位计数为一个或多个特定残基的非一致性,即DNA序列AGTGTC将与DNA序列AGTCAGTC具有一个75%的序列一致性(Ndif=2并且Nref=8)。可以例如使用适当的BLAST-程序计算序列一致性,例如由美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTp-算法。
在本发明的其他优选实施例中,该第一酶的氨基酸序列与相对于SEQID NO.2的肽具有至少80%序列一致性。例如,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQ ID NO.2的肽具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性。在一些情况下,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQ ID NO.2的肽具有至少99%序列一致性。
在本发明的一些优选实施例中,该第一酶包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。例如,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性的氨基酸序列。在一些情况下,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。
在本发明的其他优选实施例中,该第一酶的氨基酸序列相对于SEQ IDNO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少80%序列一致性。例如,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性。在一些情况下,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少99%序列一致性。因此,该第一酶可以例如具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)。
在本发明的一些优选实施例中,该第一酶包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。例如,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性的氨基酸序列。在一些情况下,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。
在本发明的其他优选实施例中,该第一酶的氨基酸序列相对于SEQ IDNO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少80%序列一致性。例如,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性。在一些情况下,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少99%序列一致性。因此,该第一酶可以例如具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)。
在本发明的一些优选实施例中,该第一酶包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。例如,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性的氨基酸序列。在一些情况下,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。
在本发明的其他优选实施例中,该第一酶的氨基酸序列相对于SEQ IDNO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性。例如,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性。在一些情况下,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少99%序列一致性。
在本发明的一些目前优选实施例中,该第一酶具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)。
在本发明的一些优选实施例中,该第一酶包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。例如,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性的氨基酸序列。在一些情况下,该第一酶可以包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。
在本发明的其他实施例中,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQ IDNO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性。例如,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少90%,优选至少95%,并且甚至更优选至少97.5%序列一致性。在一些情况下,该第一酶的氨基酸序列可以相对于SEQID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少99%序列一致性。因此,该第一酶可以例如具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)。
在本发明的一些目前优选实施例中,该第一酶具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)。
该第一酶可以例如包括:
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
可替代地,该第一酶可以例如由以下各项组成:
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
该第一酶可以例如包括:
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
可替代地,该第一酶可以例如由以下各项组成:
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
在本发明的一些实施例中,该第一酶可以例如包括一个相对于示于表1中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。该第一酶可以例如包括一个示于表1中的氨基酸序列。可替代地,该第一酶的氨基酸序列可以相对于示于表1中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。该第一酶可以例如具有一个示于表1中的氨基酸序列。
表1 有用的氨基酸序列(AAS)。
在本发明的一些实施例中,该酶可以例如包括一个相对于示于表2中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。该酶可以例如包括一个示于表2中的氨基酸序列。可替代地,该酶的氨基酸序列可以相对于示于表2中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。该酶可以例如具有一个示于表2中的氨基酸序列。
表2 有用的氨基酸序列(AAS)
在本发明的一些实施例中,该酶可以例如包括一个相对于示于表3中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。该酶可以例如包括一个示于表3中的氨基酸序列。可替代地,该酶的氨基酸序列可以相对于示于表3中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。该酶可以例如具有一个示于表3中的氨基酸序列。
表3 有用的氨基酸序列(AAS)。
在本发明的一些实施例中,该酶可以例如包括一个相对于示于表4中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。该酶可以例如包括一个示于表4中的氨基酸序列。可替代地,该酶的氨基酸序列可以相对于示于表4中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。该酶可以例如具有一个示于表4中的氨基酸序列。
表4 有用的氨基酸序列(AAS)。
在本发明的一些实施例中,该第一酶可以例如包括一个相对于示于表5中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。该第一酶可以例如包括一个示于表5中的氨基酸序列。可替代地,该第一酶的氨基酸序列可以相对于示于表5中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。该第一酶可以例如具有一个示于表5中的氨基酸序列。
表5 有用的氨基酸序列(AAS)。
在本发明的一些实施例中,该第一酶可以例如包括一个相对于示于表6中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性的氨基酸序列。该第一酶可以例如包括一个示于表6中的氨基酸序列。可替代地,该第一酶的氨基酸序列可以相对于示于表6中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。该第一酶可以例如具有一个示于表6中的氨基酸序列。
表6 有用的氨基酸序列(AAS)。
具有转半乳糖基化活性的有用的第一酶的其他实例可以发现于WO2011/120993A1中,将其通过引用结合在此。
在本发明的一些实施例中,该第一酶可以包含一个或多个糖基化的氨基酸。可替代地或另外,该第一酶可以包含一个或多个磷酸化的氨基酸。可替代地,该第一酶的所有氨基酸均未被糖基化或磷酸化。
在本发明的一些优选实施例中,该第一酶包括至少两个亚单位,每个亚单位由一种如上所定义的第一酶组成。
该第一酶优选地与该混合物接触并且由此与半乳糖基受体和半乳糖基供体两者接触。
在本发明的一些实施例中,该混合物包括第一酶和/或第二酶。该第一酶和/或第二酶可以例如以溶解态存在于该混合物中,例如作为单个的酶分子或作为酶分子的可溶性聚集体。
在本发明的其他实施例中,该第一酶和/或第二酶与该混合物分离,但是通过使该第一酶和/或第二酶与该混合物接触而与半乳糖基受体和半乳糖基供体接触。例如,可以使用在一固定的固相上的第一酶和/或第二酶。有用的固定的固相的实例是例如具有包含第一酶的颗粒的过滤器、填充床或类似结构。
可替代地,该固相可以例如是形成该混合物的一部分的自由流动的微粒状固相,例如有机或无机珠粒。
关于酶的工业用途、包括固定技术以及适合的固相类型的细节可以发现于Buchholz(布霍尔茨)(2005)中,出于所有目的将其通过引用结合在此。
优选地以足够获得可接受收率的低聚半乳糖的活性使用该第一酶。最佳活性取决于工艺的具体实现并且可以容易地由本领域的普通技术人员确定。
如果需要半乳糖基供体的高流通(turn-over)以及高收率的低聚半乳糖,那么可以优选的是以相对高的活性使用该第一酶。例如,该第一酶的活性可以如此,以使得该半乳糖基供体的流通是至少0.02mol/(L*h),优选是至少0.2mol/(L*h),并且甚至更优选是至少2mol/(L*h)。
在步骤c)的孵育过程中发生酶促反应。一旦该混合物被暴露于正确的条件(与当该半乳糖基受体和该半乳糖基供体与该第一酶接触时可以几乎立即),转半乳糖基作用通常就开始,并且在本发明的一些实施例中,步骤b)和c)同时发生。
该第一酶能够释放该半乳糖基供体的离去基团并且将该半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至该半乳糖基受体。例如,如果该半乳糖基供体是乳糖,那么葡萄糖被释放并且半乳糖基基团被转移至该受体。在酶促反应过程中,该第一酶充当催化剂。
在本发明的一些优选实施例中,该第一酶进一步将半乳糖基基团转移至已经被半乳糖基化的半乳糖基受体,由此产生包含两个、三个或甚至更多个半乳糖基基团的半乳糖基受体。
孵育混合物的pH优选接近该第一酶的最适pH。在本发明的一些实施例中,在步骤c)过程中,该孵育混合物的pH处于pH3-9的范围内。例如,在步骤c)过程中,该孵育混合物的pH可以处于pH4-8的范围内,例如处于pH5-7.5的范围内。
类似于pH,优选将该孵育混合物的温度调节至使用的第一酶的最适温度。在本发明的一些实施例中,步骤c)的孵育混合物的温度处于10℃-80℃的范围内。该孵育混合物的温度可以例如处于20℃-70℃的范围内,优选处于25℃-60℃的范围内,并且甚至更优选处于30℃-50℃的范围内。
在本发明的上下文中,术语“该第一酶的最适pH”涉及该第一酶在此处具有最高转半乳糖基化活性的pH。沿着同一线路,术语“该第一酶的最适温度”涉及该第一酶在此处具有最高转半乳糖基化活性的温度。
步骤c)可以进一步涉及搅拌该孵育混合物。
在步骤c)的孵育过程中除去游离的离去基团。该除去可以例如当步骤c)开始时立即开始或它可以被延迟,直到在该孵育混合物中形成足够量的游离的离去基团。
可以例如通过存在于该孵育混合物中的微生物将游离的离去基团从该孵育混合物中除去。
因此,在本发明的一些实施例中,该方法进一步包括提供一种微生物,该微生物能够转化从该半乳糖基供体释放的游离的离去基团并且在孵育过程中,允许所述微生物除去从该半乳糖基供体释放的离去基团。
有用的微生物优选能够从该孵育混合物中选择性地除去游离的离去基团并且例如将其代谢或转化为与离去基团相比较不干扰低聚半乳糖的合成的转化产物。
在本发明的一些优选实施例中,该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基受体的除去速率至少高10倍。
例如,该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基受体的除去速率至少高102倍,优选至少高103倍,并且甚至更优选比该微生物相对于该半乳糖基受体的除去速率至少高104倍。该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基受体的除去速率可以例如至少高105倍。甚至可以优选的是,该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基受体的除去速率至少高106倍,并且甚至更优选至少高107倍。
在本发明的上下文中,术语“除去速率”涉及每分钟该微生物能够从该孵育混合物中除去的游离的离去基团、供体、受体或单-半乳糖基化的受体的摩尔数。
在本发明的一些优选实施例中,该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基供体的除去速率至少高10倍。
例如,该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基供体的除去速率至少高102倍,优选至少高103倍,并且甚至更优选比该微生物相对于该半乳糖基供体的除去速率至少高104倍。该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基供体的除去速率可以例如至少高105倍。甚至可以优选的是,该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基供体的除去速率至少高106倍,并且甚至更优选至少高107倍。
在本发明的一些优选实施例中,该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的除去速率至少高10倍。
例如,该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的除去速率至少高102倍,优选至少高103倍,并且甚至更优选比该微生物相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的除去速率至少高104倍。该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的除去速率可以例如至少高105倍。甚至可以优选的是,该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的除去速率至少高106倍,并且甚至更优选至少高107倍。
该微生物优选是一种酵母菌或细菌。
酿酒酵母是有用的酵母菌的一个实例,并且有用的细菌可以例如是Lac Z-阴性大肠杆菌菌株或其他可以代谢葡萄糖而非乳糖的细菌。
可替代地或另外地,可以借助将离去基团转化为其他化学物质种类的特定酶将游离的离去基团从该孵育混合物中除去。
因此,在本发明的一些优选实施例中,该方法此外包括提供一种第二酶,该第二酶能够转化从该半乳糖基供体释放的游离的离去基团并且在孵育过程中,允许所述第二酶转化从该半乳糖基供体释放的离去基团。
术语“转化游离的离去基团”涉及将游离的离去基团转化为化学物质种类(它们优选是比游离的离去基团本身弱的半乳糖基受体)的工艺。转化可以涉及将游离的离去基团降解为若干较小的化学物质种类或它可以简单地涉及将游离的离去基团转化为不同的化学物质种类。
本发明可以例如涉及一种生产包括一种或多种低聚半乳糖的组合物的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一种混合物,该混合物包括
-一种半乳糖基供体,包括结合至离去基团的半乳糖基基团,该半乳糖基供体具有至多350g/mol的摩尔量,
-一种与该半乳糖基供体不同的半乳糖基受体,
所述半乳糖基受体是一种糖或糖醇,并且
其中该半乳糖基受体与该半乳糖基供体之间的摩尔比是至少1:10,并且其中该混合物包括至少0.05mol/L的半乳糖基受体,
b)提供一种第一酶和一种第二酶,所述第一酶具有β-半乳糖苷酶活性并且具有至多0.9的T-值,所述第二酶能够转化从该半乳糖基供体释放的游离的离去基团,并且所述第一酶和第二酶与该混合物接触,并且
c)允许该第一酶释放该半乳糖基供体的离去基团并且将该半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至该半乳糖基受体,以此方式形成低聚半乳糖,并且允许该第二酶转化从该半乳糖基供体释放的离去基团,由此获得包括该低聚半乳糖的组合物。
该第二酶可以例如具有己糖氧化酶活性,即属于EC1.1.3.5酶类并且具有催化用O2氧化β-D-葡萄糖以形成D-葡萄糖-1,5-内酯和过氧化氢的能力。
甚至更优选的是,该第二酶具有葡萄糖氧化酶活性,即属于EC1.1.3.4酶类并且具有催化用O2氧化β-D-葡萄糖以形成D-葡萄糖-1,5-内酯和过氧化氢而不显著氧化包含葡萄糖的二糖(如乳糖)的能力。
在一个水性酸性环境中,D-葡萄糖-1,5-内酯典型地水解以形成葡糖酸。
可替代地,第二酶可以具有己糖激酶活性(EC2.7.1.1)或葡糖激酶活性(EC 2.7.1.2)。
其他有用的第二酶可以例如发现于对于本领域的普通技术人员而言可获得的手册中。
优选的是,该第二酶在其转化游离的离去基团中是选择性的并且仅在有限的范围,并且优选一点也不,转化半乳糖基供体、半乳糖基受体和/或低聚半乳糖。
因此,在本发明的一些优选实施例中,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数至少高10倍。
例如,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数至少高102倍,优选至少高103倍,并且甚至更优选比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数至少高104倍。该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数可以例如至少高105倍。甚至可以优选的是,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数至少高106倍,并且甚至更优选至少高107倍。
术语“特异性常数”被确定为kcat/Km并且体现用于反应中的所有步骤的速率常数。因为特异性常数反映亲和力和催化能力两者,所以针对彼此比较不同酶或用不同底物比较同一酶是有用的。将特异性常数的理论最大值叫做扩散极限并且是约108至109(M-1s-1)。此时,酶与其底物的每一次碰撞都将导致催化作用,并且产物形成的速率不受限于反应速率而受限于扩散速率。
使用调节至pH6.5的50mM Na3PO4缓冲液,在37度下确定第二酶的kcat和Km。该缓冲液此外包含酶的最佳表现所需的盐和辅因子。在本发明的一些优选实施例中,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数至少高10倍。
例如,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数至少高102倍,优选至少高103倍,并且甚至更优选比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数至少高104倍。该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数可以例如至少高105倍。甚至可以优选的是,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数至少高106倍,并且甚至更优选至少高107倍。
在本发明的一些优选实施例中,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体(Gal-X)的特异性常数至少高10倍。
例如,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数至少高102倍,优选至少高103倍,并且甚至更优选比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数至少高104倍。该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数可以例如至少高105倍。甚至可以优选的是,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数至少高106倍,并且甚至更优选至少高107倍。
在本发明的一些优选实施例中,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数:
-比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数高至少10倍,
-比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数高至少10倍,并且
-比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数高至少10倍。
例如,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数可以:
-比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数高至少102倍,
-比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数高至少102倍,并且
-比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数高至少102倍。
优选地,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数:
-比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数高至少103倍,
-比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数高至少103倍,并且
-比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数高至少103倍。
可替代地,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数可以:
-比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数高至少104倍,
-比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数高至少104倍,并且
-比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数高至少104倍。
该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数可以:
-比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数高至少105倍,
-比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数高至少105倍,并且
-比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数高至少105倍。
甚至更优选的是,该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数:
-比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数高至少106倍,
-比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数高至少106倍,并且
-比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数高至少106倍。
该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数可以例如:
-比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数高至少107倍,
-比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数高至少107倍,并且
-比该第二酶相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数高至少107倍。
特别优选的是,该第二酶具有葡萄糖氧化酶活性并且该半乳糖基供体的离去基团是葡糖基基团,在这种情况下,该游离的离去基团是葡萄糖。如果该第二酶具有葡萄糖氧化酶活性,那么乳糖是一种优选的半乳糖基供体。
葡萄糖氧化酶需要O2作为氧化剂并且如果水中溶解的O2的正常量不足,那么可能必须向该孵育混合物中添加另外的O2(g)。还可能的是,如果需要的话,向该孵育混合物中添加辅因子,如FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)或NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。
如上所述,当葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化为D-葡萄糖-1,5-内酯时形成H2O2,并且例如归因于使用的酶的不希望的氧化作用,高水平的H2O2对于该工艺而言可能是有问题的。在本发明的一些实施例中,该方法进一步涉及提供一种与该孵育混合物接触并且催化H2O2降解为例如H2O和O2的过氧化物酶或过氧化氢酶。葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶两者在现有技术中是熟知的并且是可商购的。有用的葡萄糖氧化酶的一个实例是GlyzymeBG(诺维信公司(Novozymes),丹麦)。有用的过氧化氢酶的一个实例是Catazyme25L(诺维信公司,丹麦)。另一个实例是来自溶壁微球菌的酶过氧化氢酶(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),丹麦)。
该方法进一步可以涉及使该孵育混合物与一种内酯酶,并且优选一种葡糖酸内酯酶(EC3.1.1.17),即一种能够将D-葡萄糖-1,5-内酯水解为葡糖酸或其对应的碱性葡糖酸盐的酶,进行接触。
因此,在本发明的一些优选实施例中,使该孵育混合物与一种具有葡萄糖氧化酶活性的酶、一种具有葡萄糖氧化酶活性过氧化氢酶活性的酶以及一种具有葡糖酸内酯酶活性的酶接触。
在本发明的一些优选实施例中,该方法进一步包括提供一种除去剂,该除去剂能够通过用该第二酶转化离去基团而除去至少一些转化产物,并且在孵育过程中,允许该除去剂除去至少一些转化产物。
在本发明的上下文中,术语“除去剂”涉及一种能够捕获转化产物并且例如通过沉淀将其从该孵育混合物中除去的微粒状试剂或分子试剂。
该除去剂可以例如包括二价或三价金属离子的盐,或甚至由其组成。有用的金属离子的实例是Ca2+、Fe2+、Al3+或Zn2+。
在本发明的优选实施例中,该除去剂包括CaCO3,或甚至由其组成。
可以使用阴离子交换层析除去带负电的转化产物,例如像葡糖酸盐(葡糖酸的去质子形式)。
因此,该除去剂可以包括一种阴离子交换材料,或甚至由其组成。
在本发明的一些实施例中,该阴离子交换材料包括固相以及一种或多种阳离子基团。
优选地,至少一些阳离子基团附接至该固相的外表面和/或附接至通过该固相的外表面可接近的孔的表面。
在本发明的一些实施例中,该阴离子交换材料的固相包括一种或多种选自下组的组分,该组由以下各项组成:多个颗粒、过滤器以及膜。
该固相可以例如包括多糖,或甚至由其组成。特别优选交联多糖。有用的多糖的实例是纤维素、琼脂糖和/或葡聚糖。可替代地,该固相可以包括一种非碳水化合物聚合物,或甚至由其组成。有用的非碳水化合物聚合物的实例是甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、和/或苯乙烯-二乙烯基苯。
在本发明的一些优选实施例中,这些阳离子基团包括氨基基团,或甚至由其组成。叔氨基团是特别优选的并且在适当的pH条件下形成季铵基团。季铵基团为该阴离子交换材料提供强阴离子交换特征。
可替代地或另外地,这些阳离子基团可以包括一个或多个伯氨或仲氨基团。实质量的伯氨或仲氨基团典型地为该阴离子交换材料提供弱的阴离子交换特征。关于阴离子交换层析及其工业实施的更多细节可以发现于斯科普斯(Scopes)中,出于所有目的将其通过引用结合在此。
当使用一种阴离子交换材料用于捕获转化产物时,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中产生的转化产物的总量的总结合力可以例如是至少30%(mol/mol)。例如,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中产生的转化产物的总量的总结合力可以是至少50%(mol/mol)。可替代地,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中产生的转化产物的总量的总结合力可以是至少80%(mol/mol)。
当被利用时,该除去剂优选以足够沉淀或捕获在合成过程中形成的被转化的离去基团的理论量的量存在。
因此,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中产生的转化产物的总量的总结合力可以例如是至少100%(mol/mol)。例如,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中产生的转化产物的总量的总结合力可以是至少150%(mol/mol)。可替代地,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中产生的转化产物的总量的总结合力可以是至少200%(mol/mol)。
可以例如由与使用的一种或多种酶有关的计划的工艺条件和动力学数据估计在孵育过程中产生的转化产物的总量。
可替代地,可以将释放的离去基团的预期量用作给料该阴离子交换材料的指导。因此,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中释放的离去基团的总量的总结合力可以例如是至少30%(mol/mol)。例如,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中释放的离去基团的总量的总结合力可以是至少50%(mol/mol)。可替代地,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中释放的离去基团的总量的总结合力可以是至少80%(mol/mol)。
该阴离子交换材料相对于在孵育过程中释放的离去基团的总量的总结合力可以例如是至少100%(mol/mol)。例如,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中释放的离去基团的总量的总结合力可以是至少150%(mol/mol)。可替代地,该阴离子交换材料相对于在孵育过程中释放的离去基团的总量的总结合力可以是至少200%(mol/mol)。
诸位发明人已经发现即使使用相对较低浓度的半乳糖基供体,该方法出人意料地提供高收率的低聚半乳糖。相对较低浓度的半乳糖基供体另外地降低该供体的自我半乳糖基化程度,即当一个第一半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至一个第二半乳糖基供体而非转移至半乳糖基受体时。
在本发明的一些优选实施例中,步骤c)包括向该混合物中添加另外的半乳糖基供体。当使用相对较低浓度的半乳糖基供体时,这是特别优选的。通过添加更多的半乳糖基供体,避免该混合物中的半乳糖基供体被耗尽并且在酶促反应过程中可以控制该半乳糖基供体的浓度。
添加另外的半乳糖基供体可以涉及不连续的一次或多次添加半乳糖基供体,例如在酶促反应过程中至少一次。可替代地或另外地,添加另外的半乳糖基供体可以是在酶促反应过程中连续添加。与步骤a)中所使用的相同类型的另外的半乳糖基供体是优选的。
步骤c)可以例如涉及在孵育过程中测量半乳糖基供体的浓度并且如果浓度太低,添加额外的半乳糖基供体。
在本发明的一些优选实施例中,在步骤c)过程中将该混合物的半乳糖基供体的浓度维持在处于0.01-1mol/L的范围内,优选处于0.01-0.5mol/L的范围内,并且优选处于0.03-0.3mol/L的范围内的浓度。
例如,在步骤c)过程中可以将该混合物的半乳糖基供体的浓度维持在处于0.02-0.1mol/L的范围内的浓度。
步骤c)可以此外包括添加另外的半乳糖基受体。这使得在步骤c)过程中控制该混合物的半乳糖基受体的浓度成为可能并且例如可能使半乳糖基受体浓度保持基本不变,如果这是所希望的话。
为了生产足够量的包含两个或三个转移的半乳糖基基团的低聚半乳糖,该工艺应该消耗比半乳糖基受体多的半乳糖基供体。由此,更多的半乳糖基受体将被半乳糖基化两次或三次。因此,在本发明的一些优选实施例中,消耗的半乳糖基供体与消耗的半乳糖基受体之间的摩尔比是至少1:1,并且优选是至少5:1,并且甚至更优选是至少10:1。
典型地通过灭活这些酶,例如通过热处理使第一酶变性或通过断开第一酶与孵育的混合物的碳水化合物之间的接触来结束步骤c)。如果该第一酶是一种固定至固相的酶,那么可以例如通过将该固相与该孵育的混合物分离来断开接触。如果该第一酶已经被溶解于该混合物中,那么可以使用保留该第一酶而允许低聚糖通过的过滤器通过超滤作用将该第一酶与该孵育的混合物分离。
通常需要富集和/或纯化该组合物的低聚半乳糖并且减少半乳糖基受体、半乳糖基供体以及释放的离去基团的浓度。
因此,在本发明的一些优选实施例中,该方法进一步包括以下步骤:
d)富集步骤c)的组合物的低聚半乳糖。
在本发明的上下文中,术语“富集低聚半乳糖”涉及在干重基础上增加该组合物的低聚半乳糖的相对量。这典型地通过除去该组合物的一些其他固体(例如低级糖)并且任选地还有第一酶(如果需要的话)来完成。
步骤d)的富集可以例如涉及层析分离和/或纳米过滤。关于此类工艺的细节描述于Walstra(沃斯特拉)(2006)等人中,出于所有目的将其通过引用结合在此。
在本发明的一些实施例中,富集涉及从步骤c)的组合物中除去至少50%(w/w,在干重基础上)的具有至多200g/mol的摩尔量的分子。例如,富集可以涉及从步骤c)的组合物中除去至少80%(w/w,在干重基础上)的具有至多200g/mol的摩尔量的分子。
在本发明的其他实施例中,富集涉及从步骤c)的组合物中除去至少50%(w/w,在干重基础上)的具有至多350g/mol的摩尔量的分子。例如,富集可以涉及从步骤c)的组合物中除去至少80%(w/w,在干重基础上)的具有至多350g/mol的摩尔量的分子。
作为一个替代方案,或除了富集以外,可以优选的是步骤d)包括一个或多个增加该组合物中的低聚半乳糖的浓度的工艺。有用的浓缩步骤的实例是例如反渗透、蒸发和/或喷雾干燥。
步骤d)可以此外涉及从步骤c)的组合物中除去除去剂和/或结合至该除去剂的被转化的离去基团。例如可以通过过滤、沉淀或离心进行这样的除去。
由该方法提供的包含低聚半乳糖的组合物可以例如处于干粉形式或处于浆体形式。
生产干粉典型地需要一个或多个加工步骤,例如浓缩、蒸发和/或喷雾干燥。因此,在本发明的一些优选实施例中,步骤d)此外涉及浓缩、蒸发和/或喷雾干燥处于液态的组合物以获得处于粉末形式的组合物。特别优选的是喷雾干燥步骤d)的液体组合物以获得粉状组合物。步骤d)可以例如包括富集步骤,随后是浓缩步骤(例如纳米过滤、反渗透或蒸发),随后是喷雾干燥步骤。可替代地,步骤d)可以包括浓缩步骤,随后是富集步骤,随后是喷雾干燥步骤。在富集之前浓缩该组合物的低聚半乳糖可以使得随后的富集工艺更具有成本效率。
有效的喷雾干燥可能需要添加一种或多种助剂,例如麦芽糊精、乳蛋白、酪蛋白酸盐、乳清蛋白浓缩物和/或脱脂奶粉。
本工艺可以例如作为分批工艺来实施。本工艺能可替代地作为分批补料工艺来实施。本工艺能可替代地作为连续工艺来实施。
本工艺可以此外涉及将第一酶和/或未使用的半乳糖基受体再循环回至该混合物。再循环可以例如形成步骤d)的一部分。例如,步骤d)可以涉及将半乳糖基受体和/或第一酶与包含低聚半乳糖的组合物分离并且将半乳糖基受体和/或第一酶再循环至步骤a)或c)。在分批工艺或分批补料工艺的情况下,可以将半乳糖基受体和/或第一酶再循环至下一批的混合物。
在连续工艺的情况下,可以将半乳糖基受体再循环回至对应于步骤a)或步骤c)的工艺线部分。可以将第一酶再循环回至对应于步骤b)或步骤c)的工艺线部分。
应该指出的是,与步骤a)和b)相关的细节和特征不需要与该生产工艺的实际开始相关,但是至少应该在该工艺过程中的某时发生。然而,在本发明的一些实施例中,在步骤c)的整个持续过程中,该半乳糖基供体的浓度被保持在描述于步骤a)中的范围内。
如果将该方法作为分批工艺或分批补料工艺来实施,那么当合成开始时,步骤a)优选涉及该混合物的构成。如果该方法是一个连续工艺,那么步骤a)优选涉及在稳态操作下,在合成过程中构成该混合物。
可以被认为令人希望的是,将半乳糖基化的半乳糖基供体的水平保持地尽量低,因为半乳糖基化的半乳糖基供体可以被认为是不希望的杂质,这对于分离半乳糖基化的半乳糖基受体而言是棘手的。在本发明的一些优选实施例中,步骤c)的孵育混合物包含至多0.5mol/L半乳糖基化的半乳糖基供体。步骤c)的孵育混合物可以例如包含至多0.1mol/L半乳糖基化的半乳糖基供体。甚至更优选地,步骤c)的孵育混合物包含至多0.01mol/L半乳糖基化的半乳糖基供体,并且优选基本没有半乳糖基化的半乳糖基供体。
在本发明的一些优选实施例中,其中供体是乳糖,将别位乳糖和半乳糖基化的别位乳糖的总浓度保持地尽量低,因为这些化合物也被认为是不希望的杂质,这对于分离半乳糖基化的半乳糖基受体而言是困难的。
在本发明的一些优选实施例中,步骤c)的孵育混合物包含至多0.5mol/L的别位乳糖和半乳糖基化的别位乳糖的总量。步骤c)的孵育混合物可以例如包含至多0.1mol/L的别位乳糖和半乳糖基化的别位乳糖的总量。甚至更优选地,步骤c)的孵育混合物包含至多0.01mol/L的别位乳糖和半乳糖基化的别位乳糖的总量,并且优选基本完全没有别位乳糖和半乳糖基化的别位乳糖。
本发明的又一个方面涉及一种包括低聚半乳糖的组合物,该组合物通过如在此所定义的方法是可获得的。
本发明的另一个方面是一种包含低聚半乳糖的组合物,例如上述组合物,所述包含低聚半乳糖的组合物包括:
-一种具有通式Gal-X的第一低聚半乳糖,
-一种具有化学计量式(Gal)2X,例如像通式Gal-Gal-X的第二低聚半乳糖,
-一种具有化学计量式(Gal)3X,例如像通式Gal-Gal-Gal-X的第三低聚半乳糖,并且
其中X是一个非乳糖基或葡糖基的糖基基团。
在此描述的包含低聚半乳糖的组合物可以例如是一种食物成分。
如上所述,“X”或“-X”优选是在此提及的半乳糖基受体之一的糖基基团。
在本发明的一些实施例中,“X”或“-X”是一种单糖的糖基基团,该单糖不是葡萄糖。在本发明的其他实施例中,“-X”是一种二糖的糖基基团,该二糖不是乳糖。
在本发明的一些优选实施例中,“X”或“-X”是一个海藻糖基基团。在本发明的其他优选实施例中,“X”或“-X”是一个半乳糖基基团。
在本发明的一些优选实施例中,包含低聚半乳糖的组合物具有以下两者之间的摩尔比:
-低聚半乳糖Gal-X、(Gal)2X以及(Gal)3X的总量,与
-低聚半乳糖Gal-Glc、Gal2Glc、Gal3Glc的总量
是至少5:95。例如,上述摩尔比可以是至少1:4,优选是至少1:1,并且甚至更优选是至少2:1。甚至可以优选的是,上述摩尔比是至少5:1,优选是至少10:1,并且甚至更优选是至少20:1。
在本发明的其他优选实施例中,包含低聚半乳糖的组合物具有以下两者之间的摩尔比:
-低聚半乳糖Gal-X、Gal-Gal-X以及Gal-Gal-Gal-X的总量,与
-低聚半乳糖Gal-Glc、Gal-Gal-Glc、Gal-Gal-Gal-Glc的总量是至少5:95。例如,上述摩尔比可以是至少1:4,优选是至少1:1,并且甚至更优选是至少2:1。甚至可以优选的是,上述摩尔比是至少5:1,优选是至少10:1,并且甚至更优选是至少20:1。
甚至可能的是,包含低聚半乳糖的组合物完全不包含任何具有式Gal-Glc、Gal-Gal-Glc和Gal-Gal-Gal-Glc的低聚半乳糖。
在本发明的一些实施例中,包含低聚半乳糖的组合物的第一低聚半乳糖、第二低聚半乳糖与第三低聚半乳糖之间的摩尔比处于50-99:1-45:0.5-25的范围内。
在本发明的其他实施例中,包含低聚半乳糖的组合物的第一低聚半乳糖、第二低聚半乳糖与第三低聚半乳糖之间的摩尔比处于20-45:20-45:20-45的范围内。
在本发明的另外的实施例中,包含低聚半乳糖的组合物的第一低聚半乳糖、第二低聚半乳糖与第三低聚半乳糖之间的摩尔比处于0.5-25:1-45:50-98的范围内。
在本发明的一些优选实施例中,包含低聚半乳糖的组合物包括相对于包含低聚半乳糖的组合物的总重量的按重量计至少10%的第一低聚半乳糖、第二低聚半乳糖和第三低聚半乳糖的总量。例如,包含低聚半乳糖的组合物可以包括相对于包含低聚半乳糖的组合物的总重量的按重量计至少20%,优选按重量计至少30%,甚至更优选相对于包含低聚半乳糖的组合物的总重量至少40%的第一低聚半乳糖、第二低聚半乳糖和第三低聚半乳糖的总量。
甚至更高水平的第一、第二和第三低聚半乳糖可以是优选的。因此,在本发明的一些优选实施例中,包含低聚半乳糖的组合物包括相对于包含低聚半乳糖的组合物的总重量的按重量计至少50%的第一低聚半乳糖、第二低聚半乳糖和第三低聚半乳糖的总量。例如,包含低聚半乳糖的组合物可以包括相对于包含低聚半乳糖的组合物的总重量的按重量计至少60%,优选按重量计至少70%,甚至更优选相对于包含低聚半乳糖的组合物的总重量至少80%的第一低聚半乳糖、第二低聚半乳糖和第三低聚半乳糖的总量。
本发明的又一方面涉及一种食物产品,该食物产品包括在此描述的包含低聚半乳糖的组合物。
在本发明的一些实施例中,该食物产品是一种功能性食物产品,例如婴儿配方或临床营养产品。
在本发明的其他实施例中,该食物产品是一种烘焙产品,例如包括烘焙的生面团,如面包或类似产品。
在本发明的另外的实施例中,该食物产品是一种乳制品,例如鲜乳制品,如牛奶,或发酵的乳制品,如酸奶。
在本发明的仍另外的实施例中,该食物产品是一种宠物食物产品。
应该指出的是,描述于本发明的这些方面之一的背景下的实施例和特征也适用于本发明的其他方面。
现在将在以下非限制性实例中进一步详细地描述本发明。
实例
实例1:具有转半乳糖基化活性的β-半乳糖苷酶的制备
用2mL具有100mg/L氨比西林的溶源性肉汤(LB)培养基的起始培养物(starter-culture)接种750mL工作体积的发酵培养基,OD600为3.0,生长12小时。在包含2%(w/v)酵母提取物、2%(w/v)大豆蛋白胨、1%(w/v)葡萄糖以及100mg/L氨比西林的EC培养基中进行发酵。如先前所述,制备表达OLGA347β-半乳糖苷酶(具有SEQ ID NO2的序列Val(33)-Ile(1174))的大肠杆菌菌株((约根森)等人,美国专利号6,555,348 B2,实例1和2)。发酵罐来自Applikon公司,具有碟形的玻璃容器底部,总体积为2L并且配备有两个Rushton叶轮。在发酵过程中,通过适当添加2M NaOH和2M H3PO4将pH维持在pH6.5并且将温度控制在37℃。通过以1-2L/min的速率用空气鼓泡供给氧气,并且通过增加搅拌速率将pO2维持在30%。生长遵循离线(off-line)OD600读数。在29.7的OD600值下生长大约10h后,通过离心收获培养物。将650mL培养物上清液储存于-20℃下。通过将细胞球粒重悬于200mL蔗糖缓冲液(30mM Tris-HCl,40%蔗糖,2mM EDTA,pH7.5)中并且在室温下孵育10min经由渗透休克将周质蛋白与细胞球粒分离。离心后,丢弃上清液并且将球粒重悬于200mL冷水中。添加83μL的饱和MgCl2溶液,并且通过离心步骤收集包含周质蛋白的上清液。经由0.2μm Millipak40过滤器将周质部分过滤消毒并且将其储存在-20℃下。
根据方案(J.Sambrook(萨姆布鲁克)和D.W.Russell(拉塞尔),Molecular Cloning-A laboratory manual(分子克隆-实验室手册),第3版(2001),17.48-17.51页),使用o-硝基苯基-β-D-半乳吡喃糖苷(OPNG)作为底物,确定200mL周质部分和650mL培养物上清液的β-半乳糖苷酶活性。发现大部分活性位于周质部分中(525个单位,对应于98%)。
实例2:具有转半乳糖基化活性的第二β-半乳糖苷酶的制备
沿着描述于实例1中的线路制备第二β-半乳糖苷酶(OLGA917),但是基于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)-Glu(917)的表达。
实例3:一种β-半乳糖苷酶的T-值的确定
根据下面给出的测定和公式确定一种β-半乳糖苷酶的T-值。
测定:
制备3.3mL酶溶液,由待测试的β-半乳糖苷酶、10mM柠檬酸钠、1mM柠檬酸镁、1mM柠檬酸钙、Milli-Q水(Millipore公司,美国)组成,并且具有6.5的pH。该酶溶液应该包含处于在该测定条件下,在1小时内足够使用33%(w/w)的添加的乳糖的量的β-半乳糖苷酶。该酶溶液的温度应该是37℃。
在时刻=T0时,向该酶溶液中添加82.5mg乳糖一水合物(用于生物化学,德国默克公司(德国默克公司))并且与其混合,并且随后将该混合物在37℃下孵育4小时。精确地在T0后1小时,收集100μL样品并且用Milli-Q水以1:5稀释,并且通过加热至85℃灭活10min。将该灭活的混合物保持在–20℃下,直到表征。
表征:
使用任何适合的分析技术确定产生的半乳糖的量(以mol计)以及使用的乳糖的量(以mol计)。例如,可以根据由Richmond(列治文)等人(1982)和Simms(西姆斯)等人(1994)描述的方法,通过HPLC分析稀释的混合物。其他有用的分析技术描述于El Razzi(艾尔拉兹)(2002)中。
适合的分析技术的另一个实例是ISO5765-2:2002(IDF79-2:2002)“Dried milk,dried ice-mixes and processed cheese–Determination of lactosecontent-Part2:Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose(奶粉,干冰混合和加工奶酪-乳糖含量的确定-第2部分:利用乳糖的半乳糖的酶催化方法)”。
T-值的计算:
根据下面的公式,使用从该测定的稀释的混合物的表征中获得的数据计算T-值:
实例-OLGA347酶的T-值:
使用实例1的OLGA347酶进行上述测定。
经由分析型HPLC,相对于被转化的(即使用的)乳糖和产生的半乳糖分析获得自该测定的稀释混合物。HPLC装置来自沃特斯公司(Waters)并且配备有差示折光计(RI-检测器)和Aminex HPX-87C柱(300x7.8mm,125-0055)。恒溶剂地(isocratically)用0.05g/L乙酸钙,0.3mL/min的流速以及20μL的注射体积洗脱糖。
将获得的数据通过自动化软件适当地基线修正,单独地鉴定峰并整合。通过使用乳糖一水合物(用于生物化学,默克公司(Merck),德国)、D-(+)-葡萄糖一水合物(用于生物化学,默克欧洲实验室(Merck Eurolab),法国)以及D-(+)-半乳糖(≥99%,西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),意大利)的外标进行量化。
由量化的数据计算每个时刻T的乳糖的转化和半乳糖的形成。在时刻T=1h,收集的100μL样品中的29%的乳糖已经被转化,这对应于2.3μmol乳糖。在时刻T=1,在收集的100μL样品中已经形成0.5μmol半乳糖。因此可以将T-值计算为0.5μmol/2.3μmol=0.2。
经由酶催化方法ISO5765-2,还相对于被转化的(即使用的)乳糖和产生的半乳糖分析获得自该测定的稀释混合物。使用来自R-Biopharm公司的Boehringer Mannheim乳糖/D-半乳糖测试试剂盒(目录号10 176 303035)并且根据方案进行该测试。该酶催化方法确认OLGA347-酶的T-值是0.2。
实例-OLGA917酶的T-值:
使用在实例2中产生的OLGA917酶进行上述T-值测定并且根据上面解释的程序确定T-值。
确定OLGA917酶的T-值为0.3。
实例-常规的乳糖酶的T-值:
使用可商购的常规的乳糖酶Lactozym Pure2600L(诺维信公司,丹麦)进行上述测定。如针对OLGA347酶所描述,分析获得自该测定的稀释混合物。三糖和四糖未以可检出量存在并且看到相等量的葡萄糖和半乳糖。对应的T-值是1。
还确定了来自大肠杆菌(产品编号:G6008,西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),德国)和米曲霉(产品编号:G5160,西格玛奥德里奇公司,德国)的可商购的β-半乳糖苷酶的T-值,并且两种酶都具有大约1.0的T-值。
实例4:通过顺序添加供体分子并且转化葡萄糖离去基团合成包含L-海藻
糖基的杂-低聚半乳糖
将处于如发现于表7中的量的L-(-)-海藻糖和乳糖一水合物溶解于100mL MilliQ水中。将每个样品维持在37℃的温度下并且通过连续添加NaOH将pH维持在6.5。以100L/min的速率,将空气连续地泵送通过该混合物。向样品2中添加酶葡萄糖氧化酶(GOX,杜邦公司(DuPont),丹麦)。向样品3中添加酶葡萄糖氧化酶(Gluzyme,诺维信公司,丹麦)。向样品2和3中添加来自溶壁微球菌的过氧化氢酶(西格玛奥德里奇公司,丹麦)。向每个样品中添加实例2的OLGA917酶。添加MilliQ水,至总过程体积为250mL。将这一时刻定义为T=0。经5小时时间以30min间隔向这些样品中添加乳糖一水合物。
表7:
根据实例7,通过HPLC分析来自T=4h和T=5h的测试样品,并且发现这些测试样品包含显著量的半乳糖基化的海藻糖。
实例5:包含L-海藻糖基的杂-低聚半乳糖的合成及转化并且除去葡萄糖离
去基团但是不顺序添加供体分子
将处于如发现于表8中的量的L-(-)-海藻糖和乳糖一水合物溶解于100mL MilliQ水中。将每个样品维持在37℃的温度下并且通过连续添加NaOH将pH维持在6.5。以100L/min的速率,将空气连续地泵送通过该混合物。制备阴离子交换树脂(Dowex66,西格玛奥德里奇公司,美国)并且添加至样品3中。向样品2和3中添加葡萄糖氧化酶(GOX,杜邦公司,丹麦)。向样品2和3中添加来自溶壁微球菌的过氧化氢酶(西格玛奥德里奇公司,丹麦)。向每个样品中添加实例2的OLGA917酶。添加MilliQ水,至如发现于表8中的总过程体积。将这一时刻定义为T=0。
表8:
根据实例7,通过HPLC分析来自T=4h和T=5h的测试样品,并且也发现这些测试样品包含显著量的半乳糖基化的海藻糖。
实例6:通过顺序添加供体分子,转化葡萄糖离去基团并且除去转化的离
去基团合成包含L-海藻糖基的杂-低聚半乳糖
将处于如发现于表9中的量的L-(-)-海藻糖和乳糖一水合物溶解于100mL MilliQ水中。将每个样品维持在37℃的温度下并且通过连续添加NaOH将pH维持在6.5。以100L/min的速率,将空气连续地鼓泡通过该混合物。制备阴离子交换树脂(Dowex66,西格玛奥德里奇公司,美国)并且添加至每个样品中。向样品2中添加葡萄糖氧化酶(GOX,丹尼斯克公司(Danisco)/杜邦公司,丹麦)。向样品3中添加葡萄糖氧化酶(Gluzyme,诺维信公司,丹麦)。向样品2和3中添加来自溶壁微球菌的过氧化氢酶(西格玛奥德里奇公司,丹麦)。向每个样品中添加实例2的OLGA917酶。添加MilliQ水,至总过程体积为250mL。将这一时刻定义为T=0。经5小时时间以30min间隔向这些样品中添加乳糖一水合物。
表9:
在时刻T=4和5h,取出1500μL测试样品并且根据实例7通过HPLC和质谱进行分析。发现这些样品包含显著量的半乳糖基化的海藻糖。质谱质谱的结果示例于图4-6中。
图4示出了孵育4小时之后,半乳糖基化的海藻糖的二糖、三糖以及四糖的整合的响应图—在孵育过程中除去以及未除去游离的离去基团。借助酶促转化除去游离的离去基团(葡萄糖)。可以看出当在孵育过程中除去游离的离去基团时,半乳糖基化的海藻糖的含量增加。
图5示出了孵育5小时之后,半乳糖基化的海藻糖的二糖、三糖以及四糖的整合的响应图—在孵育过程中除去以及未除去游离的离去基团。再次,可以看出当在孵育过程中除去游离的离去基团时,半乳糖基化的海藻糖的含量增加。
图6示出了与半乳糖基化的供体/离去基团的整体的整合的响应(总GOS)相比的半乳糖基化的海藻糖的整体的整合的响应(总HOS)图-在孵育过程中除去以及未除去游离的离去基团。半乳糖基化的供体/离去基团的整体的整合的响应是Gal-Glc、Gal-Gal-Glc以及Gal-Gal-Gal-Glc分子的整合的响应的总和。半乳糖基化的海藻糖的整体的整合的响应是Gal-Fuc、Gal-Gal-Fuc以及Gal-Gal-Gal-Fuc分子的响应的总和。可以看出,当在孵育过程中除去游离的离去基团时,半乳糖基化的海藻糖的整体的整合的响应显著增加而半乳糖基化的供体/离去基团的整体的整合的响应几乎未变。结论:
这一实例证明当在孵育过程中除去游离的离去基团时,半乳糖基化的受体(预期产物)与半乳糖基化的供体/离去基团(副产物)之间的比率显著增加。
实例7:包含含有L-海藻糖基的杂-低聚半乳糖的样品的表征
将收集的样品用Milli-Q水以1:10稀释并且通过加热至85℃灭活15min。将该灭活的混合物保持在–20℃下,直到表征。
通过使用分析型HPLC对样品进行表征。使用0.22μm过滤器过滤这些样品。HPLC装置来自沃特斯公司并且配备有差示折光计(RI-检测器)和Aminex HPX-87C柱(300x7.8mm,125-0055)。恒溶剂地用0.05g/L乙酸钙,0.3mL/min的流速以及20μL的注射体积洗脱糖。
用安捷伦(Agilent)1200API-ES LC/MSD Quadropole6410,在100与1000amu之间的扫描质量下进行质谱分析(气体温度:350℃,干燥气流:13.0L/min,喷雾器压力:40psig)。用于LC分离的柱是来自赛默科技公司(Thermo Scientific),丹麦的HyperCarb2.1x150mm,在25℃下运行。用5mM AcNH4水溶液和乙腈进行洗脱。
基于来自电喷雾接口(electrospray interfase)的常见电离模式,提取离子层析谱。基于质谱评估提取的层析谱中的峰并且随后整合,从而为测试样品的不同碳水化合物种类提供整合的响应。
参考文献
Buchholz(布霍尔茨)(2005)“Biocatalysts and Enzymetechnology(生物催化剂与酶技术)”,Klaus Buchholz(克劳斯布霍尔茨)等人,ISBN-10:3-527-30497-5,2005,Wiley VCH Verlag GmbH(威利VCH出版社有限公司)
Franck(弗兰克)(2002)“Technological functionality of inulin andoligofructose(菊粉和低聚果糖的技术功能性)”,A.Franck(弗兰克),BritishJournal of Nutrition(英国营养学杂志)(2002),87,增刊2,S287-S291
Yun(尤恩)(1996)“Fructooligosaccharides-Occurrence,preparation,and application(低聚果糖发生,制备及应用)”,J.W.Yun(尤恩),Enzyme and Microbial Technology(酶与微生物技术)19:107-117,1996
Kunz(孔兹)(2000)“Oligosaccharides in human milk:Structural,functional and metabolic aspects(人乳中的低聚糖:结构,功能及代谢方面)”,Kunz(孔兹)等人,Ann.Rev.Nutr.(营养学年鉴)2000.20:699-722
Simms(西姆斯)等人(1994)Simms(西姆斯),P.J.;Hicks(希克斯),K.B.;Haines(海恩斯),R.M.;Hotchkiss(霍奇基斯),A.T.以及Osman(奥斯曼),S.F.;(1994)Separations of lactose,lactobionic andlactobionolactose by high performance liquid chromatography(通过高效液相层析分离乳糖、乳糖酸和乳糖酸乳糖),J.of Chromatography(层析杂志),667,67-73。
Richmond(列治文)等人(1982)Richmond(列治文),M.L.;Barfuss(贝尔福斯),D.L.;Harte(哈特),B.R.;Gray(格雷),J.I.以及Stine(斯泰恩),C.M.;(1982)Separation of Carbohydrates in Dairy Productsby High Performance Liquid Chromatography(通过高效液相层析分离乳制品中的碳水化合物),J.of Dairy Science(乳品科学杂志),65(8),1394-1400。
El Razzi(艾尔拉兹)(2002)“Carbohydrate Analysis by ModernChromatography and Electrophoresis(通过现代层析和电泳分析碳水化合物)”,第66卷,Journal of Chromatography Library(层析文库杂志),ElsevierScience(爱思唯尔科学),2002,ISBN-10:0444500618
Walstra(沃斯特拉)等人(2006)“Dairy science and technology(乳品科学与技术)”,Walstra(沃斯特拉)等人,CRC出版社,第二版,2006
Scopes(斯科普斯)Protein Purification:Principles and Practice(蛋白质纯化:原理与实践);Robert(罗伯特)K.Scopes(斯科普斯);第3版,Springer Verlag New York,Inc.(纽约施普林格出版公司),ISBN0-387-94072-3
WO 01/90,317 A2
EP 2 138 586 A1
WO 2009/113,030 A2
WO 2012/010,597 A1
Claims (23)
1.一种生产包括一种或多种低聚半乳糖的组合物的方法,该方法包括以下步骤:
a)提供一种混合物,该混合物包括
-一种半乳糖基供体,包括结合至离去基团的半乳糖基基团,该半乳糖基供体具有至多350g/mol的摩尔量,
-一种与该半乳糖基供体不同的半乳糖基受体,
所述半乳糖基受体是一种糖或糖醇,并且
其中该半乳糖基受体与该半乳糖基供体之间的摩尔比是至少1:10,并且其中该混合物包括至少0.05mol/L的该半乳糖基受体,
b)提供一种第一酶,所述第一酶具有β-半乳糖苷酶活性和转半乳糖基化活性,所述第一酶与该混合物接触,并且
c)孵育该混合物和该第一酶,从而允许该第一酶释放该半乳糖基供体的该离去基团并且将该半乳糖基供体的半乳糖基基团转移至该半乳糖基受体,由此形成该低聚半乳糖,步骤c)进一步包括从该孵育混合物中除去从该半乳糖基供体释放的离去基团,由此获得包括该一种或多种低聚半乳糖的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中该半乳糖基供体的该离去基团是一种糖基基团。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中该半乳糖基供体是乳糖或乳糖醇。
4.根据以上权利要求中任一项所述的方法,其中该第一酶具有至多0.9的T-值。
5.根据以上权利要求中任一项所述的方法,其中该第一酶包括:
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Met(1)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Gly(950)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列,或
-一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
6.根据以上权利要求中任一项所述的方法,其中该第一酶包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Ile(1174)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
7.根据以上权利要求中任一项所述的方法,其中该第一酶包括一个相对于SEQ ID NO.2的氨基酸序列Val(33)至Glu(917)具有至少80%序列一致性的氨基酸序列。
8.根据以上权利要求中任一项所述的方法,其中该第一酶:
-相对于示于表1中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性,或
-相对于示于表2中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性,或
-相对于示于表3中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性,或
-相对于示于表4中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性,或
-相对于示于表5中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性,或
-相对于示于表6中的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。
9.根据以上权利要求中任一项所述的方法,该方法此外包括提供一种微生物,该微生物能够转化从该半乳糖基供体释放的游离的离去基团,并且在孵育过程中,允许所述微生物除去从该半乳糖基供体释放的离去基团。
10.根据权利要求9所述的方法,其中
a)该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基受体的除去速率至少高10倍,
b)该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于该半乳糖基供体的除去速率至少高10倍,或
c)该微生物相对于该游离的离去基团的除去速率比该微生物相对于单-半乳糖基化的半乳糖基受体的除去速率至少高10倍。
11.根据以上权利要求中任一项所述的方法,该方法此外包括提供一种第二酶,该第二酶能够转化从该半乳糖基供体释放的游离的离去基团,并且在孵育过程中,允许所述第二酶转化从该半乳糖基供体释放的离去基团。
12.根据权利要求11所述的方法,其中该第二酶具有葡萄糖氧化酶活性。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的方法,其中
a)该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基受体的特异性常数至少高10倍,
b)该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该半乳糖基供体的特异性常数至少高10倍,或
c)该第二酶相对于该游离的离去基团的特异性常数比该第二酶相对于该单-半乳糖基化的半乳糖基受体的特异性常数至少高10倍。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法,其中该第二酶具有葡萄糖氧化酶活性并且该半乳糖基供体的该离去基团是葡萄糖。
15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法,其中该方法此外包括提供一种具有过氧化氢酶活性的酶,该酶与该孵育混合物接触。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法,其中该方法此外包括提供一种除去剂,该除去剂能够除去至少一些通过用该第二酶转化该离去基团而获得的转化产物,并且在孵育过程中,允许该除去剂除去至少一些转化产物。
17.根据权利要求16所述的方法,其中该除去剂包括一种二价或三价金属离子的盐。
18.根据权利要求13所述的方法,其中该除去剂包括一种阴离子交换材料,或甚至由其组成。
19.根据权利要求18所述的方法,其中该阴离子交换材料相对于在孵育过程中产生的转化产物的总量的总结合力是至少30%(mol/mol)。
20.根据以上权利要求中任一项所述的方法,其中步骤c)包括添加另外的半乳糖基供体。
21.根据以上权利要求中任一项所述的方法,其中在步骤c)过程中,将该混合物的半乳糖基供体的浓度维持在一个处于0.01-1mol/L的范围内的浓度。
22.根据以上权利要求中任一项所述的方法,该方法此外包括以下步骤:d)富集步骤c)的组合物的低聚半乳糖。
23.根据权利要求22所述的方法,其中步骤d)此外涉及从步骤c)的组合物中除去除去剂和/或结合至该除去剂的被转化的离去基团。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108138208A (zh) * | 2016-01-12 | 2018-06-08 | 维塔鲁斯营养有限公司 | 由乳糖生产半乳寡糖的方法 |
CN108384821A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-08-10 | 江苏省农业科学院 | 一种促进肠道益生菌增殖的低聚糖的制备方法 |
CN108588006A (zh) * | 2018-05-10 | 2018-09-28 | 华东理工大学 | 一种用于肝细胞三维培养的生物支架及其制备方法和应用 |
CN112251481A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-01-22 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种低聚半乳糖的制备方法 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2650444T3 (es) | 2012-06-08 | 2018-01-18 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Polipéptidos que tienen actividad transgalactosilante |
WO2013190531A1 (en) * | 2012-06-22 | 2013-12-27 | Glycom A/S | Glycosylated galactosyl disaccharides, methods for their production and their use in consumable products |
WO2013190529A1 (en) * | 2012-06-22 | 2013-12-27 | Glycom A/S | Glycosylated galactosyl disaccharddes, methods for their production and their use in consumable products |
TW202332774A (zh) | 2013-10-23 | 2023-08-16 | 美商健臻公司 | 重組醣蛋白及其用途 |
IL290057B2 (en) * | 2016-09-19 | 2023-09-01 | Prolacta Bioscience Inc | Pure preparations of oligosaccharides of breast milk |
CN107410502B (zh) * | 2017-04-28 | 2018-08-24 | 黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司 | 一种低敏性速溶马铃薯豆奶粉的制备方法 |
EP4101301A1 (de) | 2021-06-08 | 2022-12-14 | DMK Deutsches Milchkontor GmbH | Verfahren zur herstellung von galactooligosacchariden |
EP4249600A1 (de) | 2022-03-24 | 2023-09-27 | DMK Deutsches Milchkontor GmbH | Galactooligosaccharid-zubereitungen mit gelförmiger konsistenz |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009113030A2 (en) * | 2008-03-12 | 2009-09-17 | Tata Chemicals Ltd. | Process for the production of galactooligosaccharides by free cells |
EP2138586A1 (en) * | 2008-06-24 | 2009-12-30 | Cognis IP Management GmbH | Process for the regioselective preparation of disaccharides or oligosaccharides |
WO2012010597A1 (en) * | 2010-07-19 | 2012-01-26 | Arla Foods Amba | Galacto-oligosaccharide-containing composition and a method of producing it |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5042431B2 (ja) * | 2000-05-26 | 2012-10-03 | アルラ・フーズ・エイ・エム・ビィ・エイ | Bifidobacteriumから単離された新たな酵素 |
EP3392268B1 (en) | 2010-03-29 | 2021-06-30 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Polypeptides having transgalactosylating activity |
-
2012
- 2012-01-25 EP EP12152502.6A patent/EP2620506A1/en not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-01-25 DK DK13703536.6T patent/DK2807264T3/en active
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2016
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2009113030A2 (en) * | 2008-03-12 | 2009-09-17 | Tata Chemicals Ltd. | Process for the production of galactooligosaccharides by free cells |
EP2138586A1 (en) * | 2008-06-24 | 2009-12-30 | Cognis IP Management GmbH | Process for the regioselective preparation of disaccharides or oligosaccharides |
WO2012010597A1 (en) * | 2010-07-19 | 2012-01-26 | Arla Foods Amba | Galacto-oligosaccharide-containing composition and a method of producing it |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108138208A (zh) * | 2016-01-12 | 2018-06-08 | 维塔鲁斯营养有限公司 | 由乳糖生产半乳寡糖的方法 |
CN108384821A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-08-10 | 江苏省农业科学院 | 一种促进肠道益生菌增殖的低聚糖的制备方法 |
CN108384821B (zh) * | 2017-12-18 | 2021-09-14 | 江苏省农业科学院 | 一种促进肠道益生菌增殖的低聚糖的制备方法 |
CN108588006A (zh) * | 2018-05-10 | 2018-09-28 | 华东理工大学 | 一种用于肝细胞三维培养的生物支架及其制备方法和应用 |
CN112251481A (zh) * | 2020-11-13 | 2021-01-22 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 一种低聚半乳糖的制备方法 |
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