MX2014008935A - Metodo para producir una composicion que contiene galacto-oligosacaridos. - Google Patents

Metodo para producir una composicion que contiene galacto-oligosacaridos.

Info

Publication number
MX2014008935A
MX2014008935A MX2014008935A MX2014008935A MX2014008935A MX 2014008935 A MX2014008935 A MX 2014008935A MX 2014008935 A MX2014008935 A MX 2014008935A MX 2014008935 A MX2014008935 A MX 2014008935A MX 2014008935 A MX2014008935 A MX 2014008935A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
galactosyl
enzyme
respect
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
MX2014008935A
Other languages
English (en)
Inventor
Hans Bertelsen
Peter Langborg Wejse
Jon Weis Busch
Original Assignee
Arla Foods Amba
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arla Foods Amba filed Critical Arla Foods Amba
Publication of MX2014008935A publication Critical patent/MX2014008935A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Confectionery (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Treatment And Processing Of Natural Fur Or Leather (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un método para producir composiciones que contienen galacto-oligosacáridos así como a las composiciones que contienen galacto-oligosacáridos como tales.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR UNA COMPOSICIÓN QUE CONTIENE GALACTO-OLIGOSACÁRIDOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una composición que contiene galacto-oligosacáridos así como a un método eficaz para producirla.
ANTECEDENTES Se sabe que la leche materna humana contiene diversos oligosacáridos que atribuyen algunos de los efectos de salud beneficiosos a los niños que se alimentan con leche materna (Kunz et al . (2000)). Por ejemplo, algunos oligosacáridos, como FOS, GOS o inulina son llamados prebióticos, lo que significa que promueven las bacterias beneficiosas del sistema gastrointestinal y desfavorecen a las bacterias dañinas. Debido a sus efectos de promoción de la salud, los oligosacáridos se utilizan frecuentemente en productos alimenticios funcionales, como fórmulas para niños y nutrición clínica.
Existen varios enfoques para la producción de oligosacáridos. Un enfoque se basa en el aislamiento de los oligosacáridos de fuentes naturales. Los oligosacáridos de fructosa (FOS) y la inulina se encuentran naturalmente, por ejemplo, en la pataca, al bardana, la achicoria, el puerro, la cebolla y el espárrago y pueden aislarse de estos cultivos. La preparación de la inulina a partir de raíces de achicoria se describe, por ejemplo, en Frank (2002). Este enfoque para la producción de oligosacáridos se ve limitado por la disponibilidad de cultivos adecuados y puede ser imposible implementarlo para oligosacáridos más complejos.
Otro enfoque se basa en la síntesis enzimática en la que las enzimas catalizan la síntesis de los oligosacáridos. Yun (1996) describe la producción enzimática de fructo-oligosacáridos mediante el uso de enzimas que presentan actividad de fructosiltransferasa y utilizan sacarosa como sustrato para la enzima.
Otro ejemplo de síntesis enzimática se describe en WO 01/90,317 A2, que divulga un método para producir galacto-oligosacáridos (GOS) de fórmula Gal-Gal-Glc mediante el uso de una enzima especial beta-galactosidasa y lactosa como sustrato.
En EP 2 138 586 Al se divulga el proceso para la fabricación regio-selectiva de disacáridos u oligosacáridos mediante transglicosilación o hidrólisis de una molécula donante de carbohidratos y una molécula aceptora de glicosilo en presencia de una glicosidasa en presencia de al menos una dialquilamida. No obstante, en EP 2138 586 Al no se divulga la eliminación, durante la incubación, de grupos lábiles libres liberados por el donante de glicosilo.
En WO 2009/113,030 A2 se describe un proceso para la producción de galactooligosacáridos a base de lactosa pura mediante el uso de de células microbianas enteras en un reactor con un sistema de microfiltración de fibras huecas de flujo cruzado. No obstante, WO 2009/113,030 A2 no contiene ninguna demostración con respecto a la producción de hetero-galacto-oligosacáridos con el uso de un aceptor de galactosilo que no se encuentra relacionado con el donante.
En WO 2012/010,597 Al se divulga un método para producir composiciones que contienen galacto-oligosacáridos asi como composiciones que contienen galacto-oligosacáridos como tales. No obstante, en WO 2012/010,597 Al no se divulga la eliminación, durante la incubación, de grupos lábiles libres liberados por el donante de galactosilo.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención es proporcionar métodos mejorados para producir galacto-oligosacáridos y particularmente galacto-oligosacáridos que tienen un extremo reductor diferente y particularmente galacto-oligosacáridos que tienen un extremo reductor diferente al del donante de galactosilo utilizado durante la producción.
Los presentes inventores han descubierto, de forma sorprendente, que los grupos lábiles liberados por el donante durante la síntesis de galacto-oligosacáridos actúan como aceptores de galactosilo competidores y reducen el rendimiento de los galacto-oligosacáridos mencionados anteriormente. Esto es particularmente sorprendente en la medida que los ensayos iniciales realizados por los inventores han indicado que los grupos lábiles, y particularmente la glucosa, son aceptores bajos de galactosilo. Los presentes inventores han descubierto además que el rendimiento de los galacto-oligosacáridos mencionados anteriormente (que tienen un extremo reductor diferente al del donante de galactosilo) puede aumentarse mediante la eliminación de los grupos lábiles liberados de la mezcla de reacción durante la incubación del donante de galactosilo, el aceptor de galactosilo y la enzima beta-galactosidasa.
Las figuras 1, 2 y 3 explican esto en más detalle.
La figura 1 es una representación esquemática de los tipos principales de reacciones que tienen lugar durante la transgalactosilación. La reacción a) es la reacción deseada e implica la transferencia de un grupo galactosilo del donante (lactosa en este ejemplo) a un aceptor (por ejemplo, fucosa). Los productos de esta reacción son un grupo lábil libre (glucosa en este ejemplo) y un oligosacáridos pequeño (por ejemplo, Gal-Fue) que tiene un extremo reductor diferente al del donante de galactosilo.
La reacción b) es una reacción secundaria no deseada que conduce a la llamada autogalactosilación del donante, por ejemplo, más lactosa galactosilada si el donante es lactosa. Es difícil y costoso eliminar este subproducto del producto de oligosacáridos. Los presentes inventores han descubierto que el nivel de autogalactosilación puede reducirse de forma significativa mediante el uso de una primera enzima que tiene una alta eficiencia de transgalactosilación (un valor T bajo) en combinación con una concentración relativamente baja de donante de galactosilo.
La reacción c) de la figura 1 es otra reacción secundaria indeseada que los presentes inventores han descubierto recientemente. Los presentes inventores han observado niveles sorprendentemente altos de alolactosa en las composiciones de galacto-oligosacáridos y han llegado a la conclusión de que los grupos lábiles libres, y particularmente la glucosa, también actúan como aceptores si la concentración es suficientemente alta.
La figura 2 es una ilustración esquemática de algunas de las especies moleculares presentes en las composiciones de galacto-oligosacáridos cuando los grupos lábiles libres no se eliminan durante la incubación. Además de los productos de oligosacáridos deseados derivados del aceptor de galactosilo, la composición también contiene oligosacáridos indeseados derivados de la galactosilación de los grupos lábiles libres, por ejemplo, alolactosa y alolactosa galactosilada de forma adicional.
La figura 3 es una ilustración esguemática de algunas de las especies moleculares presentes en las composiciones de galacto-oligosacáridos cuando los grupos lábiles libres no se eliminan durante la incubación. Contrariamente a la composición de galacto-oligosacáridos ilustrada en la figura 2, la presente composición de galacto-oligosacáridos carece (o tiene al menos una concentración significativamente menor) de grupos lábiles libres, alolactosa y oligosacáridos derivados de alolactosa.
Por consiguiente, un aspecto de la invención se refiere a un método para producir una composición que comprende uno o más galacto-oligosacárido(s), el método comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una mezcla que comprende - un donante de galactosilo que comprende un grupo galactosilo unido a un grupo lábil, donde el donante de galactosilo tiene un peso molar de como máximo 350 g/mol, - un aceptor de galactosilo que es diferente al donante de galactosilo, dicho aceptor de galactosilo es un sacárido o un azúcar-alcohol, y donde la relación molar entre el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo es de al menos 1:10, y donde la mezcla comprende al menos 0.05 mol/L del aceptor de galactosilo, b) proporcionar una primera enzima, dicha primera enzima tiene actividad beta-galactosidasa, dicha primera enzima entra en contacto con la mezcla, y c) incubar la mezcla y la primera enzima, lo que permite que la primera enzima libere el grupo lábil del donante de galactosilo y transfiera el grupo de galactosilo del donante de galactosilo al aceptor de galactosilo, lo que forma el galacto-oligosacárido, la etapa c) comprende además eliminar de la mezcla de incubación, es decir durante la incubación, un grupo lábil liberado por el donante de galactosilo, por lo que se obtiene la composición que comprende el uno o más galacto-oligosacárido (s).
El término "eliminar un grupo lábil liberado por el donante de galactosilo" debe entenderse como la eliminación física de los grupos lábiles libres de la mezcla de incubación y/o la conversión de los grupos lábiles libres en una o más especies químicas adicionales que aún pueden encontrarse presentes en la mezcla de incubación. Se prefiere que dichas especies químicas no actúen como aceptores de galactosilo o que al menos sean un aceptor de galactosilo menos eficaz que el grupo lábil libre.
La presente invención revela la producción económica y eficaz de composiciones de galacto-oligosacáridos complejas de alto rendimiento. Asimismo, parece que la presente invención reduce la galactosilación de los grupos lábiles libres liberados por el donante de galactosilo asi como la autogalactosilación del donante de galactosilo, lo que resulta en subproductos indeseados que son costosos de eliminar de la composición.
Preferentemente, la primera enzima tiene actividad de transgalactosilación además de actividad de beta-galactosidasa. También puede preferirse que la primera enzima tenga un valor T de cómo máximo 0.9.
En el contexto de la presente invención, el término "actividad de transgalactosilación" de una enzima beta-galactosidasa se refiere a la capacidad de la enzima de transferir un grupo galactosilo de una molécula donante, por ejemplo, una molécula de lactosa, a una molécula no acuosa, por ejemplo, otra molécula de lactosa.
El valor T es una medida de la eficacia de transgalactosilación de una enzima beta-galactosidasa mediante el uso de lactosa como donante y aceptor de galactosilo. La determinación del valor T de una enzima beta-galactosidasa se realiza de conformidad con el ensayo y la fórmula descrita en el ejemplo 3. El valor T se calcula mediante el uso de la fórmula: cantidad de galactosa producida (en moles) Valor T = cantidad de lactosa utilizada (en moles) Una enzima lactasa sin ninguna actividad de transgalactosilación producirá un mol de galactosa por cada mol de lactosa utilizado y tendrá un valor T de 1. Una beta-galactosidasa que tenga una actividad de transgalactosilación extremadamente alta utilizaría casi todos los grupos galactosilo de la lactosa para transgalactosilar en lugar de generar lactosa y consecuentemente tendría un valor T cercano a 0.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende uno o más galacto-oligosacárido(s), donde la composición puede obtenerse mediante el método como se describe en la presente.
A continuación se describen los objetos y ventajas adicionales de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una ilustración esquemática de los tipos de reacciones implicados en la transgalactosilación.
La figura 2 muestra una representación esquemática de los productos de reacción obtenidos cuando no se utilizan los grupos lábiles libres.
La figura 3 muestra una representación esquemática de los productos de reacción obtenidos cuando no se utilizan los grupos lábiles libres.
La figura 4 muestra una gráfica de la respuesta integrada de di-, tri- y tetrasacáridos de fucosa galactosilada después de 4 horas de incubación, con y sin eliminación de los grupos lábiles libres durante la incubación. Los grupos lábiles libres (glucosa) se eliminan mediante conversión enzimática. Se observa que el contenido de la fucosa galactosilada aumenta cuando los grupos lábiles libres se eliminan durante la incubación.
La figura 5 muestra una gráfica de la respuesta integrada de di-, tri- y tetrasacáridos de fucosa galactosilada después de 5 horas de incubación, con y sin eliminación de los grupos lábiles libres durante la incubación. Nuevamente, se observa que el contenido de la fucosa galactosilada aumenta cuando los grupos lábiles libres se eliminan durante la incubación.
La figura 6 muestra una gráfica de la respuesta integrada total de la fucosa galactosilada en comparación con la respuesta integrada total del donante galactosilado/grupo lábil, con y sin eliminación de los grupos lábiles durante la incubación. La respuesta integrada total del donante galactosilado/grupo lábil es la suma de las respuestas integradas de las moléculas de Gal-Glc, Gal-Gal-Glc y Gal-Gal-Gal-Glc. La respuesta integrada total de la fucosa galactosilada es la suma de las respuestas de las moléculas de Gal-Fue, Gal-Gal-Fuc y Gal-Gal-Gal-Fuc. Se observa que la respuesta integrada total de la fucosa galactosilada aumenta de forma significativa cuando los grupos lábiles libres se eliminan durante la incubación mientras que la respuesta integrada total del donante galactosilado/grupo lábil casi no cambia.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se mencionó, un aspecto de la invención se refiere a un método para producir una composición que comprende uno o más galacto-oligosacárido(s), método que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una mezcla que comprende un donante de galactosilo que comprende un grupo galactosilo unido a un grupo lábil, donde el donante de galactosilo tiene un peso molar de como máximo 350 g/mol, - un aceptor de galactosilo que es diferente al donante de galactosilo, donde dicho aceptor de galactosilo es un sacárido o un azúcar-alcohol, y donde la relación molar entre el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo es de al menos 1:10, y donde la mezcla comprende al menos 0.05 mol/L del aceptor de galactosilo, b) proporcionar una primera enzima, donde dicha primera enzima tiene actividad beta-galactosidasa, dicha primera enzima entra en contacto con la mezcla, y c) incubar la mezcla y la primera enzima, lo que permite que la primera enzima libere el grupo lábil del donante de galactosilo y transfiera el grupo de galactosilo del donante de galactosilo al aceptor de galactosilo, lo que forma el galacto-oligosacárido, donde la etapa c) comprende además eliminar de la mezcla de incubación, es decir durante la incubación, un grupo lábil liberado por el donante de galactosilo, por lo que se obtiene la composición que comprende el uno o más galacto-oligosacárido(s).
En el contexto de la presente invención, el término "grupo glicosilo" se refiere a un grupo obtenido mediante la eliminación de uno o dos grupos hidroxilo de un monosacárido o un oligosacárido inferior, como un di- o tri-sacárido o de los azúcares-alcoholes correspondientes. El término se utiliza en la presente para describir varios bloques de construcción de donantes de galactosilo, aceptores de galactosilo y oligosacáridos.
Las abreviaturas de los sacáridos más comunes y sus grupos glicosilo correspondientes se muestran a continuación. o glicosilo Glucosa Glc glucosilo Galactosa Ga1 galactosilo fucosa Fue fucosilo mañosa Man manosilo xilosa Xyl xilosilo N-acetilgalactosamina GalNAc N-acetilgalactosaminilo Lactosa Lac lactosilo En el contexto de la presente invención, el término "oligosacárido" se refiere a una molécula que comprende al menos dos grupos glicosilo y preferentemente al menos tres, que pueden ser de tipos diferentes o del mismo tipo. Los al menos dos grupos glicosilo se encuentra unidos preferentemente mediante un enlace O-glicosilico. Un oligosacárido puede ser una cadena lineal de grupos glicosilo o puede tener una estructura ramificada. Los oligosacáridos pueden, por ejemplo, representarse como una fórmula estequiométrica, por ejemplo, (Gal)3Glc, o como fórmulas generales, por ejemplo, Gal-Gal-Gal-Glc, Gal-Gal-Glc-Gal o Gal-(Gal-)Glc-Gal. Las fórmulas estequiométricas proporcionan información con respecto a qué grupos glicosilo contiene un oligosacárido o un grupo de oligosacáridos, pero no con respecto a la posición de estos, mientras que las fórmulas generales también contienen información general con respecto a las posiciones relativas de los grupos glicosilo.
En el contexto de la presente invención, el término "homo-oligosacárido" se refiere a un oligosacárido que contiene únicamente un tipo de grupo glicosilo. Los ejemplos de homo-oligosacáridos son Gal-Gal-Gal-Gal y Glc-Glc-Glc.
En el contexto de la presente invención, el término "hetero-oligosacárido" se refiere a un oligosacárido que contiene grupos glicosilo diferentes, por ejemplo, Gal-Gal-Glc o Gal-Gal-Fuc.
En el contexto de la presente invención, el prefijo "galacto-" utilizado junto con el término "oligosacárido" indica que el oligosacárido contiene grupos galactosilo como la unidad de repetición. El prefijo "homo-" o "hetero-" puede utilizarse junto con el prefijo "galacto-". Gal-Gal-Glc y Gal-Gal-Gal-Gal son galacto-oligosacáridos. Gal-Gal-Glc es un hetero-galacto-oligosacárido y Gal-Gal-Gal-Gal es un homo-galacto-oligosacárido.
En el contexto de la presente invención, "X" representa un aceptor de galactosilo como se define en la presente. "-X" representa el grupo glicosilo que corresponde al aceptor de galactosilo y particularmente el grupo glicosilo unido a otro grupo. simboliza el enlace. El grupo glicosilo preferentemente se encuentra unido en la posición 3-, 4-, 5-o 6- del grupo glicosilo y preferentemente mediante un enlace O-glicosilico.
En el contexto de la presente invención "Gal-" representa un grupo galactosilo unido a otro grupo, preferentemente en la posición 1 del grupo galactosilo y preferentemente mediante un enlace O-glicosilico.
En el contexto de la presente invención, "-Gal-" representa un grupo galactosilo unido a otros dos grupos. El enlace izquierdo preferentemente se realiza en la posición 4-o 6- del grupo galactosilo y preferentemente mediante un enlace O-glicosilico. El enlace derecho preferentemente se realiza en la posición 1- del grupo galactosilo y preferentemente mediante un enlace O-glicosilico.
Los enlaces entre dos grupos galactosilo son típicamente enlaces 1-4 o 1-6 y normalmente enlaces O-glicosílicos. Un enlace entre un grupo galactosilo y un aceptor que contiene nitrógeno puede ser de forma alternativa un enlace N-glicosílico.
El método de la presente invención es preferentemente un método para producir una composición que comprende uno o más galacto-oligosacárido(s) mediante el uso de un donante de galactosilo y un aceptor de galactosilo, donde el uno o más galacto-oligosacárido(s) tienen el aceptor de galactosilo como su extremo reductor.
En el contexto de la presente invención los términos "método" y "proceso" se utilizan de forma intercambiable.
La etapa a) implica el suministro de la mezcla en la que deben producirse los oligosacáridos.
La mezcla es preferentemente una mezcla líquida y puede, por ejemplo, ser una solución acuosa que contiene el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo.
En algunas realizaciones de la invención la relación molar entre el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo de la mezcla de la etapa a) es de al menos 1:5, preferentemente al menos 1:1 e incluso más preferentemente al menos 5:1. Por ejemplo, la relación molar entre el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo de la mezcla de la etapa a) puede ser de al menos 10:1, como al menos 15:1.
La relación molar entre el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo de la mezcla de la etapa a) puede, por ejemplo, encontrarse en el intervalo de 1:10 y 100:1.
En algunas realizaciones de la invención la relación molar entre el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo de la mezcla de la etapa a) se encuentra en el intervalo de 1:10 y 50:1, preferentemente en el intervalo de 1:5 y 30:1 e incluso más preferentemente en el intervalo de 1:1 y 20:1. Por ejemplo, la relación molar entre el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo de la mezcla de la etapa a) puede encontrarse, por ejemplo, en el intervalo de 2:1 y 40:1, preferentemente en el intervalo de 4:1 y 30:1 e incluso más preferentemente en el intervalo de 10:1 y 25:1.
Como se menciona, los donantes de galactosilo contienen el grupo galactosilo unido mediante enlace covalente a un grupo lábil. El grupo galactosilo es preferentemente un grupo b-D-galactopiranosilo. Además, el grupo galactosilo preferentemente se encuentra unido al grupo lábil a través de un enlace O-glicosídico en la posición 1- del grupo galactosilo.
El grupo lábil del donante de galactosilo puede, por ejemplo, ser un grupo glicosilo y/o un grupo azúcar-alcohol. Se prefiere particularmente que el grupo lábil del donante de galactosilo sea un grupo glucosilo, es decir, un residuo de glucosa.
Si el grupo lábil es un grupo glicosilo de un mono o disacárido o un azúcar-alcohol correspondiente, el grupo galactosilo preferentemente se encuentra unido al grupo lábil a través de un enlace O-glicosídico en la posición 1- del grupo galactosilo, donde el enlace se une a la posición 4- de un grupo lábil tipo monosacárido o a la posición 4'- de un grupo lábil tipo disacárido.
En el contexto de la presente invención, la frase "Y y/o X" significa "Y" o "X" o "Y y X". Según la misma linea lógica, la frase "Xi, X2,..., Xi-i, y/o Xi" significa " Xi" o " X2" o "Xi-i" o "Xi" o cualquier combinación de los componentes: Xi, X2,···Xi-i y i· En algunas realizaciones de la invención el donante de galactosilo tiene un peso molar de como máximo 1000 g/mol. Por ejemplo, el donante de galactosilo puede tener un peso molar de como máximo 500 g/mol. Puede preferirse que el donante de galactosilo tenga un peso molar de cómo máximo 350 g/mol.
Los disacáridos son actualmente el tipo preferido de donante de galactosilo. De forma alternativa o adicional, los trisacáridos también pueden utilizarse como donantes de galactosilo. Por consiguiente, se prevé que la mezcla puede contener una combinación de donantes de galactosilo diferentes.
En algunas realizaciones preferidas de la invención el donante de galactosilo es lactosa. Otro ejemplo de un donante de galactosilo útil es la lactulosa. Otro ejemplo de un donante de galactosilo útil es el lactitol.
En el contexto de la presente invención el término "lactosa" se refiere al disacárido b-D-galactopiranosil-(14 )-D-glucosa, que también se denomina azúcar de la leche, y que es el sacárido más predominante de la leche bovina.
El donante de galactosilo puede proporcionarse a través de cualquier fuente de donante de galactosilo útil, ya sea fuentes refinadas industrialmente, como lactosa purificada y/o fuentes naturales, como filtrado de suero, es decir, suero desproteinado preparado mediante la ultrafiltración del suero.
El aceptor de galactosilo puede ser cualquier molécula capaz de aceptar un grupo galactosilo de una primera enzima y típicamente contiene grupos hidroxilo y preferentemente grupos hidroxilo alcohólicos. El térmico "que acepta" significa que el grupo galactosilo del donante debería estar unido al aceptor mediante enlace covalente, por ejemplo, a través de un enlace O-glicosílico.
En algunas realizaciones de la invención el aceptor de galactosilo comprende uno o más grupo (s) hidroxilo alcohólico(s). Por ejemplo, el aceptor de galactosilo puede ser un poliol.
En el contexto de la presente invención el término "poliol" se refiere a una molécula que comprende al menos dos grupos hidroxilo alcohólicos.
En algunas realizaciones preferidas de la invención el aceptor de galactosilo no es lactosa. Puede preferirse además que el aceptor de galactosilo no sea glucosa.
En algunas realizaciones preferidas de la invención el aceptor de galactosilo es diferente del donante de galactosilo. Se prefiere particularmente el uso de un donante de galactosilo relativamente económico, como lactosa, como fuente de galactosilo y un aceptor biológicamente interesante, como fucosa, como aceptor de galactosilo.
En algunas realizaciones de la invención el aceptor de galactosilo no es lactosa, galactosa o glucosa.
En algunas realizaciones de la invención el aceptor de galactosilo no es glucosa u oligosacáridos de la fórmula general Gal-(Gal)i-Glc, donde i es un entero no negativo, es decir, por ejemplo, 0, 1, 2, 3 o 4.
En algunas realizaciones de la invención el aceptor de galactosilo no es galactosa u oligosacáridos de la fórmula general Gal-(Gal)i-Gal, donde i es un entero no negativo.
Pueden utilizarse aceptores de galactosilo que tienen varios pesos molares, pero actualmente se prefieren los aceptores de galactosilo que tienen un peso molar de al menos 100 g/mol.
En algunas realizaciones de la invención el aceptor de galactosilo tiene un peso molar de como máximo 1000 g/mol. Por ejemplo, el aceptor de galactosilo puede tener un peso molar de como máximo 500 g/mol. Incluso puede preferirse que el aceptor de galactosilo tenga un peso molar de cómo máximo 350 g/mol. El aceptor de galactosilo puede, por ejemplo, tener un peso molar de como máximo 200 g/mol.
En algunas realizaciones preferidas de la invención el aceptor de galactosilo es un sacárido. El aceptor de galactosilo puede, por ejemplo, ser un monosacárido. De forma alternativa, el aceptor de galactosilo puede ser un disacárido.
Por ejemplo, el aceptor de galactosilo puede ser una pentosa. El aceptor de galactosilo puede ser, por ejemplo, arabinosa. Otro ejemplo de una pentosa útil es xilosa. Otro ejemplo de una pentosa útil es ribosa. El aceptor de galactosilo puede, por ejemplo, ser una pentosa que se selecciona del grupo que consiste en arabinosa, xilosa y ribosa.
Las hexosas son otro grupo de aceptores de galactosilo útiles. El aceptor de galactosilo puede ser, por ejemplo, mañosa. Otro ejemplo de una hexosa útil es galactosa. Otro ejemplo de una hexosa útil es tagatosa. Otro ejemplo de una hexosa útil es fructosa. El aceptor de galactosilo puede, por ejemplo, ser una hexosa que se selecciona del grupo que consiste en mañosa, galactosa, tagatosa y fructosa.
En algunas realizaciones preferidas de la invención el aceptor de galactosilo es una desoxi-hexosa. El aceptor de galactosilo puede ser, por ejemplo, fucosa, como, por ejemplo, D-fucosa, L-fucosa o una mezcla de estas.
De forma alternativa, el aceptor de galactosilo puede ser un oligosacárido, como por ejemplo, un disacárido o un trisacárido. Un ejemplo de un disacárido útil es maltosa. Otro ejemplo de un disacárido útil es lactulosa.
Otro grupo útil de aceptores de galactosilo son los derivados de sacáridos.
En el contexto de la presente invención, el término "derivado de sacárido" se refiere a un sacárido que contiene uno o más grupo(s) funcionales que no son hidroxilo. Los ejemplos de dichos grupos funcionales son un grupo carboxilo, un grupo amino, un grupo N-acetilamino y/o un grupo tiol. Los sacáridos que contienen un grupo aldehido en la posición 1- o un grupo cetona en la posición 2- no se consideran derivados de sacáridos como tales a menos que los sacáridos comprendan algunos de los grupos funcionales que no son hidroxilo mencionados anteriormente.
Un ejemplo de un derivado de sacárido útil es N-acetil galactosamina. Otro ejemplo de un derivado de sacárido útil es ácido siálico. Otro ejemplo de un derivado de sacárido útil es sialil lactosa. Por consiguiente, el aceptor de galactosilo puede ser un derivado de sacárido que se selecciona del grupo que consiste en N-acetil galactosamina, ácido siálico y sialil lactosa.
Otro grupo de aceptores de galactosilo útiles son los alcoholes de azúcar. Por tanto, en algunas realizaciones de la invención el aceptor de galactosilo es un alcohol de azúcar. Los ejemplos de alcoholes de azúcar útiles son sorbitol, xilitol, lactitol, y/o maltitol.
Contrariamente a los aceptores de galactosilo mencionados anteriormente, los presentes inventores han encontrado que la N-acetil glucosamina y la glucosa son aceptores de galactosilo menos eficaces. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la invención el aceptor de galactosilo no es glucosa o N-acetil glucosamina.
La mezcla puede contener uno o más aceptor(es) de galactosilo diferentes al primer tipo de aceptor de galactosilo. Los diferentes tipos de aceptores de galactosilo de la mezcla pueden, por ejemplo, seleccionarse entre los tipos de aceptores de galactosilo mencionados en la presente.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, los aceptores galactosilados producidos actúan como un nuevo tipo de aceptor de galactosilo y también pueden galactosilarse. De esta forma, pueden producirse galacto-oligosacáridos que tienen la fórmula estequiométrica Gali+iX, donde i es un entero no negativo. Normalmente, las especies más predominantes son GalX, Gal2X y GalaX.
En otras realizaciones preferidas de la invención, los aceptores galactosilados producidos actúan como un nuevo tipo de aceptor de galactosilo y también pueden galactosilarse. De esta forma, pueden producirse galacto-oligosacáridos que tienen la fórmula general Gal-(Gal)i-X, donde i es un entero no negativo. Normalmente, las especies más predominantes son Gal—X, Gal—Gal—X y Gal—Gal—Gal—X.
En algunas realizaciones de la invención, la mezcla de la etapa a) comprende el donante de galactosilo en una concentración de como máximo 0.7 mol/L, preferentemente como máximo 0.4 mol/L, e incluso más preferentemente como máximo 0.2 mol/L. La mezcla puede, por ejemplo, comprender el donante de galactosilo en una concentración en el intervalo de 0.001 a 0.7 mol/L, preferentemente en el intervalo de 0.01 a 0.5 mol/L e incluso más preferentemente en el intervalo de 0.02 a 0.2 mol/L.
De forma alternativa, la mezcla de la etapa a) puede comprender el donante de galactosilo en una concentración de como máximo 0.3 mol/L, preferentemente como máximo 0.1 mol/L e incluso más preferentemente como máximo 0.05 mol/L. La mezcla puede, por ejemplo, comprender el donante de galactosilo en una concentración en el intervalo de 0.001 a 0.2 mol/L, preferentemente en el intervalo de 0.005 a 0.1 mol/L e incluso más preferentemente en el intervalo de 0.01 a 0.05 mol/L.
Cabe señalar que puede que el aceptor de galactosilo galactosilado y el donante de galactosilo galactosilado actúen, en un grado limitado, como un donante de galactosilo, pero el aceptor de galactosilo galactosilado y el donante de galactosilo galactosilado no son considerados donantes de galactosilo en el contexto de la presente invención y no contribuyen a las concentraciones o proporciones de donante de galactosilo mencionadas en la presente.
El aceptor de galactosilo puede utilizarse en un intervalo de diferentes concentraciones. No obstante, se prefiere evitar la saturación de la mezcla con el aceptor de galactosilo dado que el exceso de aceptor de galactosilo normalmente debe quitarse de la composición que contiene galacto-oligosacáridos de la invención.
En algunas realizaciones de la invención, la mezcla de la etapa a) comprende el aceptor de galactosilo en una cantidad de al menos 0.05 mol/L, preferentemente al menos 0.10 mol/L, e incluso más preferentemente al menos 0.30 mol/L Pueden preferirse concentraciones aún más altas del aceptor de galactosilo, por lo que la mezcla de la etapa a) puede, por ejemplo, comprender el aceptor de galactosilo en una cantidad de al menos 0.5 mol/L, preferentemente al menos 0.7 mol/L, e incluso más preferentemente al menos 1 mol/L.
La mezcla puede, por ejemplo, comprender el aceptor de galactosilo en una concentración en el intervalo de 0.05 mol/L y 5 mol/L, preferentemente en el intervalo de 0.1 mol/L y 2 mol/L e incluso más preferentemente en el intervalo de 0.3 mol/L y 1 mol/L.
No obstante, en algunas realizaciones se prefiere una concentración relativamente baja del aceptor de galactosilo en cuyo caso la mezcla puede, por ejemplo, comprender el aceptor de galactosilo en una concentración de como máximo 2 mol/L, preferentemente como máximo 0.5 mol/L, e incluso más preferentemente como máximo 0.2 mol/L. Por ejemplo, la mezcla puede comprender el aceptor de galactosilo en una concentración en el intervalo de 0.05 mol/L y 2 mol/L, preferentemente en el intervalo de 0.06 mol/L y 1 mol/L e incluso más preferentemente en el intervalo de 0.08 mol/L y 0.8 mol/L.
Además del aceptor de galactosilo y del donante de galactosilo, la mezcla puede contener además varios aditivos para optimizar las condiciones para la reacción enzimática.
La mezcla puede por ejemplo contener uno o más tampon(es) de pH para ajustar el pH de la mezcla al pH óptimo de la primera enzima. De forma alternativa o adicional, la mezcla puede comprender sales solubles en agua que contienen uno o más iones metálicos. En función de la primera enzima especifica, pueden utilizarse iones metálicos como Ca2+, Zn2+ o Mg2+. Nótese, no obstante, que algunas de las primeras enzimas no tienen sensibilidad a la presencia de iones metálicos en la mezcla.
Los métodos convencionales para sintetizar oligosacáridos habitualmente emplean agentes que disminuyen la actividad en agua, como por ejemplo, glicerol, etilenglicol, propilenglicol, polietilenglicol (PEG). La presente invención hace posible, de forma ventajosa, la realización de una síntesis eficaz de los galacto-oligosacáridos sin el uso de dichos agentes que disminuyen la actividad en agua. Por consiguiente, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la mezcla contiene agente que disminuye la actividad en agua en una cantidad de como máximo un 5% en peso con respecto al peso de la mezcla, preferentemente como máximo un 1% en peso e incluso más preferentemente como máximo un 0.1% en peso. Por ejemplo, la mezcla puede contener un agente que disminuye la actividad en agua en una cantidad de como máximo un 0.05% en peso con respecto al peso de la mezcla.
La mezcla de la etapa a) o los ingredientes que forman la mezcla pueden haberse sometido a tratamiento térmico antes de la reacción con la primera enzima para evitar el crecimiento microbiano durante la reacción. Pueden utilizarse los procesos de tratamiento térmico habituales, como pasteurización (por ejemplo, 72 grados C durante 15 segundos), pasteurización elevada (por ejemplo, 90 grados C durante 15 segundos) o tratamiento de UHT (por ejemplo, 140 grados C durante 4 segundos). Se debe tener cuidado al someter a tratamiento térmico a enzimas que cambian con la temperatura.
La etapa b) implica el suministro de una primera enzima que preferentemente tiene actividad de beta-galactosidasa. Preferentemente, la primera enzima tiene actividad de transgalactosilación además de actividad de beta-galactosidasa. También puede preferirse que la primera enzima tenga un valor T de como máximo 0.9. Cabe señalar que el método puede implicar además el uso de enzimas adicionales, por ejemplo, enzimas que tienen una actividad enzimática diferente a la actividad de beta-galactosidasa o actividad de transgalactosilación.
En el contexto de la presente invención, el término "actividad de beta-galactosidasa" se refiere a la catálisis enzimática de la hidrólisis de residuos de b-D-galactosa terminales no reductores en b-D-galactosidas, como lactosa. La primera enzima utilizada en la invención pertenece preferentemente a la clase EC 3.2.1.23.
Se prefiere que la primera enzima tenga un valor T de como máximo 0.9. En algunas realizaciones de la invención, el valor T de la primera enzima es de como máximo 0.8, preferentemente como máximo 0.7 e incluso más preferentemente como máximo 0.6. Por ejemplo, el valor T de la primera enzima puede ser como máximo 0.5. Preferentemente, el valor T de la primera enzima puede ser como máximo 0.4. Puede ser incluso más preferido que el valor T de la primera enzima sea como máximo 0.3.
Pueden preferirse incluso valores T más bajos, como por ejemplo como máximo 0.2.
Las primeras enzimas útiles pueden, por ejemplo, derivarse de un péptido codificado por la secuencia de ADN de la SEQ ID NO. 1. Un ejemplo del péptido a partir del cual pueden derivarse las primeras enzimas útiles es el péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2.
La SEQ ID NO. 1 y la SEQ ID NO.2 pueden encontrarse en la solicitud de PCT WO 01/90,317 A2, donde se denominan SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Asimismo, otras primeras enzimas útiles también pueden encontrarse en WO 01/90,317 A2.
En algunas realizaciones preferidas de la invención la primera enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto al péptido de la SEQ ID NO. 2. Por ejemplo, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto al péptido de la SEQ ID NO. 2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5% En algunos casos, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto al péptido de la SEQ ID NO.2 En el contexto de la presente invención, el término "identidad de secuencia" se refiere a una medida cuantitativa del grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos de igual longitud o entre dos secuencias de ácidos nucleicos de igual longitud. Si las dos secuencias que deben comparase no tienen la misma longitud, deben alinearse en la mejor forma posible. La identidad de secuencia puede calcularse como (Nref-Ndif)*100)/(Nref), donde Ndif es la cantidad total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se encuentran alineadas y donde Nref es la cantidad de residuos en una de las secuencias. Por consiguiente, las secuencias de ADN AGTCAGTC tendrán una identidad de secuencia de un 75% con respecto a la secuencia AATCAATC (Ndif=2 y Nref=8). Un espacio en blanco se cuenta como no identidad de el/los residuo(s) especifico(s), es decir, la secuencia de ADN AGTGTC tendrá una identidad de secuencia de un 75% con respecto a la secuencia de ADN AGTCAGTC (Ndif=2 y Nref=8). La identidad de secuencia puede por ejemplo calcularse mediante el uso de programas BLAST adecuados, como el algoritmo BLASTp proporcionado por el Centro Nacional de Información de Bioteenología (NCBI), EE.UU.
En otras realizaciones preferidas de la invención la secuencia de aminoácidos de la primera enzima tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto al péptido de la SEQ ID NO. 2. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto al péptido de la SEQ ID NO.2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5%. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de.la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto al péptido de la SEQ ID NO.2.
En algunas realizaciones preferidas de la invención la primera enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO. 2. Por ejemplo, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO 2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5%. En algunos casos, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO.2.
En otras realizaciones preferidas de la invención la secuencia de aminoácidos de la primera enzima tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO. 2. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO.2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5%. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO.2. Por consiguiente, la primera enzima puede, por ejemplo, tener la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO.2.
En algunas realizaciones preferidas de la invención la primera enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO.2. Por ejemplo, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO. 2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5%. En algunos casos, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO.2.
En otras realizaciones preferidas de la invención la secuencia de aminoácidos de la primera enzima tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO. 2. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO.2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5%. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO.2. Por consiguiente, la primera enzima puede, por ejemplo, tener la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO.2.
En algunas realizaciones preferidas de la invención la primera enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO. 2. Por ejemplo, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO. 2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5%. En algunos casos, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2.
En otras realizaciones preferidas de la invención la secuencia de aminoácidos de la primera enzima tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO 2. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5%. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2.
En algunas realizaciones de la invención preferidas actualmente, la primera enzima tiene la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2.
En algunas realizaciones preferidas de la invención la primera enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO. 2. Por ejemplo, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO. 2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5%. En algunos casos, la primera enzima puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2.
En otras realizaciones de la invención la secuencia de aminoácidos de la primera enzima tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO. 2. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 90% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO. 2, preferentemente al menos un 95%, e incluso más preferentemente al menos un 97.5%. En algunos casos, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2. Por consiguiente, la primera enzima puede, por ejemplo, tener la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2.
En algunas realizaciones de la invención preferidas actualmente, la primera enzima tiene la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2.
La primera enzima puede comprender, por ejemplo: - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2.
De forma alternativa, la primera enzima puede, por ejemplo, consistir en: - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2.
La primera enzima puede comprender, por ejemplo: - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2 o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO.2.
De forma alternativa, la primera enzima puede, por ejemplo, consistir en: - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Gly (950) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO.2.
En algunas realizaciones de la invención, la primera enzima puede, por ejemplo, comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 1. La primera enzima puede por ejemplo comprender una secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 1. De forma alternativa, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 1. La primera enzima puede por ejemplo tener una secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 1.
Tabla 1. Secuencias de aminoácidos (AAS) útiles.
No. No. Posición en No. de Posición en la de la SEQ ID de Posición en la AAS SEQ ID NO.2 AAS NO. 2 AAS SEQ ID NO.2 Desde Hasta 1 25 1122 26 27 1122 51 30 1122 2 25 1132 27 27 1132 52 30 1132 3 25 1142 28 27 1142 53 30 1142 4 25 1152 29 27 1152 54 30 1152 5 25 1162 30 27 1162 55 30 1162 6 25 1167 31 27 1167 56 30 1167 7 25 1168 32 27 1168 57 30 1168 8 25 1169 33 27 1169 58 30 1169 9 25 1170 34 27 1170 59 30 1170 10 25 1171 35 27 1171 60 30 1171 11 25 1172 36 27 1172 61 30 1172 12 25 1173 37 27 1173 62 30 1173 13 25 1174 38 27 1174 63 30 1174 14 25 1175 39 27 1175 64 30 1175 15 25 1176 40 27 1176 65 30 1176 41 27 1177 66 30 1177 17 25 1178 42 27 1178 67 30 1178 18 25 1179 43 27 1179 68 30 1179 19 25 1180 44 27 1180 69 30 1180 20 25 1181 45 27 1181 70 30 1181 21 25 1186 46 27 1186 71 30 1186 22 25 1196 47 27 1196 72 30 1196 23 25 1206 48 27 1206 73 30 1206 24 25 1216 49 27 1216 74 30 1216 25 25 1226 50 27 1226 75 30 1226 En algunas realizaciones de la invención, la enzima puede, por ejemplo, comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 2. La enzima puede por ejemplo comprender una secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 2. De forma alternativa, la secuencia de aminoácidos de la enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 2. La enzima puede por ejemplo tener una secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 2.
Tabla 2. Secuencias de aminoácidos (AASj útiles.
No Posición en la No Posición en No. Posición en de SEQ ID NO.2 de la SEQ ID NO. de la SEQ ID NO.
Desde Hasta 76 31 1122 101 32 1122 126 33 1122 77 31 1132 102 32 1132 127 33 1132 78 31 1142 103 32 1142 128 33 1142 79 31 1152 104 32 1152 129 33 1152 80 31 1162 105 32 1162 130 33 1162 81 31 1167 106 32 1167 131 33 1167 82 31 1168 107 32 1168 132 33 1168 83 31 1169 108 32 1169 133 33 1169 84 31 1170 109 32 1170 134 33 1170 85 31 1171 110 32 1171 135 33 1171 86 31 1172 111 32 1172 136 33 1172 87 31 1173 112 32 1173 137 33 1173 88 31 1174 113 32 1174 138 33 1174 89 31 1175 114 32 1175 139 33 1175 90 31 1176 115 32 1176 140 33 1176 91 31 1177 116 32 1177 141 33 1177 92 31 1178 117 32 1178 142 33 1178 93 31 1179 118 32 1179 143 33 1179 94 31 1180 119 32 1180 144 33 1180 95 31 1181 120 32 1181 145 33 1181 96 31 1186 121 32 1186 146 33 1186 97 31 1196 122 32 1196 147 33 1196 98 31 1206 123 32 1206 148 33 1206 99 31 1216 124 32 1216 149 33 1216 100 31 1226 125 32 1226 150 33 1226 En algunas realizaciones de la invención, la enzima puede, por ejemplo, comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 3 La enzima puede por ejemplo comprender una secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 3. De forma alternativa, la secuencia de aminoácidos de la enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la p .
La enzima puede por ejemplo comprender una secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 4. De forma alternativa, la secuencia de aminoácidos de la enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 4. La enzima puede por ejemplo tener una secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 4.
Tabla 4. Secuencias de aminoácidos (AAS) útiles. p la tabla 5. La primera enzima puede por ejemplo comprender una secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 5. De forma alternativa, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 5 La primera enzima puede por ejemplo tener una secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 5. 2 En algunas realizaciones de la invención, la primera enzima puede comprender, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos presentada en la tabla 6. La primera enzima puede comprender, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos presentada en la tabla 6. De forma alternativa, la secuencia de aminoácidos de la primera enzima puede tener una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos presentada en la tabla 6. La primera enzima puede tener, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos presentada en la tabla 6.
Tabla 6. Secuencias de aminoácidos (AAS) útiles.
Desde Hasta Desde Hasta Desde Hasta 31 865 376 33 865 401 35 865 31 875 377 33 875 402 35 875 31 885 378 33 885 403 35 885 31 895 379 33 895 404 35 895 31 905 380 33 905 405 35 905 31 910 381 33 910 406 35 910 31 911 382 33 911 407 35 911 31 912 383 33 912 408 35 912 31 913 384 33 913 409 35 913 31 914 385 33 914 410 35 914 31 915 386 33 915 411 35 915 31 916 387 33 916 412 35 916 31 917 388 33 917 413 35 917 31 918 389 33 918 414 35 918 31 919 390 33 919 415 35 919 31 920 391 33 920 416 35 920 31 921 392 33 921 417 35 921 31 922 393 33 922 418 35 922 31 923 394 33 923 419 35 923 31 924 395 33 924 420 35 924 31 929 396 33 929 421 35 929 31 939 397 33 939 422 35 939 31 949 398 33 949 423 35 949 31 959 399 33 959 424 35 959 Otros ejemplos de primeras enzimas útiles que tienen actividad de transgalactosilación pueden encontrarse en WO 2011/120993 Al, que se incorpora en la presente a modo de referencia .
En algunas realizaciones de la invención, la primera enzima puede contener uno o más aminoácidos glicosilados. De forma alternativa o adicional, la primera enzima puede contener uno o más aminoácidos fosforilados. De forma alternativa, ninguno de los aminoácidos de la primera enzima son glicosilados o fosforilados.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la primera enzima comprende al menos dos subunidades, cada subunidad consiste en una primera enzima tal como se definió anteriormente .
La primera enzima entra en contacto preferentemente con la mezcla y por lo tanto toma contacto con el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo.
En algunas realizaciones de la invención, la mezcla comprende la primera enzima y/o la segunda enzima. La primera enzima y/o la segunda enzima pueden estar presentes, por ejemplo, en la mezcla en forma disuelta, por ejemplo, como moléculas enzimáticas simples o como agregado soluble de moléculas enzimáticas.
En otras realizaciones de la invención, la primera enzima y/o la segunda enzima se encuentran separadas de la mezcla, pero entran en contacto con el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo mediante el contacto de la primera enzima y/o la segunda enzima con la mezcla. Por ejemplo, pueden utilizarse la primera enzima y/o la segunda enzima inmovilizadas en una fase sólida estacionaria. Los ejemplos de fases sólidas estacionarias útiles son, por ejemplo, un filtro, un lecho empacado de partículas que contienen la primera enzima, o estructuras similares.
De forma alternativa, la fase sólida puede ser, por ejemplo, una fase sólida de partículas que fluyen libremente, por ejemplo, cuentas orgánicas o inorgánicas, que forman parte de la mezcla.
Los detalles relacionados con el uso industrial de enzimas que incluyen téenicas de inmovilización y tipos adecuados de fases sólidas pueden encontrarse en Buchholz (2005), que se incorpora en la presente a modo de referencia para todos los fines.
La primera enzima se utiliza preferentemente en una actividad suficiente como para obtener un rendimiento aceptable de galacto-oligosacáridos. La actividad óptima depende de la implementación específica de los procesos y puede determinarse fácilmente por el entendido en la técnica.
Si se requiere una alta rotación de donante de galactosilo y un alto rendimiento de galacto-oligosacárido, puede preferirse el uso de la primera enzima en una actividad relativamente alta. Por ejemplo, la actividad de la primera enzima puede ser tal que la rotación del donante de galactosilo sea de al menos 0.02 mol/(L*h), preferentemente al menos 0.2 mol/(L*h), e incluso más preferentemente al menos 2 mol/(L*h).
La reacción enzimática sucede durante la incubación de la etapa c). Tan pronto como la mezcla esté expuesta a las condiciones correctas, que puede ser casi inmediatamente cuando el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo entran en contacto con la primera enzima, normalmente comienza la transgalactosilación y, en algunas realizaciones de la invención, las etapas b) y c) de la invención suceden de forma simultánea.
La primera enzima es capaz de liberar el grupo lábil del donante de galactosilo y transferir el grupo galactosilo del donante de galactosilo al aceptor de galactosilo. Por ejemplo, si el donante de galactosilo es lactosa, se libera la glucosa y se transfiere el grupo galactosilo al aceptor. La primera enzima actúa como catalizadora durante la reacción enzimática.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la primera enzima transfiere además grupos galactosilo a aceptores de galactosilo ya galactosilados, generando asi aceptores de galactosilo que contienen dos, tres o incluso más grupos galactosilo.
El pH de la mezcla de incubación se encuentra preferentemente cerca del pH óptimo de la primera enzima. En algunas realizaciones de la invención, el pH de la mezcla de incubación durante la etapa c) se encuentra en el intervalo de pH 3 a 9. Por ejemplo, el pH de la mezcla de incubación durante la etapa c) puede estar en el intervalo de pH 4 a·8, tal como en el intervalo de pH 5 a 7.5.
De manera similar al pH, la temperatura de la mezcla de incubación se ajusta preferentemente a la temperatura óptima de la primera enzima utilizada. En algunas realizaciones de la invención, la temperatura de la mezcla de incubación de la etapa c) se encuentra en el intervalo de 10 a 80°C. La temperatura de la mezcla de incubación puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 70°C, preferentemente en el intervalo de 25 a 60°C, e incluso más preferentemente en el intervalo de 30 a 50°C.
En el contexto de la presente invención, el término "pH óptimo de la primera enzima" se refiere al pH donde la primera enzima tiene la mayor actividad de transgalactosilación. En el mismo contexto, el término "temperatura óptima de la primera enzima" se refiere a la temperatura donde la primera enzima tiene la mayor actividad de transgalactosilación.
La etapa c) implica además agitar la mezcla de incubación.
La eliminación de los grupos lábiles libres sucede durante la incubación de la etapa c). La eliminación puede comenzar, por ejemplo, inmediatamente cuando comienza la etapa c) o puede posponerse hasta que se comience a formar una cantidad significativa de grupos lábiles libres en la mezcla de incubación.
Los grupos lábiles libres pueden eliminarse, por ejemplo, de la mezcla de incubación mediante microorganismos presentes en la mezcla de incubación.
De este modo, en algunas realizaciones de la invención, el método comprende además proporcionar un microorganismo que es capaz de convertir los grupos lábiles libres liberados por el donante de galactosilo, y permite a dicho microorganismo, durante la incubación, eliminar un grupo lábil liberado por el donante de galactosilo.
Los microorganismos útiles son capaces preferentemente de eliminar de forma selectiva los grupos lábiles libres de la mezcla de incubación y, por ejemplo, metabolizarlos o convertirlos en productos de conversión que interfieren menos con la sintesis de galacto-oligosacáridos que el grupo lábil.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo.
Por ejemplo, la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre puede ser al menos 102 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo, preferentemente al menos 103 veces más alta, e incluso más preferentemente al menos 104 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo. La velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre puede ser, por ejemplo, al menos 105 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo. Puede ser incluso más preferido que la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre sea al menos 106 veces más alta, e incluso más preferido al menos 107 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo.
En el contexto de la presente invención, el término "velocidad de eliminación" se refiere a la cantidad de moles del grupo lábil libre, donante, aceptor o aceptor monogalactosilado que el microorganismo es capaz de eliminar de la mezcla de incubación por minuto.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al donante de galactosilo.
Por ejemplo, la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre puede ser al menos 102 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al donante de galactosilo, preferentemente al menos 103 veces más alta, e incluso más preferentemente al menos 104 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al donante de galactosilo. La velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre puede ser, por ejemplo, al menos 105 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al donante de galactosilo. Puede ser incluso más preferido que la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre sea al menos 106 veces más alta, e incluso más preferido al menos 107 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al donante de galactosilo.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
Por ejemplo, la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre puede ser al menos 102 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado, preferentemente al menos 103 veces más alta, e incluso más preferentemente al menos 104 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado. La velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre puede ser, por ejemplo, al menos 105 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado. Puede ser incluso más preferido que la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre sea al menos 106 veces más alta, e incluso más preferido al menos 107 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
El microorganismo es preferentemente una levadura o una bacteria.
Saccharomyces cerevisiae es un ejemplo de una levadura útil, y las bacterias útiles podrían ser, por ejemplo, cepas de E. coli Lac Z-negativo u otras bacterias que pueden metabolizar glucosa pero no lactosa.
De forma alternativa, o adicional, los grupos lábiles libres pueden eliminarse de la mezcla de incubación a través de medios de enzimas específicas que convierten los grupos lábiles en otras especies químicas.
De este modo, en algunas realizaciones preferidas de la invención, el método comprende además proporcionar una segunda enzima que es capaz de convertir los grupos lábiles libres liberados por el donante de galactosilo, y permite que dicha segunda enzima, durante la incubación, convierta un grupo lábil liberado por el donante de galactosilo.
El término "conversión de grupos lábiles libres" se refiere al proceso de convertir los grupos lábiles libres en especies químicas que son preferentemente aceptores de galactosilo más pobres que los grupos lábiles libres como tales. La conversión puede implicar la degradación del grupo lábil libre en varias especies químicas más pequeñas o puede simplemente implicar una transformación del grupo lábil libre en una especie química diferente.
La presente invención puede referirse, por ejemplo, a un método para producir una composición que comprenda uno o más galacto-oligosacáridos, dicho método comprende las etapas de: a) proporcionar una mezcla que comprende: un donante de galactosilo que comprende un grupo galactosilo unido a un grupo lábil, donde dicho donante de galactosilo tiene un peso molar de al menos 350 g/mol, - un aceptor de galactosilo que es diferente al donante de galactosilo, donde dicho aceptor de galactosilo es un sacárido o un alcohol de azúcar, y donde la relación molar entre el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo es de al menos 1:10, y donde la mezcla comprende al menos 0.05 mol/L del aceptor de galactosilo, b) proporcionar una primera enzima y una segunda enzima, donde dicha primera enzima tiene actividad beta-galactosidasa y un valor T de al menos 0.9, dicha segunda enzima es capaz de convertir los grupos lábiles libres liberados por el donante de galactosilo, y dichas primera y segunda enzimas entran en contacto con la mezcla, y c) permitir que la primera enzima libere el grupo lábil del donante de galactosilo y transferir el grupo de galactosilo del donante de galactosilo al aceptor de galactosilo, formando asi el galacto-oligosacárido, y permitir que la segunda enzima convierta un grupo lábil liberado por el donante de galactosilo, obteniendo asi la composición que comprende el galacto-oligosacárido.
La segunda enzima puede tener, por ejemplo, actividad hexosa oxidasa, es decir, que pertenece a la clase de enzima EC 1.1.3.5 y que tiene la capacidad de catalizar la oxidación de beta-D-glucosa con 02 para formar D-glucono-1,5-lactona y peróxido de hidrógeno.
Es incluso más preferido que la segunda enzima tenga actividad glucosa oxidasa, es decir, que pertenece a la clase de enzima EC 1.1.3.4 y que tiene la capacidad de catalizar la oxidación de beta-D-glucosa con 02 para formar D-glucono-1,5-lactona y peróxido de hidrógeno sin oxidación significativa de disacáridos que contienen glucosa, tal como lactosa.
En un ambiente ácido y acuoso, la D-glucono-1,5-lactona se hidroliza típicamente para formar ácido glucónico.
De forma alternativa, las segundas enzimas pueden tener actividad hexoquinasa (EC 2.7.1.1) o actividad glucoquinasa (EC 2.7.1.2).
Otras segundas enzimas útiles pueden encontrarse, por ejemplo, en manuales disponibles para el entendido en la téenica.
Se prefiere que la segunda enzima sea selectiva en su conversión de los grupos lábiles libres y únicamente a determinado alcance, y preferentemente no todos, convierten el donante de galactosilo, el aceptor de galactosilo y/o los galacto-oligosacáridos.
De este modo, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo.
Por ejemplo, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser al menos 102 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo, preferentemente al menos 103 veces más alta, e incluso más preferentemente al menos 104 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo. La constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser, por ejemplo, al menos 105 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo. Puede ser incluso más preferido que la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre sea al menos 106 veces más alta, e incluso más preferido al menos 107 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo.
El término "constante de especificidad" se determina como kcat/Km e incorpora las constantes de velocidad para todas las etapas en la reacción. Debido a que la constante de especificidad refleja la capacidad catalítica y de afinidad, es útil para comparar diversas enzimas entre sí, o la misma enzima con sustratos diferentes. El máximo teórico para la constante de especificidad se conoce como límite de difusión y es de aproximadamente 108 a 109 (M~4 s1). En este momento, cada colisión de la enzima con su sustrato ocasionará catálisis, y la velocidad de formación del producto no está limitada por la velocidad de reacción sino por la velocidad de difusión. kCat y Km de la segunda enzima se determina a 37 grados mediante el uso de 50 mM de tampón de Na3P04 ajustado a pH 6.5.
El tampón contiene además las sales y los factores conjuntos necesarios para un rendimiento óptimo de la enzima.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo.
Por ejemplo, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser al menos 102 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo, preferentemente al menos 103 veces más alta, e incluso más preferentemente al menos 104 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo. La constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser, por ejemplo, al menos 105 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo. Puede ser incluso más preferido que la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre sea al menos 106 veces más alta, e incluso más preferido al menos 107 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado (Gal-X).
Por ejemplo, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser al menos 102 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado, preferentemente al menos 103 veces más alta, e incluso más preferentemente al menos 104 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado. La constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser, por ejemplo, al menos 105 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado. Puede ser incluso más preferido que la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre sea al menos 106 veces más alta, e incluso más preferido al menos 107 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre es: al menos 10 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo, al menos 10 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo, y al menos 10 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
Por ejemplo, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser: al menos 102 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo, - al menos 102 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo, y al menos 102 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
De preferencia, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre es: al menos 103 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo, al menos 103 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo, y al menos 103 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
De forma alternativa, la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser al menos 104 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo, al menos 104 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo, y al menos 104 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
La constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser: al menos 105 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo, al menos 105 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo, y al menos 105 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
Es aún más preferido que la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre sea: al menos 106 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo, al menos 106 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo, y al menos 106 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
La constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre puede ser, por ejemplo: al menos 107 veces más alta gue su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo, al menos 107 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo, y al menos 107 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
Se prefiere particularmente que la segunda enzima tenga actividad glucosa oxidasa y el grupo lábil del donante de galactosilo sea un grupo glucosilo en cuyo caso el grupo lábil libre es glucosa. Si la segunda enzima tiene actividad glucosa oxidasa, la lactosa es un donante de galactosilo preferido.
La glucosa oxidasa requiere 02 como oxidante y puede ser necesario agregar 02 extra (g) a la mezcla de incubación si la cantidad normal de 02 disuelto en agua no es suficiente. También es posible agregar factores conjuntos tales como FAD (dinucleótido de flavina adenina) o NAD (dinucleótido de nicotinamida adenina) a la mezcla de incubación en caso de ser necesario.
Tal como se mencionó anteriormente, H2O2 se forma cuando la glucosa oxidasa cataliza la oxidación de glucosa a D-glucono-1,5-lactona, y altos niveles de H202 pueden ser problemáticos para el proceso, por ejemplo, debido a la oxidación no deseada de las enzimas utilizadas. En algunas realizaciones de la invención, el método implica además proporcionar una peroxidasa o una catalasa que entra en contacto con la mezcla de incubación y que cataliza la degradación de H2O2, por ejemplo, a H2O y O2. Ambas glucosa oxidasas y catalasas son bien conocidas en la téenica anterior y se encuentran disponibles comercialmente. Un ejemplo de una glucosa oxidasa útil es Glyzyme BG (Novozymes, Dinamarca). Un ejemplo de una enzima catalasa útil es Catazyme 25L (Novozymes, Dinamarca). Otro ejemplo es enzima catalasa de Micrococcus lysodeikticus (Sigma-Aldrich, Dinamarca).
El método puede implicar además poner en contacto la mezcla de incubación con una lactonasa, y preferentemente una gluconolactonasa (EC 3.1.1.17), es decir, una enzima capaz de hidrolizar D-glucono-1,5-lactona en ácido glucónico o su correspondiente gluconato base.
De este modo, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la mezcla de incubación entra en contacto con una enzima que tiene actividad glucosa oxidasa, una enzima que tiene actividad glucosa oxidasa, actividad catalasa y una enzima que tiene actividad gluconolactonasa.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, el método comprende además proporcionar un agente de eliminación capaz de eliminar al menos parte del producto de conversión obtenido mediante la conversión del grupo lábil con la segunda enzima, y dejar que el agente de eliminación, durante la incubación, elimine al menos parte del producto de conversión.
En el contexto de la presente invención, el término "agente de eliminación" se refiere a un agente molecular o de partículas capaz de capturar el producto de conversión y eliminarlo de la mezcla de incubación, por ejemplo, mediante precipitación.
El agente de eliminación puede, por ejemplo, comprender o incluso consistir en, una sal de un ión metálico divalente o trivalente. Los ejemplos de iones metálicos útiles son Ca2+, Fe2+, Al3+, o Zn2+.
En realizaciones preferidas de la invención, el agente de eliminación comprende, o incluso consiste en, CaCCd.
Los productos de conversión con carga negativa tales como, por ejemplo, gluconato, la forma desprotonada de ácido glucónico, pueden eliminarse mediante el uso de cromatografía de intercambio de aniones.
De este modo, el agente de eliminación puede comprender, o incluso consistir en, un material de intercambio de aniones En algunas realizaciones de la invención, el material de intercambio de aniones comprende una fase sólida y uno o más grupos catiónicos.
Preferentemente, al menos algunos de los grupos catiónicos se sujetan a la superficie externa de la fase sólida y/o a la superficie de los poros a los que puede accederse a través de la superficie de la fase sólida.
En algunas realizaciones de la invención, la fase sólida del material de intercambio de aniones comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en una pluralidad de partículas, un filtro y una membrana.
La fase sólida puede comprender o consistir en, por ejemplo, polisacáridos. Son particularmente preferidos los polisacáridos reticulados. Los ejemplos de polisacáridos útiles son celulosa, agarosa y/o dextrano. De forma alternativa, la fase sólida puede comprender, o incluso consistir en, un polímero que no contiene carbohidratos. Los ejemplos útiles de polímeros que no contienen carbohidratos son metacrilato, poliestireno y/o estireno-divinilbenceno.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, los grupos catiónicos comprenden, o incluso consisten en, grupos amino. Se prefieren particularmente grupos amino terciarios y resultan en grupos de amonio cuaternario en condiciones de pH adecuadas. Los grupos de amonio cuaternario proporcionan fuertes características de intercambio de aniones al material de intercambio de aniones.
De forma alternativa o adicional, los grupos catiónicos pueden comprender uno o más grupos amino primarios o secundarios. Una cantidad sustancial de grupos amino primarios o secundarios le otorga al material de intercambio de aniones características débiles de intercambio de aniones.
Más detalles respecto a la cromatografía de intercambio de aniones y su implementación industrial pueden encontrarse en Scopes, que se incorpora en la presente a modo de referencia para todos los fines.
Cuando se utiliza un material de intercambio de aniones para capturar el producto de conversión, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 30% (mol/mol) con respecto a la cantidad total del producto de conversión producida durante la incubación. Por ejemplo, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 50% (mol/mol) con respecto a la cantidad total del producto de conversión producida durante la incubación. De forma alternativa, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 80% (mol/mol) con respecto a la cantidad total del producto de conversión producida durante la incubación.
Cuando se utiliza, el agente de eliminación está preferentemente presente en una cantidad suficiente como para precipitar o capturar la cantidad teórica del grupo lábil convertido durante el proceso de síntesis.
De este modo, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 100% (mol/mol) con respecto a la cantidad total del producto de conversión producida durante la incubación. Por ejemplo, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 150% (mol/mol) con respecto a la cantidad total del producto de conversión producida durante la incubación. De forma alternativa, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 200% (mol/mol) con respecto a la cantidad total del producto de conversión producida durante la incubación.
La cantidad total del producto de conversión producida durante la incubación puede estimarse, por ejemplo, a partir de las condiciones del proceso y datos cinéticos planeados con respecto a la o las enzimas utilizadas.
De forma alternativa, la cantidad esperada de grupos lábiles liberados puede utilizarse como guia para dosificar el material de intercambio de aniones. De este modo, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 30% (mol/mol) con respecto a la cantidad total de grupos lábiles liberados durante la incubación. Por ejemplo, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 50% (mol/mol) con respecto a la cantidad total de grupos lábiles liberados durante la incubación. De forma alternativa, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 80% (mol/mol) con respecto a la cantidad total de grupos lábiles liberados durante la incubación.
La capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 100% (mol/mol) con respecto a la cantidad total de grupos lábiles liberados durante la incubación. Por ejemplo, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 150% (mol/mol) con respecto a la cantidad total de grupos lábiles liberados durante la incubación. De forma alternativa, la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones puede ser, por ejemplo, de al menos un 200% (mol/mol) con respecto a la cantidad total de grupos lábiles liberados durante la incubación.
Los inventores han descubierto que el presente método proporciona de forma sorprendente un gran rendimiento de galacto-oligosacáridos aunque se utilice una concentración relativamente baja del donante de galactosilo. La concentración relativamente baja del donante de galactosilo reduce adicionalmente el grado de autogalactosilación del donante, es decir, cuando el grupo galactosilo de un primer donante de galactosilo se transfiere a un segundo donante de galactosilo en lugar de un aceptor de galactosilo.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la etapa c) comprende la adición de más donante de galactosilo a la mezcla. Esto se prefiere particularmente cuando se utiliza una concentración relativamente baja del donante de galactosilo. Mediante la adición de más donante de galactosilo se evita que el donante de galactosilo se agote en la mezcla y la concentración del donante de galactosilo pueda controlarse durante la reacción enzimática.
La adición de más donante de galactosilo puede implicar una o más adiciones individuales de donante de galactosilo, por ejemplo, al menos una vez durante la reacción enzimática. De forma alternativa o adicional, la adición de más donante de galactosilo puede ser una adición continua durante la reacción enzimática. El donante de galactosilo adicional es preferentemente del mismo tipo que se utilizó en la etapa a).
La etapa c) puede implicar, por ejemplo, la medición de la concentración de donante de galactosilo durante la incubación y la adición de más donante de galactosilo si la concentración es demasiado baja.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la concentración de donante de galactosilo de la mezcla durante la etapa c) se mantiene a una concentración en el intervalo de 0.01 a 1 mol/L, preferentemente en el intervalo de 0.01 a 0.5 mol/L, y preferentemente en el intervalo de 0.03 a 0.3 mol/L.
Por ejemplo, la concentración de donante de galactosilo de la mezcla durante la etapa c) puede mantenerse a una concentración en el intervalo de 0.02 a 0.1 mol/L.
La etapa c) puede comprender además la adición de más aceptor de galactosilo. Esto permite controlar la concentración de aceptor de galactosilo de la mezcla durante la etapa c) y, por ejemplo, mantener la concentración de aceptor de galactosilo sustancialmente constante si se desea.
Con el fin de producir cantidades significativas de galacto-oligosacáridos, que contienen dos o tres grupos galactosilo transferidos, el proceso debería consumir más donante de galactosilo que aceptor de galactosilo. Por lo cual, más aceptores de galactosilo se volverán galactosilados dos o tres veces. Así, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la relación molar entre el donante de galactosilo consumido y el aceptor de galactosilo consumido es de al menos 1:1, y preferentemente de al menos 5:1, e incluso más preferentemente de al menos 10:1.
La etapa c) finaliza típicamente mediante la inactivación de las enzimas, por ejemplo, mediante la desnaturalización de la primera enzima a través de tratamiento térmico o a través de la rotura del contacto entre la primera enzima y los carbohidratos de la mezcla incubada. Si la primera enzima es una enzima inmovilizada a una fase sólida, el contacto puede, por ejemplo romperse mediante la separación de la fase sólida y la mezcla incubada Si la primera enzima se disolvió en la mezcla, puede separarse la primera enzima de la mezcla de incubación a través de ultrafiltración mediante el uso de un filtro que retiene la primera enzima pero que permite el pasaje de oligo-sacáridos.
A menudo es necesario enriquecer y/o purificar los galacto-oligosacáridos de la composición y reducir la concentración del aceptor de galactosilo, el donante de galactosilo y el grupo lábil liberado.
De este modo, en algunas realizaciones preferidas de la invención, el método comprende además la siguiente etapa: d) enriquecer los oligo-sacáridos de la composición de la etapa c).
En el contexto de la presente invención, el término "enriquecimiento de los galacto-oligosacáridos" se refiere a aumentar la cantidad relativa de los galacto-oligosacáridos de la composición sobre una base en peso seco. Esto se lleva a cabo típicamente mediante la eliminación de los otros sólidos de la composición, por ejemplo, los sacáridos inferiores y, opcionalmente, también la primera enzima, en caso de ser necesario.
El enriquecimiento de la etapa d) puede implicar, por ejemplo, separación cromatográfica y/o nanofiltración. Los detalles respecto a dichos procesos se describen en Walstra et al . (2006) que se incorpora en la presente a modo de referencia para todos los fines.
En algunas realizaciones de la invención, el enriquecimiento implica que se elimine al menos un 50% (p/p sobre base en peso seco) de las moléculas que tienen un peso molar de al menos 200 g/mol de la composición de la etapa c). Por ejemplo, el enriquecimiento puede implicar que se elimine al menos un 80% (p/p sobre base en peso seco) de las moléculas que tienen un peso molar de al menos 200 g/mol de la composición de la etapa c).
En otras realizaciones de la invención, el enriquecimiento implica que se elimine al menos un 50% (p/p sobre base en peso seco) de las moléculas que tienen un peso molar de al menos 350 g/mol de la composición de la etapa c). Por ejemplo, el enriquecimiento puede implicar que se elimine al menos un 80% (p/p sobre base en peso seco) de las moléculas que tienen un peso molar de al menos 350 g/mol de la composición de la etapa c).
Como una alternativa, o de forma adicional al enriquecimiento, puede preferirse que la etapa d) comprenda uno o más procesos que aumenten la concentración galacto-oligosacáridos en la composición. Los ejemplos de etapas de concentraciones útiles son, por ejemplo, osmosis inversa, evaporación y/o secado por atomización.
La etapa d) puede implicar además eliminar el agente de eliminación y/o grupos lábiles convertidos unidos al agente de eliminación de la composición de la etapa c). Dicha eliminación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante filtración, sedimentación o centrifugación.
La composición que contiene galacto-oligosacáridos proporcionada por el método puede encontrarse, por ejemplo, en la forma de un polvo seco en la forma de un jarabe.
La producción de un polvo seco requiere típicamente una o más etapas de procesos, tales como concentración, evaporación y/o secado por atomización. De este modo, en algunas realizaciones de la invención, la etapa d) implica además concentrar, evaporar y/o secar por atomización la composición en forma líquida para obtener la composición en forma de polvo. Se prefiere particularmente secar por atomización la composición líquida de la etapa d) para obtener una composición en polvo. La etapa d) puede comprender, por ejemplo, el enriquecimiento de la etapa seguida de la etapa de concentración, por ejemplo, nanofiltración, osmosis inversa o evaporación, seguida de una etapa de secado por atomización. De forma alternativa, la etapa d) puede comprender la etapa de concentración seguida de una etapa de enriquecimiento, seguida de una etapa de secado por atomización. La concentración de los galacto-oligosacáridos de la composición antes del enriquecimiento puede hacer que el proceso de enriquecimiento posterior sea más rentable.
El secado por atomización eficaz puede requerir la adición de uno o más agentes auxiliares, tales como maltodextrina, proteina láctea, caseinato, concentrado de proteínas del suero y/o polvo de leche descremada.
El presente proceso puede implementarse, por ejemplo, como un proceso en lotes. El presente proceso puede implementarse, de forma alternativa, como un proceso alimentado por lotes. El presente proceso puede implementarse, de forma alternativa, como un proceso continuo.
El presente proceso puede implicar, además, la recirculación de la primera enzima y/o del aceptor de galactosilo no utilizado nuevamente a la mezcla. La recirculación puede formar parte, por ejemplo, de la etapa d). Por ejemplo, la etapa d) puede implicar separar el aceptor de galactosilo y/o la primera enzima de la composición que contiene galacto-oligosacáridos y recircular el aceptor de galactosilo y/o la primera enzima hacia la etapa a) o c). En caso de un proceso en lotes o un proceso alimentado por lotes, el aceptor de galactosilo y/o la primera enzima pueden recircularse a la mezcla del próximo lote.
En el caso de un proceso continuo, el aceptor de galactosilo puede recircularse nuevamente hacia la parte de la línea de proceso que corresponde a la etapa a) o etapa c).
La primera enzima puede recircularse nuevamente hacia la parte de la linea de proceso que corresponde a la etapa b) o etapa c).
Deberla observarse que los detalles y las características relacionadas con las etapas a) y b) no se relacionan con el comienzo real de un proceso de producción pero al menos deberían ocurrir en algún momento durante el proceso. Sin embargo, en algunas realizaciones de la invención, la concentración del donante de galactosilo se mantiene dentro del intervalo descrito en la etapa a) durante toda la duración de la etapa c).
Si el método se implementa como un proceso en lotes o alimentado por lotes, la etapa a) pertenece preferentemente a la composición de la mezcla cuando comienza la síntesis. Si el método es un proceso continuo, la etapa a) se refiere preferentemente a la composición de la mezcla durante la síntesis en una operación de estado estacionario.
Se puede considerar deseable que el nivel de donante de galactosilo galactosilado se mantenga tan bajo como sea posible, ya que el donante de galactosilo galactosilado puede percibirse como una impureza no deseada, lo que es engañoso para separar del aceptor de galactosilo galactosilado. En algunas realizaciones preferidas de la invención, la mezcla de incubación de la etapa c) contiene como máximo 0.5 mol/L de donante de galactosilo galactosilado. La mezcla de incubación de la etapa c) puede contener, por ejemplo, como máximo 0.1 mol/L de donante de galactosilo galactosilado. Incluso más preferentemente la mezcla de incubación de la etapa c) contiene como máximo 0.01 mol/L de donante de galactosilo galactosilado, y de preferencia sustancialmente ningún donante de galactosilo galactosilado.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, cuando el donante es lactosa, la concentración total de alolactosa y alolactosa galactosilada se mantiene tan baja como sea posible, ya que estos compuestos también se perciben como impurezas no deseadas, lo que es difícil de separar del aceptor de galactosilo galactosilado.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la mezcla de incubación de la etapa c) contiene una cantidad total de alolactosa y alolactosa galactosilada de un máximo de 0.5 mol/L. La mezcla de incubación de la etapa c) puede contener, por ejemplo, una cantidad total de alolactosa y alolactosa galactosilada de un máximo de 0.1 mol/L. Incluso más preferentemente, la mezcla de incubación de la etapa c) contiene una cantidad total de alolactosa y alolactosa galactosilada de un máximo de 0.01 mol/L, y de preferencia sustancialmente ninguna alolactosa ni alolactosa galactosilada .
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende galacto-oligosacáridos, dicha composición puede obtenerse mediante el método tal como se define en la presente.
Un aspecto adicional de la invención es una composición que contiene galacto-oligosacáridos, por ejemplo, la composición mencionada anteriormente, dicha composición que contiene galacto-oligosacáridos comprende: - un primer galacto-oligosacárido que tiene la fórmula general Gal-X, - un segundo galacto-oligosacárido que tiene la fórmula estequiométrica (Gal)2X, tal como, por ejemplo, la fórmula general Gal-Gal-X, - un tercer galacto-oligosacárido que tiene la fórmula estequiométrica (Gal)3X, tal como, por ejemplo, la fórmula general Gal-Gal-Gal-X, y donde X es un grupo glicosilo, que no es lactosilo o glucosilo.
La composición que contiene galacto-oligosacáridos descrita en la presente puede ser, por ejemplo, un ingrediente alimenticio.
Tal como se describió anteriormente, "X" o "-X" es preferentemente un grupo glicosilo de uno de los aceptores de galactosilo mencionados en la presente.
En algunas realizaciones de la invención, "X" o "-X" es un grupo glicosilo de un monosacárido, que no es glucosa. En otras realizaciones de la invención, "X" es un grupo glicosilo de un disacárido, que no es lactosa.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, "X" o "-X" es un grupo fucosilo. En otras realizaciones preferidas de la invención, "X" o "-X" es un grupo galactosilo.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene galacto-oligosacáridos tiene una relación molar entre: - la cantidad total de los galacto-oligosacáridos Gal-X, (Gal)2X y (Gal)3X, y - la cantidad total de los galacto-oligosacáridos Gal-Glc, Gal2Glc, Gal3Glc de al menos 5:95. Por ejemplo, la relación molar mencionada anteriormente puede ser de al menos 1:4, preferentemente al menos 1:1, e incluso más preferentemente al menos 2:1. Puede ser incluso más preferido que la relación molar mencionada anteriormente sea de al menos 5:1, preferentemente al menos 10:1, e incluso más preferentemente al menos 20:1.
En otras realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene galacto-oligosacáridos tiene una relación molar entre: - la cantidad total de los galacto-oligosacáridos Gal-X, Gal—Gal—X y Gal—Gal—Gal—X, y - la cantidad total de los galacto-oligosacáridos Gal-Glc, Gal-Gal-Glc, Gal-Gal-Gal-Glc de al menos 5:95. Por ejemplo, la relación molar mencionada anteriormente puede ser de al menos 1:4, preferentemente al menos 1:1, e incluso más preferentemente al menos 2:1. Puede ser incluso más preferido que la relación molar mencionada anteriormente sea al menos 5:1, preferentemente al menos 10:1, e incluso más preferentemente al menos 20:1.
Es aún más posible que la composición que contiene galacto-oligosacáridos no contenga ningún galacto-oligosacárido de la fórmula Gal-Glc, Gal-Gal-Glc, y Gal-Gal-Ga1—G1c.
En algunas realizaciones de la invención, la composición que contiene galacto-oligosacáridos tiene una relación molar entre el primer galacto-oligosacárido, el segundo galacto-oligosacárido, y el tercer galacto-oligosacárido en el intervalo de 50-99: 1-45 : 0.5-25.
En otras realizaciones de la invención, la composición que contiene galacto-oligosacáridos tiene una relación molar entre el primer galacto-oligosacárido, el segundo galacto-oligosacárido, y el tercer galacto-oligosacárido en el intervalo de 20-45: 20-45: 20-45.
En realizaciones adicionales de la invención, la composición que contiene galacto-oligosacáridos tiene una relación molar entre el primer galacto-oligosacárido, el segundo galacto-oligosacárido, y el tercer galacto-oligosacárido en el intervalo de 0.5-25: 1-45 : 50-98.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene galacto-oligosacáridos comprende una cantidad total del primer galacto-oligosacárido, segundo galacto-oligosacárido, y tercer galacto-oligosacárido de al menos un 10% en peso con respecto al peso total de la composición que contiene galacto-oligosacáridos. Por ejemplo, la composición que contiene galacto-oligosacáridos puede comprender una cantidad total del primer galacto-oligosacárido, segundo galacto-oligosacárido, y tercer galacto-oligosacárido de al menos un 20% en peso con respecto al peso total de la composición que contiene galacto-oligosacáridos, preferentemente al menos un 30% en peso, incluso más preferentemente al menos un 40% con respecto al peso total de la composición que contiene galacto-oligosacáridos.
Se pueden preferir aún niveles más altos del primer, segundo y tercer galacto-oligosacárido. De este modo, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la composición que contiene galacto-oligosacáridos comprende una cantidad total del primer galacto-oligosacárido, segundo galacto-oligosacárido, y tercer galacto-oligosacárido de al menos un 50% en peso con respecto al peso total de la composición que contiene galacto-oligosacáridos. Por ejemplo, la composición que contiene galacto-oligosacáridos puede comprender una cantidad total del primer galacto-oligosacárido, segundo galacto-oligosacárido, y tercer galacto-oligosacárido de al menos un 60% en peso con respecto al peso total de la composición que contiene galacto-oligosacáridos, preferentemente al menos un 70% en peso, incluso más preferentemente al menos un 80% con respecto al peso total de la composición que contiene galacto-oligosacáridos.
Otro un aspecto de la invención se refiere a un producto alimenticio que comprende la composición que contiene galacto-oligosacáridos descrita en la presente.
En algunas realizaciones de la invención, el producto alimenticio es un producto alimenticio funcional tal como una fórmula para niños o un producto para nutrición clínica.
En otras realizaciones de la invención, el producto alimenticio es un producto horneado, por ejemplo, que comprende masa, tal como pan o productos similares.
En realizaciones adicionales de la invención, el producto alimenticio es un producto lácteo, por ejemplo, un producto lácteo fresco tal como leche, o un producto lácteo fermentado tal como yogur.
En otras realizaciones adicionales de la invención, el producto alimenticio es un producto alimenticio para mascotas.
Debe observarse que las realizaciones y características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a los otros aspectos de la invención.
A continuación la invención se describirá en mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS Ejemplo 1: Preparación de una beta-galactosidasa que tiene actividad de transgalactosilación Un volumen de trabajo de 750 mL de medio de fermentación se inoculó con 2 mL de cultivo de partida de medio de caldo de Lisogenia (LB) con 100 mg/L de ampicilina con una OOeoo de 3.0 cultivado durante 12 horas. La fermentación se llevó a cabo en medio EC que contenia extracto de levadura al 2 % (p/v), peptona de soja al 2 % (p/v), glucosa al 1 % (p/v) y 100 mg/L de ampicilina. La cepa de E. coli que expresa OLGA347 b-galactosidasa (que tiene la secuencia Val (33) lie (1174) de la SEQ ID NO 2) se preparó tal como se describió anteriormente (Jorgensen et al., patente de los Estados Unidos No. 6,555,348 B2, Ejemplos 1 y 2). El fermentador era de Applikon con recipiente con fondo de vidrio con un volumen total de 2 L y equipado con dos impulsores Rushton. Durante la fermentación, el pH se mantuvo a pH 6.5 mediante la adición adecuada de NaOH 2 M y H3PO42 M y la temperatura se controló a 37°C. Se suministró oxigeno mediante burbujeo con aire a una velocidad de 1 a 2 L/min., y pC>2 se mantuvo a 30% mediante aumento de la velocidad de agitación. El cultivo se siguió de lecturas de O?eoo fuera de linea. El cultivo se cosechó mediante centrifugación después de aproximadamente 10 horas de cultivo a un valor de 006oo de 29.7. El sobrenadante del cultivo de 650 mL se almacenó a -20°C. Las proteínas periplasmáticas se aislaron del sedimento celular mediante choque osmótico y se volvió a suspender el sedimento celular en 200 mL de tampón de sacarosa (30 mM de Tris-HCl, sacarosa al 40%, 2 mM de EDTA, pH 7.5) e incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se descartó el sobrenadante y se volvió a suspender el sedimento en 200 mL de agua fría. Se agregaron 83 mL de una solución saturada de MgCl2, y se recogió el sobrenadante que contenía las proteínas periplasmáticas mediante una etapa de centrifugación. La fracción periplasmática se esterilizó con filtro a través de un filtro Millipak 40 de 0.2 mm y se almacenó a -20°C.
La actividad de b-galactosidasa de la fracción periplasmática de 200 mL y del sobrenadante del cultivo de 650 mL se determinó mediante el uso de o-nitrofenil-/?-D-galactopiranosida (OPNG) como un sustrato de conformidad con el protocolo (J. Sambrook y D.W. Russell, Molecular Cloning -A laboratory manual, 3ra edición (2001), pp.17.48-17.51). La mayoría de la actividad se encontró en la fracción periplasmática (525 unidades, que corresponden a un 98%).
Ejemplo 2: Preparación de una segunda beta-galactosidasa que tiene actividad de transgalactosilación Se preparó una segunda beta-galactosidasa (OLGA917) junto con las líneas descritas en el ejemplo 1 pero con base en la expresión de la secuencia de aminoácidos Val (33) - Glu (917) de la SEQ ID NO.2.
Ejemplo 3: Determinación del valor T de una enzima beta-galactosidasa El valor T de una enzima beta-galactosidasa se determina de conformidad con el ensayo y la fórmula proporcionados a continuación .
Ensayo: Preparar 3.3 mL de solución enzimática que consiste en la enzima beta-galactosidasa a analizar, 10 mM de citrato de sodio, 1 mM de citrato de magnesio, 1 M de citrato de calcio, agua Milli-Q (Millipore, EE.UU.), y un pH de 6.5. La solución enzimática debería contener la enzima beta-galactosidasa en una cantidad suficiente para utilizar un 33% (p/p) de la lactosa agregada en 1 hora en la presente condición de ensayo La temperatura de la solución enzimática debería ser de 37°C.
En el momento = To se agregan 82.5 mg de monohidrato de lactosa (para bioquímica, Merck Alemania) y se mezclan con la solución enzimática, y la mezcla se incuba posteriormente a 37°C durante 4 horas. Precisamente 1 hora después de To se recolecta una muestra de 100 ml y se diluye 1:5 con agua Milli-Q y se inactiva mediante calentamiento a 85 °C durante 10 minutos. La mezcla inactivada se mantiene a -20°C hasta la caracterización.
Caracterización: La determinación de la cantidad (en moles) de galactosa producida y la cantidad de lactosa (en moles) producida puede llevarse a cabo mediante el uso de cualquier téenica de análisis adecuada. Por ejemplo, la mezcla diluida puede analizarse mediante HPLC de conformidad con el método descrito por Richmond et al . (1982) y Simms et al . (1994). Otras técnicas de análisis adecuadas se describen en El Razzi (2002).
Otro ejemplo de técnica adecuada de análisis es ISO 5765-2:2002 (IDF 79-2: 2002) "Dried milk, dried ice-mixes and processed cheese - Determination of lactose content - Parte 2: Enzymatic method utilizing the galactose moiety of the lactose".
Cálculo del valor T: El valor T se calcula de conformidad con la siguiente fórmula mediante el uso de datos obtenidos de la caracterización de la mezcla diluida del ensayo: cantidad de galactosa producida (en moles) Valor T = cantidad de lactosa utilizada (en moles) Ejemplo - valor T de la enzima OLGA347: El ensayo mencionado anteriormente se llevó a cabo mediante el uso de la enzima OLGA347 del ejemplo 1.
La mezcla diluida obtenida del ensayo se analizó con respecto a la lactosa convertida (es decir, utilizada) y la galactosa generada a través de HPLC analítica. El aparato de HPLC era de Waters y se eguipó con un refractómetro diferencial (detector de RI) y una columna BioRad Arninex HPX-87C (300x7.8 mm, 125-0055). La elución de sacáridos se llevó a cabo isocráticamente con 0.05 g/L de CaAcetato, una velocidad de flujo de 0.3 mL/min. y un volumen de inyección de 20 mL.
Los datos obtenidos se corrigieron adecuadamente en el punto de referencia mediante software automático, los picos se integraron e identificaron de forma individual. La cuantificación se llevó a cabo mediante el uso de estándares externos de monohidrato de lactosa (para bioguimica, Merck, Alemania), D-(+)-monohidrato de glucosa (para bioquímica, Merck Eurolab, Francia), y D-(+)-galactosa (³99%, Sigma-Aldrich, Italia).
La conversión de lactosa y la formación de galactosa en cada momento T se calculó a partir de los datos cuantificados. En el momento T=1 hora se había convertido un 29% de la lactosa en la muestra recolectada de 100 mE, que corresponde a 2.3 mmo? de lactosa. En el momento T=1 se habían formado 0.5 mmo? de galactosa en la muestra recolectada de 100 pL. El valor T puede calcularse entonces hasta 0.5 mkio? / 2.3 miho? = 0.2.
La mezcla diluida obtenida del ensayo se analizó también con respecto a la lactosa convertida (es decir, utilizada) y la galactosa generada a través del método enzimático ISO 5765-2. Se utilizó un kit de análisis de lactosa/D-galactosa Boehringer Mannheim de R-Biopharm (No. de Cat.10176 303 035) y el análisis se realizó de conformidad con el protocolo. El método enzimático confirmó un valor T de la enzima OLGA347 de 0.2.
Ejemplo - valor T de la enzima OLGA917: El ensayo del valor T mencionado anteriormente se llevó a cabo mediante el uso de la enzima OLGA917 producida en el ejemplo 2 y el valor T se determinó siguiendo el procedimiento explicado anteriormente.
El valor T de la enzima OLGA917 se determinó hasta 0.3.
Ejemplo - valor T de enzima lactasa convencional: El ensayo mencionado anteriormente se llevó a cabo mediante el uso de enzima lactasa convencional disponible comercialmente Lactozym Puré 2600L (Novozymes, Dinamarca). La mezcla diluida obtenida del ensayo se analizó tal como se describió para la enzima OLGA347. Los tri- y tetra-sacáridos no estaban presentes en las cantidades detectables y se observaron cantidades equivalentes de glucosa y galactosa. El valor T correspondiente es 1.
También se determinaron los valores T de beta-galactosidasa comercialmente disponible de Escherichia coli (Número de producto: G6008, Sigma-Aldrich, Alemania) y Aspergillus oryzae (Número de producto: G5160, Sigma-Aldrich, Alemania), y ambas enzimas tienen un valor T de aproximadamente 1.0.
Ejemplo 4: Síntesis de hetero-galacto-oligosacáridos que contienen L-fucosilo mediante la adición secuencial de moléculas donantes y conversión de grupos lábiles de glucosa Se disolvieron monohidrato de lactosa y L-(-)-fucosa en cantidades tal como se describió en la tabla 7 en 100 mL de agua MilliQ. Cada muestra se mantuvo a una temperatura de 37°C y el pH se mantuvo a 6.5 mediante la adición continua de NaOH. Se bombeó continuamente aire a través de la mezcla a una velocidad de 100 L/min. Se agregó enzima glucosa oxidasa, GOX, DuPont, Dinamarca, a la muestra 2. Se agregó enzima glucosa oxidasa, Gluzyme, Novozymes, Dinamarca, a la muestra 3. Se agregó enzima catalasa, de Micrococcus lysodeikticus, Sigma-Aldrich, Dinamarca, a la muestras 2 y 3. Se agregó enzima OLGA917 del ejemplo 2 a cada muestra. Se agregó agua MilliQ a un volumen de proceso total de 250 mL. Este tiempo se definió como T=0. Se agregó monohidrato de lactosa a las muestras en un período de 5 horas en intervalos de 30 minutos Tabla 7: Las muestras de prueba de T=4 horas y T=5 horas se analizaron mediante HPLC de conformidad con el ejemplo 7 y se descubrió que contienen cantidades significativas de fucosa galactosilada.
Ejemplo 5: Síntesis de hetero-galacto-oligosacáridos que contienen L-fucosilo y conversión y eliminación de grupos lábiles de glucosa pero sin la adición secuencial de moléculas donantes Se disolvieron monohidrato de lactosa y L-(-)-fucosa en cantidades tal como se describió en la tabla 8 en 100 mL de agua MilliQ. Cada muestra se mantuvo a una temperatura de 37°C y el pH se mantuvo a 6.5 mediante la adición continua de NaOH. Se bombeó continuamente aire a través de la mezcla a una velocidad de 100 L/min. Se preparó resina de intercambio de aniones, Dowex 66, Sigma-Aldrich, EE.UU. y se agregó a la muestra 3. Se agregó enzima glucosa oxidasa, GOX, DuPont, Dinamarca a las muestras 2 y 3. Se agregó enzima catalasa, de Micrococcus lysodeiktlcus, Sigma-Aldrich, Dinamarca, a la muestras 2 y 3. Se agregó enzima OLGA917 del ejemplo 2 a cada muestra. Se agregó agua MilliQ a un volumen de proceso total tal como se describió en la tabla 8. Este tiempo se definió como T=0.
Tabla 8: Las muestras de prueba de T=4 horas y T=5 horas se analizaron mediante HPLC de conformidad con el ejemplo 7 y también se descubrió que contienen cantidades significativas de fucosa galactosilada.
Ejemplo 6: Síntesis de hetero-galacto-oligosacáridos que contienen L-fucosilo mediante la adición secuencial de moléculas donantes, conversión de grupos lábiles de glucosa y eliminación de grupos lábiles convertidos Se disolvieron monohidrato de lactosa y L-(-)-fucosa en cantidades tal como se describió en la tabla 9 en 100 mL de agua MilliQ. Cada muestra se mantuvo a una temperatura de 37°C y el pH se mantuvo a 6.5 mediante la adición continua de NaOH. Se bombeó continuamente aire a través de la mezcla a una velocidad de 100 L/min. Se agregó resina de intercambio de aniones, Dowex 66, Sigma-Aldrich, EE.UU. y se agregó a cada muestra. Se agregó enzima glucosa oxidasa, GOX, Danisco/DuPont, Dinamarca a la muestra 2. Se agregó enzima glucosa oxidasa, Gluzyme, Novozymes, Dinamarca a la muestra 3 Se agregó enzima catalasa, de Micrococcus lysodeikticus, Sigma-Aldrich, Dinamarca a la muestras 2 y 3. Se agregó enzima OLGA917 del ejemplo 2 a cada muestra. Se agregó agua MilliQ a un volumen de proceso total de 250 mL. Este tiempo se definió como T=0. Se agregó monohidrato de lactosa a las muestras en un periodo de 5 horas en intervalos de 30 minutos.
Tabla 9: En los momentos T=4 y 5 horas se tomaron muestras de análisis de 1500 pL y se analizaron mediante HPLC y espectroscopia de masas de conformidad con el ejemplo 7. Se descubrió que las muestras contenían cantidades significativas de fucosa galactosilada. Los resultados del análisis de espectroscopia de masa se ilustran en las figuras 4 a 6.
La figura 4 muestra un gráfico de la respuesta integrada de di-, tri- y tetrasacáridos de fucosa galactosilada después de 4 horas de incubación, con o sin la eliminación de grupos lábiles libres durante la incubación. Los grupos lábiles libres (glucosa) se eliminan mediante medios de conversión enzimática. Se observa que el contenido de fucosa galactosilada aumenta cuando los grupos lábiles libres se eliminan durante la incubación.
La figura 5 muestra un gráfico de la respuesta integrada de di-, tri- y tetrasacáridos de fucosa galactosilada después de 5 horas de incubación, con o sin la eliminación de grupos lábiles libres durante la incubación. Nuevamente, se observa que el contenido de fucosa galactosilada aumenta cuando los grupos lábiles libres se quitan durante la incubación.
La figura 6 muestra un gráfico de la respuesta integrada total de fucosa galactosilada (HOS total) en comparación con la respuesta integrada total de grupo lábil/donante galactosilado (GOS total), con o sin la eliminación de grupos lábiles libres durante la incubación. La respuesta integrada total de grupo lábil/donante galactosilado es la suma de las respuestas integradas de moléculas de Gal-Glc, Gal-Gal-Glc y Gal-Gal-Gal-Glc. La respuesta integrada total de fucosa galactosilada es la suma de las respuestas integradas de moléculas de Gal-Fue, Gal-Gal-Fuc y Gal-Gal-Gal-Fuc. Se observa que la respuesta integrada total de fucosa galactosilada aumenta significativamente cuando los grupos lábiles libres se quitan durante la incubación mientras que la respuesta integrada total del grupo lábil/donante galactosilado casi no cambia.
Conclusión: Este ejemplo demuestra que la relación entre el aceptor galactosilado (el producto deseado) y los grupos lábiles/donante galactosilado (subproducto) aumentan significativamente cuando los grupos lábiles libres se eliminan durante la incubación.
Ejemplo 7: Caracterización de muestras que contienen hetero-galacto-oligosacáridos que contienen L-fucosilo Las muestras recolectadas se diluyeron 1:10 con agua Milli-Q y se inactivaron mediante calentamiento a 85 °C durante 15 minutos. La mezcla inactivada se mantuvo a -20°C hasta la caracterización.
Las muestras se caracterizaron mediante el uso de HPLC analítica. Las muestras se filtraron mediante el uso de un filtro de 0.22 mm. El aparato de HPLC era de Waters y se equipó con un refractómetro diferencial (detector de RI) y una columna BioRad A inex HPX-87C (300x7.8 mm, 125-0055). La elución de sacáridos se llevó a cabo isocráticamente con 0.05 g/L de CaAcetato, una velocidad de flujo de 0.3 mL/min. y un volumen de inyección de 20 m?,.
El análisis de espectrometría de masas se llevó a cabo con masas de escaneo Agilent 1200 API-ES LC/MSD Quadropole 6410 entre 100 y 1000 amu (temperatura de gas: 350 °C, flujo de gas de secado: 13.0 L/min., presión de nebulización: 40 psig). La columna utilizada para separación LC es una HyperCarb de 2.1x150 mm de Thermo Scientific, Dinamarca, que se lleva a cabo a 25°C. La elución se realizó con 5 mM de solución acuosa de AcNH4 y acetonitrilo.
Se extrajeron cromatogramas de iones con base en los patrones de ionización comunes de la interfaz de electropulverización. Los picos en los cromatogramas extraídos se evaluaron con base en los espectros de masa y posteriormente se integraron, proporcionando asi respuestas integradas para varias especies de carbohidratos de la muestra de análisis.
REFERENCIAS Buchholz (2005) "Biocatalysts and Enzy e technology", Klaus Buchholz et al., ISBN-10: 3-527-30497-5, 2005, Wilcy VCH Verlag GmbH Franck (2002) "Technological functionality of inulin and oligofructose", A. Franck, British Journal of Nutrition (2002), 87, Suppl.2, S287-S291 Yun (1996) "Fructooligosaecharides-Occurrence, preparation, and application", J. W. Yun, Enzyme and Microbial Technology 19: 107-117, 1996 Kunz (2000) "Oligosaccharides in human milk: Structural, functional and metabolic aspects", Kunz et al . , Ann. Rev. Nutr.2000. 20:699-722 Simms et al . (1994) Simms, P.J.; Hicks, K.B.; Haines, R.M.; Hotchkiss, A.T. y Os an, S.F.; (1994) Separations of lactose, lactobionic and lactobionolactose by high performance liquid chromatography. J. of Chromatography, 667, 67-73.
Richmond et al . (1982) Richmond, M.L.; Barfuss, D.L.; Harte, B.R.; Gray, J.I. y Stine, C.M.; (1982) Separation of Carbohydrates in Dairy Products by High Performance Liquid Chromatography , J. of Dairy Science, 65 (8), 1394-1400.
El Razzi (2002) "Carbohydrate Analysis by Modern Chromatography and Electrophoresis", volumen 66, Journal of Chromatography Library, Elsevier Science, 2002, ISBN-10: 0444500618 Walstra et al . (2006) "Dairy Science and technology", Walstra et al . , CRC Press, segunda edición, 2006 Scopes Protein Purification: Principies and Practice; Robert K. Scopes; 3ra edición, Springer Verlag New York, Inc., ISBN 0-387-94072-3 WO 01/90,317 A2 EP 2138 586 Al WO 2009/113,030 A2 WO 2012/010,597 Al Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES ENMENDADAS
1. Un método para producir una composición que comprende uno o más galacto-oligosacárido(s), el método comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una mezcla que comprende - un donante de galactosilo que comprende un grupo galactosilo unido a un grupo lábil, donde el donante de galactosilo tiene un peso molar de como máximo 350 g/mol, - un aceptor de galactosilo que es diferente al donante de galactosilo, donde dicho aceptor de galactosilo es un sacárido o un azúcar-alcohol, y donde la relación molar entre el aceptor de galactosilo y el donante de galactosilo es de al menos 1:10, y donde la mezcla comprende al menos 0.05 mol/L del aceptor de galactosilo, b) proporcionar una primera enzima, donde dicha primera enzima tiene actividad beta-galactosidasa y actividad de transgalactosilación, donde dicha primera enzima entra en contacto con la mezcla, y c) incubar la mezcla y la primera enzima, lo que permite que la primera enzima libere el grupo lábil del donante de galactosilo y transfiera el grupo galactosilo del donante de galactosilo al aceptor de galactosilo, lo que forma el galacto-oligosacárido, donde la etapa c) comprende además eliminar de la mezcla de incubación, un grupo lábil liberado por el donante de galactosilo, y donde la eliminación del grupo lábil liberado del donante de galactosilo implica la eliminación física de los grupos lábiles libres de la mezcla de incubación y/o la conversión de los grupos lábiles libres en una o más especies químicas que pueden estar aún presentes en la mezcla de incubación, por lo que se obtiene la composición que comprende el uno o más galacto-oligosacárido(s).
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, donde el grupo lábil del donante de galactosilo es un grupo glicosilo.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, donde el donante de galactosilo es lactosa o lactitol.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la primera enzima comprende: - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Met (1) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) Gly (950) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) - lie (1174) de la SEQ ID NO.2, o - una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) Glu (917) de la SEQ ID NO.2.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la primera enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) a lie (1174) of SEQ ID NO. 2.
6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la primera enzima comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos Val (33) a Glu (917) de la SEQ ID NO. 2.
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la primera enzima tiene: una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 1, o una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 2, o una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 3, o una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 4, o una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 5, o una identidad de secuencia de al menos un 99% con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la tabla 6.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además proporcionar un microorganismo que es capaz de convertir los grupos lábiles libres liberados por el donante de galactosilo y dejar que dicho microorganismo, durante la incubación, elimine el grupo lábil liberado por el donante de galactosilo.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, donde a) la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo, b) la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al donante de galactosilo, o c) la velocidad de eliminación del microorganismo con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su velocidad de eliminación con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además proporcionar una segunda enzima que es capaz de convertir los grupos lábiles libres liberados por el donante de galactosilo y dejar que dicha segunda enzima, durante la incubación, convierta el grupo lábil liberado por el donante de galactosilo.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, donde la segunda enzima tiene actividad de glucosa oxidasa.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, donde a) la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo, b) la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al donante de galactosilo, o c) la constante de especificidad de la segunda enzima con respecto al grupo lábil libre es al menos 10 veces más alta que su constante de especificidad con respecto al aceptor de galactosilo monogalactosilado.
13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde la segunda enzima tiene actividad de glucosa oxidasa y el grupo lábil del donante de galactosilo es glucosa.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde el método comprende además proporcionar una enzima que tiene actividad de catalasa donde la enzima entra en contacto con la mezcla de incubación.
15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde el método comprende además proporcionar un agente de eliminación capaz de eliminar al menos parte del producto de conversión obtenido mediante la conversión del grupo lábil con la segunda enzima y dejar que el agente de eliminación, durante la incubación, elimine al menos parte del producto de conversión.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, donde el agente de eliminación comprende una sal de un ión metálico divalente o trivalente.
17. El método de conformidad con la reivindicación 15, donde el agente de eliminación comprende o incluso consiste en un material de intercambio de aniones.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, donde la capacidad de unión total del material de intercambio de aniones es de al menos un 30% (mol/mol) con respecto a la cantidad total de producto de conversión producido durante la incubación.
19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la etapa c) comprende la adición de donante de galactosilo adicional.
20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la concentración de donante de galactosilo de la mezcla durante la etapa c) se mantiene a una concentración en el intervalo de 0.01 a 1 mol/L.
21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la siguiente etapa: d) enriquecer el galacto-oligosacárido de la composición de la etapa c).
22. El método de conformidad con la reivindicación 21, donde la etapa d) implica además eliminar el agente de eliminación y/o los grupos lábiles convertidos unidos al agente de eliminación de la composición de la etapa c).
MX2014008935A 2012-01-25 2013-01-25 Metodo para producir una composicion que contiene galacto-oligosacaridos. MX2014008935A (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261590503P 2012-01-25 2012-01-25
EP12152502.6A EP2620506A1 (en) 2012-01-25 2012-01-25 Method of producing a galacto-oligosaccharide-containing composition
PCT/EP2013/051477 WO2013110778A1 (en) 2012-01-25 2013-01-25 Method of producing a composition containing galacto-oligosaccharides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2014008935A true MX2014008935A (es) 2015-07-06

Family

ID=45524414

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014008935A MX2014008935A (es) 2012-01-25 2013-01-25 Metodo para producir una composicion que contiene galacto-oligosacaridos.

Country Status (17)

Country Link
US (2) US20150037847A1 (es)
EP (2) EP2620506A1 (es)
JP (1) JP6183921B2 (es)
KR (1) KR20140126336A (es)
CN (1) CN104136618B (es)
AR (1) AR089822A1 (es)
AU (1) AU2013213524B2 (es)
BR (1) BR112014018032A2 (es)
CA (1) CA2861966A1 (es)
CL (1) CL2014001960A1 (es)
DK (1) DK2807264T3 (es)
EA (1) EA028927B1 (es)
IN (1) IN2014DN06831A (es)
MX (1) MX2014008935A (es)
NZ (1) NZ627138A (es)
SG (2) SG10201606132RA (es)
WO (1) WO2013110778A1 (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6641179B2 (ja) 2012-06-08 2020-02-05 デュポン ニュートリション バイオサイエンシス エーピーエス トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド
WO2013190529A1 (en) * 2012-06-22 2013-12-27 Glycom A/S Glycosylated galactosyl disaccharddes, methods for their production and their use in consumable products
US20150182549A1 (en) * 2012-06-22 2015-07-02 Glycom A/S Method for enzymatic glycosylation of oligosaccharides from mammalian animal milk
TWI793159B (zh) 2013-10-23 2023-02-21 美商健臻公司 重組醣蛋白及其用途
CN108138208A (zh) * 2016-01-12 2018-06-08 维塔鲁斯营养有限公司 由乳糖生产半乳寡糖的方法
IL290057B2 (en) * 2016-09-19 2023-09-01 Prolacta Bioscience Inc Pure preparations of oligosaccharides of breast milk
CN107410502B (zh) * 2017-04-28 2018-08-24 黑龙江省北大荒绿色健康食品有限责任公司 一种低敏性速溶马铃薯豆奶粉的制备方法
CN108384821B (zh) * 2017-12-18 2021-09-14 江苏省农业科学院 一种促进肠道益生菌增殖的低聚糖的制备方法
CN108588006A (zh) * 2018-05-10 2018-09-28 华东理工大学 一种用于肝细胞三维培养的生物支架及其制备方法和应用
CN112251481B (zh) * 2020-11-13 2022-08-26 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 一种低聚半乳糖的制备方法
EP4101301A1 (de) 2021-06-08 2022-12-14 DMK Deutsches Milchkontor GmbH Verfahren zur herstellung von galactooligosacchariden
EP4249600A1 (de) 2022-03-24 2023-09-27 DMK Deutsches Milchkontor GmbH Galactooligosaccharid-zubereitungen mit gelförmiger konsistenz

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1283876B1 (en) * 2000-05-26 2007-01-24 Arla Foods amba Beta-galactosidase isolated from bifidobacterium
JP5455244B2 (ja) * 2008-03-12 2014-03-26 タタ ケミカルズ リミテッド 遊離細胞によるガラクトオリゴ糖の製造方法
EP2138586A1 (en) * 2008-06-24 2009-12-30 Cognis IP Management GmbH Process for the regioselective preparation of disaccharides or oligosaccharides
US9107440B2 (en) 2010-03-29 2015-08-18 Dupont Nutrition Biosciences Aps Polypeptides having transgalactosylating activity
MX348325B (es) * 2010-07-19 2017-06-06 Arla Foods Amba Composicion que contiene galacto-oligosacarido y un metodo para producirla.

Also Published As

Publication number Publication date
JP6183921B2 (ja) 2017-08-23
WO2013110778A1 (en) 2013-08-01
EP2807264A1 (en) 2014-12-03
AU2013213524A1 (en) 2014-07-24
US20170067086A1 (en) 2017-03-09
AR089822A1 (es) 2014-09-17
DK2807264T3 (en) 2018-02-05
JP2015508291A (ja) 2015-03-19
EA201491195A1 (ru) 2014-12-30
CN104136618B (zh) 2018-06-05
SG10201606132RA (en) 2016-09-29
SG11201404110SA (en) 2014-08-28
EP2620506A1 (en) 2013-07-31
KR20140126336A (ko) 2014-10-30
IN2014DN06831A (es) 2015-05-22
CL2014001960A1 (es) 2015-01-16
AU2013213524B2 (en) 2016-06-16
NZ627138A (en) 2016-06-24
CA2861966A1 (en) 2013-08-01
CN104136618A (zh) 2014-11-05
BR112014018032A2 (pt) 2017-06-27
US20150037847A1 (en) 2015-02-05
EA028927B1 (ru) 2018-01-31
EP2807264B1 (en) 2017-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6183921B2 (ja) ガラクトオリゴ糖含有組成物の製造方法
EP2596113B1 (en) Galacto-oligosaccharide-containing composition and a method of producing it
JP5597890B2 (ja) 新規のプレバイオティクス
JP2023093593A (ja) ガラクトオリゴ糖の製造方法
JP2017018135A (ja) ガラクトオリゴ糖含有組成物およびそれを生産する方法
AU2011281663B2 (en) Galacto-oligosaccharide-containing composition and a method of producing it