CN108138208A - 由乳糖生产半乳寡糖的方法 - Google Patents

由乳糖生产半乳寡糖的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108138208A
CN108138208A CN201780003136.XA CN201780003136A CN108138208A CN 108138208 A CN108138208 A CN 108138208A CN 201780003136 A CN201780003136 A CN 201780003136A CN 108138208 A CN108138208 A CN 108138208A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lactase
aqueous solution
lactose
gos
initial
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780003136.XA
Other languages
English (en)
Inventor
S·托谬克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vita Ruth Nutrition Co Ltd
Original Assignee
Vita Ruth Nutrition Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vita Ruth Nutrition Co Ltd filed Critical Vita Ruth Nutrition Co Ltd
Publication of CN108138208A publication Critical patent/CN108138208A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0036—Galactans; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01108—Lactase (3.2.1.108)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Dairy Products (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

公开了由乳糖酶法制备半乳寡糖(GOS)的方法，其中使用两种不同的微生物乳糖酶以便在乳糖消化过程中使转半乳糖基化程度最大化。还公开了用于避免包含GOS和乳糖的溶液在被调整用于与酵母中性乳糖酶一起温育时混浊的方法。

Description

由乳糖生产半乳寡糖的方法
背景
1.领域
本公开涉及由乳糖酶法制备半乳寡糖(GOS)的方法。更具体地，本公开涉及两种不同微生物乳糖酶的依次应用，以便在乳糖消化期间使转半乳糖基化程度最大化。
2.相关领域的描述
半乳寡糖(GOS)是不可消化的碳水化合物，其用作人乳中寡糖的结构单元。GOS调节肠胃微生物的生长和活性，因此被认为促进肠道中微生物的健康平衡。尤其，GOS被认为可降低血清胆固醇水平，改善矿物质吸收，并预防结肠癌的发生。GOS的性质主要取决于化学组成、结构和聚合度(DP)。
GOS可以通过用β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶消化乳糖而形成。β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶催化半乳糖基部分从乳糖的非还原端水解。此外，β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶可以催化转半乳糖基化，其中半乳糖基部分被转移到除水之外的亲核受体，即可能是存在于反应介质中的任何糖。转半乳糖基化是动力学控制的反应，并且代表水解与合成反应之间的竞争。促进合成超过水解的能力取决于几个因素，包括β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的来源和介质中与所述酶一起存在的受体糖的初始组成(例如乳糖和半乳糖)。如果乳糖是最初的底物，则转半乳糖基化导致产生GOS，其包含二-(DP2)、三-(DP3)和具有或没有末端葡萄糖的甚至更高级的寡糖(DP4+)的混合物。GOS的化学结构和组成(例如己糖部分的数量和键连的类型)影响其性质，例如肠道中益生菌发酵模式。GOS的化学组成、结构、聚合度和收率也取决于所用β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的来源。
许多成人是乳糖不耐受的，因此在由乳糖制备GOS过程中期望尽可能多地水解乳糖。然而，有利于酶法消化乳糖至例如小于20％的初始乳糖浓度的反应条件也倾向于有利于消化所合成的GOS。因此，降低乳糖浓度可能导致GOS收率降低。
概述
本公开涉及由乳糖生产半乳寡糖(GOS)的方法。该方法包括将包含初始浓度的乳糖的初始水溶液与酸性真菌乳糖酶一起温育以产生包含乳糖和GOS的中间水溶液，其中乳糖的浓度为初始水溶液的初始浓度的约30％-约70％；向中间水溶液中加入酵母乳糖酶；并且温育包含酵母乳糖酶的中间水溶液以产生最终的水溶液，其中乳糖的浓度为初始水溶液的初始浓度的0％-20％之间。温育初始水溶液以产生中间水溶液可涉及温育初始水溶液以产生具有初始水溶液的初始乳糖浓度的约40％的中间水溶液。温育初始水溶液以产生中间水溶液可涉及温育初始水溶液以产生中间水溶液，其包含占中间水溶液中总糖的49％-52％的DP2糖(w/w)。将中间水溶液与酵母乳糖酶一起温育以产生最终水溶液，可涉及温育中间水溶液以产生最终水溶液，其中包含最终水溶液中总糖的23.5％-25％的DP2糖(w/w)。
该方法还可以包括在加入酵母乳糖酶之前用KOH、MgCl2和柠檬酸将中间水溶液的pH调节至5.5至9.0之间。用KOH、MgCl2和柠檬酸将中间水溶液的pH调节至5.5至9.0之间可以包括将pH调节至6.0至7.5。用KOH、MgCl2和柠檬酸将中间水溶液的pH调节至5.5至9.0之间可包括将pH调节至约6.8。用KOH、MgCl2和柠檬酸调节中间水溶液的pH值可以包括将KOH、MgCl2和柠檬酸依次加入到中间水溶液中。依次地将KOH、MgCl2和柠檬酸加入到中间水溶液中包括：按顺序用KOH调节中间水溶液的pH至约9.2；向中间水溶液中加入约0.16g MgCl2/100g水溶液；并将中间水溶液的pH从约9.1调节至约6.8。
所述酸性真菌乳糖酶可以为真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。
所述真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶可以来源于曲霉菌属(Aspergillus)的种类。曲霉菌属的种类可以是米曲霉(Aspergillus oryzae)。所述酸性真菌乳糖酶的浓度可以以溶液中每克乳糖的乳糖酶单位(LU)表示。初始水溶液中酸性真菌乳糖酶的浓度可以是初始水溶液中1-300LU/克乳糖。酸性真菌乳糖酶的浓度可以是初始水溶液中约10-约20LU/克乳糖。酸性真菌乳糖酶的浓度可以在初始水溶液中约15-约17LU/克乳糖。酸性真菌乳糖酶的浓度可以为初始水溶液中约16.7LU/克乳糖。或者，酸性真菌乳糖酶的浓度可以为初始水溶液中约5.6LU/克乳糖，或初始水溶液中约5.8LU/克乳糖。
所述酵母中性乳糖酶可以为酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。所述酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶可以来源于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的种类。克鲁维酵母属的种类可以为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
向中间水溶液中加入酵母中性乳糖酶可以包括加入酵母乳糖酶至中间水溶液中1至50LU/克乳糖的浓度。向中间水溶液中添加酵母中性乳糖酶可以包括将酵母乳糖酶添加至中间水溶液中约4-约5LU/克乳糖的浓度。向中间水溶液中添加酵母中性乳糖酶可以包括将酵母乳糖酶添加至中间水溶液中约4.7LU/克乳糖的浓度。向中间水溶液中添加酵母中性乳糖酶可以包括将酵母乳糖酶添加至中间水溶液中约4.4LU/克乳糖的浓度。
初始水溶液中乳糖的初始浓度可以在15-63°Bx之间。初始水溶液中乳糖的初始浓度可以在约30°Bx-约60°Bx之间。初始水溶液中乳糖的初始浓度可以为约45°Bx。初始水溶液中乳糖的初始浓度可以为约53°Bx。
初始水溶液可以在约25至65℃的温度与真菌酸性乳糖酶一起温育。温度可以在约40至约55℃之间。初始水溶液可以在约53.5℃的温度与真菌乳糖酶一起温育。
初始水溶液可以与真菌乳糖酶在约2.5至约8.0之间的pH下温育。初始水溶液可以与真菌乳糖酶在约3.5至约6.5的pH下温育。在具体的实施方案中，初始水溶液与真菌乳糖酶在约4.5和约5.5之间的pH下温育。
在一些实施方案中，该方法包括在添加酵母中性乳糖酶之前使真菌酸性乳糖酶失活。在一些实施方案中，使真菌乳糖酶失活包括将中间水溶液的pH调节至约2或更低。在一些实施方案中，使真菌酸性乳糖酶失活包括将中间水溶液的pH调节至约2。可以用盐酸(HCl)调节中间水溶液的pH以使真菌乳糖酶失活。在一些实施方案中，使真菌酸性乳糖酶失活包括加热至72℃以上。
中间水溶液可以在约4至约50℃的温度与酵母中性乳糖酶一起温育。在一些实施方案中，中间水溶液与酵母乳糖酶在约30至约45℃之间的温度一起温育。在一些实施方案中，将中间水溶液与酵母乳糖酶在约36.5℃的温度一起温育。
该方法可以进一步包括使酵母乳糖酶失活。在一些实施方案中，使酵母乳糖酶失活包括将最终水溶液的pH调节至约pH 5.5。在一些实施方案中，用柠檬酸将最终水溶液的pH调节至约pH 5.5。在一些实施方案中，使酵母乳糖酶失活包括在72℃温育最终的水溶液。
该方法可进一步包括通过色谱法从最终水溶液中部分去除葡萄糖和半乳糖以产生富含GOS的溶液。
该方法还可以包括通过色谱法从最终的水溶液中除去真菌酸性乳糖酶、酵母中性乳糖酶、葡萄糖和半乳糖。
在一些实施方案中，通过离子交换色谱法从最终的水溶液中除去真菌酸性乳糖酶和酵母中性乳糖酶。
在一些实施方案中，通过离子交换、过滤、色谱分离或另外的发酵反应从最终的水溶液中至少部分地去除葡萄糖和/或半乳糖。在一些实施方案中，色谱分离包括模拟移动床色谱。
本公开还涉及根据如上所述方法生产的半乳寡糖(GOS)糖浆。在一些实施方案中，GOS糖浆为在GOS糖浆中GOS占总碳水化合物的至少40％w/w。在一些实施方案中，GOS糖浆为在GOS糖浆中GOS占总碳水化合物的至少65％w/w。
在一些实施方案中，GOS糖浆中DP2∶DP3∶DP4之比为约2∶3∶1。
本公开还一般涉及来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶与来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖基水解酶的组合在由包含乳糖的水溶液制备半乳寡糖(GOS)糖浆中的用途，其中所述GOS糖浆为GOS糖浆中GOS占总碳水化合物至少约40％w/w。来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖基水解酶用于与所述水溶液一起温育，然后将所述水溶液与来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起温育。
在一些实施方案中，GOS糖浆可以为GOS糖浆中GOS占总碳水化合物至少约60％w/w。在一些实施方案中，GOS糖浆可以为GOS糖浆中GOS占总碳水化合物的至少约65％w/w。
本公开还一般涉及来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶用于增加包含乳糖的水溶液中的半乳寡糖(GOS)的量中的用途，所述包含乳糖的水溶液预先已用来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶处理。在一些实施方案中，GOS的量可以增加至占溶液中至少40％w/w的总碳水化合物。在一些实施方案中，GOS的多样性可以增加。
本发明还一般涉及来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶与来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的组合用于将水溶液中的乳糖浓度降至低于乳糖初始浓度的20％w/w的用途。将来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶用于与水溶液一起温育，然后将该水溶液与来源于乳酸克鲁维酵母的β-D半乳糖苷半乳糖水解酶一起温育。
本发明的其它方面和特征在结合附图回顾如下本发明的具体实施方案时对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。
附图简述
在附图中示例了本发明的实施方案，
图1是生产GOS糖浆的方法的流程图，如本文实施例5中所公开。
图2是本文实施例5中所公开、使用来自米曲霉的真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶使乳糖初步转半乳糖基化后的HPLC色谱图。
图3是本文实施例5中所公开、使用来自克鲁维酵母属的酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶使乳糖二次转半乳糖基化后的HPLC色谱图。
图4是本文实施例6中所公开、生产GOS糖浆的方法的流程图。
图5是本文实施例6中所公开、使用来自米曲霉的真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶使乳糖初步转半乳糖基化后的HPLC色谱图。
图6是本文实施例6中所公开、使用来自克鲁维酵母属的酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶使乳糖二次转半乳糖基化后的HPLC色谱图。
图7是本文实施例6中所公开、纯化和富集后终产物的HPLC色谱图。
详细描述
定义
如本文所用，“DP”是指GOS的聚合度。二糖GOS被表征为“DP2”。三糖GOS被表征为“DP3”。四糖GOS被表征为“DP4”。本领域技术人员将理解，每个分组可以包括多个种类的GOS，其在糖部分的顺序和部分之间的键连方面不同。
如本文所用，“初始水溶液”是指被制备用于且被作为主要活性乳糖酶的酸性真菌乳糖酶消化的乳糖溶液。
如本文所用，“乳糖的初始浓度”是指加入以产生初始水溶液的乳糖的量，包括在开始与酸性真菌乳糖酶温育后可加入到初始水溶液中的任何乳糖。
如本文所用，“中间水溶液”是指在有效终止酸性真菌乳糖酶对初始水溶液的消化后得到的乳糖溶液，其然后被酵母中性乳糖酶消化。
如本文所用，“最终水溶液”是指在有效终止酵母中性乳糖酶对中间水溶液的消化后得到的乳糖溶液。
本公开涉及使用酸性乳糖酶和中性乳糖酶的组合由乳糖生产半乳寡糖(GOS)的方法。更具体地，该方法包括将包含乳糖的水溶液与酸性真菌乳糖酶一起温育。酸性真菌乳糖酶将溶液中的乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。乳糖酶进一步催化转半乳糖基化反应，其中将半乳糖基部分转移至存在于溶液中的潜在任何糖部分(例如半乳糖、葡萄糖、乳糖等)，以产生包含DP2、DP3、DP4、DP5以及甚至更高级寡糖的混合物的GOS。
使用酸性真菌乳糖酶的初步消化
在本文公开的方法的各种实施方案中，酸性真菌乳糖酶是真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶可以来源于曲霉菌属的种类。在具体的实施方案中，β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶来源于米曲霉，例如可得自Enzyme Development Corporation(New York)的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，为ENZECOTM真菌乳糖酶浓缩物。本领域技术人员将理解，乳糖酶单位(LU)的确定将在酶TDS中说明。可将一个LU定义为在TDS中指定的测定条件下将释放1.0μmol/min邻硝基苯酚的酶的量。初始水溶液中酸性真菌乳糖酶的浓度可以是在初始水溶液中每克乳糖1至300LU之间。酸性真菌乳糖酶的浓度可以是在初始水溶液中约10-约20LU/克乳糖。酸性真菌乳糖酶的浓度可以是在初始水溶液中约15-约17LU/克乳糖。在具体的实施方案中，酸性真菌乳糖酶的浓度可以是在初始水溶液中约16.7LU/克乳糖。在具体的实施方案中，酸性真菌乳糖酶的浓度可以是在初始水溶液中约5.6LU/克乳糖。在具体的实施方案中，酸性真菌乳糖酶的浓度可以是在初始水性中约5.8LU/克乳糖。尽管如此，本领域技术人员将会理解，本文公开的方法可以用范围广泛的酸性乳糖酶浓度进行，这取决于许多因素，包括水溶液中乳糖的初始浓度、允许进行反应的时间期限、pH和反应温度。
乳糖的来源可能会有所不同。乳糖可以以乳渗透物的形式提供。或者，乳糖可以作为食用结晶乳糖提供，它们通常可从商业供应商获得。初始水溶液中乳糖的初始浓度应在15至63°Bx的范围内。然而，本领域技术人员将理解，出于商业目的，乳糖的初始浓度应当高于15°Bx，因为较低浓度的乳糖有利于水解超过转半乳糖基化，从而导致较低的GOS收率。此外，较低的乳糖初始浓度需要较大的待处理的体积以获得相同量的产品，因此需要更多下游分离资源，例如色谱设备和蒸发器。因此，初始水溶液中的乳糖的初始浓度将优选在约30°Bx-约60°Bx。在具体的实施方案中，初始水溶液中乳糖的初始浓度约为45°Bx。在具体的实施方案中，初始水溶液中乳糖的初始浓度约为53°Bx。
初始水溶液的pH应当在约2.5-约8.0的范围内。然而，本领域技术人员将理解，初始水溶液的pH值应当接近该酶的最佳pH值。因此，在一些实施方案中，初始水溶液的pH将介于约3.5-约6.5之间。在一些实施方案中，初始水溶液的pH将介于约4.5-约5.5之间。例如，ENZECOTM真菌乳糖酶浓缩物在约2.5-约2.8的pH范围内具有活性，不过，该活性在约3.5-约6.5的pH范围之外可能是缓慢的。例如，ENZECOTM真菌乳糖酶浓缩物具有在4.5-5.0之间的最佳pH。
本领域技术人员将理解，包含乳糖的溶液的pH可以根据乳糖的浓度和乳糖来源的不同而改变。因此，可能有必要将初始水溶液的pH调节到适合的pH范围内以使初始水溶液的pH在期望的范围内。
将初始水溶液与真菌乳糖酶在约35-约65℃的温度温育。例如，ENZECOTM真菌乳糖酶浓缩液在pH 4.5-6.5时具有55℃的最佳温度。因此，在一些实施方案中，在约50-约56.5℃的温度将初始水溶液与酸性真菌乳糖酶一起温育。在一些实施方案中，将初始水溶液与酸性真菌乳糖酶在约50-约55℃的温度温育。在具体的实施方案中，在约53.5℃的温度将初始水溶液与酸性真菌乳糖酶一起温育。
本领域技术人员将理解，本文公开的方法不受限于初始水溶液与酸性真菌乳糖酶一起温育的任何特定反应时间。而是，允许反应进行，直到初始水溶液中提供的乳糖的约20％-约70％被水解(即直到乳糖的浓度为乳糖在初始水溶液中的初始浓度的约20％-约70％)。在具体的实施方案中，允许反应进行，直到初始水溶液中提供的约40％的乳糖被水解(即直到乳糖的浓度为初始水溶液中乳糖的初始浓度的约40％)和/或直至DP2糖占中间水溶液中总糖的49％-52％(w/w)。因此，可以实时监测初始水溶液中乳糖和其它糖的浓度，以鉴定终止与酸性真菌乳糖酶一起温育的适当时间。本领域技术人员将会理解，温育时间取决于温度、初始乳糖浓度、pH和乳糖酶浓度的组合。如果酶的成本不重要，则反应可以用高浓度的酶快速进行。或者，如果反应进行得更慢，则酶的成本可能会被节省。参数也可以根据反应时间如何在下游过程中进行逻辑配合来调整。
使用中性酵母乳糖酶的二次消化
一旦达到水溶液中乳糖的期望浓度(和/或DP2糖浓度为中间水溶液中总糖的约49％-52％(w/w))，则将该中间水溶液与酵母中性乳糖酶一起温育。在添加酵母中性乳糖酶之前，可以优选使酸性真菌乳糖酶失活。使酸性真菌乳糖酶失活可涉及用例如HCl将中间水溶液的pH调节至约2或更低。使酸性真菌乳糖酶失活是为了使酸性真菌乳糖酶对GOS的水解最小化，从而使GOS收率最大化。然而，本领域技术人员将会理解，使酸性真菌乳糖酶失活的主动步骤可能并非是完全必要的。
将中性酵母乳糖酶加入到包含GOS和约20-约70％初始乳糖的中间水溶液中以达到一定浓度。在本文公开的不同的实施方案中，所述中性酵母乳糖酶是酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶可以来源于克鲁维酵母属的种类。在具体的实施方案中，β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶来源于乳酸克鲁维酵母，例如作为ENZECOTM LactaseNL 2.5X、得自Enzyme Development Corporation(New York)的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。可以将酵母中性乳糖酶以在中间水溶液中1-50LU/克乳糖的浓度加入到中间水溶液中。可以将酵母中性乳糖酶以在中间水溶液中约4-约5LU/g乳糖的浓度加入到中间水溶液中。可以将酵母中性乳糖酶以在中间水溶液中约4.7LU/克乳糖的浓度加入到中间水溶液中。可以将酵母中性乳糖酶以在中间水溶液中约4.4LU/克乳糖的浓度加入到中间水溶液中。尽管如此，本领域技术人员将理解，本文公开的方法可以使用宽泛的酵母乳糖酶浓度进行，这取决于许多因素，包括乳糖在中间水溶液中的初始浓度、允许反应进行的时间期限、pH和反应温度。
在某些实施方案中，例如，其中中性酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶来源于克鲁维酵母属的种类，可能有必要为酶活性加入钾和镁。在其中必须将pH调节至5.5或以上的实施方案中，例如，其中中间水溶液的pH已被调节至约2.0或0或以下以使酸性真菌乳糖酶失活，可以使用钾、氯化镁和柠檬酸调节pH和盐。
ENZECOTM Lactase NL 2.5X具有约6-约7的最佳pH。因此，本领域技术人员将理解，可能有必要将中间水溶液的pH调节为6-7.5，以有利于中性酵母乳糖酶的活性。在具体的实施方案中，用氢氧化钾、氯化镁和柠檬酸调节中间水溶液的pH涉及将pH调节至约6.8。
这类pH值调整可以产生混合物混浊，从而堵塞下游分离设备。然而，通过以特定顺序添加盐可以显著避免该混浊。更具体地，通过依次加入氢氧化钾、氯化镁和柠檬酸将中间水溶液的pH调节至期望的pH和盐浓度可避免混浊。更特别地，以如下用量和顺序向中间水溶液中依次加入氢氧化钾、氯化镁和柠檬酸可以显著地避免混浊：
●加入氢氧化钾以达到约9.2的pH；
●加入氯化镁以达到约9.1的pH；和
●加入柠檬酸至约6.8的pH。
在加入中性酵母乳糖酶之前，将中间水溶液的温度调节至30至45℃。然而，本领域技术人员将理解，尽管可以调节温度以获得最佳酶活性，但酵母乳糖酶可以在该范围之外以更慢的速率进行，例如，在约4.0至约50.0℃之间。在本文公开的具体实施方案中，将中间水溶液的温度调节至约36.5℃以与中性酵母乳糖酶一起温育。与酸性真菌乳糖酶一样，反应时间将取决于温度、pH、乳糖酶浓度以及中间水溶液中乳糖的初始浓度。同样，如果不考虑酶的成本，则反应速度可以提高。或者，反应可以更慢地运行以节省酶的成本。
将中间水溶液与中性酵母乳糖酶一起温育以产生最终的水溶液，其中乳糖的浓度为初始水溶液中乳糖初始浓度的0-约20％。在一些实施方案中，将中间水溶液与中性酵母乳糖酶一起温育，直到得到最终水溶液，所述最终水溶液包含占最终水溶液总糖的23.5％-25％的DP2糖(w/w)。
酵母乳糖酶的失活
一旦达到初始水溶液中乳糖初始浓度的0-20％的最终浓度，可将中性酵母乳糖酶失活。在一些实施方案中，使中性酵母乳糖酶失活包括将最终水溶液的pH调节至约pH 5.5，在该pH或低于该pH时，该酶实际上没有活性。除了将pH调节至5.5或作为将pH调节至5.5的替代之外，使酵母乳糖酶失活可能涉及在72℃温育最终水溶液。pH调节步骤的必要性可取决于最终水溶液可以多快速地加热，以及在这类热处理之前反应进行得有多快速。如果加热可以足够快地完成，以便在加热最终水溶液时糖组成没有变化(例如GOS的水解)，则可能不需要调整pH值。另一方面，本领域技术人员将理解，如果使用pH使反应失活、反应速率非常缓慢或酶活性少量或没有保留，则可能不必要热处理最终水溶液以使中性酵母乳糖酶失活。
分离
然后可以使用色谱法从最终水溶液中除去酶、稳定剂、葡萄糖和半乳糖以产生富含GOS的溶液。最初可以对最终水溶液进行离子交换色谱以除去乳糖酶、阳离子、阴离子和有助于颜色的成分。
离子交换后，可进行进一步分离以部分除去葡萄糖和半乳糖并富集GOS部分。本领域技术人员了解可利用的标准方法，包括离子交换、过滤、色谱分离(SMB)或额外的发酵反应。
例如，模拟移动床色谱法可以用于将GOS糖浆中的GOS从最终水溶液中总碳水化合物的约40％w/w富集至分离后总碳水化合物的60％w/w以上。
GOS产物
GOS糖浆中不同GOS种类的组成是不可预期的，并且取决于与乳糖溶液一起温育的特定乳糖酶、乳糖浓度和乳糖浓度。因此，本领域技术人员将理解，本文公开的GOS糖浆具有二-(DP2)、三-(DP3)、四-(DP4)、五-(DP5)和更高GOS的独特平衡。因此，本公开还涉及具有根据本文公开的方法生产的新GOS平衡的GOS糖浆。
因此，本公开还涉及来源于米曲霉的第一种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶与来源于乳酸克鲁维酵母的第二种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的组合在由包含乳糖的水溶液制备GOS糖浆中的用途。GOS糖浆可以包含GOS糖浆中占总碳水化合物的至少40％的GOS w/w。该用途涉及将水溶液与第一种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起温育，然后与第二种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起温育。
实施例1
食用乳糖的水溶液，起始浓度45°Bx，使用盐酸调节至pH＝5并且平衡至53.5℃。将来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(来自Enzyme Development Company的ENZECOTM真菌乳糖酶浓缩物)添加到该水溶液中，达到使水溶液中280LU/克乳糖的浓度。将初始水溶液与来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起在恒定的搅拌下温育195分钟。在1min、2.5min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min、75min、90min、120min和195min取水溶液样品。表1中示出了不同时间点的水溶液的碳水化合物级分的组成。
实施例2
将4.5kg食用乳糖混悬于5.5kg水中。在恒定搅拌下使该混悬液的温度达到高于90℃，直到乳糖完全溶解以产生初始水溶液。使用盐酸将初始水溶液的pH调节至约4.5。使初始水溶液的温度平衡至55℃。将来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(来自EnzymeDevelopment Company的ENZECOTM真菌乳糖酶浓缩物)加入到初始水溶液中至20LAU/g乳糖的浓度。将初始水溶液与来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起在恒定搅拌下温育6小时。然后通过用HCl调节pH至约2.0使β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶失活。
通过HPLC分析所得包含GOS、葡萄糖、半乳糖和未反应的乳糖的中间溶液，以确保乳糖浓度降至乳糖在初始水溶液中的初始浓度的60％以下(参见图1，表2)。
用50％KOH将中间水溶液的pH调节至约pH 8。然后用包含3.72％w/w柠檬酸、6.01％w/w六水合氯化镁和15.55％w/w磷酸氢二钾的盐溶液将中间溶液的pH调节至6.75。然后以8.8LAU/g乳糖的剂量加入来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(来自Enzyme Development Company的ENZECOTMLactase NL 2.5x)。将中间溶液与来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起在恒定搅拌下温育10小时。然后通过用HCl调节pH至约3.0使来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶失活。
表2.使用来自米曲霉的真菌β-半乳糖苷酶进行乳糖初步转半乳糖基化后的GOS混合物中的糖％组成
碳水化合物 总碳水化合物的％w/w
DP6 0.495
DP5 1.884
DP4 6.505
DP3 19.050
DP2 4.005
乳糖 42.348
葡萄糖 19.634
半乳糖 6.079
总GOS 31.939
通过HPLC分析所得包含GOS、葡萄糖、半乳糖和未反应的乳糖的最终水溶液，以确保乳糖浓度达到乳糖在初始水溶液中的初始浓度的10％或以下(参见图2，表3)。
表3.使用来自克鲁维酵母属的酵母β-半乳糖苷酶进行乳糖二次转半乳糖基化后的GOS混合物中的糖％组成
碳水化合物 总碳水化合物的％w/w
DP6+ 0.435
DP5 1.908
DP4 6.742
DP3 18.580
DP2 12.842
乳糖 8.733
葡萄糖 33.67
半乳糖 17.082
总GOS 40.506
实施例3
将脱矿质、脱蛋白、超滤的乳渗透物蒸发至35°Bx，并与来源于米曲霉和乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起温育，如实施例2中所述。由来源于超滤乳渗透物的乳糖的两阶段转半乳糖基化之后，GOS混合物中糖的组成如表4所示。
表4.使用来自米曲霉和乳酸克鲁维酵母的真菌β-半乳糖苷酶、对超滤乳渗透物中的乳糖进行两-阶段转半乳糖基化后，GOS混合物中的糖％组成
名称 总碳水化合物的％w/w
DP5+ 1.328
DP4 6.094
DP3 18.143
DP2 15.475
乳糖 8.523
葡萄糖 33.973
半乳糖 16.464
总GOS 41.040
实施例4
将27.4kg食用乳糖混悬于20.8kg水中以产生54°Bx的溶液。在恒定搅拌下使该混悬液的温度达到高于95℃，直到乳糖完全溶解以产生初始水溶液。初始水溶液的pH为5.4。使初始水溶液的温度平衡至58.5℃。将来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(来自Enzyme Development Company的ENZECOTM真菌乳糖酶浓缩物)加入到初始水溶液中至277LU/g乳糖的浓度。将初始水溶液与来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起在恒定搅拌下温育15分钟。然后通过用HCl调节pH至约2.0使β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶失活。
通过HPLC分析所得包含GOS、葡萄糖、半乳糖和未反应乳糖的中间水溶液，以确保乳糖浓度降至乳糖在初始水溶液中的初始浓度的60％以下(参见表5)。
将中间水溶液稀释至50BRIX。用50％KOH将pH调节至约pH 9.3。加入六水合氯化镁(25g)，并且使用50％柠檬酸将pH调节至6.80。然后以40.4LU/g乳糖的剂量加入来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(来自Enzyme Development Company的ENZECOTMLactase NL 2.5x)。将该溶液的温度调节至40℃。将中间溶液与来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起在恒定搅拌下温育100分钟。然后通过用HCl调节pH至约3.0使来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶失活。
表5.使用来自米曲霉的真菌β-半乳糖苷酶进行乳糖初步转半乳糖基化后的GOS混合物中的糖％组成
名称 总碳水化合物的％w/w
DP6 0.397
DP5 1.812
DP4 6.795
DP3 19.773
DP2 3.216
乳糖 43.655
葡萄糖 18.875
半乳糖 5.478
总GOS 31.595
通过HPLC分析所得包含GOS、葡萄糖、半乳糖和未反应乳糖的最终水溶液(参见表6)。
表6.使用来自克鲁维酵母属的酵母β-半乳糖苷酶进行乳糖二次转半乳糖基化后的GOS混合物中糖的％组成
名称 总碳水化合物的％w/w
DP6+ 0.380
DP5 1.840
DP4 6.892
DP3 19.302
DP2 13.403
乳糖 8.691
葡萄糖 32.573
半乳糖 16.919
总GOS 41.817
实施例5
将食用结晶乳糖(Lynn Proteins，Inc.，Granton，WI)在90℃溶于水至终浓度为45°Bx，产生乳糖的初始水溶液。将初始乳糖溶液的温度平衡至约53.5℃，并且使用HCl将pH调节至4.5-5.0。然后将来源于米曲霉的真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(来自EnzymeDevelopment Company的ENZECOTM真菌乳糖浓缩物)加入到初始水溶液中至浓度为5.6LU/g乳糖。将该溶液在恒定搅拌下温育17小时，以产生包含乳糖浓度为初始水溶液中初始浓度的约40％的中间水溶液。然后通过用HCI、采用15％w/w的HCl水溶液将pH调节至约2.0，使真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶失活。稳定搅拌60分钟后，将50％w/w的KOH溶液缓慢地加入到中间水溶液中，由此将pH调节至约9.30。然后加入25％w/v的六水合氯化镁溶液至浓度为0.16％w/w的中间水溶液，由此将pH调节至约9.21。然后将50％的柠檬酸溶液缓慢地加入到中间水溶液中，直到pH达到约6.8。然后使中间水溶液平衡至36.5℃。然后将来源于乳酸克鲁维酵母的酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(来自Enzyme Development Company的ENZECOTM Lactase NL 2.5x)加入到中间水溶液中至浓度为4.7LU/g的乳糖。将中间水溶液在稳定搅拌下温育17h，以产生包含乳糖浓度小于初始水溶液中乳糖浓度的20％的最终水溶液。用柠檬酸将最终水溶液的pH调节至pH 5.5，以使来源于乳酸克鲁维酵母的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶失活。然后将最终水溶液在72℃热处理15秒。将来自5次试验的最终水溶液的碳水化合物组成提供在表7中。
将最终水溶液进行离子交换纯化以除去盐、乳糖酶和颜色成分。离子交换后，将部分纯化的溶液进行纯化步骤以富集GOS部分。表7中提供了来自5次试验的最终水溶液GOS糖浆的碳水化合物组成。
表7.所制备的GOS糖浆的碳水化合物组成，使用来自米曲霉和乳酸克鲁维酵母的乳糖酶的组合，然后色谱分离
实施例6
将食用结晶乳糖(Lynn Proteins，Inc.，Granton，WI)在95℃溶于水至终浓度为53°Bx，产生乳糖的初始水溶液。将初始乳糖溶液的温度平衡至约55-56.5℃，并且将pH调节至4.5-5.5。然后将来源于米曲霉的真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(来自EnzymeDevelopment Company的ENZECOTM真菌乳糖浓缩物)加入到初始水溶液中至浓度为5.8LU/g乳糖。将该溶液在恒定搅拌下温育11小时，以产生中间水溶液，该中间水溶液包含浓度为初始水溶液中乳糖初始浓度的约40％的乳糖以及占总糖49％-52％的DP2糖。因此，增加初始乳糖浓度和酶浓度将所需反应时间从17h减少至11h。然后通过用HCl、采用15％w/w的HCl水溶液将pH调节至约2.0，使真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶失活。将20％w/w的KOH溶液缓慢地加入到中间水溶液中，由此将pH调节至约9.30。然后加入25％w/v的六水合氯化镁溶液至浓度为0.16％w/w的中间水溶液，由此将pH调节至约9.21，且将必需离子加入到二次酶反应中。然后将20％的柠檬酸溶液缓慢地加入到中间水溶液中，直到pH达到约6.8。然后使中间水溶液平衡至36.5℃。然后将来源于乳酸克鲁维酵母的酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(来自Enzyme Development Company的ENZECOTM Lactase NL 2.5x)加入到中间水溶液中至浓度为4.4LU/g的乳糖。将中间水溶液在稳定搅拌下温育17h，以产生最终水溶液，该最终水溶液包含浓度为初始水溶液中乳糖浓度的20％以下的乳糖以及DP2糖为总糖的23.5％-25％。然后将最终水溶液在72℃热处理15秒，以使来源于乳酸克鲁维酵母的酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶失活。将来自10次试验的最终水溶液的碳水化合物组成提供在表8中。
将最终水溶液进行离子交换纯化以除去盐、乳糖酶和颜色成分。离子交换后，将部分纯化的溶液进行纯化步骤以富集GOS部分。表8中提供了来自5次试验的最终水溶液GOS糖浆的碳水化合物组成。
表8.所制备的GOS糖浆的碳水化合物组成，使用来自米曲霉和乳酸克鲁维酵母的乳糖酶的组合，然后色谱分离
尽管已经描述和示例了本发明的具体实施方案，但是这类实施方案应当被视为示例本发明，而不被视为限制所附权利要求所解释的本发明。

Claims (54)

1.由乳糖生产半乳寡糖(GOS)的方法，该方法包括：
将包含初始浓度的乳糖的初始水溶液与真菌乳糖酶一起温育，产生包含乳糖和GOS的中间水溶液，该中间水溶液中乳糖浓度为初始水溶液的初始浓度的约30％-约70％；
向中间水溶液中加入酵母乳糖酶；和
温育包含所述酵母乳糖酶的中间水溶液，产生最终水溶液，其中乳糖浓度为初始水溶液的初始浓度的0％-20％。
2.权利要求1的方法，包括加入酵母乳糖酶前用KOH、MgCl2和柠檬酸将中间水溶液的pH调节至5.5-9.0。
3.权利要求2的方法，其中用KOH、MgCl2和柠檬酸将中间水溶液的pH调节至5.5-9.0包括将pH调节至6.0-7.5。
4.权利要求2的方法，其中用KOH、MgCl2和柠檬酸将中间水溶液的pH调节至5.5-9.0包括将pH调节至约6.8。
5.权利要求2、3或4的方法，其中用KOH、MgCl2和柠檬酸将中间水溶液的pH调节至5.5-9.0包括向中间水溶液中依次添加KOH、MgCl2和柠檬酸。
6.权利要求5的方法，其中向中间水溶液中依次添加KOH、MgCl2和柠檬酸包括如下依次顺序的步骤：
用KOH将中间水溶液的pH调节至约9.2；
向中间水溶液中加入约0.16g MgCl2/100g水溶液；和
将中间水溶液的pH调节至约9.1-约6.8。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述真菌乳糖酶是真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。
8.权利要求7的方法，其中真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶来源于曲霉菌属的种类。
9.权利要求7的方法，其中真菌β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶来源于米曲霉。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述真菌乳糖酶在初始水溶液中的浓度为在初始水溶液中1-300个乳糖酶单位(LU)/克乳糖。
11.权利要求10的方法，其中所述真菌乳糖酶在初始水溶液中的浓度为在初始水溶液中约56LU/克乳糖或约5.8LU/克乳糖。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述酵母乳糖酶是酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。
13.权利要求12的方法，其中酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶来源于克鲁维酵母属的种类。
14.权利要求12的方法，其中酵母β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶来源于乳酸克鲁维酵母。
15.权利要求1-14任一项的方法，其中向中间水溶液中添加所述酵母乳糖酶包括加入所述酵母乳糖酶至在中间水溶液中为1-50个乳糖酶单位(LU)/克乳糖的浓度。
16.权利要求15的方法，其中向中间水溶液中添加所述酵母乳糖酶包括加入所述酵母乳糖酶至在中间水溶液中为约4.4LU或约4.7LU/克乳糖的浓度。
17.权利要求1-16任一项的方法，其中乳糖在初始水溶液中的初始浓度为15-63°Bx。
18.权利要求1-16任一项的方法，其中乳糖在初始水溶液中的初始浓度约为30°Bx-约60°Bx。
19.权利要求1-16任一项的方法，其中乳糖在初始水溶液中的初始浓度为约45°Bx。
20.权利要求1-16任一项的方法，其中乳糖在初始水溶液中的初始浓度为约53°Bx。
21.权利要求1-20任一项的方法，其中将初始水溶液温育以产生中间水溶液，该中间水溶液包含乳糖在初始水溶液中的初始浓度的约40％。
22.权利要求1-21任一项的方法，其中将初始水溶液与所述真菌乳糖酶一起温育，直到该水溶液包含占中间水溶液总糖重量49％-52％的DP2糖。
23.权利要求1-22任一项的方法，其中将中间水溶液与酵母乳糖酶一起温育，直到该水溶液包含占水溶液总糖重量23.5％-25％的DP2糖。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中将初始水溶液与所述真菌乳糖酶在约25-75℃的温度一起温育。
25.权利要求1-23任一项的方法，其中将初始水溶液与所述真菌乳糖酶在约35-约65℃的温度一起温育。
26.权利要求1-23任一项的方法，其中将初始水溶液与所述真菌乳糖酶在约50-约55℃的温度一起温育。
27.权利要求1-23任一项的方法，其中将初始水溶液与所述真菌乳糖酶在约53.5℃的温度一起温育。
28.权利要求1-27任一项的方法，其中将初始水溶液与所述真菌乳糖酶在约2.5-约8.0的pH下一起温育。
29.权利要求1-27任一项的方法，其中将初始水溶液与所述真菌乳糖酶在约3.5-约6.5的pH下一起温育。
30.权利要求1-27任一项的方法，其中将初始水溶液与所述真菌乳糖酶在约4.5-约5.5的pH下一起温育。
31.权利要求1-30任一项的方法，包括加入酵母乳糖酶前使所述真菌乳糖酶失活。
32.权利要求31的方法，其中使所述真菌乳糖酶失活包括将中间水溶液的pH调节至约2或以下。
33.权利要求31的方法，其中使所述真菌乳糖酶失活包括将中间水溶液的pH调节至约2。
34.权利要求32或33的方法，其中用盐酸调节中间水溶液的pH以使所述真菌乳糖酶失活。
35.权利要求1-34任一项的方法，其中将中间水溶液与所述酵母乳糖酶一起在约4-约50℃的温度温育。
36.权利要求1-34任一项的方法，其中将中间水溶液与所述酵母乳糖酶一起在约30-约45℃的温度温育。
37.权利要求1-34任一项的方法，其中将中间水溶液与所述酵母乳糖酶一起在约36.5℃的温度温育。
38.权利要求1-35任一项的方法，还包括使酵母乳糖酶失活。
39.权利要求38的方法，其中使酵母乳糖酶失活包括将最终水溶液的pH调节至约pH5.5或以下。
40.权利要求39的方法，包括用柠檬酸将最终水溶液的pH调节至约pH 5.5。
41.权利要求38、39或40的方法，其中使酵母乳糖酶失活包括在72℃温育最终水溶液。
42.权利要求1-41任一项的方法，还包括通过离子交换、过滤、色谱分离或额外的发酵反应从最终水溶液中除去半乳糖和/或葡萄糖。
43.权利要求42的方法，其中色谱分离包括模拟移动床色谱。
44.根据如权利要求1-43任一项中所定义的方法生产的半乳寡糖(GOS)糖浆。
45.权利要求44的GOS糖浆，包含占GOS糖浆中总碳水化合物的至少40％的GOS w/w。
46.权利要求44的GOS糖浆，包含占GOS糖浆中总碳水化合物的至少65％的GOS w/w。
47.权利要求44、45或46的GOS糖浆，其中GOS糖浆中二糖GOS:三糖GOS:四糖GOS之比为约2:3:1。
48.来源于米曲霉的第一种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶与来源于乳酸克鲁维酵母的第二种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的组合在由包含乳糖的水溶液制备半乳寡糖(GOS)糖浆中的用途，其中GOS糖浆包含占GOS糖浆中总碳水化合物的至少约40％的GOS w/w。
49.权利要求48的用途，其中将第一种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶与所述水溶液一起温育，然后将该水溶液与第二种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶一起温育。
50.权利要求48或49的用途，其中GOS糖浆包含占GOS糖浆中总碳水化合物的至少约60％的GOS w/w。
51.权利要求48或49的用途，其中GOS糖浆包含占GOS糖浆中总碳水化合物的至少约65％的GOS w/w。
52.来源于米曲霉的第一种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶用于在用来源于乳酸克鲁维酵母的第二种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶处理前预处理包含乳糖的水溶液的用途。
53.来源于乳酸克鲁维酵母的第二种β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶用于增加预先已经用来源于米曲霉的β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶处理、包含乳糖的水溶液中半乳寡糖(GOS)的量的用途。
54.使包含含有乳糖和半乳寡糖的溶液的反应混合物在其pH从约4.5-5.5被调节至用于与中性酵母乳糖酶在pH约6.0-约7.5下一起温育时的浊度最小化的方法，该方法包括如下依次顺序的步骤：
用KOH将溶液的pH调节至约9.2；
向中间水溶液中加入约0.16g MgCl2/100g溶液；和
将溶液的pH调节至约6.0-约7.5。
CN201780003136.XA 2016-01-12 2017-01-12 由乳糖生产半乳寡糖的方法 Pending CN108138208A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662277838P 2016-01-12 2016-01-12
US62/277,838 2016-01-12
PCT/CA2017/050042 WO2017120678A1 (en) 2016-01-12 2017-01-12 Method for producing galactooligosaccharides from lactose

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108138208A true CN108138208A (zh) 2018-06-08

Family

ID=59310498

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780003136.XA Pending CN108138208A (zh) 2016-01-12 2017-01-12 由乳糖生产半乳寡糖的方法

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP3402892A1 (zh)
CN (1) CN108138208A (zh)
AU (1) AU2017207540A1 (zh)
CA (1) CA2992497C (zh)
WO (1) WO2017120678A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210010045A1 (en) * 2017-07-04 2021-01-14 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Method for producing galactooligosaccharide
WO2023161321A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Frieslandcampina Nederland B.V. Process for preparing high purity galacto-oligosaccharide
GB2616483A (en) * 2022-03-11 2023-09-13 Clasado Res Services Limited Oligosaccharide composition

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003274991A (ja) * 2002-03-20 2003-09-30 Nippon Origo Kk ガラクトオリゴ糖の製造法
CN101831389A (zh) * 2010-04-19 2010-09-15 江南大学 一种产β-D-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法
WO2010105207A1 (en) * 2009-03-13 2010-09-16 The Regents Of The University Of California Prebiotic oligosaccharides
WO2011093907A1 (en) * 2010-02-01 2011-08-04 Corn Products International, Inc. High-purity galactooligosaccharides and uses thereof
US20120040051A1 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Kwan-Han Chen Process for preparing milk product enhanced with galactooligosaccharide and easily absorbable, and functional milk product prepared therewith
CN102369998A (zh) * 2010-08-13 2012-03-14 爱之味股份有限公司 制备富含低聚半乳糖和低乳糖的易吸收乳制品的方法
CN103993054A (zh) * 2014-05-19 2014-08-20 山东龙力生物科技股份有限公司 一种酶协同制备高纯度低聚半乳糖的方法
CN104136618A (zh) * 2012-01-25 2014-11-05 阿拉食品公司 一种包含低聚半乳糖的组合物的生产方法
WO2015012597A1 (ko) * 2013-07-23 2015-01-29 (주)네오크레마 모유 성분인 갈락토실락토스가 강화된 갈락토올리고당의 제조 방법
CN104805026A (zh) * 2015-04-21 2015-07-29 山东福瑞达生物科技有限公司 一株产β-半乳糖苷酶菌株及其制备高纯度低聚半乳糖的方法
CN104975056A (zh) * 2015-07-21 2015-10-14 保龄宝生物股份有限公司 一种高含量低聚半乳糖的生产方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105274165A (zh) * 2015-11-20 2016-01-27 保龄宝生物股份有限公司 一种高含量低聚半乳糖的简便生产方法
CN105274164A (zh) * 2015-11-20 2016-01-27 保龄宝生物股份有限公司 一种低聚半乳糖的制备方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003274991A (ja) * 2002-03-20 2003-09-30 Nippon Origo Kk ガラクトオリゴ糖の製造法
WO2010105207A1 (en) * 2009-03-13 2010-09-16 The Regents Of The University Of California Prebiotic oligosaccharides
WO2011093907A1 (en) * 2010-02-01 2011-08-04 Corn Products International, Inc. High-purity galactooligosaccharides and uses thereof
CN101831389A (zh) * 2010-04-19 2010-09-15 江南大学 一种产β-D-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法
US20120040051A1 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 Kwan-Han Chen Process for preparing milk product enhanced with galactooligosaccharide and easily absorbable, and functional milk product prepared therewith
CN102369998A (zh) * 2010-08-13 2012-03-14 爱之味股份有限公司 制备富含低聚半乳糖和低乳糖的易吸收乳制品的方法
CN104136618A (zh) * 2012-01-25 2014-11-05 阿拉食品公司 一种包含低聚半乳糖的组合物的生产方法
WO2015012597A1 (ko) * 2013-07-23 2015-01-29 (주)네오크레마 모유 성분인 갈락토실락토스가 강화된 갈락토올리고당의 제조 방법
CN104812908A (zh) * 2013-07-23 2015-07-29 新克莱玛有限公司 强化作为母乳成分的半乳糖乳糖的低聚半乳糖的制备方法
CN103993054A (zh) * 2014-05-19 2014-08-20 山东龙力生物科技股份有限公司 一种酶协同制备高纯度低聚半乳糖的方法
CN104805026A (zh) * 2015-04-21 2015-07-29 山东福瑞达生物科技有限公司 一株产β-半乳糖苷酶菌株及其制备高纯度低聚半乳糖的方法
CN104975056A (zh) * 2015-07-21 2015-10-14 保龄宝生物股份有限公司 一种高含量低聚半乳糖的生产方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AH-REUM PARK 等: ""Galacto-oligosaccharide production using microbial beta-galactosidase: current state and perspectives"", 《APPL MICROBIOL BIOTECHNOL》 *
B A RABIU 等: ""Synthesis and fermentation properties of novel galacto-oligosaccharides by beta-galactosidases from Bifidobacterium species"", 《APPL ENVIRON MICROBIOL》 *
CARLOS VERA 等: ""Synthesis of galacto-oligosaccharides by β-galactosidase from Aspergillus oryzae using partially dissolved and supersaturated solution of lactose"", 《ENZYME MICROB TECHNOL》 *
SUWIMOL CHOCKCHAISAWASDEE 等: ""Synthesis of galacto-oligosaccharide from lactose using beta-galactosidase from Kluyveromyces lactis: Studies on batch and continuous UF membrane-fitted bioreactors"", 《BIOTECHNOL BIOENG》 *
付文佳 等: ""酶法合成低聚半乳糖的研究"", 《中国食品科学技术学会第十二届年会暨第八届中美食品业高层论坛论文集》 *
刘建福 等: ""K.fragilis β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的组成分析"", 《食品与发酵工业》 *
归莉琼 等: ""米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖"", 《华东理工大学学报》 *
许牡丹 等: ""米曲霉β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的工艺研究"", 《食品工业科技》 *
高秀容 等: ""β-半乳糖苷酶的研究进展"", 《生物技术通报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2992497C (en) 2020-12-22
AU2017207540A1 (en) 2018-04-12
CA2992497A1 (en) 2017-07-20
EP3402892A4 (en) 2018-11-21
EP3402892A1 (en) 2018-11-21
WO2017120678A1 (en) 2017-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yuan et al. Pilot‐plant production of xylo‐oligosaccharides from corncob by steaming, enzymatic hydrolysis and nanofiltration
CN104186656B (zh) 一种低糖褐色乳酸菌饮品及其制备方法
Silvério et al. Biocatalytic approaches using lactulose: end product compared with substrate
CN108138208A (zh) 由乳糖生产半乳寡糖的方法
CN105612258A (zh) 半乳寡糖的生产
CN107177648A (zh) 一种壳寡糖酶法生产工艺
CN112760311B (zh) 一种具有较优β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶酶活比的酶液及其制备方法和应用
CN106636254B (zh) 一种高纯度低聚木糖制备工艺
US5939309A (en) Bifidobacterium bifidum proliferation promoting composition containing xylooligosaccharide
CN110367429A (zh) 一种陈皮酵素饮品的制备方法
CN103695501A (zh) 一种用果聚糖蔗糖酶生产低聚乳果糖的方法
JP6920695B2 (ja) オオムギβ−グルカン含有飲料
CN105861347B (zh) 一种利用纳米铬生产酵母铬的方法
CN108315363B (zh) 一种持续补氮的柠檬酸发酵方法
CN103431361A (zh) 结合豆腐生产线制备调味料的制备工艺
CN101775423A (zh) 一种酶法合成低聚乳果糖的方法
CN103355714A (zh) 一种发酵型梨汁饮料及制备方法
CN111073922A (zh) 一种维生素b12发酵补料培养基及补料方法
CN104172387A (zh) 一种生产菊芋果糖饮料的方法
CN112314707B (zh) 一种含乳酸菌饮料的制备方法
RU2202606C2 (ru) Способ подготовки полисахаридного сырья к микробиологической конверсии
CN114568492A (zh) 用于制造褐色乳饮料的组合物、褐色乳饮料及其制造方法
CN108315368B (zh) 赖氨酸发酵培养基的制备工艺
JP2000041693A (ja) ガラクトオリゴ糖の製造方法
CN105255980A (zh) 一种利用小麦麸皮生产低聚糖多肽混合物的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180608

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication