CN108315363B - 一种持续补氮的柠檬酸发酵方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及柠檬酸发酵领域，具体涉及一种持续补氮的柠檬酸发酵方法。其主要技术方案是对玉米液化液进行复合蛋白酶处理，并根据菌种生长及产酸阶段的不同特性，以流加氮源方式来控制不同阶段不同的氮源浓度，使细胞迅速获得氮源，促进了细胞生长，缩短细胞生长周期，使细胞提前进入产酸高峰期，同时有效降低了料液的粘度，提高了料液的溶氧能力，达到了最优的培养效果。采用本发明工艺后，能明显缩短发酵周期，提高发酵稳定性，而且能提高设备利用率，提升了柠檬酸行业的竞争力，进而提高了企业的经济效益。

Description

一种持续补氮的柠檬酸发酵方法
技术领域
本发明涉及柠檬酸发酵领域，涉及一种持续补氮的柠檬酸发酵方法。
背景技术
柠檬酸是一种非常重要的有机酸，是无色透明或者半透明晶体，或颗粒状、微粒状粉末，无臭，有令人愉悦的酸味。柠檬酸在潮湿的空气中略有潮解性，主要被用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂、除腥脱臭剂。
目前，柠檬酸生产工艺主要采用以玉米为原料的分批发酵方式。其特点是，首先将玉米进行液化得到玉米液化液，主要作为氮源；一部分玉米液化液过滤得到玉米液化清液主要作为碳源。然后将玉米液化液和玉米液化清液一次性投入种子罐和发酵罐进行培养。其主要缺点是：其一，玉米液化液主要是大颗粒的玉米渣，菌体对其吸收利用速度较慢，而且料液粘稠会导致溶氧低；其二，没有针对不同时期菌种的生长及产酸特性来调节氮源浓度，特别是在菌体生长与产酸相偶联的时期，控制好氮源浓度对发酵周期及产酸速度尤为重要。
发明内容
本发明针对现有柠檬酸发酵工艺的诸多缺陷，提供了一种持续补氮的柠檬酸发酵方法，主要技术方案为对玉米液化液进行复合蛋白酶处理，并根据菌种生长及产酸阶段的不同特性，以流加氮源(玉米蛋白酶水解)方式来控制不同阶段不同的氮源浓度，使发酵菌体细胞迅速获得氮源，促进细胞生长，缩短细胞生长周期，使细胞提前进入产酸高峰期，同时有效降低了料液的粘度，提高了料液的溶氧能力，达到了最优的培养效果。采用本发明的工艺后，能明显缩短发酵周期，提高发酵稳定性，而且能提高设备利用率。
本发明一种持续补氮的柠檬酸发酵方法，包括1)种子液培养，2)柠檬酸发酵过程，具体工艺步骤为：
1)种子液培养
根据种子罐培养基总糖浓度为：9.5-10.0g/100mL，总氮浓度为：0.20-0.22g/100mL，加入硫酸铵及玉米蛋白酶水解液，加水定容，制备成柠檬酸种子罐培养基，高温灭菌后进行保压降温；
制备黑曲霉孢子悬浮液，按照30-40万个/ml的密度接入灭菌降温后的种子罐培养基中，培养至产柠檬酸浓度为2.0-2.2g/100ml。
更进一步的，具体培养过程可以为：
其中培养0-6h阶段，控制培养温度：35.0℃；罐压：0.08MPa；通风比0.10V/(V·min)；搅拌速率：100rpm；
培养6h至培养结束，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)，搅拌速率：200rpm。
在黑曲霉生长前期，菌体吸收并利用发酵培养基中的氮源，主要用于合成菌体自身生长发育及代谢过程中所必需的各种蛋白质、氨基酸和核酸等有机物质。而玉米液化液经复合蛋白酶水解得到氨基酸及小分子肽，相对于大分子肽来说更有利于菌体的摄取及利用，因此有效促进了菌体的生长，明显的缩短了种子培养周期，同时玉米蛋白酶水解液较玉米液化液，料液的粘度明显偏低，进而提高了料液的溶氧能力。
2)柠檬酸发酵
根据总糖浓度为：18.0-18.5g/100mL，总氮浓度为：0.085-0.095g/100mL，计算玉米液化清液及玉米蛋白酶水解液用量，加玉米液化清液于发酵罐中，加水定容制备成初始发酵培养基，高温灭菌后降温；并将玉米蛋白酶水解液灭菌后待用；
种子液培养好后，将种子液转入灭菌降温后的初始发酵培养基中，种子液的用量为初始发酵培养基体积的1/10左右，菌球浓度控制在3-4万个/mL，调节温度、风量、罐压及搅拌转速开始发酵，并在发酵过程中向发酵罐分阶段流加上述灭菌的玉米蛋白酶水解液；
更进一步的具体发酵过程为：
0-8h阶段，控制培养温度：36.5-36.8℃，罐压：0.09-0.10MPa，通风比：0.014-0.15V/(V·min)，搅拌速率：230-250rpm，向发酵罐流加灭菌后的玉米蛋白酶水解液，使发酵液中氮源控制在0.04-0.045％；
此时间段内黑曲霉处于调整期及旺盛期的前期，为适应新的生长环境和快速的生长做准备，在此时间段内，大量的合成了菌体生长发育及代谢过程所需要的菌体结构蛋白质、酶、辅酶、核酸和氨基酸等含氮类有机物质，导致发酵液中的氮源被急剧地消耗掉，因此将发酵液中氮源控制在0.04-0.045％；
8-14h阶段，控制罐压：0.09-0.10MPa，通风比：0.16-0.18V/(V·min)，搅拌速率：320-350rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中氮源浓度控制在0.03-0.035％；
此阶段是菌体生长和产酸同时进行的关键时期，通过控制适当的氮源浓度，一定程度的抑制菌体的生长，使得菌体更侧重于产酸。
14-28h阶段，控制罐压：0.09-0.10MPa，通风比：0.16-0.18V/(V·min)，搅拌速率：320-350rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中氮源浓度控制在0.025-0.030％；
在此阶段通过控制氮源浓度在偏低水平，使得菌体生长提前结束，从而快速进入产酸高峰期。
28h至发酵结束，控制罐压：0.09-0.10MPa，通风比：0.14-0.15V/(V·min)，搅拌速率：280-300rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中氮源浓度控制在0.01-0.02％；发酵结束条件标准为产柠檬酸速度小于0.1g/(100ml.h)。
在此阶段氮源主要用于产酸，因此氮源浓度控制在较低水平。
本发明中所述的玉米液化清液及玉米蛋白酶水解液的制备方法为：
首先将玉米粉加水调浆后加耐高温α-淀粉酶，经二次高压蒸汽喷射液化后得到玉米液化液，其总糖浓度为20-21g/100mL；
更进一步的，调浆用水温度优选为55-60℃，玉米粉与水的质量比优选为1:2.6-3.0；
将上述玉米液化液经板框压滤即得到玉米液化清液，主要用于提供碳源。
将上述玉米液化液加入复合蛋白酶水解即得到玉米蛋白酶水解液，作为柠檬酸发酵的主要氮源。
所述的复合蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶；其中，酸性蛋白酶的添加量为每克玉米粉干基添加6个酶单位，中性性蛋白酶的添加量为每克玉米粉干基添加3个酶单位，碱性蛋白酶的添加量为每克玉米粉干基添加2个酶单位。
采用复合酶水解与单一酶水解相比，其水解程度大、水解液中的氨基酸态氮的含量和液态氮的含量高、蛋白质溶出率高，可获得高水解度的水解液，更有利于黑曲霉吸收利用。
与现有技术相比，本发明的最主要特征就是采用了复合蛋白酶水解氮源技术，及在不同时期针对菌体生长及产酸特性通过流加氮源控制不同时期的氮源浓度，以保证在发酵前期菌体快速吸收利用氮源合成了菌体生长发育及代谢过程所需要的菌体结构蛋白质、酶等含氮类有机物质，同时在生长及产酸相偶联阶段通过控制氮源的浓度，使得含氮量适当而不过量，在保证黑曲霉菌体在调整期和生长旺盛期正常的生长发育及代谢的前提下，提前结束菌体生长期而快速进入产酸高峰期。
综上所述，本发明的补氮工艺明显的缩短了发酵周期、提升了产酸水平，提高了糖酸转化率及发酵指数。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不以任何方式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。
实施例1
(1)将玉米粉碎，用57℃温水按1:2.8的配比调浆后加耐高温α-淀粉酶，经二次高压蒸汽喷射液化后得到玉米液化液，液化液总糖为20.8g/100ml。
其中一部分经板框压滤得到玉米液化清液；
另一部分玉米液化液加入复合蛋白酶水解得到玉米蛋白酶水解液：将玉米液化液的pH调节为7.0，并在酶解过程中维持其恒定，按每克玉米粉干基添加3个酶单位的比例添加中性蛋白酶，54℃反应3h后95℃，10分钟灭酶活，然后将中性蛋白酶水解液冷却至室温，调节pH为8.5，并在酶解过程中维持其恒定，按每克玉米粉干基添加2个酶单位的比例添加碱性蛋白酶，48℃反应2h后95℃，10分钟灭酶活，然后将水解液冷却至室温，调节pH为4.8，并在酶解过程中维持其恒定，按每克玉米粉干基添加6个酶单位的比例添加酸性蛋白酶，55℃反应3.5h后95℃，10分钟灭酶活，最终得到玉米蛋白酶水解液。
控制种子罐总氮、总糖分别为0.22g/100mL、9.8g/100mL，将硫酸铵加玉米蛋白酶水解液及水混合，制备成柠檬酸种子罐培养基，高温灭菌后降温待用。
(2)将配制好的黑曲霉孢子菌悬液按照每毫升种子液中接入30-40万个黑曲霉孢子的比例接入种子罐培养基，调节温度、风量、罐压及搅拌转速进行培养；
其中培养0-6h阶段，控制培养温度：35.0℃；罐压：0.08MPa；通风比0.10V/(V·min)；搅拌速率：100rpm；
培养6h至培养结束，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)，搅拌速率：200rpm；
种子罐培养结束条件标准为产柠檬酸浓度为2.0-2.2g/100ml。
(3)根据总糖浓度为：18.5g/100mL，总氮浓度为：0.092g/100mL，计算玉米液化清液及玉米蛋白酶水解液用量，加玉米液化清液于发酵罐中，加水定容制备成初始发酵培养基，保压降温后待用；并将玉米蛋白酶水解液灭菌后待用；种子液培养好后，将种子液转入灭菌降温后的初始发酵培养基，种子液与初始发酵培养基的体积比为1:10，调节温度、风量、罐压及搅拌转速开始发酵；
其中0-8h阶段，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：250rpm，开始向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.043％；
8-14h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.034％；
14-28h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.028％；
28h至发酵结束，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：300rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.017％；发酵结束条件标准为产柠檬酸速度小于0.1g/(100ml.h)。
在此条件下，种子罐培养种龄20h，发酵周期54h，产酸18.90％，转化率102.16％，发酵指数为3.50g/(L·h)。
实施例2
(1)将玉米粉碎，用57℃温水按1:2.7的配比调浆，后加耐高温α-淀粉酶，经二次高压蒸汽喷射液化后得到玉米液化液，玉米液化液总糖为20.6g/100ml。
其中一部分经板框压滤得到玉米液化清液；
另一部分玉米液化液加入复合蛋白酶水解得到玉米蛋白酶水解液，其中每克玉米粉干基添加酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的量分别为6个酶单位、3个酶单位、2个酶单位。将硫酸铵加玉米蛋白酶水解液及水混合，制备成柠檬酸种子罐培养基，总氮、总糖分别为0.21g/100mL、9.6g/100mL，灭菌后待用。
(2)将配制好的黑曲霉孢子菌悬液按照每毫升种子液中接入30-40万个黑曲霉孢子的比例接入种子罐培养基，调节温度、风量、罐压及搅拌转速进行培养；
其中培养0-6h阶段，控制培养温度：35.0℃；罐压：0.08MPa；通风比0.10V/(V·min)；搅拌速率：100rpm；
培养6h至培养结束，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)，搅拌速率：200rpm。
(3)根据总糖浓度为：18.3g/100mL，总氮浓度为：0.090g/100mL，计算玉米液化清液及玉米蛋白酶水解液用量，加玉米液化清液于发酵罐中，加水定容制备成初始发酵培养基，保压降温后待用；并将玉米蛋白酶水解液灭菌后待用；种子液培养好后，将种子液转入灭菌降温后的初始发酵培养基，种子液与初始发酵培养基的体积比为1:10，调节温度、风量、罐压及搅拌转速开始发酵；
其中0-8h阶段，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：250rpm，开始向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.042％；
8-14h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.032％；
14-28h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.026％；
28h至发酵结束，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：300rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.018％；
种子罐培养结束条件标准为，产柠檬酸浓度为2.0-2.2g/100ml；发酵结束条件标准为产柠檬酸速度小于0.1g/(100ml.h)。
在此条件下，种子罐培养种龄19h，发酵周期53h，产酸18.85％，转化率103.01％，发酵指数为3.56g/(L·h)。
实施例3
(1)将玉米粉碎，用57℃温水按1:2.7的配比调浆，后加耐高温α-淀粉酶，经二次高压蒸汽喷射液化后得到玉米液化液，液化液总糖为20.6g/100ml。
其中一部分经板框压滤得到玉米液化清液；
另一部分玉米液化液加入复合蛋白酶水解得到玉米蛋白酶水解液，其中每克干基添加酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的量分别为6个酶单位、3个酶单位、2个酶单位。将硫酸铵加玉米蛋白酶水解液及水混合，制备成柠檬酸种子罐培养基，总氮、总糖分别为0.22g/100mL、9.6g/100mL，消毒后待用。
(2)将配制好的黑曲霉孢子菌悬液按照每毫升种子液中接入30-40万个黑曲霉孢子的比例接入种子罐培养基，调节温度、风量、罐压及搅拌转速进行培养；
其中培养0-6h阶段，控制培养温度：35.0℃；罐压：0.08MPa；通风比0.10V/(V·min)；搅拌速率：100rpm；
培养6h至培养结束，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)，搅拌速率：200rpm。
(3)根据总糖浓度为：18.3g/100mL，总氮浓度为：0.090g/100mL，计算玉米液化清液及玉米蛋白酶水解液用量，加玉米液化清液于发酵罐中，加水定容制备成初始发酵培养基，保压降温后待用；并将玉米蛋白酶水解液灭菌后待用；种子液培养好后，将种子液转入灭菌降温后的初始发酵培养基，种子液与初始发酵培养基的体积比为1:10，调节温度、风量、罐压及搅拌转速开始发酵；
其中0-8h阶段，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：250rpm，开始向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.043％；
8-14h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.033％；
14-28h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.027％；
28h至发酵结束，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：300rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中可利用氮源浓度控制在0.017％；
种子罐培养结束条件标准为，产柠檬酸浓度为2.0-2.2g/100ml；发酵结束条件标准为产柠檬酸速度小于0.1g/(100ml.h)。
在此条件下，种子罐培养种龄19h，发酵周期53h，产酸18.80％，转化率102.73％，发酵指数为3.55g/(L·h)。
比较例1
(1)将粉碎好的玉米面粉与57℃温水按重量比1:2.8混合调浆，搅拌均匀后加适量淀粉酶经二次高压蒸汽喷射液化得到玉米液化液，液化液总糖为20.8g/100ml。
(2)将液化好的玉米液化液、硫酸铵加入种子罐，加水定容，配制成总糖为9.8g/100ml、总氮为0.22g/100ml的种子罐培养基，灭菌后待用；
(3)将黑曲霉孢子制成孢子悬浮液，按照每毫升种子液中接入30-40万个黑曲霉孢子的比例，接入种子罐培养基，调节温度、风量、罐压及搅拌转速进行培养；
其中培养0-6h阶段，控制培养温度：35.0℃；罐压：0.08MPa；通风比0.10V/(V·min)；搅拌速率：100rpm；
培养6h至培养结束，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)，搅拌速率：200rpm。
(4)将玉米液化液用厢式板框压滤机压滤得到玉米液化清液，将玉米液化清液、玉米液化液加入发酵罐中，加水定容，制备成总糖浓度为18.5g/100ml、总氮为0.092g/100ml的初始发酵培养基，灭菌后待用；种子液培养好后，用无菌转运方法将种子液转入灭菌降温后的发酵液培养基，种子液与初始发酵培养基的体积比为1:10，调节温度、风量、罐压及搅拌转速开始发酵；
其中0-8h阶段，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：250rpm；
8-14h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm；
14-28h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm；
28h至发酵结束，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：300rpm；
种子罐培养结束条件标准为，产柠檬酸浓度为2.0-2.2g/100ml；发酵结束条件标准为产柠檬酸速度小于0.1g/(100ml.h)。
在此条件下，种子罐培养种龄24h，发酵周期59h，产酸18.80％，转化率101.62％，发酵指数为3.19g/(L·h)。
比较例2
(1)将粉碎好的玉米面粉与57℃温水按重量比1:2.7混合调浆，搅拌均匀后加适量淀粉酶经二次高压蒸汽喷射液化得到玉米液化液，液化液总糖为20.6g/100ml。
(2)将液化好的玉米液化液、硫酸铵加入种子罐，加水定容，配制成总糖为9.6g/100ml、总氮为0.22g/100ml的种子罐培养基，灭菌后待用；
(3)将黑曲霉孢子制成孢子悬浮液，按照每毫升种子液中接入30-40万个黑曲霉孢子的比例，接入种子罐培养基，调节温度、风量、罐压及搅拌转速进行培养；
其中培养0-6h阶段，控制培养温度：35.0℃；罐压：0.08MPa；通风比0.10V/(V·min)；搅拌速率：100rpm；
培养6h至培养结束，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)，搅拌速率：200rpm。
(4)将玉米液化液用厢式板框压滤机压滤得到玉米液化清液，将玉米液化清液、玉米液化液加入发酵罐中，加水定容，制备成总糖浓度为18.3g/100ml、总氮为0.09g/100ml的初始发酵培养基，灭菌后待用；种子液培养好后，用无菌转运方法将种子液转入灭菌降温后的初始发酵培养基中，种子液与初始发酵培养基的体积比为1:10，调节温度、风量、罐压及搅拌转速开始发酵；
其中0-8h阶段，控制培养温度：36.5℃；罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：250rpm；
8-14h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm；
14-28h阶段，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.18V/(V·min)；搅拌速率：350rpm；
28h至发酵结束，控制罐压：0.10MPa；通风比：0.15V/(V·min)；搅拌速率：300rpm；
种子罐培养结束条件标准为，产柠檬酸浓度为2.0-2.2g/100ml；发酵结束条件标准为产柠檬酸速度小于0.1g/(100ml.h)。
在此条件下，种子罐培养种龄24h，发酵周期58h，产酸18.60％，转化率101.64％，发酵指数为3.21g/(L·h)。
表1本发明与现有技术指标对比
Figure BDA0001660842830000081
本发明所述的补氮新工艺与原有工艺相比较，菌种种龄及发酵周期明显缩短，产酸率提高，转化率和发酵指数也相应提高，而且能提高设备利用率，提升了柠檬酸行业的竞争力。

Claims (1)

1.一种持续补氮的柠檬酸发酵方法，包括1）种子液培养，2）柠檬酸发酵过程，其特征在于：
1）种子液培养过程具体为：
根据种子罐培养基总糖浓度为：9.5-10.0 g/100 mL，总氮浓度为：0.20-0.22 g/100mL，加入硫酸铵及玉米蛋白酶水解液，加水定容，制备成柠檬酸种子罐培养基，高温灭菌后进行保压降温；
制备黑曲霉孢子悬浮液，按照30-40万个/ml的密度接入灭菌降温后的种子罐培养基中，培养至产柠檬酸浓度为2.0-2.2g/100ml；
2）柠檬酸发酵过程具体为：
根据总糖浓度为：18.0-18.5 g/100 mL，总氮浓度为：0.085-0.095 g/100 mL，计算玉米液化清液及玉米蛋白酶水解液用量，加玉米液化清液于发酵罐中，加水定容制备成初始发酵培养基，高温灭菌后降温；并将玉米蛋白酶水解液灭菌后待用；
种子液培养好后，将种子液转入灭菌降温后的初始发酵培养基中，菌球浓度控制在3-4万个/mL，开始发酵，并在发酵过程中向发酵罐分阶段流加上述灭菌的玉米蛋白酶水解液；
所述的在发酵过程中向发酵罐分阶段流加玉米蛋白酶水解液的具体过程如下：
0-8 h阶段，控制培养温度：36.5-36.8℃，罐压：0.09-0.10 MPa，通风比：0.15 V/(V•min)，搅拌速率：230-250 rpm，向发酵罐流加灭菌后的玉米蛋白酶水解液，使发酵液中氮源控制在0.04-0.045%；
8-14 h阶段，控制罐压：0.09-0.10 MPa，通风比：0.16-0.18 V/(V•min)，搅拌速率：320-350 rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中氮源浓度控制在0.03-0.035%；
14-28 h阶段，控制罐压：0.09-0.10 MPa，通风比：0.16-0.18 V/(V•min)，搅拌速率：320-350 rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中氮源浓度控制在0.025-0.030%；
28h至发酵结束，控制罐压：0.09-0.10 MPa，通风比：0.14-0.15 V/(V•min)，搅拌速率：280-300 rpm，同时向发酵罐流加玉米蛋白酶水解液，发酵液中氮源浓度控制在0.01-0.02%；
所述的玉米液化清液及玉米蛋白酶水解液制备方法如下：
首先将玉米粉加水调浆后加耐高温α-淀粉酶，经二次高压蒸汽喷射液化后得到玉米液化液；
所述的玉米液化清液为玉米液化液经板框压滤所得；
所述的玉米蛋白酶水解液为玉米液化液加入复合蛋白酶水解所得，所述的复合蛋白酶由酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶组成，其中，酸性蛋白酶的添加量为每克玉米粉干基添加6个酶单位，中性性蛋白酶的添加量为每克玉米粉干基添加3个酶单位，碱性蛋白酶的添加量为每克玉米粉干基添加2个酶单位。
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