EA028927B1 - Способ получения композиции, содержащей галактоолигосахариды - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу получения композиции, содержащей галактоолигосахариды, причем способ включает получение смеси, содержащей галактозильный донор и галактозильный акцептор, контактирование смеси с ферментом, обладающим бета-галактозидазной активностью и трансгалактозилирующей активностью, и инкубирование указанной смеси.

Description

Изобретение относится к способу получения композиции, содержащей галактоолигосахариды, причем способ включает получение смеси, содержащей галактозильный донор и галактозильный акцептор, контактирование смеси с ферментом, обладающим бета-галактозидазной активностью и трансгалактозилирующей активностью, и инкубирование указанной смеси.

028927 Β1

028927

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей галактоолигосахариды, а также эффективному способу ее получения.

Предпосылки изобретения

В человеческом грудном молоке, как известно, содержится ряд различных олигосахаридов, которым приписываются некоторые из полезных для здоровья эффектов грудного вскармливания младенцев (Кип/ с1 а1. (2000)). Например, некоторые олигосахариды, такие как ΡΟδ, ΟΘδ или инулин, являются так называемыми пребиотиками, что означает, что они поддерживают полезные бактерии желудочнокишечного тракта и неблагоприятны для вредных бактерий. В связи с их полезными для здоровья эффектами олигосахариды часто применяют в функциональных пищевых продуктах, таких как детские смеси и лечебное питание.

Существуют несколько подходов для получения олигосахаридов. Один подход основан на выделении олигосахаридов из встречающихся в природе источников. Фруктозные олигосахариды (ΡΘδ) и инулин, например, в природе встречаются в топинамбуре, лопухе, цикории, луке-порее, репчатом луке и спарже, и их можно выделять из данных сельскохозяйственных культур. Получение инулина из корней цикория, например, описано во Ргапк (2002). Данный подход к получению олигосахаридов ограничивается наличием пригодных сельскохозяйственных культур и может быть неосуществимым для более сложных олигосахаридов.

Другой подход основан на ферментативном синтезе, в котором ферменты катализируют синтез олигосахаридов. Уип (1996) описывает ферментативное получение фруктоолигосахаридов с использованием ферментов, обладающих фруктозилтрансферазной активностью, и с использованием сахарозы в качестве субстрата для фермента.

Еще пример ферментативного синтеза описан в заявке на патент XVО 01/90317 А2, в которой раскрывают способ получения галактоолигосахаридов (ОО8) формулы 0а1-0а1-01с с использованием специального фермента β-галактозидазы и лактозы в качестве субстрата. В ОепВапк, с входящим номером Ά1224435.2, раскрыта обновленная версия (от 5 августа 2003 г.) последовательности фермента β-галактозидазы, раскрытого в νθ 01/90317.

В заявке на патент ЕР 2 138 586 А1 раскрыт способ региоселективного производства дисахаридов или олигосахаридов с помощью трансгликозилирования или гидролиза углеводной донорной молекулы и гликозильной акцепторной молекулы в присутствии гликозидазы в присутствии по меньшей мере одного диалкиламида. Однако в ЕР 2138586 А1 не раскрыто удаление во время инкубации свободных отщепляемых групп, высвобожденных из гликозильного донора.

В заявке на патент νθ 2009/113030 А2 описан способ получения галактоолигосахаридов на основе чистой лактозы с использованием цельных микробных клеток в реакторе с системой микрофильтрации в поперечном потоке на основе полых волокон. Однако в νθ 2009/113030 А2 отсутствует какая-либо идея, относящаяся к получению гетерогалактоолигосахаридов с использованием галактозильного акцептора, который не связан с донором.

В заявке на патент νθ 2012/010597 А1 раскрыт способ получения композиций, содержащих галактоолигосахариды, а также собственно композиции, содержащие галактоолигосахариды. Однако в νθ 2012/010597 А1 не раскрыто удаление во время инкубации свободных отщепляемых групп, высвобожденных из галактозильного донора.

Краткое описание изобретения

Задачей настоящего изобретения является обеспечение улучшенных способов получения галактоолигосахаридов и, в частности, галактоолигосахаридов, обладающих иным восстанавливающим концом, чем у галактозильного донора, используемого в процессе получения.

Авторы настоящего изобретения, к удивлению, обнаружили, что отщепляемые группы, высвобожденные из донора во время синтеза галактоолигосахаридов, действуют как конкурирующие галактозильные акцепторы и снижают выход вышеупомянутых галактоолигосахаридов. Это особенно удивительно, поскольку первоначальные испытания, проведенные авторами настоящего изобретения, показали, что отщепляемые группы, и особенно глюкоза, являются слабыми галактозильными акцепторами. Авторы настоящего изобретения к тому же обнаружили, что выход вышеупомянутых галактоолигосахаридов (обладающих иным восстанавливающим концом, чем галактозильный донор) можно увеличить путем удаления высвобожденных отщепляемых групп из реакционной смеси во время инкубации галактозильного донора, галактозильного акцептора и фермента β-галактозидазы.

На фиг. 1-3 данное объяснено более подробно.

Фиг. 1 является схематическим изображением основных типов реакций, которые происходят во время трансгалактозилирования.

Реакция а) является требуемой реакцией и включает перенос галактозильной группы от донора (в данном примере лактозы) на акцептор (например, фукозу). Продуктами данной реакции являются свободная отщепляемая группа (в данном примере глюкоза) и небольшой олигосахарид (например, Оа1-Рис), обладающий иным восстанавливающим концом, чем галактозильный донор.

- 1 028927

Реакция Ь) является нежелательной побочной реакцией, которая приводит к так называемому самогалактозилированию донора, например дополнительно галактозилированной лактозе, если донором является лактоза. Данный побочный продукт сложно и дорого удалять из олигосахаридного продукта. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что уровень самогалактозилирования можно значительно снизить путем применения первого фермента, обладающего высокой эффективностью трансгалактозилирования (низкое Т-значение), в комбинации с относительно низкой концентрацией галактозильного донора.

Реакция с) на фиг. 1 является другой нежелательной побочной реакцией, которую авторы настоящего изобретения недавно обнаружили. Авторы настоящего изобретения наблюдали удивительно высокие уровни аллолактозы в галактоолигосахаридных композициях и пришли к заключению, что свободные отщепляемые группы, и особенно глюкоза, также действуют в качестве акцептора, если их концентрация достаточно высока.

Фиг. 2 является схематическим изображением некоторых видов молекул, присутствующих в композициях с галактоолигосахаридами, когда свободные отщепляемые группы не удаляются во время инкубации. В дополнение к требуемым олигосахаридным продуктам, полученным из галактозильного акцептора, композиция к тому же содержит нежелательные олигосахариды, полученные при галактозилировании свободных отщепляемых групп, например аллолактозы и дополнительно галактозилированной аллолактозы.

Фиг. 3 является схематическим изображением некоторых видов молекул, присутствующих в композициях с галактоолигосахаридами, когда свободные отщепляемые группы удаляются во время инкубации. В отличие от композиции с галактоолигосахаридами, проиллюстрированной на фиг. 2, в настоящей композиции с галактоолигосахаридами отсутствуют (или присутствуют по меньшей мере в значительно более низкой концентрации) свободные отщепляемые группы, аллолактоза и олигосахариды, полученные из аллолактозы.

Таким образом, аспект настоящего изобретения относится к способу получения композиции, содержащей один или несколько галактоолигосахаридов, при этом способ включает этапы:

a) получение смеси, содержащей

галактозильный донор, содержащий галактозильную группу, связанную с отщепляемой группой, при этом галактозильный донор обладает молярной массой не более 350 г/моль,

галактозильный акцептор, который отличается от галактозильного донора, причем указанный галактозильный акцептор является сахаридом или сахароспиртом, и

где молярное соотношение между галактозильным акцептором и галактозильным донором составляет по меньшей мере 1:10 и где смесь содержит по меньшей мере 0,05 моль/л галактозильного акцептора

b) обеспечение присутствия первого фермента, причем указанный первый фермент обладает β-галактозидазной активностью, при этом указанный первый фермент контактирует со смесью; и

c) инкубирование смеси и первого фермента, тем самым позволяя первому ферменту высвободить отщепляемую группу галактозильного донора и перенести галактозильную группу галактозильного донора к галактозильному акцептору, таким образом образуя галактоолигосахарид, при этом этап с) дополнительно включает удаление из инкубационной смеси отщепляемой группы, высвобожденной из галактозильного донора, и где удаление отщепляемой группы, высвобожденной из галактозильного донора, включает физическое удаление свободных отщепляемых групп из инкубационной смеси и/или превращение свободных отщепляемых групп в одно или несколько других химических соединений, которые все еще могут присутствовать в инкубационной смеси, с получением в результате композиции, содержащей один или несколько галактоолигосахаридов с получением в результате композиции, содержащей один или несколько галактоолигосахаридов.

Выражение "удаление отщепляемой группы, высвобожденной из галактозильного донора" следует понимать как физическое удаление свободных отщепляемых групп из инкубационной смеси и/или превращение свободных отщепляемых групп в одно или несколько других химических соединений, которые все еще могут присутствовать в инкубационной смеси. Предпочтительно, чтобы такие химические соединения не действовали как галактозильные акцепторы или, по меньшей мере, чтобы они являлись менее эффективными галактозильными акцепторами, чем свободная отщепляемая группа.

Настоящее изобретение открывает дешевое и эффективное получение композиций со сложными галактоолигосахаридами с высоким выходом. Настоящее изобретение к тому же уменьшает галактозилирование свободных отщепляемых групп, высвобожденных из галактозильного донора, а также самогалактозилирование галактозильного донора, которые оба приводят в результате к нежелательным побочным продуктам, которые дорого удалять из композиции.

Предпочтительно первый фермент обладает трансгалактозилирующей активностью в дополнение к β-галактозидазной активности. Также может быть предпочтительным, чтобы первый фермент обладал Т-значением не более 0,9.

- 2 028927

В контексте настоящего изобретения выражение "трансгалактозилирующая активность" фермента β-галактозидазы относится к способности фермента переносить галактозильную группу от донорной молекулы, например молекулы лактозы, к неводной молекуле, например другой молекуле лактозы.

Т-значение является мерой трансгалактозилирующей эффективности фермента β-галактозидазы с использованием лактозы как в качестве галактозильного донора, так и акцептора. Определение Т-значения фермента β-галактозидазы выполняют в соответствии с анализом и формулой, описанными в примере 3. Т-значение рассчитывают с использованием формулы

количество полученной галактозы (в моль)

Т-значение = _

количество использованной лактозы (в моль)

Фермент лактаза без какой-либо трансгалактозилирующей активности будет производить 1 моль галактозы на каждый использованный моль лактозы и будет иметь Т-значение 1. β-галактозидаза, обладающая чрезвычайно высокой трансгалактозилирующей активностью, будет использовать почти все галактозильные группы из лактозы для трансгалактозилирования вместо образования галактозы и будет, следовательно обладать Т-значением около 0.

Еще аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей один или несколько галактоолигосахаридов, при этом композицию можно получить с помощью способа, описанного в данном документе.

Дополнительные задачи и преимущества настоящего изобретения описаны ниже.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана схематическая иллюстрация типов реакций, участвующих в трансгалактозилировании.

На фиг. 2 показано схематическое представление продуктов реакции, полученных без использования свободных отщепляемых групп.

На фиг. 3 показано схематическое представление продуктов реакции, полученных без использования свободных отщепляемых групп.

На фиг. 4 показан график интегрированного ответа ди-, три- и тетрасахаридов галактозилированной фукозы через 4 ч инкубации - с и без удаления свободных отщепляемых групп в течение инкубации. Свободные отщепляемые группы (глюкоза) удаляют с помощью ферментативного превращения. На нем видно, что содержание галактозилированной фукозы увеличивается, если свободные отщепляемые группы удаляют во время инкубации.

На фиг. 5 показан график интегрированного ответа ди-, три- и тетрасахаридов галактозилированной фукозы через 5 ч инкубации - с и без удаления свободных отщепляемых групп в течение инкубации. И в данном случае на нем видно, что содержание галактозилированной фукозы увеличивается, если свободные отщепляемые группы удаляются во время инкубации.

На фиг. 6 показан график общего интегрированного ответа галактозилированной фукозы по сравнению с общим интегрированным ответом галактозилированного донора/отщепляемой группы - с и без удаления свободных отщепляемых групп в течение инкубации. Общий интегрированный ответ галактозилированного донора/отщепляемой группы является суммой интегрированных ответов молекул Са1-О1с, Са1-Оа1-О1с и Оа1-Са1-Оа1-О1с. Общий интегрированный ответ галактозилированной фукозы является суммой ответов молекул Са1-Еис, Са1-Оа1-Еис и Са1-Оа1-Са1-Рис. Как видно, общий интегрированный ответ галактозилированной фукозы значительно возрастает при удалении свободных отщепляемых групп в течение инкубации, в то время как общий интегрированный ответ галактозилированного донора/отщепляемой группы почти не изменяется.

Подробное описание настоящего изобретения

Как уже упоминалось, аспект настоящего изобретения относится к способу получения композиции, содержащей один или несколько галактоолигосахаридов, при этом способ включает этапы:

a) получение смеси, содержащей

галактозильный донор, содержащий галактозильную группу, связанную с отщепляемой группой, при этом галактозильный донор обладает молярной массой не более 350 г/моль,

галактозильный акцептор, который отличается от галактозильного донора, причем указанный галактозильный акцептор является сахаридом или сахароспиртом, и

где молярное соотношение между галактозильным акцептором и галактозильным донором составляет по меньшей мере 1:10 и где смесь содержит по меньшей мере 0,05 моль/л галактозильного акцептора;

b) обеспечение присутствия первого фермента, причем указанный первый фермент обладает β-галактозидазной активностью, при этом указанный первый фермент контактирует со смесью; и

c) инкубирование смеси и первого фермента, тем самым позволяя первому ферменту высвободить отщепляемую группу галактозильного донора и перенести галактозильную группу галактозильного донора к галактозильному акцептору, таким образом образуя галактоолигосахарид, при этом этап с) дополнительно включает удаление из инкубационной смеси отщепляемой группы, высвобожденной из галак- 3 028927

тозильного донора, и где удаление отщепляемой группы, высвобожденной из галактозильного донора, включает физическое удаление свободных отщепляемых групп из инкубационной смеси и/или превращение свободных отщепляемых групп в одно или несколько других химических соединений, которые все еще могут присутствовать в инкубационной смеси, с получением в результате композиции, содержащей один или несколько галактоолигосахаридов.

В контексте настоящего изобретения выражение "гликозильная группа" относится к группе, полученной путем удаления одной или двух гидроксильных групп из моносахарида или низшего олигосахарида, такого как ди- или трисахарида, или из соответствующих сахароспиртов. Данное выражение применяют в данном документе для описания различных структурных элементов галактозильных доноров, галактозильных акцепторов и олигосахаридов.

Сокращения наиболее распространенных сахаридов и их соответствующих гликозильных групп приведены ниже.

Сахарид	Сокращение	Название гликозильной группы
Глюкоза	О1с	глюкозил
Галактоза	Оа1	галактозил
фукоза	Рис	фукозил
манноза	Мал	маннозил
ксилоза	Ху1	ксилозил
N-ацетилгалактозамин	ОаШАс	N -ацетилгалактозаминил
Лактоза	Ьас	лактозил

В контексте настоящего изобретения выражение "олигосахарид" относится к молекуле, содержащей по меньшей мере две гликозильные группы, предпочтительно по меньшей мере три, которые могут являться различными или того же типа. По меньшей мере две гликозильные группы предпочтительно связаны посредством О-гликозильной связи. Олигосахарид может быть линейной цепью гликозильных групп или он может обладать разветвленной структурой. Олигосахариды могут, например, быть представлены стехиометрической формулой, например (Оа1)₃О1с, или общими формулами, например Оа1-Оа1-Оа1-О1с, Са1-Са1-С1с-Са1 или Оа1-(Оа1-)О1с-Оа1. Стехиометрические формулы предоставляют информацию о том, какие гликозильные группы содержит олигосахарид или группы олигосахаридов, но не об их взаимном расположении, тогда как общие формулы также содержат общую информацию о взаимном расположении гликозильных групп.

В контексте настоящего изобретения выражение "гомоолигосахариды" относится к олигосахаридам, содержащим только один тип гликозильной группы. Примерами гомоолигосахаридов являются

Са1-Са1-Са1-Са1 и С1с-С1с-С1с.

В контексте настоящего изобретения выражение "гетероолигосахариды" относится к олигосахаридам, которые содержат различные гликозильные группы, например Оа1-Оа1-О1с или Оа1-Оа1-Рис.

В контексте настоящего изобретения приставка "галакто-", применяемая вместе с выражением "олигосахарид", означает, что олигосахарид содержит галактозильные группы в качестве повторяющегося звена. Приставку "гомо-" или "гетеро-" могут применять вместе с приставкой "галакто-". Как Са1-Са1-С1с, так и Са1-Са1-Са1-Са1 являются галактоолигосахаридами. Оа1-Оа1-О1с является гетерогалактоолигосахаридом, а Оа1-Оа1-Оа1-Оа1 является гомогалактоолигосахаридом.

В контексте настоящего изобретения "X" представляет галактозильный акцептор, как определено в данном документе. "-Х" представляет гликозильную группу, соответствующую галактозильному акцептору, в частности гликозильную группу, связанную с другой группой. "-" обозначает связь. Гликозильная группа предпочтительно связана через 3-, 4-, 5- или 6-положение гликозильной группы и предпочтительно посредством О-гликозильной связи. В контексте настоящего изобретения "Оа1-" представляет галактозильную группу, связанную с другой группой предпочтительно через 1-положение галактозильной группы и предпочтительно посредством О-гликозильной связи.

В контексте настоящего изобретения "-Оа1-" представляет галактозильную группу, связанную с двумя другими группами. Левая связь предпочтительно осуществляется через 4- или 6-положение галактозильной группы и предпочтительно посредством О-гликозильной связи. Правая связь предпочтительно осуществляется через 1-положение галактозильной группы и предпочтительно посредством О-гликозильной связи.

Связи между двумя галактозильными группами являются обычно 1-4 или 1-6 связями и, как правило, О-гликозильными связями. Связь между галактозильной группой и азотсодержащим акцептором альтернативно может быть Ν-гликозильной связью.

Способ по настоящему изобретению предпочтительно является способом получения композиции, содержащей один или несколько галактоолигосахаридов, с использованием галактозильного донора и галактозильного акцептора, причем один или несколько галактоолигосахаридов содержат галактозиль- 4 028927

ный акцептор в качестве восстанавливающего конца.

В контексте настоящего изобретения выражение "способ" и "процесс" применяют взаимозаменяемо.

Этап а) включает приготовление смеси, в которой будут получены олигосахариды.

Смесь предпочтительно является жидкой смесью и может, например, являться водным раствором, содержащим галактозильный акцептор и галактозильный донор.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молярное соотношение между галактозильным акцептором и галактозильным донором в смеси на этапе а) составляет по меньшей мере 1:5, предпочтительно по меньшей мере 1:1 и еще более предпочтительно по меньшей мере 5:1. Например, молярное соотношение между галактозильным акцептором и галактозильным донором в смеси на этапе а) может составлять по меньшей мере 10:1, например по меньшей мере 15:1.

Молярное соотношение между галактозильным акцептором и галактозильным донором в смеси на этапе а) может, например, составлять 1:10-100:1.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молярное соотношение между галактозильным акцептором и галактозильным донором в смеси на этапе а) составляет 1:10-50:1, предпочтительно 1:5-30:1 и еще более предпочтительно 1:1-20:1. Например, молярное соотношение между галактозильным акцептором и галактозильным донором в смеси на этапе а) может, например, составлять 2:1-40:1, предпочтительно 4:1-30:1 и еще более предпочтительно 10:1-25:1.

Как уже упоминалось, галактозильные доноры содержат галактозильную группу, ковалентно связанную с отщепляемой группой. Галактозильная группа является предпочтительно β-0-галактопиранозильной группой. К тому же, галактозильная группа предпочтительно связана с отщепляемой группой посредством О-гликозидной связи в 1-положении галактозильной группы.

Отщепляемая группа галактозильного донора может быть, например, гликозильной группой и/или группой сахароспирта. Особенно предпочтительно, чтобы отщепляемая группа галактозильного донора являлась глюкозильной группой, т.е. остатком глюкозы.

Если отщепляемая группа является гликозильной группой моно- или дисахарида или соответствующего сахароспирта, то галактозильная группа предпочтительно связана с отщепляемой группой посредством О-гликозидной связи в 1-положении галактозильной группы, причем связь находится в 4-положении отщепляемой группы моносахаридного типа или в 4'-положении отщепляемой группы дисахаридного типа.

В контексте настоящего изобретения фраза "Υ и/или X" означает "Υ" или "X" или "Υ и X". Следуя той же линии логики, фраза "Х₁, Х₂, ..., Х_1-! и/или Х₁" означает "Х₁", или "Х₂", или "Х_1-!", или "Х₁", или любую комбинацию компонентов: Х₁, Х₂, ..., Х_н и Х₁.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный донор обладает молярной массой не более 1000 г/моль. Например, галактозильный донор может обладать молярной массой не более 500 г/моль. Может даже являться предпочтительным, чтобы галактозильный донор обладал молярной массой не более 350 г/моль.

Дисахариды являются предпочтительным типом галактозильного донора на данный момент. Альтернативно или дополнительно трисахариды также могут применяться в качестве галактозильных доноров. Таким образом, предполагают, что смесь может содержать комбинацию различных галактозильных доноров.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный донор является лактозой. Другим примером пригодного галактозильного донора является лактулоза. Еще примером пригодного галактозильного донора является лактитол.

В контексте настоящего изобретения выражение "лактоза" относится к дисахариду β-^-галактопиранозил-(1^4)-^-глюкоза, который также упоминается как молочный сахар и который является наиболее преобладающим сахаридом коровьего молока.

Галактозильный донор можно получать из любого пригодного источника галактозильных доноров, как из промышленно очищенных источников, таких как очищенная лактоза, так и/или природных источников, таких как сывороточный пермеат, т. е. депротеинизированная сыворотка, полученная путем ультрафильтрации сыворотки.

Галактозильным акцептором может быть любая молекула, которая способна принимать галактозильную группу от первого фермента и обычно содержит гидроксильные группы и предпочтительно спиртовые гидроксильные группы. Выражение "принимать" означает, что галактозильная группа донора должна ковалентно связываться с акцептором, например, посредством О-гликозильной связи.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор содержит одну или несколько спиртовых гидроксильных групп. Например, галактозильный акцептор может быть полиолом.

В контексте настоящего изобретения выражение "полиол" относится к молекуле, содержащей по меньшей мере две спиртовые гидроксильные группы.

- 5 028927

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор не является лактозой. Кроме того, может быть предпочтительным, чтобы галактозильный акцептор не являлся глюкозой.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор отличается от галактозильного донора. Особенно предпочтительно применять относительно дешевый галактозильный донор, такой как лактоза, в качестве источника галактозильной группы и биологически интересующий акцептор, например фукозу, в качестве галактозильного акцептора.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор не является лактозой, галактозой или глюкозой.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор не является глюкозой или олигосахаридами общей формулы Оа1-(Оа1)гО1с, где ί является неотрицательным целым числом, т.е., например, 0, 1, 2, 3 или 4.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор не является галактозой или олигосахаридами общей формулы Оа1-(Оа1)₁-Оа1, где ί является неотрицательным целым числом.

Можно применять галактозильные акцепторы, обладающие различными молярными массами, но галактозильные акцепторы, обладающие молярной массой по меньшей мере 100 г/моль, являются предпочтительными на данный момент.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор обладает молярной массой не более 1000 г/моль. Например, галактозильный акцептор может обладать молярной массой не более 500 г/моль. Может даже являться предпочтительным, чтобы галактозильный акцептор обладал молярной массой не более 350 г/моль. Галактозильный акцептор может, например, обладать молярной массой не более 200 г/моль.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор является сахаридом. Галактозильный акцептор может, например, являться моносахаридом. Альтернативно, галактозильный акцептор может быть дисахаридом.

Например, галактозильный акцептор может быть пентозой. Галактозильный акцептор может, например, являться арабинозой. Другим примером пригодной пентозы является ксилоза. Еще примером пригодной пентозы является рибоза. Галактозильный акцептор может, например, являться пентозой, выбранной из группы, состоящей из арабинозы, ксилозы и рибозы.

Гексозы являются другой группой пригодных галактозильных акцепторов. Галактозильный акцептор может, например, являться маннозой. Другим примером пригодной гексозы является галактоза. Еще примером пригодной гексозы является тагатоза. Дополнительным примером пригодной гексозы является фруктоза. Галактозильный акцептор может, например, являться гексозой, выбранной из группы, состоящей из маннозы, галактозы, тагатозы и фруктозы.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор является дезоксигексозой. Галактозильный акцептор может, например, являться фукозой, такой как, например, Ό-фукоза, Ь-фукоза или их смесь.

Альтернативно, галактозильный акцептор может быть олигосахаридом, таким как, например, дисахарид или трисахарид. Примером пригодного дисахарида является мальтоза. Другим примером пригодного дисахарида является лактулоза. Еще полезной группой галактозильных акцепторов являются сахариды.

Еще пригодной группой галактозильных акцепторов являются производные сахаридов.

В контексте настоящего изобретения выражение "производное сахарида" относится к сахариду, содержащему одну или несколько негидроксильных функциональных групп. Примерами таких функциональных групп являются карбоксильная группа, аминогруппа, Ν-ацетиламиногруппа и/или тиольная группа. Сахариды, которые содержат альдегидную группу в 1-положении или кетогруппу во 2-положении, не рассматриваются как производные сахаридов как таковые, за исключением случаев, когда сахариды содержат некоторые из негидроксильных функциональных групп, упомянутых выше.

Примером пригодного производного сахарида является Ν-ацетилгалактозамин. Другим примером пригодного производного сахарида является сиаловая кислота. Еще примером пригодного производного сахарида является сиалиллактоза. Таким образом, галактозильный акцептор может быть производным сахарида, выбранным из группы, состоящей из Ν-ацетилгалактозамина, сиаловой кислоты и сиалиллактозы.

Другой группой пригодных галактозильных акцепторов являются сахароспирты. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор является сахароспиртом. Примерами пригодных сахароспиртов являются сорбитол, ксилитол, лактитол и/или мальтитол.

В противоположность вышеуказанным галактозильным акцепторам, авторы настоящего изобретения обнаружили, что Ν-ацетилглюкозамин и глюкоза являются менее эффективными галактозильными акцепторами. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения галактозильный акцептор не является глюкозой или Ν-ацетилглюкозамином.

- 6 028927

Смесь может содержать один или несколько дополнительных галактозильных акцепторов, отличных от первого типа галактозильного акцептора. Различные типы галактозильных акцепторов смеси можно, например, выбирать среди типов галактозильных акцепторов, упомянутых в данном документе.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения полученные галактозилированные акцепторы действуют как новый тип галактозильного акцептора и также могут быть галактозилированы. Таким образом, можно получать галактоолигосахариды со стехиометрической формулой Са1₁₊1Х, где ί является неотрицательным целым числом. Как правило, наиболее преобладающими видами являются Са1Х, Оа1₂Х и Оа1₃Х.

В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения полученные галактозилированные акцепторы действуют как новый тип галактозильного акцептора и также могут быть галактозилированы. Таким образом, можно получать галактоолигосахариды с общей формулой Оа1-(Оа1)гХ, где ί является неотрицательным целым числом. Как правило, наиболее преобладающими видами являются Са1-Х, Са1-Са1-Х и Са1-Са1-Са1-Х.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения смесь этапа а) содержит галактозильный донор в концентрации не более 0,7 моль/л, предпочтительно не более 0,4 моль/л и даже более предпочтительно не более 0,2 моль/л. Смесь может, например, содержать галактозильный донор в концентрации 0,001-0,7 моль/л, предпочтительно 0,01-0,5 моль/л и даже более предпочтительно 0,02-0,2 моль/л.

Альтернативно, смесь этапа а) может содержать галактозильный донор в концентрации не более 0,3 моль/л, предпочтительно не более 0,1 моль/л и даже более предпочтительно не более 0,05 моль/л. Смесь может, например, содержать галактозильный донор в концентрации 0,001-0,2 моль/л, предпочтительно 0,005-0,1 моль/л и даже более предпочтительно 0,01-0,05 моль/л.

Следует отметить, что галактозилированный галактозильный акцептор и галактозилированный галактозильный донор могут в определенных пределах действовать как галактозильный донор, но галактозилированный галактозильный акцептор и галактозилированный галактозильный донор не считаются галактозильным донором в контексте настоящего изобретения и не вносят вклад в концентрации или соотношения галактозильного донора, упомянутого в данном документе.

Галактозильный акцептор можно применять в диапазоне разностных концентраций. Однако предпочтительно избегать насыщения смеси галактозильным акцептором, так как избыток галактозильного акцептора, как правило, следует удалять из композиции по настоящему изобретению, содержащей галактоолигосахарид.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения смесь этапа а) содержит галактозильный акцептор в количестве по меньшей мере 0,05 моль/л, предпочтительно по меньшей мере 0,10 моль/л и даже более предпочтительно по меньшей мере 0,30 моль/л. Даже более высокие концентрации галактозильного акцептора могут являться предпочтительными, таким образом, смесь этапа а) может, например, содержать галактозильный акцептор в количестве по меньшей мере 0,5 моль/л, предпочтительно по меньшей мере 0,7 моль/л и даже более предпочтительно по меньшей мере 1 моль/л.

Смесь может, например, содержать галактозильный акцептор в концентрации 0,05-5 моль/л, предпочтительно 0,1-2 моль/л и даже более предпочтительно 0,3-1 моль/л.

Однако в некоторых вариантах осуществления предпочтительной является относительно низкая концентрация галактозильного акцептора, и в этом случае смесь может, например, содержать галактозильный акцептор в концентрации не более 2 моль/л, предпочтительно не более 0,5 моль/л и даже более предпочтительно не более 0,2 моль/л. Например, смесь может содержать галактозильный акцептор в концентрации 0,05-2 моль/л, предпочтительно 0,06-1 моль/л и даже более предпочтительно 0,08-0,8 моль/л.

В дополнение к галактозильному акцептору и галактозильному донору, смесь может также содержать различные добавки для оптимизации условий ферментативной реакции.

Смесь может содержать, например, один или несколько рН буферов для доведения рН смеси до оптимального уровня рН первого фермента. Альтернативно или в дополнение, смесь может содержать водорастворимые соли, содержащие один или более ионов металлов. В зависимости от конкретного первого фермента, например, можно применять, ионы металлов, такие как Са²'. Ζη²' или Мд²'. Однако следует отметить, что некоторые первые ферменты являются нечувствительными к присутствию ионов металлов в смеси.

Обычные способы синтеза олигосахаридов часто используют средства, снижающие активность воды, такие как, например, глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль (РЕО). Настоящее изобретение успешно дает возможность выполнять эффективный синтез галактоолигосахаридов без применения таких средств, снижающих активность воды. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения смесь содержит средство, снижающее активность воды, в количестве не более 5 вес.% относительно веса смеси, предпочтительно не более 1 вес.% и даже более предпочтительно не более 0,1 вес.%. Например, смесь может содержать средство, снижающее активность воды, в количестве не более 0,05 вес.% относительно веса смеси.

- 7 028927

Смесь этапа а) или ингредиенты, образующие смесь, можно подвергать термообработке перед реакцией с первым ферментом для предотвращения микробного роста в течение реакции. Можно применять обычные способы термообработки, такие как пастеризация (например, 72°С в течение 15 с), высокая пастеризация (например, 90°С в течение 15 с) или ИНТ-обработка (например, 140°С в течение 4 с). Следует проявлять осторожность при термообработке термолабильных ферментов.

Этап Ь) включает обеспечение присутствия первого фермента, который предпочтительно обладает β-галактозидазной активностью. Предпочтительно первый фермент обладает трансгалактозилирующей активностью в дополнение к β-галактозидазной активности. Также может быть предпочтительным, чтобы первый фермент обладал Т-значением не более 0,9. Следует отметить, что способ может к тому же включать применение дополнительных ферментов, например, ферментов, обладающих иной ферментативной активностью, отличной от β-галактозидазной активности или трансгалактозилирующей активности.

В контексте настоящего изобретения выражение "β-галактозидазная активность" относится к ферментативному катализу гидролиза концевых невосстанавливающих остатков β-Ό-галактозы в β-Ό-галактозидах, таких как лактоза. Первый фермент, применяемый в настоящем изобретении, предпочтительно относится к классу ЕС 3.2.1.23.

Предпочтительно, чтобы первый фермент обладал Т-значением не более 0,9. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Т-значение первого фермента составляет не более 0,8, предпочтительно не более 0,7 и еще более предпочтительно не более 0,6. Например, Т-значение первого фермента может составлять не более 0,5. Предпочтительно Т-значение первого фермента может составлять не более 0,4. Может являться даже более предпочтительным, чтобы Т-значение первого фермента составляло не более 0,3.

Еще более низкие Т-значения могут являться предпочтительными, например не более 0,2.

Пригодный первый фермент можно, например, получать из пептида (β-галактозидазы), полученного, как описано в примерах 1 и 2.

Другие примеры пригодных первых ферментов, обладающих трансгалактозилирующей активностью, можно найти в \УО 2011/120993 А1.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый фермент может содержать одну или несколько гликозилированных аминокислот. Альтернативно или в дополнение, первый фермент может содержать одну или несколько фосфорилированных аминокислот. Альтернативно, ни одна из аминокислот первого фермента не является гликозилированной или фосфорилированной.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения первый фермент содержит по меньшей мере две субъединицы, причем каждая субъединица состоит из первого фермента, определенного выше.

Первый фермент предпочтительно контактирует со смесью, и в связи с этим его приводят в контакт как с галактозильным акцептором, так и с галактозильным донором.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения смесь содержит первый фермент и/или второй фермент. Первый фермент и/или второй фермент могут, например, присутствовать в смеси в растворенной форме, например в виде отдельных молекул фермента или в виде растворимого агрегата молекул фермента.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения первый фермент и/или второй фермент находятся отдельно от смеси, но их приводят в контакт с галактозильным акцептором и галактозильным донором путем контактирования первого фермента и/или второго фермента со смесью. Например, можно применять первый фермент и/или второй фермент, иммобилизованные на неподвижной твердой фазе. Примерами применимых неподвижных твердых фаз являются, например, фильтр, плотный слой частиц, содержащих первый фермент или подобные структуры.

Альтернативно, твердая фаза может, например, являться сыпучей, состоящей из частиц твердой фазой, например органическими или неорганическими гранулами, образующими часть смеси.

Детали, относящиеся к промышленному применению ферментов, включая способы иммобилизации и пригодные типы твердых фаз, можно найти в Βιιείιΐιοίζ (2005).

Первый фермент предпочтительно применяют в достаточной активности с получением приемлемого выхода галактоолигосахаридов. Оптимальная активность зависит от конкретного осуществления способа и может легко определяться специалистом в данной области.

Если требуется высокий оборот галактозильного донора и высокий выход галактоолигосахаридов, может быть предпочтительным применение первого фермента в относительно высокой активности. Например, активность первого фермента может быть таковой, что оборот галактозильного донора составляет по меньшей мере 0,02 моль/(л-ч), предпочтительно по меньшей мере 0,2 моль/(л-ч) и даже более предпочтительно по меньшей мере 2 моль/(л-ч).

Ферментативная реакция происходит в течение инкубации на этапе с). Как только смесь подвергается воздействию соответствующих условий, что может происходить практически немедленно при осуществлении контакта галактозильного акцептора и галактозильного донора с первым ферментом, обычно

- 8 028927

начинается трансгалактозилирование, а в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения этапы Ь) и с) происходят одновременно.

Первый фермент способен высвобождать отщепляемую группу галактозильного донора и переносить галактозильную группу галактозильного донора к галактозильному акцептору. Например, если галактозильным донором является лактоза, высвобождается глюкоза и галактозильная группа переносится к акцептору. Первый фермент действует в качестве катализатора в течение ферментативной реакции.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения первый фермент к тому же переносит галактозильную группу к уже галактозилированным галактозильным акцепторам, тем самым образуя галактозильные акцепторы, содержащие две, три или даже более галактозильные группы.

Значение рН инкубационной смеси предпочтительно близко к оптимальному рН первого фермента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рН инкубационной смеси в течение этапа с) составляет 3-9. Например, рН инкубационной смеси в течение этапа с) может составлять 4-8, например 5-7,5.

Подобно рН, температуру инкубационной смеси предпочтительно доводят до оптимальной температуры используемого первого фермента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения температура инкубации смеси этапа с) составляет 10-80°С. Температура инкубационной смеси может, например, составлять 20-70°С, предпочтительно 25-60°С и даже более предпочтительно 30-50°С.

В контексте настоящего изобретения выражение "оптимальный рН первого фермента" относится к рН, при котором первый фермент обладает наивысшей трансгалактозилирующей активностью. Аналогичным образом, выражение "оптимальная температура первого фермента" относится к температуре, при которой первый фермент обладает наивысшей трансгалактозилирующей активностью.

Этап с) может дополнительно включать перемешивание инкубационной смеси.

Удаление свободных отщепляемых групп происходит в течение инкубации на этапе с). Удаление может, например, начинаться немедленно в момент начала этапа с) или его можно отложить до начала накопления значительного количества свободных отщепляемых групп в инкубационной смеси.

Свободные отщепляемые группы можно, например, удалять из инкубационной смеси с помощью микроорганизмов, присутствующих в инкубационной смеси.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает получение микроорганизма, который способен превращать свободные отщепляемые группы, высвобожденные из галактозильного донора, и предоставление возможности указанному микроорганизму удалить в течение инкубации отщепляемую группу, высвобожденную из галактозильного донора.

Пригодные микроорганизмы предпочтительно способны избирательно удалять свободные отщепляемые группы из инкубационной смеси и, например, метаболизировать или превращать их в продукты превращения, которые в меньшей степени препятствуют синтезу галактоолигосахаридов, чем отщепляемая группа.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы по меньшей мере в 10 раз выше, чем скорость удаления им галактозильного акцептора.

Например, скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы, может быть по меньшей мере в 10² раз выше, чем скорость удаления им галактозильного акцептора, предпочтительно по меньшей мере в 10³ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁴ раз выше, чем скорость удаления им галактозильного акцептора. Скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы может, например, быть по меньшей мере в 10⁵ раз выше, чем скорость удаления им галактозильного акцептора. Может даже быть предпочтительным, чтобы скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы была по меньшей мере в 10⁶ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁷ раз выше, чем скорость удаления им галактозильного акцептора.

В контексте настоящего изобретения выражение "скорость удаления" относится к числу молей свободной отщепляемой группы, донора, акцептора или моногалактозилированного акцептора, которое микроорганизм способен удалить из инкубационной смеси за 1 мин.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы по меньшей мере в 10 раз выше, чем скорость удаления им галактозильного донора.

Например, скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы может быть по меньшей мере в 10² раз выше, чем скорость удаления им галактозильного донора, предпочтительно по меньшей мере в 10³ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁴ раз выше, чем скорость удаления им галактозильного донора. Скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы может, например, быть по меньшей мере в 10⁵ раз выше, чем скорость удаления им галактозильного донора. Может даже быть предпочтительным, чтобы скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы была по меньшей мере в 10⁶ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁷ раз выше, чем скорость удаления им галактозильного донора.

- 9 028927

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы по меньшей мере в 10 раз выше, чем скорость удаления им моногалактозилированного галактозильного акцептора.

Например, скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы может быть по меньшей мере в 10² раз выше, чем скорость удаления им моногалактозилированного галактозильного акцептора, предпочтительно по меньшей мере в 10³ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁴ раз выше, чем скорость удаления им моногалактозилированного галактозильного акцептора. Скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы может, например, быть по меньшей мере в 10⁵ раз выше, чем скорость удаления им моногалактозилированного галактозильного акцептора. Может даже быть предпочтительным, чтобы скорость удаления микроорганизмом свободной отщепляемой группы была по меньшей мере в 10⁶ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁷ раз выше, чем скорость удаления им моногалактозилированного галактозильного акцептора.

Микроорганизм предпочтительно является дрожжами или бактерией.

8ассЬаготусе8 ссгсуыас является примером пригодных дрожжей, а пригодными бактериями могут являться, например, Бас Ζ-отрицательные штаммы Е.соП или другие бактерии, которые могут метаболизировать глюкозу, но не лактозу.

Альтернативно или дополнительно, свободные отщепляемые группы можно удалять из инкубационной смеси с помощью специфических ферментов, которые превращают отщепляемые группы в другие химические соединения.

Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает обеспечение присутствия второго фермента, который способен превращать свободные отщепляемые группы, высвобожденные из галактозильного донора, и предоставление возможности указанному второму ферменту в течение инкубации превращать отщепляемую группу, высвобожденную из галактозильного донора.

Выражение "превращение свободных отщепляемых групп" относится к способу превращения свободных отщепляемых групп в химические соединения, которые предпочтительно являются более слабыми галактозильными акцепторами, чем сами свободные отщепляемые группы. Превращение может включать деградацию свободной отщепляемой группы на несколько более мелких химических соединений или может просто включать трансформацию свободной отщепляемой группы в различные химические соединения.

Настоящее изобретение может, например, относиться к способу получения композиции, содержащей один или несколько галактоолигосахаридов, причем способ включает этапы:

a) получение смеси, содержащей

галактозильный донор, содержащий галактозильную группу, связанную с отщепляемой группой, причем галактозильный донор обладает молярной массой не более 350 г/моль,

галактозильный акцептор, который отличается от галактозильного донора, причем указанный галактозильный акцептор является сахаридом или сахароспиртом, и

где молярное соотношение между галактозильным акцептором и галактозильным донором составляет по меньшей мере 1:10 и где смесь содержит по меньшей мере 0,05 моль/л галактозильного акцептора;

b) обеспечение присутствия первого фермента и второго фермента, причем указанный первый фермент обладает β-галактозидазной активностью и Т-значением не более 0,9, при этом указанный второй фермент способен превращать свободные отщепляемые группы, высвобожденные из галактозильного донора, и указанные первый и второй ферменты контактируют со смесью; и

c) предоставление возможности первому ферменту высвободить отщепляемую группу галактозильного донора и перенести галактозильную группу галактозильного донора к галактозильному акцептору, таким образом образуя галактоолигосахарид, и предоставление возможности второму ферменту превращать отщепляемую группу, высвобожденную из галактозильного донора, с получением в результате композиции, содержащей галактоолигосахарид.

Второй фермент может, например, обладать гексозооксидазной активностью, т. е. принадлежать к классу ферментов ЕС 1.1.3.5, и обладать способностью катализировать окисление бета-Э-глюкозы с помощью О₂ с образованием И-глюконо-1,5-лактона и перекиси водорода.

Даже более предпочтительно, чтобы второй фермент обладал глюкозооксидазной активностью, т.е. принадлежал к классу ферментов ЕС 1.1.3.4, и обладал способностью катализировать окисление бета-Эглюкозы с помощью О² с образованием И-глюконо-1,5-лактона и перекиси водорода без существенного окисления содержащих глюкозу дисахаридов, таких как лактоза.

В водной кислой среде И-глюконо-1,5-лактон, как правило, гидролизуется с образованием глюконовой кислоты.

Альтернативно, второй фермент может обладать гексокиназной активностью (ЕС 2.7.1.1) или глюкокиназной активностью (ЕС 2.7.1.2).

Другие пригодные вторые ферменты можно найти, например, в справочниках, которые доступны специалисту в данной области.

- 10 028927

Предпочтительно, чтобы второй фермент являлся избирательным в превращении свободных отщепляемых групп и только в определенных пределах, а предпочтительно, чтобы вообще не превращал галактозильный донор, галактозильный акцептор и/или галактоолигосахариды.

Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе по меньшей мере в 10 раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору.

Например, константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть по меньшей мере в 10² раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору, предпочтительно по меньшей мере в 10³ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁴ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору. Константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть, например, по меньшей мере в 10⁵ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору. Может даже быть предпочтительным, чтобы константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе была по меньшей мере в 10⁶ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁷ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору.

Выражение "константа специфичности" определяется как к_са1/К_т и включает константы скорости для всех этапов в реакции. Поскольку константа специфичности отражает как аффинность, так и каталитическую способность, она применима для сравнения различных ферментов друг с другом или одного и того же фермента с различными субстратами. Теоретический максимум для константы специфичности называется пределом диффузии и составляет приблизительно от 10⁸ до 10⁹ (М^-1-с^-1). В данный момент каждое столкновение фермента с его субстратом приведет к катализу, а скорость образования продукта ограничивается не скоростью реакции, а скоростью диффузии.

к_с,„ и К_т второго фермента определяются при 37°С с использованием 50 мМ буфера Ыа₃РО₄, доведенного до рН 6,5. Буфер дополнительно содержит соли и кофакторы, которые требуются для достижения оптимальных свойств фермента. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе по меньшей мере в 10 раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору.

Например, константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть по меньшей мере в 10² раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору, предпочтительно по меньшей мере 10³ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁴ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору. Константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть, например, по меньшей мере в 10⁵ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору. Может даже быть предпочтительным, чтобы константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе была по меньшей мере в 10⁶ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁷ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе по меньшей мере в 10 раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору (Оа1-Х).

Например, константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть по меньшей мере в 10² раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору, предпочтительно по меньшей мере в 10³ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁴ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору. Константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть, например, по меньшей мере в 10⁵ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору. Может даже быть предпочтительным, чтобы константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе была по меньшей мере в 10⁶ раз выше и даже более предпочтительно по меньшей мере в 10⁷ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе является

по меньшей мере в 10 раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору;

по меньшей мере в 10 раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору; и

по меньшей мере в 10 раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору.

- 11 028927

Например, константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть

по меньшей мере в 10² раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору;

по меньшей мере в 10² раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору; и

по меньшей мере в 10² раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору.

Предпочтительно константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе

по меньшей мере в 10³ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору;

по меньшей мере в 10³ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору; и

по меньшей мере, в 10³ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору.

Альтернативно, константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть

по меньшей мере в 10⁴ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору;

по меньшей мере в 10⁴ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору; и

по меньшей мере в 10⁴ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору.

Константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть

по меньшей мере в 10⁵ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору;

по меньшей мере в 10⁵ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору; и

по меньшей мере в 10⁵ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору.

Даже более предпочтительно, чтобы константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе была

по меньшей мере в 10⁶ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору;

по меньшей мере в 10⁶ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору; и

по меньшей мере в 10⁶ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору.

Константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе может быть, например,

по меньшей мере в 10⁷ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору;

по меньшей мере в 10⁷ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору; и

по меньшей мере в 10⁷ раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору.

Особенно предпочтительно, чтобы второй фермент обладал глюкозооксидазной активностью, а отщепляемая группа галактозильного донора являлась глюкозильной группой, в таком случае свободной отщепляемой группой является глюкоза. Если второй фермент обладает глюкозооксидазной активностью, лактоза является предпочтительным галактозильным донором.

Глюкозооксидаза требует О₂ в качестве окислителя, и может потребоваться добавить дополнительный О₂ (г) к инкубационной смеси, если нормальное количество растворенного О₂ в воде является недостаточным. Также возможно добавлять кофакторы, такие как ΡΆΌ (флавинадениндинуклеотид) или ΝΆΌ (никотинамидадениндинуклеотид), к инкубационной смеси, при необходимости.

Как упоминалось выше, Н2О2 образуется, когда глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы в О-глюконо-1,5-лактон, и высокие уровни Н₂О₂ могут являться проблематичными для способа, например, в связи с нежелательным окислением используемых ферментов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает этап, на котором обеспечивают присутствие пероксидазы или каталазы, которая контактирует с инкубационной смесью и которая катализирует распад Н2О2, например, на Н2О и О2. Как глюкозооксидазы, так и каталазы хорошо известны в данной

- 12 028927

области и коммерчески доступны. Примером пригодной глюкозооксидазы является С1у/уте ВС (Νονοζνπκδ. Дания). Примером пригодного фермента каталазы является Са1а/уте 25Ь (Νονοζνιηοδ. Дания). Другим примером является фермент каталаза из Мюгососсик 1у8обе1кйси8 (Зщта-АИпск Дания).

Способ может дополнительно включать приведение в контакт инкубационной смеси с лактоназой и предпочтительно с глюконолактоназой (ЕС 3.1.1.17), т.е. ферментом, способным гидролизовать П-глюконо-1,5-лактон в глюконовую кислоту или ее соответствующий основной глюконат.

Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения инкубационную смесь приводят в контакт с ферментом, обладающим глюкозооксидазной активностью, ферментом, обладающим глюкозооксидазной активностью, каталазной активностью, и ферментом, обладающим глюконолактоназной активностью.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает обеспечение присутствия средства для удаления, способного удалять, по меньшей мере, некоторые из продуктов превращения, полученных путем превращения отщепляемой группы с помощью второго фермента, и предоставление возможности средству для удаления во время инкубации удалять, по меньшей мере, некоторые из продуктов превращения.

В контексте настоящего изобретения выражение "средство для удаления" относится к состоящему из частиц или молекулярному средству, способному захватывать продукт превращения и удалять его из инкубационной смеси, например, путем осаждения.

Средство для удаления может, например, содержать соль иона двухвалентного или трехвалентного металла или даже состоять из них. Примерами пригодных ионов металлов являются Са²+, Ре²⁺, А1³+ или Ζη²+.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения средство для удаления содержит СаСО₃ или даже состоит из него.

Отрицательно заряженные продукты превращения, такие как, например, глюконат, депротонированная форма глюконовой кислоты, можно удалить с помощью анионообменной хроматографии.

Таким образом, средство для удаления может содержать анионообменный материал или даже состоять из него.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анионообменный материал содержит твердую фазу и одну или несколько катионных групп.

Предпочтительно, по меньшей мере, некоторые из катионных групп присоединены к наружной поверхности твердой фазы и/или к поверхности пор, которые доступны через поверхность твердой фазы.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения твердая фаза анионообменного материала содержит один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из множества частиц, фильтра и мембраны.

Твердая фаза может, например, содержать полисахариды или даже состоять из них. Поперечно сшитые полисахариды являются особенно предпочтительными. Примерами пригодных полисахаридов являются целлюлоза, агароза и/или декстран. Альтернативно, твердая фаза может содержать неуглеводный полимер или даже состоять из него. Примерами пригодных неуглеводных полимеров являются метакрилат, полистирол и/или стирол-дивинилбензол.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения катионные группы содержат аминогруппы или даже состоят из них. Третичные аминогруппы являются особенно предпочтительными и приводят к образованию четвертичных аммониевых групп при соответствующих условиях рН. Четвертичные аммониевые группы обеспечивают сильные анионообменные характеристики анионообменному материалу.

Альтернативно или дополнительно, катионные группы могут содержать одну или несколько первичных или вторичных аминогрупп. Значительное количество первичных или вторичных аминогрупп обычно обеспечивает анионообменный материал слабыми анионообменными характеристиками.

Более подробную информацию относительно анионообменной хроматографии и ее промышленной реализации можно найти в §сорек.

Если для захвата продукта превращения применяют анионообменный материал, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять, например, по меньшей мере 30% (моль/моль) относительно общего количества продукта превращения, полученного в течение инкубации. Например, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять по меньшей мере 50% (моль/моль) относительно общего количества продукта превращения, полученного в течение инкубации. Альтернативно, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять по меньшей мере 80% (моль/моль) относительно общего количества продукта превращения, полученного в течение инкубации.

При использовании средство для удаления предпочтительно присутствует в количестве, достаточном для осаждения или захвата теоретического количества превращенной отщепляемой группы, образованной в процессе синтеза.

Таким образом, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять, например, по меньшей мере 100% (моль/моль) относительно общего количества продукта превращения,

- 13 028927

полученного в течение инкубации. Например, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять, по меньшей мере 150% (моль/моль) относительно общего количества продукта превращения, полученного в течение инкубации. Альтернативно, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять, по меньшей мере 200% (моль/моль) относительно общего количества продукта превращения, полученного в течение инкубации.

Общее количество продукта превращения, полученного в течение инкубации, можно оценить, например, исходя из планируемых условий процесса и кинетических данных, относящихся к применяемому ферменту(ам).

Альтернативно, ожидаемое количество высвобожденных отщепляемых групп можно использовать в качестве руководства для дозирования анионообменного материала. Таким образом, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять, например, по меньшей мере 30% (моль/моль) относительно общего количества отщепляемых групп, высвобожденных в течение инкубации. Например, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять по меньшей мере 50% (моль/моль) относительно общего количества отщепляемых групп, высвобожденных в течение инкубации. Альтернативно, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять по меньшей мере 80% (моль/моль) относительно общего количества отщепляемых групп, высвобожденных в течение инкубации.

Общая связывающая способность анионообменного материала может составлять, например, по меньшей мере 100% (моль/моль) относительно общего количества отщепляемых групп, высвобожденных в течение инкубации. Например, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять по меньшей мере 150% (моль/моль) относительно общего количества отщепляемых групп, высвобожденных в течение инкубации. Альтернативно, общая связывающая способность анионообменного материала может составлять по меньшей мере 200% (моль/моль) относительно общего количества отщепляемых групп, высвобожденных в течение инкубации.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что способ по настоящему изобретению, к удивлению, предусматривает высокий выход галактоолигосахаридов даже в том случае, если применяется относительно низкая концентрация галактозильного донора. Относительно низкая концентрация галактозильного донора дополнительно снижает степень самогалактозилирования донора, т.е. когда галактозильная группа первого галактозильного донора переносится ко второму галактозильному донору вместо галактозильного акцептора.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения этап с) включает добавление дополнительного галактозильного донора к смеси. Данное является особенно предпочтительным при применении относительно низкой концентрации галактозильного донора. Добавление еще одного галактозильного донора позволяет избежать истощения галактозильного донора в смеси, и концентрацию галактозильного донора можно контролировать в течение ферментативной реакции.

Добавление дополнительного галактозильного донора может включать дискретное добавление(я) галактозильного донора, например, по меньшей мере один раз в течение ферментативной реакции. Альтернативно или дополнительно, добавление дополнительного галактозильного донора может быть непрерывным добавлением в течение ферментативной реакции. Дополнительный галактозильный донор относится, предпочтительно, к тому же типу, что и применяемый на этапе а).

Этап с) может, например, включать измерение концентрации галактозильного донора в течение инкубации и добавление дополнительного галактозильного донора, если концентрация является слишком низкой.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения концентрацию галактозильного донора смеси в течение этапа с) поддерживают при концентрации в диапазоне 0,01-1 моль/л, предпочтительно в диапазоне 0,01-0,5 моль/л и предпочтительно в диапазоне 0,03-0,3 моль/л.

Например, концентрация галактозильного донора смеси в течение этапа с) может поддерживаться при концентрации в диапазоне 0,02-0,1 моль/л.

Этап с) может к тому же включать добавление дополнительного галактозильного акцептора. Данное дает возможность контролировать концентрацию галактозильного акцептора смеси в течение этапа с) и, например, удерживать концентрацию галактозильного акцептора, по существу, постоянной, при необходимости.

Для получения значительных количеств галактоолигосахаридов, которые содержат две или три перенесенные галактозильные группы, в способе следует использовать больше галактозильного донора, чем галактозильного акцептора. При этом больше галактозильных акцепторов станут галактозилированными два или три раза. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения молярное соотношение между использованным галактозильным донором и использованным галактозильным акцептором составляет по меньшей мере 1:1 и предпочтительно по меньшей мере 5:1 и даже более предпочтительно по меньшей мере 10:1.

Этап с), как правило, завершают путем инактивации ферментов, например, путем денатурации первого фермента с помощью термообработки или путем прерывания контакта между первым ферментом и

- 14 028927

углеводами инкубированной смеси. Если первый фермент является ферментом, иммобилизованным на твердой фазе, контакт можно прервать, например, путем разделения твердой фазы и инкубированной смеси. Если первый фермент растворен в смеси, первый фермент можно отделить от инкубированной смеси путем ультрафильтрации с использованием фильтра, который задерживает первый фермент, но обеспечивает прохождение олигосахаридов.

Зачастую требуется обогатить и/или очистить галактоолигосахариды композиции и уменьшить концентрацию галактозильного акцептора, галактозильного донора и высвобожденной отщепляемой группы.

Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения способ дополнительно включает этап ά) обогащения галактоолигосахаридов композиции этапа с).

В контексте настоящего изобретения выражение "обогащение галактоолигосахаридов" относится к повышению относительного количества галактоолигосахаридов композиции на основе веса в сухом состоянии. Как правило, данное осуществляется путем удаления некоторых других твердых веществ композиции, например, низших сахаридов и, необязательно, также первого фермента, при необходимости.

Обогащение на этапе ά) может, например, включать хроматографическое разделение и/или нанофильтрацию. Подробная информация относительно данных способов описана в \Уа1к1га с1 а1. (2006).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения обогащение предусматривает, что по меньшей мере 50% (в весовом отношении на основе веса в сухом состоянии) молекул, обладающих молярной массой не более 200 г/моль, удаляют из композиции этапа с). Например, обогащение может предусматривать, что по меньшей мере 80% (в весовом отношении на основе веса в сухом состоянии) молекул, обладающих молярной массой не более 200 г/моль, удаляют из композиции этапа с).

В других вариантах осуществления настоящего изобретения обогащение предусматривает, что по меньшей мере 50% (в весовом отношении на основе веса в сухом состоянии) молекул, обладающих молярной массой не более 350 г/моль, удаляют из композиции этапа с). Например, обогащение может предусматривать, что по меньшей мере 80% (в весовом отношении на основе веса в сухом состоянии) молекул, обладающих молярной массой не более 350 г/моль, удаляют из композиции этапа с).

В качестве альтернативы или в дополнение к обогащению может быть предпочтительным, чтобы этап ά) включал один или несколько способов, которые увеличивают концентрацию галактоолигосахаридов в композиции. Примерами пригодных этапов концентрирования являются, например, обратный осмос, выпаривание и/или сушка распылением.

Этап ά) может дополнительно включать удаление средства для удаления и/или превращенных отщепляемых групп, связанных со средством для удаления, из композиции этапа с). Такое удаление можно осуществлять, например, путем фильтрации, седиментации или центрифугирования.

Композиция, содержащая галактоолигосахариды, полученная данным способом, может находиться, например, в форме сухого порошка или в форме сиропа.

Получение сухого порошка, как правило, требует одного или нескольких этапов процесса, таких как концентрирование, выпаривание и/или распылительная сушка. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения этап ά) дополнительно включает концентрирование, выпаривание и/или распылительную сушку композиции в жидкой форме с получением композиции в виде порошка. Особенно предпочтительной является распылительная сушка жидкой композиции из этапа ά) с получением порошкообразной композиции. Этап ά) может включать, например, этап обогащения с последующим этапом концентрирования, например нанофильтрации, обратного осмоса или выпаривания, с последующим этапом распылительной сушки. Альтернативно, этап ά) может включать этап концентрирования с последующим этапом обогащения, с последующим этапом распылительной сушки. Концентрирование галактоолигосахаридов композиции до обогащения может сделать последующий процесс обогащения экономически эффективным.

Эффективная распылительная сушка может требовать добавления одного или нескольких вспомогательных средств, например мальтодекстрина, молочного белка, казеината, концентрата сывороточного белка и/или сухого обезжиренного молока.

Настоящий способ можно, например, осуществлять в виде периодического процесса. Настоящий способ можно, альтернативно, осуществлять в виде периодического процесса с подпиткой. Настоящий способ можно, альтернативно, осуществлять в виде непрерывного процесса.

Настоящий способ может дополнительно включать рециркуляцию первого фермента и/или неиспользованного галактозильного акцептора обратно в смесь. Рециркуляция может, например, быть частью этапа ά). Например, этап ά) может включать выделение галактозильного акцептора и/или первого фермента из композиции, содержащей галактоолигосахариды, и возвращение галактозильного акцептора и/или первого фермента на этап а) или с). В случае периодического процесса или периодического процесса с подпиткой галактозильный акцептор и/или первый фермент можно возвращать в смесь следующей партии.

В случае непрерывного процесса галактозильный акцептор можно возвращать обратно в часть технологической линии, соответствующей этапу а) или этапу с). Первый фермент можно возвращать обратно в часть технологической линии, соответствующей этапу Ь) или этапу с).

- 15 028927

Следует отметить, что подробности и особенности, связанные с этапами а) и Ь), необязательно относятся к фактическому началу производственного процесса, но они должны, по меньшей мере, встречаться иногда в течение данного процесса. Однако в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения концентрация галактозильного донора поддерживается в диапазоне, описанном на этапе а), в течение всего периода этапа с).

Если способ осуществляется в виде периодического процесса или периодического процесса с подпиткой, этап а) предпочтительно относится к композиции смеси при начале синтеза. Если способ является непрерывным процессом, этап а) предпочтительно относится к композиции смеси в течение синтеза при стационарном режиме.

Может рассматриваться как необходимое, чтобы уровень галактозилированного галактозильного донора поддерживался настолько низким, насколько возможно, так как галактозилированный галактозильный донор может рассматриваться как нежелательная примесь, которую сложно отделить от галактозилированного галактозильного акцептора. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения инкубационная смесь этапа с) содержит не более 0,5 моль/л галактозилированного галактозильного донора. Инкубационная смесь этапа с) может содержать, например, не более 0,1 моль/л галактозилированного галактозильного донора. Даже более предпочтительно инкубационная смесь этапа с) содержит не более 0,01 моль/л галактозилированного галактозильного донора и предпочтительно, по существу, не содержит галактозилированного галактозильного донора.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, если донором является лактоза, общая концентрация аллолактозы и галактозилированной аллолактозы поддерживалась настолько низкой, насколько возможно, так как данные соединения также рассматриваются как нежелательные примеси, которые трудно отделить от галактозилированного галактозильного акцептора.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения инкубационная смесь этапа с) содержит общее количество аллолактозы и галактозилированной аллолактозы не более 0,5 моль/л. Инкубационная смесь этапа с) может содержать, например, общее количество аллолактозы и галактозилированной аллолактозы не более 0,1 моль/л. Даже более предпочтительно инкубационная смесь этапа с) содержит общее количество аллолактозы и галактозилированной аллолактозы не более 0,01 моль/л и предпочтительно, по существу, вообще не содержит аллолактозы и галактозилированной аллолактозы.

Еще аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей галактоолигосахариды, причем композицию можно получить способом, определенным в данном документе.

Дополнительным аспектом настоящего изобретения является композиция, содержащая галактоолигосахариды, например, вышеупомянутая композиция, причем указанная композиция, содержащая галактоолигосахариды, содержит

первый галактоолигосахарид, обладающий общей формулой Са1-Х;

второй галактоолигосахарид, обладающий стехиометрической формулой (Са1)₂Х, такой как, например, общей формулой Са1-Са1-Х,

третий галактоолигосахарид, обладающий стехиометрической формулой (Са1)₃Х, такой как, например, общей формулой Са1-Са1-Са1-Х,

где Х является гликозильной группой, которая не является лактозильной или глюкозильнной.

Композиция, содержащая галактоолигосахарид, описанная в данном документе, может быть, например, пищевым ингредиентом.

Как описано выше, "Х" или "-Х" является предпочтительно гликозильной группой одного из галактозильных акцепторов, упоминающихся в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения "Х" или "-Х" является гликозильной группой моносахарида, который не является глюкозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения "-Х" является гликозильной группой дисахарида, который не является лактозой.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения "Х" или "-Х" является фукозильной группой. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения "Х" или "-Х" является галактозильной группой.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая галактоолигосахариды, обладает молярным соотношением между общим количеством галактоолигосахаридов Са1-Х, (Са1)₂Х и (Са1)₃Х и общим количеством галактоолигосахаридов Са1-С1с, Са1₂С1с, Са1₃С1с по меньшей мере 5:95. Например, вышеупомянутое молярное соотношение может составлять по меньшей мере 1:4, предпочтительно по меньшей мере 1:1 и даже более предпочтительно по меньшей мере 2:1. Может даже являться предпочтительным, чтобы вышеупомянутое молярное соотношение составляло по меньшей мере 5:1, предпочтительно по меньшей мере 10:1 и даже более предпочтительно по меньшей мере 20:1.

В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая галактоолигосахариды, обладает молярным соотношением между общим количеством галактоолигосахаридов Са1-Х, Са1-Са1-Х, и Са1-Са1-Са1-Х и общим количеством галактоолигосахаридов Са1-С1с, Са1-Са1-С1с, Са1-Са1-Са1-С1с по меньшей мере 5:95. Например, вышеупомянутое молярное соот- 16 028927

ношение может составлять по меньшей мере 1:4, предпочтительно по меньшей мере 1:1 и даже более предпочтительно по меньшей мере 2:1. Может даже являться предпочтительным, чтобы вышеупомянутое молярное соотношение составляло по меньшей мере 5:1, предпочтительно по меньшей мере 10:1 и даже более предпочтительно по меньшей мере 20:1.

Возможно даже, что композиция, содержащая галактоолигосахариды, вообще не содержит никаких галактоолигосахаридов формулы Оа1-О1с, Оа1-Оа1-О1с и Оа1-Оа1-Оа1-О1с.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая галактоолигосахариды, обладает молярным соотношением между первым галактоолигосахаридом, вторым галактоолигосахаридом и третьим галактоолигосахаридом в диапазоне 50-99:1-45:0,5-25.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая галактоолигосахариды, обладает молярным соотношением между первым галактоолигосахаридом, вторым галактоолигосахаридом и третьим галактоолигосахаридом в диапазоне 20-45:20-45:20-45.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая галактоолигосахариды, обладает молярным соотношением между первым галактоолигосахаридом, вторым галактоолигосахаридом и третьим галактоолигосахаридом в диапазоне 0,5-25:1-45:50-98.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая галактоолигосахариды, содержит общее количество первого галактоолигосахарида, второго галактоолигосахарида и третьего галактоолигосахарида по меньшей мере 10 вес.% относительно общего веса композиции, содержащей галактоолигосахариды. Например, композиция, содержащая галактоолигосахариды, может содержать общее количество первого галактоолигосахарида, второго галактоолигосахарида и третьего галактоолигосахарида по меньшей мере 20 вес.% относительно общего веса композиции, содержащей галактоолигосахариды, предпочтительно по меньшей мере 30 вес.%, даже более предпочтительно по меньшей мере 40% относительно общего веса композиции, содержащей галактоолигосахариды.

Даже более высокие уровни первого, второго и третьего галактоолигосахаридов могут являться предпочтительными. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая галактоолигосахариды, содержит общее количество первого галактоолигосахарида, второго галактоолигосахарида и третьего галактоолигосахарида по меньшей мере 50 вес.% относительно общего веса композиции, содержащей галактоолигосахариды. Например, композиция, содержащая

галактоолигосахариды, может содержать общее количество первого галактоолигосахарида, второго галактоолигосахарида и третьего галактоолигосахарида по меньшей мере 60 вес.% относительно общего веса композиции, содержащей галактоолигосахариды, предпочтительно по меньшей мере 70 вес.%, даже более предпочтительно по меньшей мере 80% относительно общего веса композиции, содержащей галактоолигосахариды.

Еще аспект настоящего изобретения относится к пищевому продукту, который содержит композицию, содержащую галактоолигосахариды, описанную в данном документе.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пищевой продукт является функциональным пищевым продуктом, таким как детская смесь или продукт для лечебного питания.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения пищевой продукт является выпеченным продуктом, например содержащим выпеченное тесто, таким как хлеб или подобные продукты.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения пищевой продукт является молочным продуктом, например свежим молочным продуктом, таким как молоко, или кисломолочным продуктом, таким как йогурт.

Еще в дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения пищевой продукт является кормом для домашних животных.

Следует отметить, что варианты осуществления и признаки, описанные в контексте одного из аспектов настоящего изобретения, также применимы и к другим аспектам настоящего изобретения.

Настоящее изобретение далее будет описано более подробно в следующих неограничивающих примерах.

- 17 028927

Примеры

Пример 1. Получение β-галактозидазы. обладающей трансгалактозилирующей активностью.

В рабочий объем 750 мл ферментационной среды вносили 2 мл заквасочной культуры в лизогенном бульоне (среде ЬВ) со 100 мг/л ампициллина с ОЭ₆₀₀ 3,0, выращиваемой в течение 12 ч. Ферментацию проводили в среде ЕС, содержащей 2% (вес./об.) дрожжевого экстракта, 2% (вес./об.) соевого пептона, 1% (вес./об.) глюкозы и 100 мг/л ампициллина. Штамм Е.соИ, экспрессирующий ОБОЛ347 β-галактозидазу (обладающую последовательностью Уа1 (33) - 11е (1174)) получали, как описано ранее Иогдепзеп е! а1., ^О 01/90317 и патент США № 6555348 В2, примеры 1 и 2). Использовали ферментер от АррНкоп со стеклянными сосудами с выпуклым дном, с общим объемом 2 л и оборудованный двумя мешалками Кизй!оп. В течение ферментации рН поддерживали при рН 6,5 путем соответствующего добавления 2 М №ОН и 2 М Н₃РО₄ и температуру поддерживали при 37°С. Кислород подавали барботированием воздухом со скоростью 1-2 л/мин и рО₂ поддерживали при 30% путем увеличения скорости перемешивания. Рост сопровождался автономными считываниями показаний при ОЭ₆₀₀. Культуру собирали центрифугированием приблизительно через 10 ч роста при значении ОЭ₆₀₀ 29,7. 650 мл культурального супернатанта хранили при -20°С. Периплазматические белки выделяли из клеточного осадка с помощью осмотического шока путем ресуспендирования клеточного осадка в 200 мл сахарозного буфера (30 мМ трис-НС1, 40% сахарозы, 2 мМ ЕЭТА, рН 7,5) и инкубирования в течение 10 мин при комнатной температуре. После центрифугирования супернатант выливали и осадок ресуспендировали в 200 мл холодной воды. Добавляли 83 мкл насыщенного раствора МдС1₂ и супернатант, содержащий периплазматические белки, собирали с помощью этапа центрифугирования. Периплазматическую фракцию стерилизовали посредством фильтрации через фильтр 0,2 мкм МйПрак 40 и хранили при -20°С.

β-галактозидазную активность 200 мл периплазматической фракции и 650 мл культурального супернатанта определяли с использованием о-нитрофенил^-И-галактопиранозида (ОРХО) в качестве субстрата в соответствии с протоколом (I. 8ашЬгоок апй Ι).\Υ. Киззей, Мо1еси1аг С1ошп§ - А 1аЬога!огу тапиа1, 3^гй еййюп (2001), р. 17.48-17.51). Преобладание активности обнаруживали в периплазматической фракции (525 единиц, соответствующих 98%).

Пример 2. Получение второй β-галактозидазы, обладающей трансгалактозилирующей активностью.

Вторую β-галактозидазу (ОБОА917) получали в соответствии со схемой, описанной в примере 1, но на основе экспрессии аминокислотной последовательности Уа1 (33) - О1и (917).

Пример 3. Определение Т-значения фермента β-галактозидазы.

Т-значение фермента β-галактозидазы определяли в соответствии с анализом и формулой, приведенными ниже.

Анализ.

Получали 3,3 мл ферментного раствора, содержащего фермент β-галактозидазу, подлежащую тестированию, 10 мМ цитрата натрия, 1 мМ цитрата магния, 1 мМ цитрата кальция, воду МйП-Ц (МППроге, США), и обладающего рН 6,5. Ферментный раствор должен содержать фермент β-галактозидазу в количестве, достаточном для использования 33% (вес./вес.) добавленной лактозы в течение 1 ч при условиях настоящего анализа. Температура ферментного раствора должна составлять 37°С.

В момент времени Т₀ добавляли 82,5 мг моногидрата лактозы (для биохимии, Мегск, Германия), смешивали с ферментным раствором и затем смесь инкубировали при 37°С в течение 4 ч. Точно через 1 ч после Т₀ собирали 100 мкл образца, разбавляли 1:5 с использованием воды МйП-Ц и инактивировали путем нагревания до 85°С в течение 10 мин. Инактивированную смесь хранили при -20°С до определения характеристик.

Определение характеристик.

Определение количества (в моль) полученной галактозы и количества использованной лактозы (в моль) можно выполнять с использованием любого пригодного способа анализа. Например, разбавленную смесь можно анализировать с помощью НРЕС в соответствии со способом, описанным ЮсНтопй е! а1. (1982) и 8пптз е! а1. (1994). Другие пригодные способы анализа описаны в Ε1 Κπζζί (2002).

Другим примером пригодного способа анализа является 18О 5765-2:2002 (ГОЕ 79-2: 2002) "Сухое молоко, сухие смеси для мороженого и плавленый сыр - определение содержания лактозы - часть 2: ферментативный способ с использованием галактозного фрагмента лактозы" ("Иней тйк, дней 1се-т1хез апй ргосеззей сНеезе - Ое!егтта!юп оГ 1ас!озе соп!еп! - Раг! 2: Епгутайс те!Ной шПшпц (Не да1ас!озе то1е(у оГ !Не 1ас!озе").

Расчет Т-значения.

Т-значение рассчитывали в соответствии со следующей формулой, используя данные, полученные при определении характеристик разбавленной смеси из анализа:

количество полученной галактозы (моль)

Т-значение = _

количество использованной лактозы (моль)

Пример - Т-значение фермента ОЕОА347.

Вышеупомянутый анализ проводили с использованием фермента ОЕОА347 из примера 1.

- 18 028927

Разбавленную смесь, полученную из анализа, анализировали в отношении превращенной (т.е. использованной) лактозы и образованной галактозы с помощью аналитической НРБС. Использовали прибор ИРЬС от Ша1егз, оснащенный дифференциальным рефрактометром (ΚΙ-детектор) и колонкой БюКаб Лттех НРХ-87С (300x7,8 мм, 125-0055). Элюирование сахаридов проводили изократически с 0,05 г/л ацетата Са (СаЛее1а1е), скоростью потока 0,3 мл/мин и объемом вводимой пробы 20 мкл.

Полученные данные соответствующим образом откалибровали по начальным параметрам с помощью автоматизированного программного обеспечения, пики индивидуально идентифицировали и интегрировали. Количественную оценку проводили с применением внешних стандартов моногидрата лактозы (для биохимии, Мегск, Германия), моногидрата Б-(+)-глюкозы (для биохимии, Мегск Еиго1аЬ, Франция) и И-(+)-галактозы (>99%, 81§та-АШпск, Италия).

Превращение лактозы и образование галактозы в каждый момент времени Т рассчитывали из количественных данных. В момент времени Т=1 ч в собранных 100 мкл образца превращено 29% лактозы, что соответствует 2,3 мкмоль лактозы. В момент времени Т=1 в собранных 100 мкл образца образовано 0,5 мкмоль галактозы. Таким образом, Т-значение можно рассчитать как 0,5 мкмоль/2,3 мкмоль = 0,2.

Разбавленную смесь, полученную из анализа, также анализировали в отношении превращенной (т.е. использованной) лактозы и образованной галактозы с помощью ферментативного способа Ι8Ο 5765-2. Использовали набор для анализа Боекппдег Маппке1т лактоза/О-галактоза от К-Бюркагт (номер по каталогу 10 176 303 035) и тест выполняли в соответствии с протоколом. Ферментативный способ подтвердил Т-значение фермента ОБОА347, равное 0,2.

Пример - Т-значение фермента ОБОЛ917.

Вышеупомянутый анализ Т-значения проводили с использованием фермента ОБОЛ917, полученного в примере 2, и Т-значение определяли в соответствии с процедурой, описанной выше.

Т-значение фермента ОБОЛ917 определили как 0,3.

Пример - Т-значение стандартного фермента лактазы.

Вышеупомянутый анализ проводили с использованием коммерчески доступного стандартного фермента лактазы Ьас1о7ут Риге 2600Б (^оуогутез, Дания). Разбавленную смесь, полученную из анализа, анализировали, как описано для фермента ОБОА347. Три- и тетрасахариды не присутствовали в обнаружимых количествах, и наблюдались равные количества глюкозы и галактозы. Соответствующее Т-значение составляет 1.

Также определяли Т-значения коммерчески доступной β-галактозидазы из ЕзскепсЫа сой (номер продукта: 06008, 81§та-А1бпсЬ, Германия) и АзрегдШиз огу7ае (номер продукта: О5160, 81§та-А1бпсЬ, Германия), и оба фермента обладали Т-значением приблизительно 1,0.

Пример 4. Синтез Б-фукозилсодержащих гетерогалактоолигосахаридов путем последовательного добавления молекул донора и превращения глюкозных отщепляемых групп.

Б-(-)-фукозу и моногидрат лактозы в количествах, которые приведены в табл. 1, растворяли в 100 мл воды Μί11ίρ. Каждый образец поддерживали при температуре 37°С и рН поддерживали на уровне

6,5 путем непрерывного добавления ^аОН. Воздух постоянно прокачивали через смесь со скоростью 100 л/мин. Фермент глюкозооксидазу, ООХ, ЭиРоп!, Дания, добавляли к образцу 2. Фермент глюкозооксидазу, О1и7уте, ^оуо7утез, Дания, добавляли к образцу 3. Фермент каталазу из Мюгососсиз 1узо0е1кйсиз, 81§та-А1бпсЬ, Дания, добавляли к образцам 2 и 3. Фермент ОБОА917 из примера 2 добавляли к каждому образцу. Воду Μί11ίρ добавляли до общего объема процесса 250 мл. Данный момент времени определяли как Т=0. Моногидрат лактозы добавляли к образцам в течение 5-часового периода с интервалами 30 мин.

Таблица 1

Образец	1 (Контроль)	2	3
Начальная концентрация Ь-фукозы	10%	10%	10%
Начальная концентрация моногидрата лактозы	5 %	5%	5%
Добавление лактозы / 30 минут	2,63 г	2,63 г	2,63 г
ινυιΐιτηνν ι ον глюкозооксидазы		109 45 мг	110 50 мг
Удельная активность глюкозооксидазы		11000 Ед/г	10000 Ед/г
Количество каталазы	-	20 мкл	20 мкл
Удельная активность каталазы		170000 Ед/мл	170000 Ед/мл
Количество фермента ОЬСА	5 мл	5 мл	5 мл

- 19 028927

Тестовые образцы от Т=4 ч и Т=5 ч анализировали с помощью НРЬС в соответствии с примером 7 и установили, что они содержат значительные количества галактозилированной фукозы.

Пример 5. Синтез Ь-фукозилсодержащих гетерогалактоолигосахаридов и превращение и удаление глюкозных отщепляемых групп, но без последовательного добавления молекул донора.

Ь-(-)-фукозу и моногидрат лактозы в количествах, которые приведены в табл. 2, растворяли в 100 мл воды Μίίίίρ. Каждый образец поддерживали при температуре 37°С и рН поддерживали на уровне

6,5 путем непрерывного добавления ХаОН. Воздух постоянно прокачивали через смесь со скоростью 100 л/мин. Подготавливали анионообменную смолу Эо^ех 66, 81дта-АШпсй, США и добавляли к образцу 3. Фермент глюкозооксидазу, ООХ, ЭиРоп!, Дания, добавляли к образцам 2 и 3. Фермент каталазу из М1сгососси8 1у8О0е1кйси8, 81дта-АМпсй, Дания, добавляли к образцам 2 и 3. Фермент О1.ОЛ917 из примера 2 добавляли к каждому образцу. Воду Μΐίίΐρ добавляли до общего объема процесса, который приведен в табл. 2. Данный момент времени определяли как Т=0.

Таблица 2

Образец	1 (Контроль)	2	3
Начальная концентрация Ь-фукозы	10%	10%	10%
Начальная концентрация моногидрата лактозы	15 %	15%	15%
Количество глюкозооксидазы		100,45 мг	100,45 мг
Удельная активность	-	11000Ед/г	11000Ед/г
глюкозооксидазы
Количество каталазы	-	20 мкл	20 мкл
Удельная активность каталазы		170000 Ед/мл	170000 Ед/мл
Объем ионообменной смолы			40 мл
Слабоосновная емкость	-	-	1,35 мг-экв/мл
Количество фермента ОЬСА	5 мл	5 мл	5 мл
Общий объем процесса	250 мл	250 мл	250 мл

Тестовые образцы от Т=4 ч и Т=5 ч анализировали с помощью НРЬС в соответствии с примером 7 и установили, что они также содержат значительные количества галактозилированной фукозы.

Пример 6. Синтез Ь-фукозилсодержащих гетерогалактоолигосахаридов путем последовательного добавления молекул донора, превращения глюкозных отщепляемых групп и удаления превращенных отщепляемых групп.

Ь-(-)-фукозу и моногидрат лактозы в количествах, которые приведены в табл. 3, растворяли в 100 мл воды Μΐίίΐρ. Каждый образец поддерживали при температуре 37°С и рН поддерживали на уровне

6,5 путем непрерывного добавления ХаОН. Воздух постоянно прокачивали через смесь со скоростью 100 л/мин. Подготавливали анионообменную смолу Эо^ех 66, 81дта-ЛШпсй, США и добавляли к каждому образцу. Фермент глюкозооксидазу, ООХ, Оашзсо/ОиРоп!, Дания, добавляли к образцу 2. Фермент глюкозооксидазу, СИихуте, Хоуо/утез, Дания, добавляли к образцу 3. Фермент каталазу из Мюгососсиз ίу8оάе^кΐ^си8, 81дта-ЛШпсй, Дания, добавляли к образцам 2 и 3. Фермент ОЬОЛ917 из примера 2 добавляли к каждому образцу. Воду Μΐίίΐρ добавляли до общего объема процесса 250 мл. Данный момент времени определили как Т=0. Моногидрат лактозы добавляли к образцам в течение 5-часового периода с интервалами 30 мин.

- 20 028927

Таблица 3

Образец	1 (Контроль)	2	3
Начальная концентрация Ь-фукозы	10%	10%	10%
Начальная концентрация моногидрата лактозы	5 %	5%	5%
Добавление лактозы / 30	1,06 г	1,06 г	1,06 г
у. Количество глюкозооксидазы	-	40 мг	45 мг
Удельная активность глюкозооксидазы		11000 Ед/г	10000 Ед/г
Количество каталазы	-	10 мкл	10 мкл
Удельная активность каталазы		170000 Ед/мл	170000 Ед/мл
Объем ионообменной смолы	40 мл	40 мл	40 мл
Слабоосновная емкость	1,35 мг-экв/мл	1,35 мг-экв/мл	1,35 мг-экв/мл
Количество фермента ОЬСА	2 мл	2 мл	2 мл

В моменты времени Т=4 и 5 ч брали 1500 мкл тестовых образцов и анализировали с помощью НРЬС и масс-спектроскопии в соответствии с примером 7. Обнаружили, что образцы содержали значительные количества галактозилированной фукозы. Результаты анализа масс-спектроскопии показаны на фиг. 4-6.

На фиг. 4 показан график интегрированного ответа ди-, три- и тетрасахаридов галактозилированной фукозы через 4 ч инкубации - с и без удаления свободных отщепляемых групп в течение инкубации. Свободные отщепляемые группы (глюкоза) удаляют с помощью ферментативного превращения. Видно, что содержание галактозилированной фукозы увеличивается, если свободные отщепляемые группы удаляются во время инкубации.

На фиг. 5 показан график интегрированного ответа ди-, три- и тетрасахаридов галактозилированной фукозы через 5 ч инкубации - с и без удаления свободных отщепляемых групп в течение инкубации. И в данном случае видно, что содержание галактозилированной фукозы увеличивается, если свободные отщепляемые группы удаляются во время инкубации.

На фиг. 6 показан график общего интегрированного ответа галактозилированной фукозы (общее количество НО8) по сравнению с общим интегрированным ответом галактозилированного донора/отщепляемой группы (общее количество 008) - с и без удаления свободных отщепляемых групп в течение инкубации. Общий интегрированный ответ галактозилированного донора/отщепляемой группы является суммой интегрированных ответов молекул 0а1-01с, 0а1-0а1-01с и 0а1-0а1-0а1-01с. Общий интегрированный ответ галактозилированной фукозы является суммой ответов молекул Оа1-Рис, 0а1-0а1Рис и Оа1-Оа1-Оа1-Рис. Видно, что общий интегрированный ответ галактозилированной фукозы значительно возрастает при удалении свободных отщепляемых групп в течение инкубации, в то время как общий интегрированный ответ галактозилированного донора/отщепляемой группы почти не изменяется.

Заключение.

Данный пример демонстрирует, что соотношение между галактозилированным акцептором (целевым продуктом) и галактозилированным донором/отщепляемыми группами (побочным продуктом) значительно увеличивается, когда свободные отщепляемые группы удаляются в течение инкубации.

Пример 7. Определение характеристик образцов, которые содержат Ь-фукозилсодержащие гетерогалактоолигосахариды.

Собранные образцы разводили 1:10 водой Μί11ίΓ) и инактивировали путем нагревания до 85°С в течение 15 мин. Инактивированную смесь хранили при -20°С до определения характеристик.

Характеристики образцов определяли путем применения аналитической НРЬС. Образцы фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкм. Использовали прибор НРЬС от ХХлИеш, оснащенный дифференциальным рефрактометром (ΚΙ-детектор) и колонкой ВюКай Лттех НРХ-87С (300x7,8 мм, 125-0055). Элюирование сахаридов проводили изократически с 0,05 г/л ацетата Са (СаЛсе1а1е), скоростью потока 0,3 мл/мин и объемом вводимой пробы 20 мкл.

Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием ЛдПеп! 1200 АР1-Е8 ГС/Μ8О Оца6горо1е 6410, сканирующего массы от 100 до 1000 а.е.м. (температура газа: 350°С, поток сушильного газа: 13,0 л/мин, давление распылителя: 40 фунтов/кв.дюйм). Колонкой, применявшейся для ГС разделения, являлась НурегСагЬ 2,1x150 мм от ТЕегшо 8с1епййс, Дания, работающая при 25 °С. Элюирование проводили с 5 мМ водного раствора ΑсNН4 и ацетонитрилом.

Ионные хроматограммы выделяли на основе общих профилей ионизации из межфазной границы электрораспыления. Пики на выделенных хроматограммах оценивали на основе масс-спектров, а затем

- 21 028927

интегрировали, получая, тем самым, интегрированные ответы для различных видов углеводов тестового образца.

Список использованной литературы

ВисЫлоЬ (2005) 'Вюса1а1уз15 апб Епгуте 1есЬпо1о§у”, К1аиз ВисЫюк е1 αϊ., Ι8ΒΝ-10: 3-527-30497-5, 2005, УД1еу УСН Уег1а§ ОтЪН

Ргапск (2002) “ТесЬпо1о§1са1 ГипсйопаШу о£ тикп апб оНдо£гис1озе ". А. Ргапск,

ВпкзЬ 1оигпа1 ο£Νηΐπΐίοη (2002), 87, Зиррк 2, 8287-8291

Уип (1996) “РгисЮоИдозассЬапбез-Оссиггепсе, ргерагабоп, апб аррПсаОоп". 1. XV.

Уип, Рпгуте апб М1сгоЫа1 ТесЬпо1о§у 19: 107-117, 1996

Κιιηζ (2000) “ОНдозассЪапбез ίη Ьитап тбк: 81тс1ига1, £инсОона1 апб тсГаЬоНс

азрес1з”, Кипг βίαΐ., Апп. Κεν. ΝηΙτ. 2000. 20:699-722

ЗтипзеГа/. (1994) Зиптз, Р.Р; Нлскз, К.В.; Натез, К.М.; НсЯсЫбзз, А.Т. апб Озтап, 8.Р.; (1994) Зерагабопз о£ 1ас1озе, '|асюЬюшс апб 1ас1оЬюпо1ас1озе Ьу т§п реггогтапсе Ιίςιιίά сЬгота!о§гарЬу. 1. о£ СЬгота1о§гарЬу, 667, 67-73.

ЮсЬтопб βί αϊ. (1982) ИсЬтопб, М.Р.; ВагЕизз, ϋ.Ρ.; Наг1е, В.К.; Огау, ΡΙ.

апб ЗЬпе. С.М.; (1982) ЗерагаЕюп о£ СагЬоЬубга1ез ίη Оалгу РгобисЕз Ьу РЬ§Ь Рег£огтапсе Ρίςιιί6 СЬготаЕодгарЬу, I. оЕОалгу Зеленее. 65 (8), 1394-1400.

Е1 Каггл (2002) “СагЬоЬубга1е АпаЦзлз Ьу Мобет СЬготаЕодгарЬу апб Е1ес1горЬогез1з”, уо1ите 66, 1оигпа1 о£ СЬготаЕодгарЬу РлЬгагу, Е1зе\лег Зеленее. 2002, Ι8ΒΝ-10: 0444500618

\Уа1зЕга βίαΐ. (2006) "Эаиу зеленее апб ГесЬпо1о§у”, \Уа1зЕга е1 а1., СКС Ргезз, Зесопб ебйюп, 2006

ЗсОрсаРгОист ΡϋιιΐϊΟαΐϊΟίΐ; РгШС1р1е8 ЗПи РгЯСиСе; Уег1а§ Νετν Уогк, 1пс., Ι8ΒΝ 0-387-94072-3

\УО 01/90317 А2 ЕР 2 138 586 А1 \УО 2009/113030 А2 ΑΌ 2012/010597 ΑΙ

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Арла Фудс амба

<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГАЛАКТООЛИГОСАХАРИДЫ

<130> Р1120РС00

<160> 2

<170> РабепЫп версия 3.1

<210> 1

<211> 5509

<212> ДНК

<213> в1£1ЩоЬас£ег1ит Ы£1Щит

<220>

<221> СБ5

<222> (212)..(5470)

<223>

<400> 1

а£дсд££дсд ££дсда££££ £ссддссс£д £а£ддддда£ асадда££дд сдабддсдас 60

асдссд££££ £д££аа£ддс а£££аса£да аа£асадд£а а£дада£а£с а££с£са£да 120

- 22 028927

ЬсассдЬдЬд даЬаЬсдсаЬ ЬддЬдсдЬаЬ асасЬаасад саасададсд дсдсддсадд 180

сдсЬсдЬдда ЬЬсааЬдаад ааддаасдЬЬ Ь аЬд дса дЬЬ сдс ада сЬЬ ддЬ 232

МеЬ А1а Уа1 Агд Агд Ьеи О1у 1 5

ддс О1у

сдс Агд

аЬс 11е 10

дЬд Уа1

дсЬ А1а

ЬЬс РЬе

дсс А1а

дсс А1а 15

аса ТЬг

дЬд Уа1

дсс А1а

ЬЬд Ьеи

Ьса Зег 20

аЬа 11е

ссд Рго

ЬЬа Ьеи

280

ддд

ЬЬд

ЬЬа

аса

ааЬ

Ьса

дсд

Ьдд

дсд

дЬс

дад

дас

дсс

асс

сда

Ьсс

328

О1у

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Азп

Зег

А1а

Тгр

А1а

Уа1

О1и

Азр

А1а

ТЬг

Агд

Зег

25

30

35

дас

Ьсс

асс

асд

сад

аЬд

адс

Ьсс

асд

ссд

дад

дЬд

дЬс

Ьас

Ьсс

адс

376

Азр

Зег

ТЬг

ТЬг

О1п

МеЬ

Зег

Зег

ТЬг

Рго

О1и

Уа1

Уа1

Туг

Зег

Зег

40

45

50

55

дсс

дЬд

даЬ

Ьсс

аад

сад

ааЬ

сдс

асс

Ьсд

даЬ

ЬЬс

дас

дсс

аас

Ьдд

424

А1а

Уа1

Азр

Зег

Ьуз

О1п

Азп

Агд

ТЬг

Зег

Азр

РЬе

Азр

А1а

Азп

Тгр

60

65

70

аад

ЬЬс

аЬд

сЬд

Ьсс

даЬ

Ьсс

дЬд

сад

дсд

сад

даЬ

ссд

дсд

ЬЬс

дас

472

Ьуз

РЬе

МеЬ

Ьеи

Зег

Азр

Зег

Уа1

О1п

А1а

О1п

Азр

Рго

А1а

РЬе

Азр

75

80

85

даЬ

Ьсд

дсс

Ьдд

сад

сад

дЬс

дас

сЬд

ссд

саЬ

дас

Ьас

адс

аЬс

асд

520

Азр

Зег

А1а

Тгр

О1п

О1п

Уа1

Азр

Ьеи

Рго

Н1з

Азр

Туг

Зег

11е

ТЬг

90

95

100

сад

аад

ЬаЬ

Ьсд

сад

адс

аас

дад

дсс

даа

адс

дса

Ьас

сЬЬ

ссс

ддс

568

О1п

Ьуз

Туг

Зег

О1п

Зег

Азп

О1и

А1а

О1и

Зег

А1а

Туг

Ьеи

Рго

О1у

105

110

115

ддс

асс

ддс

Ьдд

Ьас

сдс

аад

Ьсс

ЬЬс

асс

аЬс

дас

сдд

дас

сЬс

дсс

616

О1у

ТЬг

О1у

Тгр

Туг

Агд

Ьуз

Зег

РЬе

ТЬг

11е

Азр

Агд

Азр

Ьеи

А1а

120

125

130

135

ддс

аад

сдс

аЬс

дсс

аЬс

аас

ЬЬс

дас

ддс

дЬд

Ьас

аЬд

аас

дсс

асс

664

О1у

Ьуз

Агд

11е

А1а

11е

Азп

РЬе

Азр

О1у

Уа1

Туг

МеЬ

Азп

А1а

ТЬг

140

145

150

дЬс

Ьдд

ЬЬс

аас

ддс

дЬс

аад

сЬс

ддс

асс

саЬ

ссд

Ьас

ддс

Ьас

Ьсд

712

Уа1

Тгр

РЬе

Азп

О1у

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1у

ТЬг

Н1з

Рго

Туг

О1у

Туг

Зег

155

160

165

ссд

ЬЬс

Ьсс

ЬЬс

дас

сЬд

асс

ддс

аас

дсс

аад

ЬЬс

ддЬ

ддд

дад

аас

760

Рго

РЬе

Зег

РЬе

Азр

Ьеи

ТЬг

О1у

Азп

А1а

Ьуз

РЬе

О1у

О1у

О1и

Азп

170

175

180

асс

аЬс

дЬс

дЬс

аад

дЬс

дад

аас

адд

сЬд

ссд

Ьсс

адс

сдс

Ьдд

Ьас

808

ТЬг

11е

Уа1

Уа1

Ьуз

Уа1

О1и

Азп

Агд

Ьеи

Рго

Зег

Зег

Агд

Тгр

Туг

185

190

195

Ьсс

ддс

Ьсс

ддс

аЬс

Ьас

сдс

дас

дЬс

асс

сЬс

асс

дЬс

асс

дас

ддс

856

Зег

О1у

Зег

О1у

11е

Туг

Агд

Азр

Уа1

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Уа1

ТЬг

Азр

О1у

200

205

210

215

дЬд

сас

дЬс

ддс

ааЬ

аас

ддс

дЬд

дсс

аЬс

аад

асс

ссд

адс

сЬс

дсс

904

Уа1

Н1з

Уа1

О1у

Азп

Азп

О1у

Уа1

А1а

11е

Ьуз

ТЬг

Рго

Зег

Ьеи

А1а

220

225

230

- 23 028927

асе ТЬг

саа О1п

аас Азп

ддс О1у 235

ддс О1у

дас Азр

дЕд Уа1

асд ТЬг

аЕд МеЕ 240

аас Азп

сЕс Ьеи

асс ТЬг

асс ТЬг

аад Ьуз 245

дЕс Уа1

дсс А1а

952

аас

дас

асс

дад

дсс

дсд

дсд

аас

аЕс

асс

сЕс

аад

сад

асс

дЕд

ЕЕс

1000

Азп

Азр

ТЬг

О1и

А1а

А1а

А1а

Азп

11е

ТЬг

Ьеи

Ьуз

О1п

ТЬг

Уа1

РЬе

250

255

260

ссс

аад

дда

ддс

аад

асс

дас

дсс

дсс

аЕс

ддс

асс

дЕс

асс

асс

дса

1048

Рго

Ьуз

О1у

О1у

Ьуз

ТЬг

Азр

А1а

А1а

11е

О1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

ТЬг

А1а

265

270

275

Есс

аад

Есс

аЕс

дсд

дсс

ддЕ

дсс

адс

дсд

дас

дЕд

асс

Есс

асд

аЕс

1096

Зег

Ьуз

Зег

11е

А1а

А1а

О1у

А1а

Зег

А1а

Азр

Уа1

ТЬг

Зег

ТЬг

11е

280

285

290

295

асе

дсс

дсЕ

Есд

ссс

аад

сЕд

Едд

адс

аЕс

аад

аас

ссд

аас

сЕд

Еас

1144

ТЬг

А1а

А1а

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Тгр

Зег

11е

Ьуз

Азп

Рго

Азп

Ьеи

Туг

300

305

310

асс

дЕд

сдс

асс

даа

дЕд

сЕс

аас

ддс

ддс

аад

дЕд

сЕс

дас

асЕ

Еас

1192

ТЬг

Уа1

Агд

ТЬг

О1и

Уа1

Ьеи

Азп

О1у

О1у

Ьуз

Уа1

Ьеи

Азр

ТЬг

Туг

315

320

325

дас

асс

даа

ЕаЕ

ддс

ЕЕс

сдс

Едд

асс

ддс

ЕЕс

даЕ

дсд

асс

адс

ддЕ

1240

Азр

ТЬг

О1и

Туг

О1у

РЬе

Агд

Тгр

ТЬг

О1у

РЬе

Азр

А1а

ТЬг

Зег

О1у

330

335

340

ЕЕс

Есд

сЕс

аас

ддс

дад

ааа

дЕс

аад

сЕс

аад

ддс

дЕс

Еса

аЕд

саЕ

1288

РЬе

Зег

Ьеи

Азп

О1у

О1и

Ьуз

Уа1

Ьуз

Ьеи

Ьуз

О1у

Уа1

Зег

МеЕ

Н1з

345

350

355

саЕ

дас

сад

дда

Есд

сЕс

ддс

дсд

дЕс

дсс

аас

сдс

сдс

дсс

аЕс

дад

1336

Ηΐ3

Азр

О1п

О1у

Зег

Ьеи

О1у

А1а

Уа1

А1а

Азп

Агд

Агд

А1а

11е

О1и

360

365

370

375

сдс

сад

дЕс

дад

аЕЕ

сЕс

сад

аад

аЕд

ддс

дЕс

аас

Есд

аЕс

сдс

асс

1384

Агд

О1п

Уа1

О1и

11е

Ьеи

О1п

Ьуз

МеЕ

О1у

Уа1

Азп

Зег

11е

Агд

ТЬг

380

385

390

асд

сас

аас

ссс

дса

дсс

аад

дсд

сЕд

аЕЕ

дас

дЕс

Едс

аас

дад

аад

1432

ТЬг

ΗΪ8

Азп

Рго

А1а

А1а

Ьуз

А1а

Ьеи

11е

Азр

Уа1

Суз

Азп

О1и

Ьуз

395

400

405

ддс

дЕс

сЕс

дЕд

дЕс

даа

дад

дЕс

ЕЕс

дас

аЕд

Едд

аас

сдд

Есд

аад

1480

О1у

Уа1

Ьеи

Уа1

Уа1

О1и

О1и

Уа1

РЬе

Азр

МеЕ

Тгр

Азп

Агд

Зег

Ьуз

410

415

420

аас

ддс

аас

асс

дад

даЕ

Еас

ддс

аад

Едд

ЕЕс

ддс

сад

дсс

аЕс

дсс

1528

Азп

О1у

Азп

ТЬг

О1и

Азр

Туг

О1у

Ьуз

Тгр

РЬе

О1у

О1п

А1а

11е

А1а

425

430

435

ддЕ

дас

аас

дсс

дЕс

сЕд

ддЕ

ддс

дас

аад

дас

дад

асс

Едд

дсс

аад

1576

О1у

Азр

Азп

А1а

Уа1

Ьеи

О1у

О1у

Азр

Ьуз

Азр

О1и

ТЬг

Тгр

А1а

Ьуз

440

445

450

455

ЕЕс

дас

сЕд

асс

адс

асс

аЕс

аас

сдЕ

дас

адд

аас

дсс

ссд

Есс

дЕс

1624

РЬе

Азр

Ьеи

ТЬг

Зег

ТЬг

11е

Азп

Агд

Азр

Агд

Азп

А1а

Рго

Зег

Уа1

460

465

470

аЕс

аЕд

Едд

Есд

сЕс

ддс

аас

дад

аЕд

аЕд

даа

ддс

аЕс

адс

ддс

адс

1672

11е

МеЕ

Тгр

Зег

Ьеи

О1у

Азп

О1и

МеЕ

МеЕ

О1и

О1у

11е

Зег

О1у

Зег

475

480

485

- 24 028927

дЕс ναι

Есд Зег

ддс О1у 490

ЕЕс РЬе

ссд Рго

дсЕ А1а

асс ТЬг

Есс Зег 495

дсс А1а

аад Ьуз

сЕд Ьеи

дЕс Уа1

дса А1а 500

Едд Тгр

асд ТЬг

аад Ьуз

1720

дсс

дсд

дас

адс

асс

сдс

ссд

аЕд

асс

Еас

ддс

дас

аас

аад

аЕс

аад

1768

А1а

А1а

Азр

Зег

ТЬг

Агд

Рго

МеЕ

ТЬг

Туг

О1у

Азр

Азп

Ьуз

11е

Ьуз

505

510

515

дсс

аас

Едд

аас

дад

Есд

аас

асс

аЕд

ддс

дас

аас

сЕд

асс

дсс

аас

1816

А1а

Азп

Тгр

Азп

О1и

Зег

Азп

ТЬг

МеЕ

О1у

Азр

Азп

Ьеи

ТЬг

А1а

Азп

520

525

530

535

ддс

ддс

дЕд

дЕс

ддс

асс

аас

Еас

Есс

дас

ддс

дсд

аас

Еас

дас

аад

1864

О1у

О1у

Уа1

Уа1

О1у

ТЬг

Азп

Туг

Зег

Азр

О1у

А1а

Азп

Туг

Азр

Ьуз

540

545

550

аЕс

сдс

асд

асс

сас

ссс

Еса

Едд

дсс

аЕс

ЕаЕ

ддЕ

Есс

дад

асд

дсд

1912

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

Н1з

Рго

Зег

Тгр

А1а

11е

Туг

О1у

Зег

О1и

ТЬг

А1а

555

560

565

Есс

дсс

аЕс

аас

адс

сда

ддс

аЕс

Еас

аас

сдс

асс

асс

ддс

ддс

дсс

1960

Зег

А1а

11е

Азп

Зег

Агд

О1у

11е

Туг

Азп

Агд

ТЬг

ТЬг

О1у

О1у

А1а

570

575

580

сад

Еса

адс

дас

аад

сад

сЕд

асс

адс

ЕаЕ

дас

ааЕ

Есс

дса

дЕс

ддс

2008

О1п

Зег

Зег

Азр

Ьуз

О1п

Ьеи

ТЬг

Зег

Туг

Азр

Азп

Зег

А1а

Уа1

О1у

585

590

595

Едд

ддс

дсс

дЕс

дсс

адс

Есс

дсс

Едд

Еас

дас

дЕд

дЕс

сад

сдс

даЕ

2056

Тгр

О1у

А1а

Уа1

А1а

Зег

Зег

А1а

Тгр

Туг

Азр

Уа1

Уа1

О1п

Агд

Азр

600

605

610

615

ЕЕс

дЕс

дсс

ддс

аса

Еас

дЕд

Едд

асс

ддс

ЕЕс

дас

Еас

сЕс

ддс

даа

2104

РЬе

Уа1

А1а

О1у

ТЬг

Туг

Уа1

Тгр

ТЬг

О1у

РЬе

Азр

Туг

Ьеи

О1у

О1и

620

625

630

ссс

асс

ссд

Едд

аас

ддс

асс

ддс

Есс

ддс

дсс

дЕд

ддс

Есс

ЕЕд

дсс

2152

Рго

ТЬг

Рго

Тгр

Азп

О1у

ТЬг

О1у

Зег

О1у

А1а

Уа1

О1у

Зег

Ьеи

А1а

635

640

645

дЕс

дсс

даа

даа

сЕс

дЕа

сЕЕ

сдд

саЕ

сдЕ

сда

сас

сдс

адд

сЕЕ

ссс

2200

ναι

А1а

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

Н1з

Агд

Агд

Н1з

Агд

Агд

Ьеи

Рго

650

655

660

даа

дас

асс

ЕаЕ

Еас

ЕЕс

ЕаЕ

сад

адс

сад

Едд

аас

дас

дас

дЕд

сас

2248

О1и

Азр

ТЬг

Туг

Туг

РЬе

Туг

О1п

Зег

О1п

Тгр

Азп

Азр

Азр

Уа1

Н1з

665

670

675

асд

сЕд

сас

аЕс

сЕс

ссс

дса

Едд

аас

дад

аас

дЕс

дЕс

дсс

аад

ддс

2296

ТЬг

Ьеи

Н1з

11е

Ьеи

Рго

А1а

Тгр

Азп

О1и

Азп

Уа1

Уа1

А1а

Ьуз

О1у

680

685

690

695

Есс

ддс

аас

аас

дЕд

ссд

дЕс

дЕс

дЕс

Еас

асс

дас

дсд

дсс

аад

дЕс

2344

Зег

О1у

Азп

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

Туг

ТЬг

Азр

А1а

А1а

Ьуз

Уа1

700

705

710

аад

сЕд

Еас

ЕЕс

аса

ссд

аад

ддс

адЕ

асс

даа

аад

сда

сЕд

аЕс

дда

2392

Ьуз

Ьеи

Туг

РЬе

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

Зег

ТЬг

О1и

Ьуз

Агд

Ьеи

11е

О1у

715

720

725

дад

аад

Есс

ЕЕс

асс

аад

аад

асс

асс

дсд

дсс

дда

Еас

асс

ЕаЕ

сад

2440

О1и

Ьуз

Зег

РЬе

ТЬг

Ьуз

Ьуз

ТЬг

ТЬг

А1а

А1а

О1у

Туг

ТЬг

Туг

О1п

- 25 028927

730

735

740

д/с

/ас

дад

ддс

/сс

дас

аад

дас

/сс

асс

дсс

сас

аад

аас

а/д

/ас

2488

ναι

Туг 745

О1и

О1у

Зег

Азр

Ьуз 750

Азр

Зег

ТЬг

А1а

Н1з 755

Ьуз

Азп

Ме/

Туг

с/д

асс

/дд

аас

д/д

ссд

/дд

дсс

дад

ддс

асс

а/с

/сс

дсс

даа

дса

2536

Ьеи 760

ТЬг

Тгр

Азп

Уа1

Рго 765

Тгр

А1а

О1и

О1у

ТЬг 770

11е

Зег

А1а

О1и

А1а 775

/ас

дас

дад

аас

аас

адд

с/д

а/с

ссс

дад

ддд

/сс

асс

дад

ддс

аас

2584

Туг

Азр

О1и

Азп

Азп 780

Агд

Ьеи

11е

Рго

О1и 785

О1у

Зег

ТЬг

О1и

О1у 790

Азп

дсд

/сд

д/д

асс

асс

асс

ддс

аад

дсс

дсд

аад

с//

ааа

дсс

да/

дсс

2632

А1а

Зег

Уа1

ТЬг 795

ТЬг

ТЬг

О1у

Ьуз

А1а 800

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а 805

Азр

А1а

дас

сдс

аад

асд

а/с

асс

дсд

дас

ддс

аад

дас

с/д

/сд

/ас

а/с

дад

2680

Азр

Агд

Ьуз 810

ТЬг

11е

ТЬг

А1а

Азр 815

О1у

Ьуз

Азр

Ьеи

Зег 820

Туг

11е

О1и

д/с

дас

д/д

асс

дас

дсс

аас

ддс

са/

а/с

д/с

ссс

да/

дсс

дсс

аас

2728

ναι

Азр 825

Уа1

ТЬг

Азр

А1а

Азп 830

О1у

Н1з

11е

Уа1

Рго 835

Азр

А1а

А1а

Азп

сдс

д/с

асс

//с

дас

д/с

аад

ддс

дсс

ддс

ааа

с/д

д/с

ддс

д/с

дас

2776

Агд 840

Уа1

ТЬг

РЬе

Азр

Уа1 845

Ьуз

О1у

А1а

О1у

Ьуз 850

Ьеи

Уа1

О1у

Уа1

Азр 855

аас

ддс

адс

/сд

ссд

да/

сас

дас

/сс

/а/

сад

дсс

дас

аас

сдс

аад

2824

Азп

О1у

Зег

Зег

Рго 860

Азр

Н1з

Азр

Зег

Туг 865

О1п

А1а

Азр

Азп

Агд 870

Ьуз

дсд

//с

адс

ддс

аад

д/д

с/с

дсс

а/с

д/с

сад

/сс

асс

аад

дад

дсд

2872

А1а

РЬе

Зег

О1у 875

Ьуз

Уа1

Ьеи

А1а

11е 880

Уа1

О1п

Зег

ТЬг

Ьуз 885

О1и

А1а

ддс

дад

а/с

асс

д/с

асс

дсс

аад

дсс

дас

дд/

с/д

саа

/са

/сс

аса

2920

О1у

О1и

11е 890

ТЬг

Уа1

ТЬг

А1а

Ьуз 895

А1а

Азр

О1у

Ьеи

О1п 900

Зег

Зег

ТЬг

д/д

аад

а/с

дсс

асс

асс

дсс

д/с

ссс

ддс

асс

адс

асс

дад

аад

асд

2968

ναι

Ьуз 905

11е

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а 910

Уа1

Рго

О1у

ТЬг

Зег 915

ТЬг

О1и

Ьуз

ТЬг

д/с

сдс

адс

//с

/ас

/ас

/сд

сдс

аас

/ас

/ас

д/с

аад

асс

ддс

аас

3016

ναι 920

Агд

Зег

РЬе

Туг

Туг 925

Зег

Агд

Азп

Туг

Туг 930

Уа1

Ьуз

ТЬг

О1у

Азп 935

аад

ссд

а//

с/д

ссд

ад/

да/

д/с

дад

д/д

сдс

/ас

/сс

дас

ддс

асд

3064

Ьуз

Рго

11е

Ьеи

Рго 940

Зег

Азр

Уа1

О1и

Уа1 945

Агд

Туг

Зег

Азр

О1у 950

ТЬг

/сд

дас

сд/

сад

аас

д/с

аса

/дд

дас

дса

д/с

адс

дас

дас

сад

а/с

3112

Зег

Азр

Агд

О1п 955

Азп

Уа1

ТЬг

Тгр

Азр 960

А1а

Уа1

Зег

Азр

Азр 965

О1п

11е

дсс

аад

дсс

дд/

/сд

//с

адс

д/д

дсс

ддс

асд

д/с

дсс

ддд

сад

аад

3160

А1а

Ьуз

А1а 970

О1у

Зег

РЬе

Зег

Уа1 975

А1а

О1у

ТЬг

Уа1

А1а 980

О1у

О1п

Ьуз

а/с

/сс

д/д

сдс

д/д

асд

а/д

а/с

дас

дад

а/с

дд/

дсд

с/д

с/с

аас

3208

- 26 028927

11е Зег Уа1 Агд Уа1 ТЪг Мек 11е Азр О1и 11е О1у А1а Ьеи Ьеи Азп 985 990 995

как Туг 1000

ксд Зег

дсс А1а

адс Зег

аса ТЪг

ссд Рго 1005

дкс Уа1

ддс О1у

асд ТЪг

ссс Рго

дсс А1а 1010

дкд Уа1

скд Ьеи

сск Рго

ддс О1у

3253

кед

сдк

ссд

дсс

дкд

скд

ссс

дас

ддс

асс

дкд

асс

адс

дсд

аас

3298

Зег

Агд

Рго

А1а

Уа1

Ьеи

Рго

Азр

О1у

Ткг

Уа1

ТЪг

Зег

А1а

Азп

1015

1020

1025

ккс

дсс

дкс

сас

кдд

асс

аад

ссс

дсс

дас

асс

дкд

кас

аас

асд

3343

РЪе

А1а

Уа1

НЬз

Тгр

ТЪг

Ьуз

Рго

А1а

Азр

ТЪг

Уа1

Туг

Азп

ТЪг

1030

1035

1040

дсс

ддс

асс

дкс

аад

дкс

ссс

ддс

асс

дсс

асс

дкс

ккс

ддс

аад

3388

А1а

О1у

ТЪг

Уа1

Ьуз

Уа1

Рго

О1у

ТЪг

А1а

ТЪг

Уа1

РЪе

О1у

Ьуз

1045

1050

1055

дад

ккс

аад

дкс

асс

дсд

асд

акк

сдс

дкд

сад

сдд

ксд

сад

дкс

3433

О1и

РЪе

Ьуз

Уа1

ТЪг

А1а

ТЪг

11е

Агд

Уа1

О1п

Агд

Зег

О1п

Уа1

1060

1065

1070

асе

акс

ддс

адс

адс

дкс

ксс

ддс

аак

дсд

скд

сдс

скд

аск

сад

3478

ТЪг

11е

О1у

Зег

Зег

Уа1

Зег

О1у

Азп

А1а

Ьеи

Агд

Ьеи

ТЪг

О1п

1075

1080

1085

аас

акс

ссс

дсс

дас

аад

сад

ксс

дас

асд

скд

дас

дсс

акс

аад

3523

Азп

11е

Рго

А1а

Азр

Ьуз

О1п

Зег

Азр

ТЪг

Ьеи

Азр

А1а

11е

Ьуз

1090

1095

1100

дас

ддс

ксс

асд

асс

дкс

дас

дсс

аак

асс

ддс

ддс

ддс

дсд

аас

3568

Азр

О1у

Зег

ТЪг

ТЪг

Уа1

Азр

А1а

Азп

ТЪг

О1у

О1у

О1у

А1а

Азп

1105

1110

1115

ссд

кса

дса

кдд

асс

аас

кдд

дсд

кас

ксд

аад

дсс

ддс

сас

аас

3613

Рго

Зег

А1а

Тгр

ТЪг

Азп

Тгр

А1а

Туг

Зег

Ьуз

А1а

О1у

НЬз

Азп

1120

1125

1130

асс

дсс

дад

акс

асс

ккс

дад

кас

дсд

асс

дад

сад

сад

скс

ддс

3658

ТЪг

А1а

О1и

11е

ТЪг

РЪе

О1и

Туг

А1а

ТЪг

О1и

О1п

О1п

Ьеи

О1у

1135

1140

1145

сад

акк

дкс

акд

кас

ккс

ккс

сдс

дас

адс

аас

дсд

дкд

адд

ккс

3703

О1п

11е

Уа1

Мек

Туг

РЪе

РЪе

Агд

Азр

Зег

Азп

А1а

Уа1

Агд

РЪе

1150

1155

1160

ссс

дас

дсс

ддс

аад

асд

аад

акс

сад

акс

ксс

дсд

дас

ддс

аад

3748

Рго

Азр

А1а

О1у

Ьуз

ТЪг

Ьуз

11е

О1п

11е

Зег

А1а

Азр

О1у

Ьуз

1165

1170

1175

аас

кдд

асд

дак

скс

дск

дсс

асд

дад

асс

акс

дсд

дсс

сад

дад

3793

Азп

Тгр

ТЪг

Азр

Ьеи

А1а

А1а

ТЪг

О1и

ТЪг

11е

А1а

А1а

О1п

О1и

1180

1185

1190

ксд

ксс

дас

сда

дкс

аад

ссд

кас

асс

как

дас

ккс

дск

ссд

дкд

3838

Зег

Зег

Азр

Агд

Уа1

Ьуз

Рго

Туг

ТЪг

Туг

Азр

РЪе

А1а

Рго

Уа1

1195

1200

1205

дда

дсс

асд

ккс

дкс

аад

дкс

асд

дкс

асс

аас

дсс

дас

асс

аса

3883

О1у

А1а

ТЪг

РЪе

Уа1

Ьуз

Уа1

ТЪг

Уа1

ТЪг

Азп

А1а

Азр

ТЪг

ТЬг

1210

1215

1220

- 27 028927

асе ТЬг 1225

ссс Рго

адс Зег

ддс О1у

дЬд Уа1

дЬс Уа1 1230

Ьдс Суз

дсс А1а

ддс О1у

сЬд Ьеи

асс ТЬг 1235

дад О1и

аЬс 11е

дад О1и

сЬд Ьеи

3928

аад

асс

дсд

асс

адс

аад

ЬЬс

дЬс

асд

аас

асд

Ьсс

дсс

дсд

сЬс

3973

Ьуз

ТЬг

А1а

ТЬг

Зег

Ьуз

РЬе

Уа1

ТЬг

Азп

ТЬг

Зег

А1а

А1а

Ьеи

1240

1245

1250

Ьсд

Ьсд

сЬд

аса

дЬд

аас

ддс

асд

аад

дЬс

Ьсс

дас

Ьсс

дЬд

сЬс

4018

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азп

О1у

ТЬг

Ьуз

Уа1

Зег

Азр

Зег

Уа1

Ьеи

1255

1260

1265

дсс

дсс

ддс

Ьсс

Ьас

аас

асд

ссс

дсд

аЬс

аЬс

дсд

дас

дЬс

ааа

4063

А1а

А1а

О1у

Зег

Туг

Азп

ТЬг

Рго

А1а

11е

11е

А1а

Азр

Уа1

Ьуз

1270

1275

1280

дсс

дад

ддс

даа

ддс

аас

дсс

адс

дЬс

асс

дЬд

сЬд

ссс

дсд

сас

4108

А1а

О1и

О1у

О1и

О1у

Азп

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

Уа1

Ьеи

Рго

А1а

Н1з

1285

1290

1295

дас

аас

дЬд

аЬс

сдс

дЬд

аЬс

асс

дад

Ьсс

дад

дас

сас

дЬс

асд

4153

Азр

Азп

Уа1

11е

Агд

Уа1

11е

ТЬг

О1и

Зег

О1и

Азр

Н1з

Уа1

ТЬг

1300

1305

1310

сдс

аад

асс

ЬЬс

асс

аЬс

аас

сЬд

ддс

асд

дад

сад

даа

ЬЬс

ссс

4198

Агд

Ьуз

ТЬг

РЬе

ТЬг

11е

Азп

Ьеи

О1у

ТЬг

О1и

О1п

О1и

РЬе

Рго

1315

1320

1325

дса

дас

Ьсс

даЬ

даа

сдс

дас

Ьас

ссд

дсс

дсс

дас

аЬд

асд

дЬс

4243

А1а

Азр

Зег

Азр

О1и

Агд

Азр

Туг

Рго

А1а

А1а

Азр

МеЬ

ТЬг

Уа1

1330

1335

1340

асс

дЬд

ддс

адс

даа

сад

асд

Ьсс

ддс

асс

дсд

асс

даа

ддс

ссд

4288

ТЬг

Уа1

О1у

Зег

О1и

О1п

ТЬг

Зег

О1у

ТЬг

А1а

ТЬг

О1и

О1у

Рго

1345

1350

1355

аад

ааа

ЬЬс

дсд

дЬс

дас

ддс

аас

асс

адс

асд

Ьас

Ьдд

саЬ

Ьсс

4333

Ьуз

Ьуз

РЬе

А1а

Уа1

Азр

О1у

Азп

ТЬг

Зег

ТЬг

Туг

Тгр

Н1з

Зег

1360

1365

1370

аас

Ьдд

асд

ссс

асс

асс

дЬд

аас

дас

сЬд

Ьдд

аЬс

дсс

ЬЬс

дад

4378

Азп

Тгр

ТЬг

Рго

ТЬг

ТЬг

Уа1

Азп

Азр

Ьеи

Тгр

11е

А1а

РЬе

О1и

1375

1380

1385

сЬс

сад

ааа

ссс

асс

аад

сЬс

дас

дсд

сЬд

сдс

Ьас

сЬд

ссд

сдс

4423

Ьеи

О1п

Ьуз

Рго

ТЬг

Ьуз

Ьеи

Азр

А1а

Ьеи

Агд

Туг

Ьеи

Рго

Агд

1390

1395

1400

ссс

дсд

ддс

адс

аад

аас

ддс

Ьсс

дЬс

асс

даа

Ьас

аад

дЬЬ

сад

4468

Рго

А1а

О1у

Зег

Ьуз

Азп

О1у

Зег

Уа1

ТЬг

О1и

Туг

Ьуз

Уа1

О1п

1405

1410

1415

дЬс

адс

даЬ

дас

ддс

асс

аас

Ьдд

асс

дас

дсд

ддс

Ьсс

ддс

аса

4513

Уа1

Зег

Азр

Азр

О1у

ТЬг

Азп

Тгр

ТЬг

Азр

А1а

О1у

Зег

О1у

ТЬг

1420

1425

1430

Ьдд

асс

асс

даЬ

Ьас

ддс

Ьдд

аад

сЬс

дсс

дад

ЬЬс

ааЬ

сад

ссд

4558

Тгр

ТЬг

ТЬг

Азр

Туг

О1у

Тгр

Ьуз

Ьеи

А1а

О1и

РЬе

Азп

О1п

Рго

1435

1440

1445

дЬд

асс

асс

аад

сас

дЬд

сдд

сЬс

аад

дсс

дЬс

сас

асс

ЬаЬ

дсд

4603

Уа1

ТЬг

ТЬг

Ьуз

Нтз

Уа1

Агд

Ьеи

Ьуз

А1а

Уа1

Нтз

ТЬг

Туг

А1а

1450

1455

1460

- 28 028927

даЕ Азр 1465

Есс Зег

ддс О1у

аас Азп

дас Азр

аад Ьуз 1470

ЕЕс РЬе

аЕд МеЕ

Есс Зег

дсс А1а

Есс Зег 1475

даа О1и

аЕс 11е

сдс Агд

сЕд Ьеи

4648

сдс

аад

дсс

дЕс

дас

асс

асс

дас

аЕс

адс

ддс

дсд

асс

дЕд

асс

4693

Агд

Ьуз

А1а

Уа1

Азр

ТЬг

ТЬг

Азр

11е

Зег

О1у

А1а

ТЬг

Уа1

ТЬг

1480

1485

1490

дЕд

ссс

дсс

аад

сЕд

асс

дЕс

дас

сдд

дЕд

дас

дсс

дас

саЕ

ссс

4738

ναι

Рго

А1а

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Агд

Уа1

Азр

А1а

Азр

Н1з

Рго

1495

1500

1505

дсс

асс

ЕЕс

дсс

асд

аад

дас

дЕд

асд

дЕд

асд

ЕЕд

ддс

дас

дсс

4783

А1а

ТЬг

РЬе

А1а

ТЬг

Ьуз

Азр

Уа1

ТЬг

Уа1

ТЬг

Ьеи

О1у

Азр

А1а

1510

1515

1520

асд

сЕд

сдс

Еас

ддс

дЕд

дас

Еас

сЕд

сЕс

дас

Еас

дсд

ддс

аас

4828

ТЬг

Ьеи

Агд

Туг

С1у

Уа1

Азр

Туг

Ьеи

Ьеи

Азр

Туг

А1а

О1у

Азп

1525

1530

1535

асс

дсс

дЕс

ддс

аад

дсс

асд

дЕд

асс

дЕд

сдс

ддс

аЕс

дас

аад

4873

ТЬг

А1а

Уа1

О1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Агд

О1у

11е

Азр

Ьуз

1540

1545

1550

Еас

Есс

ддс

асс

дЕс

дсс

аад

асд

ЕЕс

асс

аЕс

даа

сЕд

аад

аас

4918

Туг

Зег

О1у

ТЬг

Уа1

А1а

Ьуз

ТЬг

РЬе

ТЬг

11е

О1и

Ьеи

Ьуз

Азп

1555

1560

1565

дсс

ссд

дсд

ссд

даа

ссд

асд

сЕд

асс

Есд

дЕд

адс

дЕс

аад

асс

4963

А1а

Рго

А1а

Рго

О1и

Рго

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Зег

Уа1

Зег

Уа1

Ьуз

ТЬг

1570

1575

1580

аад

ссЕ

Есс

аад

сЕд

асс

ЕаЕ

дЕд

дЕс

ддс

дас

дсд

ЕЕс

дас

ссд

5008

Ьуз

Рго

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Туг

Уа1

Уа1

О1у

Азр

А1а

РЬе

Азр

Рго

1585

1590

1595

дса

дда

сЕд

дЕд

сЕд

сад

сас

дас

ада

сад

дсс

даЕ

сдс

ссс

сса

5053

А1а

О1у

Ьеи

Уа1

Ьеи

О1п

Н1з

Азр

Агд

О1п

А1а

Азр

Агд

Рго

Рго

1600

1605

1610

сад

сса

сЕЕ

дЕЕ

дда

даа

сад

дсс

дас

даа

сдс

дда

сЕд

асд

Едс

5098

О1п

Рго

Ьеи

Уа1

С1у

О1и

О1п

А1а

Азр

О1и

Агд

О1у

Ьеи

ТЬг

Суз

1615

1620

1625

дда

асд

сда

Едс

даЕ

сдс

дЕЕ

даа

сад

сЕд

сдс

ааа

сас

дад

ааЕ

5143

О1у

ТЬг

Агд

Суз

Азр

Агд

Уа1

О1и

О1п

Ьеи

Агд

Ьуз

Н1з

О1и

Азп

1630

1635

1640

сдЕ

даа

дсс

саЕ

сдЕ

асд

ддс

сЕс

даЕ

саЕ

сЕд

даа

ЕЕс

дЕд

ддЕ

5188

Агд

О1и

А1а

Η18

Агд

ТЬг

О1у

Ьеи

Азр

Н1з

Ьеи

О1и

РЬе

Уа1

О1у

1645

1650

1655

дсс

дсс

даЕ

дда

дсд

дЕс

ддЕ

даа

сад

дсс

асс

ЕЕс

аад

дЕд

саЕ

5233

А1а

А1а

Азр

С1у

А1а

Уа1

О1у

О1и

О1п

А1а

ТЬг

РЬе

Ьуз

Уа1

Н1з

1660

1665

1670

дЕс

саЕ

дсс

даЕ

саа

ддЕ

дас

ддс

сдс

саЕ

даЕ

даЕ

дсс

даЕ

даа

5278

ναι

Ηΐ3

А1а

Азр

О1п

О1у

Азр

О1у

Агд

Н1з

Азр

Азр

А1а

Азр

О1и

1675

1680

1685

сдс

даЕ

аЕс

даЕ

сса

саЕ

дЕс

ссЕ

дЕс

даЕ

сас

дсд

дЕс

ддЕ

дад

5323

Агд

Азр

11е

Азр

Рго

Нтз

Уа1

Рго

Уа1

Азр

Нтз

А1а

Уа1

О1у

О1и

- 29 028927

1690 1695 1700

сЬЬ Ьеи 1705

дсд А1а

сдд Агд

дсЬ А1а

дсд А1а

Ьдс Суз 1710

саЬ Ηΐ3

сас Ηΐ3

дЬс Уа1

аЬс 11е

ддЬ О1у 1715

сЬд Ьеи

сдд Агд

дЬс Уа1

дас Азр

5368

асс

саЬ

сдс

сЬс

аад

дса

Ьсс

ддс

ЬЬс

сад

аЬс

ссс

дсс

дас

дас

5413

ТЬг

Ηΐ3

Агд

Ьеи

Ьуз

А1а

Бег

О1у

РЬе

О1п

11е

Рго

А1а

Азр

Азр

1720

1725

1730

аЬд

дсс

дад

аЬс

дас

сдс

аЬс

асс

ддс

ЬЬс

сас

сдс

ЬЬс

дад

сдс

5458

МеЬ

А1а

О1и

11е

Азр

Агд

11е

ТЬг

О1у

РЬе

Ηΐ3

Агд

РЬе

О1и

Агд

1735 1740 1745

сас дЬс ддс Ьда сдЬдаЬЬддд сЬЬссссдсЬ дЬсЬддЬдсс ддсЬсдсда 5509

Ηΐ3 Уа1 О1у

1750

<210> 2

<211> 1752

<212> БЕЛОК

<213> ВгЫЬоЬасЬегЬит. ЫЫЬит.

<400> 2

МеЬ 1

А1а

Уа1

Агд

Агд 5

Ьеи

О1у

О1у

Агд

11е 10

Уа1

А1а

РЬе

А1а

А1а 15

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

Бег 20

11е

Рго

Ьеи

О1у

Ьеи 25

Ьеи

ТЬг

Азп

Бег

А1а 30

Тгр

А1а

Уа1

О1и

А3р 35

А1а

ТЬг

Агд

Бег

А3р 40

Бег

ТЬг

ТЬг

О1п

МеЬ 45

Бег

Бег

ТЬг

Рго

О1и 50

Уа1

Уа1

Туг

Бег

Бег 55

А1а

Уа1

Азр

Бег

Ьуз 60

О1п

Азп

Агд

ТЬг

Бег 65

Азр

РЬе

А3р

А1а

А3п 70

Тгр

Ьуз

РЬе

МеЬ

Ьеи 75

Бег

Азр

Бег

Уа1

О1п 80

А1а

О1п

А3р

Рго

А1а 85

РЬе

А3р

А3р

Бег

А1а 90

Тгр

О1п

О1п

Уа1

Азр 95

Ьеи

Рго

Ηΐ3

А3р

Туг 100

Бег

11е

ТЬг

О1п

Ьуз 105

Туг

Бег

О1п

Бег

Азп 110

О1и

А1а

О1и

Бег

А1а 115

Туг

Ьеи

Рго

О1у

О1у 120

ТЬг

О1у

Тгр

Туг

Агд 125

Ьуз

Бег

РЬе

ТЬг

11е 130

А3р

Агд

А3р

Ьеи

А1а 135

О1у

Ьуз

Агд

11е

А1а 140

11е

Азп

РЬе

Азр

О1у

Уа1

Туг

МеЬ

Азп

А1а

ТЬг

Уа1

Тгр

РЬе

Азп

О1у

Уа1

Ьуз

Ьеи

О1у

- 30 028927

145 150 155 160

ТЪг Нтз

Рго

Туг

О1у Туг 165

Зег

Рго

РЪе

Зег 170

РЪе

Азр

Ьеи

ТЪг

О1у 175

Азп

А1а

Ьуз

РЪе

О1у

О1у

О1и

Азп

ТЪг

11е

Уа1

Уа1

Ьуз

Уа1

О1и

Азп

Агд

180

185

190

Ьеи

Рго

Зег

Зег

Агд

Тгр

Туг

Зег

О1у

Зег

О1у

11е

Туг

Агд

Азр

Уа1

195

200

205

ТЪг

Ьеи

ТЪг

Уа1

ТЪг

Азр

О1у

Уа1

Н1з

Уа1

О1у

Азп

Азп

О1у

Уа1

А1а

210

215

220

11е

Ьуз

ТЪг

Рго

Зег

Ьеи

А1а

ТЪг

О1п

Азп

О1у

О1у

Азр

Уа1

ТЪг

МеЬ

225

230

235

240

Азп

Ьеи

ТЪг

ТЪг

Ьуз

Уа1

А1а

Азп

Азр

ТЪг

О1и

А1а

А1а

А1а

Азп

11е

245

250

255

ТЪг

Ьеи

Ьуз

О1п

ТЪг

Уа1

РЪе

Рго

Ьуз

О1у

О1у

Ьуз

ТЪг

Азр

А1а

А1а

260

265

270

11е

О1у

ТЪг

Уа1

ТЪг

ТЪг

А1а

Зег

Ьуз

Зег

11е

А1а

А1а

О1у

А1а

Зег

275

280

285

А1а

Азр

Уа1

ТЪг

Зег

ТЪг

11е

ТЪг

А1а

А1а

Зег

Рго

Ьуз

Ьеи

Тгр

Зег

290

295

300

11е

Ьуз

Азп

Рго

Азп

Ьеи

Туг

ТЪг

Уа1

Агд

ТЪг

О1и

Уа1

Ьеи

Азп

О1у

305

310

315

320

О1у

Ьуз

Уа1

Ьеи

Азр

ТЪг

Туг

Азр

ТЪг

О1и

Туг

О1у

РЪе

Агд

Тгр

ТЪг

325

330

335

О1у

РЪе

Азр

А1а

ТЪг

Зег

О1у

РЪе

Зег

Ьеи

Азп

О1у

О1и

Ьуз

Уа1

Ьуз

340

345

350

Ьеи

Ьуз

О1у

Уа1

Зег

МеЬ

Н1з

Н1з

Азр

О1п

О1у

Зег

Ьеи

О1у

А1а

Уа1

355

360

365

А1а

Азп

Агд

Агд

А1а

11е

О1и

Агд

О1п

Уа1

О1и

11е

Ьеи

О1п

Ьуз

МеЬ

370

375

380

О1у

Уа1

Азп

Зег

11е

Агд

ТЪг

ТЪг

Нтз

Азп

Рго

А1а

А1а

Ьуз

А1а

Ьеи

385 390 395 400

- 31 028927

11е

Азр

Уа1

Суз

Азп О1и Ьуз 405

О1у

Уа1

Ьеи 410

Уа1

Уа1

О1и

О1и

Уа1 415

РЬе

Азр

МеЬ

Тгр

Азп

Агд

Зег

Ьуз

Азп

О1у

Азп

ТЬг

О1и

Азр

Туг

О1у

Ьуз

420

425

430

Тгр

РЬе

О1у

О1п

А1а

11е

А1а

О1у

Азр

Азп

А1а

Уа1

Ьеи

О1у

О1у

Азр

435

440

445

Ьуз

Азр

О1и

ТЬг

Тгр

А1а

Ьуз

РЬе

Азр

Ьеи

ТЬг

Зег

ТЬг

11е

Азп

Агд

450

455

460

Азр

Агд

Азп

А1а

Рго

Зег

Уа1

11е

МеЬ

Тгр

Зег

Ьеи

О1у

Азп

О1и

МеЬ

465

470

475

480

МеЬ

О1и

О1у

11е

Зег

О1у

Зег

Уа1

Зег

О1у

РЬе

Рго

А1а

ТЬг

Зег

А1а

485

490

495

Ьуз

Ьеи

Уа1

А1а

Тгр

ТЬг

Ьуз

А1а

А1а

Азр

Зег

ТЬг

Агд

Рго

МеЬ

ТЬг

500

505

510

Туг

О1у

Азр

Азп

Ьуз

11е

Ьуз

А1а

Азп

Тгр

Азп

О1и

Зег

Азп

ТЬг

МеЬ

515

520

525

О1у

Азр

Азп

Ьеи

ТЬг

А1а

Азп

О1у

О1у

Уа1

Уа1

О1у

ТЬг

Азп

Туг

Зег

530

535

540

Азр

О1у

А1а

Азп

Туг

Азр

Ьуз

11е

Агд

ТЬг

ТЬг

Нгз

Рго

Зег

Тгр

А1а

545

550

555

560

11е

Туг

О1у

Зег

О1и

ТЬг

А1а

Зег

А1а

11е

Азп

Зег

Агд

О1у

11е

Туг

565

570

575

Азп

Агд

ТЬг

ТЬг

О1у

О1у

А1а

О1п

Зег

Зег

Азр

Ьуз

О1п

Ьеи

ТЬг

Зег

580

585

590

Туг

Азр

Азп

Зег

А1а

Уа1

О1у

Тгр

О1у

А1а

Уа1

А1а

Зег

Зег

А1а

Тгр

595

600

605

Туг

Азр

Уа1

Уа1

О1п

Агд

Азр

РЬе

Уа1

А1а

О1у

ТЬг

Туг

Уа1

Тгр

ТЬг

610

615

620

О1у

РЬе

Азр

Туг

Ьеи

О1у

О1и

Рго

ТЬг

Рго

Тгр

Азп

О1у

ТЬг

О1у

Зег

625

630

635

640

О1у

А1а

Уа1

С1у

Зег

Ьеи

А1а

Уа1

А1а

О1и

О1и

Ьеи

Уа1

Ьеи

Агд

Нгз

645

650

655

- 32 028927

Агд Агд Ηΐ3

Агд 660

Агд Ьеи

Рго

О1и

Азр 665

ТЬг Туг Туг

РЬе

Туг 670

Ο1η

Зег

Ο1η

Тгр

Азп

Азр

Азр

Уа1

Н1з

ТЬг

Ьеи

Н1з

11е

Ьеи

Рго

А1а

Тгр

Азп

675

680

685

О1и

Азп

Уа1

Уа1

А1а

Ьуз

О1у

Зег

О1у

Азп

Азп

Уа1

Рго

Уа1

Уа1

Уа1

690

695

700

Туг

ТЬг

Азр

А1а

А1а

Ьуз

Уа1

Ьуз

Ьеи

Туг

РЬе

ТЬг

Рго

Ьуз

О1у

Зег

705

710

715

720

ТЬг

О1и

Ьуз

Агд

Ьеи

11е

О1у

О1и

Ьуз

Зег

РЬе

ТЬг

Ьуз

Ьуз

ТЬг

ТЬг

725

730

735

А1а

А1а

О1у

Туг

ТЬг

Туг

Ο1η

Уа1

Туг

О1и

О1у

Зег

Азр

Ьуз

Азр

Зег

740

745

750

ТЬг

А1а

ΗΪ8

Ьуз

Азп

МеЬ

Туг

Ьеи

ТЬг

Тгр

Азп

Уа1

Рго

Тгр

А1а

О1и

755

760

765

О1у

ТЬг

11е

Зег

А1а

О1и

А1а

Туг

Азр

О1и

Азп

Азп

Агд

Ьеи

11е

Рго

770

775

780

О1и

О1у

Зег

ТЬг

О1и

О1у

Азп

А1а

Зег

Уа1

ТЬг

ТЬг

ТЬг

О1у

Ьуз

А1а

785

790

795

800

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьуз

А1а

Азр

А1а

Азр

Агд

Ьуз

ТЬг

11е

ТЬг

А1а

Азр

О1у

805

810

815

Ьуз

Азр

Ьеи

Зег

Туг

11е

О1и

Уа1

Азр

Уа1

ТЬг

Азр

А1а

Азп

О1у

Н1з

820

825

830

11е

Уа1

Рго

Азр

А1а

А1а

Азп

Агд

Уа1

ТЬг

РЬе

Азр

Уа1

Ьуз

О1у

А1а

835

840

845

О1у

Ьуз

Ьеи

Уа1

О1у

Уа1

Азр

Азп

О1у

Зег

Зег

Рго

Азр

Н1з

Азр

Зег

850

855

860

Туг

Ο1η

А1а

Азр

Азп

Агд

Ьуз

А1а

РЬе

Зег

О1у

Ьуз

Уа1

Ьеи

А1а

11е

865

870

875

880

Уа1

Ο1η

Зег

ТЬг

Ьуз

О1и

А1а

О1у

О1и

11е

ТЬг

Уа1

ТЬг

А1а

Ьуз

А1а

885

890

895

Азр

О1у

Ьеи

Ο1η

Зег

Зег

ТЬг

Уа1

Ьуз

11е

А1а

ТЬг

ТЬг

А1а

Уа1

Рго

900

905

910

- 33 028927

О1у ТЬг	Зег 915	ТЬг	О1и Ьуз	ТЬг Уа1 920	Агд	Зег	РЬе	Туг Туг 925	Зег Агд	Азп
Туг Туг 930	Уа1	Ьуз	ТЬг О1у	Азп Ьуз 935	Рго	11е	Ьеи	Рго Зег 940	Азр Уа1	О1и
Уа1 Агд 945	Туг	Зег	Азр О1у 950	ТЬг Зег	Азр	Агд	О1п 955	Азп Уа1	ТЬг Тгр	Азр 960
А1а Уа1	Зег	Азр	Азр О1п 965	11е А1а	Ьуз	А1а 970	О1у	Зег РЬе	Зег Уа1 975	А1а
О1у ТЬг	Уа1	А1а 980	О1у О1п	Ьуз 11е	Зег 985	Уа1	Агд	Уа1 ТЬг	МеЬ 11е 990	Азр
О1и 11е	О1у 995	А1а	Ьеи Ьеи	Азп Туг 100С	Зег А1а Зег ТЬг Рго Уа1 О1у ТЬг ι 1005

Рго

А1а 1010

Уа1

Ьеи

Рго

О1у

Зег 1015

Агд

Рго

А1а

Уа1

Ьеи 1020

Рго

Азр

О1у

ТЬг

Уа1

ТЬг

Зег

А1а

Азп

РЬе

А1а

Уа1

Н1з

Тгр

ТЬг

Ьуз

Рго

А1а

1025

1030

1035

Азр

ТЬг

Уа1

Туг

Азп

ТЬг

А1а

О1у

ТЬг

Уа1

Ьуз

Уа1

Рго

О1у

ТЬг

1040

1045

1050

А1а

ТЬг

Уа1

РЬе

О1у

Ьуз

О1и

РЬе

Ьуз

Уа1

ТЬг

А1а

ТЬг

11е

Агд

1055

1060

1065

Уа1

О1п

Агд

Зег

О1п

Уа1

ТЬг

11е

О1у

Зег

Зег

Уа1

Зег

О1у

Азп

1070

1075

1080

А1а

Ьеи

Агд

Ьеи

ТЬг

О1п

Азп

11е

Рго

А1а

Азр

Ьуз

О1п

Зег

Азр

1085

1090

1095

ТЬг

Ьеи

Азр

А1а

11е

Ьуз

Азр

О1у

Зег

ТЬг

ТЬг

Уа1

Азр

А1а

Азп

1100

1105

1110

ТЬг

О1у

О1у

О1у

А1а

Азп

Рго

Зег

А1а

Тгр

ТЬг

Азп

Тгр

А1а

Туг

1115

1120

1125

Зег

Ьуз

А1а

О1у

Н1з

Азп

ТЬг

А1а

О1и

11е

ТЬг

РЬе

О1и

Туг

А1а

1130

1135

1140

ТЬг

О1и

О1п

О1п

Ьеи

О1у

О1п

11е

Уа1

МеЬ

Туг

РЬе

РЬе

Агд

Азр

- 34 028927

1145 1150 1155

Зег

Азп 1160

А1а Уа1

Агд

РЬе

Рго 1165

Азр

А1а

О1у

Ьуз

ТЬг 1170

Ьуз

11е

О1п

11е

Зег

А1а

Азр

О1у

Ьуз

Азп

Тгр

ТЬг

Азр

Ьеи

А1а

А1а

ТЬг

О1и

1175

1180

1185

ТЬг

11е

А1а

А1а

О1п

О1и

Зег

Зег

Азр

Агд

Уа1

Ьуз

Рго

Туг

ТЬг

1190

1195

1200

Туг

Азр

РЬе

А1а

Рго

Уа1

О1у

А1а

ТЬг

РЬе

Уа1

Ьуз

Уа1

ТЬг

Уа1

1205

1210

1215

ТЬг

Азп

А1а

Азр

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Рго

Зег

О1у

Уа1

Уа1

Суз

А1а

О1у

1220

1225

1230

Ьеи

ТЬг

О1и

11е

О1и

Ьеи

Ьуз

ТЬг

А1а

ТЬг

Зег

Ьуз

РЬе

Уа1

ТЬг

1235

1240

1245

Азп

ТЬг

Зег

А1а

А1а

Ьеи

Зег

Зег

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азп

О1у

ТЬг

Ьуз

1250

1255

1260

Уа1

Зег

Азр

Зег

Уа1

Ьеи

А1а

А1а

О1у

Зег

Туг

Азп

ТЬг

Рго

А1а

1265

1270

1275

11е

11е

А1а

Азр

Уа1

Ьуз

А1а

О1и

О1у

О1и

О1у

Азп

А1а

Зег

Уа1

1280

1285

1290

ТЬг

Уа1

Ьеи

Рго

А1а

Ηΐ3

Азр

Азп

Уа1

11е

Агд

Уа1

11е

ТЬг

О1и

1295

1300

1305

Зег

О1и

Азр

Ηΐ3

Уа1

ТЬг

Агд

Ьуз

ТЬг

РЬе

ТЬг

11е

Азп

Ьеи

О1у

1310

1315

1320

ТЬг

О1и

О1п

О1и

РЬе

Рго

А1а

Азр

Зег

Азр

О1и

Агд

Азр

Туг

Рго

1325

1330

1335

А1а

А1а

Азр

МеЬ

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

О1у

Зег

О1и

О1п

ТЬг

Зег

О1у

1340

1345

1350

ТЬг

А1а

ТЬг

О1и

О1у

Рго

Ьуз

Ьуз

РЬе

А1а

Уа1

Азр

О1у

Азп

ТЬг

1355

1360

1365

Зег

ТЬг

Туг

Тгр

Ηΐ3

Зег

Азп

Тгр

ТЬг

Рго

ТЬг

ТЬг

Уа1

Азп

Азр

1370 1375 1380

- 35 028927

Ьеи

Тгр 1385

11е А1а

РЬе

О1и Ьеи 1390

О1п

Ьуз

Рго

ТЬг

Ьуз 1395

Ьеи Азр

А1а

Ьеи

Агд

Туг

Ьеи

Рго

Агд

Рго

А1а

О1у

Зег

Ьуз

Азп

О1у

Зег

Уа1

1400

1405

1410

ТЬг

О1и

Туг

Ьуз

Уа1

О1п

Уа1

Зег

Азр

Азр

О1у

ТЬг

Азп

Тгр

ТЬг

1415

1420

1425

Азр

А1а

О1у

Зег

О1у

ТЬг

Тгр

ТЬг

ТЬг

Азр

Туг

О1у

Тгр

Ьуз

Ьеи

1430

1435

1440

А1а

О1и

РЬе

Азп

О1п

Рго

Уа1

ТЬг

ТЬг

Ьуз

Н1з

Уа1

Агд

Ьеи

Ьуз

1445

1450

1455

А1а

Уа1

Н1з

ТЬг

Туг

А1а

Азр

Зег

О1у

Азп

Азр

Ьуз

РЬе

Ме/

Зег

1460

1465

1470

А1а

Зег

О1и

11е

Агд

Ьеи

Агд

Ьуз

А1а

Уа1

Азр

ТЬг

ТЬг

Азр

11е

1475

1480

1485

Зег

О1у

А1а

ТЬг

Уа1

ТЬг

Уа1

Рго

А1а

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Уа1

Азр

Агд

1490

1495

1500

Уа1

Азр

А1а

Азр

Н1з

Рго

А1а

ТЬг

РЬе

А1а

ТЬг

Ьуз

Азр

Уа1

ТЬг

1505

1510

1515

Уа1

ТЬг

Ьеи

О1у

Азр

А1а

ТЬг

Ьеи

Агд

Туг

О1у

Уа1

Азр

Туг

Ьеи

1520

1525

1530

Ьеи

Азр

Туг

А1а

О1у

Азп

ТЬг

А1а

Уа1

О1у

Ьуз

А1а

ТЬг

Уа1

ТЬг

1535

1540

1545

Уа1

Агд

О1у

11е

Азр

Ьуз

Туг

Зег

О1у

ТЬг

Уа1

А1а

Ьуз

ТЬг

РЬе

1550

1555

1560

ТЬг

11е

О1и

Ьеи

Ьуз

Азп

А1а

Рго

А1а

Рго

О1и

Рго

ТЬг

Ьеи

ТЬг

1565

1570

1575

Зег

Уа1

Зег

Уа1

Ьуз

ТЬг

Ьуз

Рго

Зег

Ьуз

Ьеи

ТЬг

Туг

Уа1

Уа1

1580

1585

1590

О1у

Азр

А1а

РЬе

Азр

Рго

А1а

О1у

Ьеи

Уа1

Ьеи

О1п

Н1з

Азр

Агд

1595

1600

1605

О1п

А1а

Азр

Агд

Рго

Рго

О1п

Рго

Ьеи

Уа1

О1у

О1и

О1п

А1а

Азр

1610

1615

1620

- 36 028927

О1и Агд

О1у

Ьеи

ТНг

Суз

О1у 1630

ТНг Агд

Суз

Азр

Агд 1635

Уа1

О1и

О1п

1625

Ьеи

Агд

Ьуз

Шз

О1и

Азп

Агд

О1и

А1а

Шз

Агд

ТНг

О1у

Ьеи

Азр

1640

1645

1650

Шз

Ьеи

О1и

РНе

Уа1

О1у

А1а

А1а

Азр

О1у

А1а

Уа1

О1у

О1и

О1п

1655

1660

1665

А1а

ТНг

РНе

Ьуз

Уа1

Шз

Уа1

Шз

А1а

Азр

О1п

О1у

Азр

О1у

Агд

1670

1675

1680

Шз

Азр

А3р

А1а

А3р

О1и

Агд

Азр

11е

Азр

Рго

Шз

Уа1

Рго

Уа1

1685

1690

1695

Азр

Шз

А1а

Уа1

О1у

О1и

Ьеи

А1а

Агд

А1а

А1а

Суз

Шз

Шз

Уа1

1700

1705

1710

11е

О1у

Ьеи

Агд

Уа1

Азр

ТНг

Шз

Агд

Ьеи

Ьуз

А1а

Зег

О1у

РНе

1715

1720

1725

О1п

11е

Рго

А1а

А3р

Азр

МеЬ

А1а

О1и

11е

Азр

Агд

11е

ТНг

О1у

1730

1735

1740

РНе

Шз

Агд

РНе

О1и

Агд

Шз

Уа1

О1у

1745

1750

Claims (13)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения композиции, включающей один или несколько галактоолигосахаридов, причем способ включает этапы:

   a) получение смеси, содержащей

   галактозильный донор, содержащий галактозильную группу, связанную с отщепляемой группой, причем галактозильный донор обладает молярной массой не более 350 г/моль,

   галактозильный акцептор, который отличается от галактозильного донора, причем указанный галактозильный акцептор является сахаридом или сахароспиртом,

   где молярное соотношение между галактозильным акцептором и галактозильным донором составляет по меньшей мере 1:10 и где смесь содержит по меньшей мере 0,05 моль/л галактозильного акцептор^а;

   b) обеспечение присутствия первого фермента, причем указанный первый фермент обладает βгалактозидазной активностью и трансгалактозилирующей активностью, при этом указанный первый фермент контактирует со смесью; и

   c) инкубирование смеси и первого фермента, тем самым предоставляя возможность первому ферменту высвободить отщепляемую группу галактозильного донора и перенести галактозильную группу галактозильного донора к галактозильному акцептору, таким образом образуя галактоолигосахарид, при этом этап с) дополнительно включает удаление из инкубационной смеси отщепляемой группы, высвобожденной из галактозильного донора, где удаление отщепляемой группы, высвобожденной из галактозильного донора, включает физическое удаление свободных отщепляемых групп из инкубационной смеси и/или превращение свободных отщепляемых групп в одно или несколько других химических соединений, которые все еще могут присутствовать в инкубационной смеси, с получением в результате композиции, содержащей один или несколько галактоолигосахаридов.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что отщепляемая группа галактозильного донора является гликозильной группой.

   - 37 028927
3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что галактозильный донор является лактозой или лактитолом.
4. 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий обеспечение присутствия второго фермента, который способен превращать свободные отщепляемые группы, высвобожденные из галактозильного донора, и предоставление возможности указанному второму ферменту в течение инкубации превращать отщепляемую группу, высвобожденную из галактозильного донора.
5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что второй фермент обладает глюкозооксидазной активностью.
6. 6. Способ по любому из пп.4, 5, отличающийся тем, что:

   a) константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе по меньшей мере в 10 раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному акцептору;

   b) константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе по меньшей мере в 10 раз выше, чем его константа специфичности по отношению к галактозильному донору; или

   c) константа специфичности второго фермента по отношению к свободной отщепляемой группе по меньшей мере в 10 раз выше, чем его константа специфичности по отношению к моногалактозилированному галактозильному акцептору.
7. 7. Способ по любому из пп.5, 6, отличающийся тем, что способ дополнительно включает обеспечение присутствия фермента, обладающего каталазной активностью, причем фермент контактирует с инкубационной смесью.
8. 8. Способ по любому из пп.4-7, отличающийся тем, что способ дополнительно включает обеспечение присутствия средства для удаления, способного удалять, по меньшей мере, некоторые из продуктов превращения, полученные путем превращения отщепляемой группы с помощью второго фермента, и предоставление возможности средству для удаления в течение инкубации удалять, по меньшей мере, некоторые из продуктов превращения.
9. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что средство для удаления содержит соль иона двухвалентного или трехвалентного металла.
10. 10. Способ по п.8, отличающийся тем, что средство для удаления содержит анионообменный материал или даже состоит из него.
11. 11. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что этап с) включает добавление дополнительного галактозильного донора.
12. 12. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что концентрацию галактозильного донора смеси в течение этапа с) поддерживают при концентрации 0,01-1 моль/л.
13. 13. Способ по любому из предыдущих пунктов, дополнительно включающий этап ά) обогащения галактоолигосахарида композиции этапа с).

    Донор

    ®-о

    +

    : Акцептор