JP6183921B2 - ガラクトオリゴ糖含有組成物の製造方法 - Google Patents
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Description
a)
・脱離基に結合されたガラクトシル基を含むガラクトシルドナーであって、多くとも350g/molのモル重量を有するガラクトシルドナーと、
・ガラクトシルドナーとは異なるガラクトシルアクセプターであって、糖または糖アルコールであるガラクトシルアクセプター、を含む混合物を提供するステップであって、ガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも1:10であり、かつ混合物は、少なくとも0.05mol/Lのガラクトシルアクセプターを含む提供するステップ、
b)第1の酵素を提供するステップであって、前記第1の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性を有するとともに、前記第1の酵素は、混合物に接触する提供するステップ、および
c)混合物と第1の酵素とをインキュベートして、第1の酵素によりガラクトシルドナーの脱離基を放出させるとともに、ガラクトシルドナーのガラクトシル基をガラクトシルアクセプターに転移することにより、ガラクトオリゴ糖を形成するステップであって、ステップc)は、インキュベート中の混合物から、すなわち、インキュベーション時に、ガラクトシルドナーから放出された脱離基を除去することにより、1種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物を取得することをさらに含む形成するステップ、
を含む。
を用いて計算される。
a)
・脱離基に結合されたガラクトシル基を含むガラクトシルドナーであって、多くとも350g/molのモル重量を有するガラクトシルドナー
・ガラクトシルドナーとは異なるガラクトシルアクセプターであって、糖または糖アルコールであるガラクトシルアクセプター
を含む混合物を提供するステップであって、ガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも1:10であり、かつ混合物は、少なくとも0.05mol/Lのガラクトシルアクセプターを含む提供するステップ、
b)第1の酵素を提供するステップであって、前記第1の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性を有するとともに、前記第1の酵素は、混合物に接触する提供するステップ、および
c)混合物と第1の酵素とをインキュベートして、第1の酵素によりガラクトシルドナーの脱離基を放出させるとともに、ガラクトシルドナーのガラクトシル基をガラクトシルアクセプターに転移することにより、ガラクトオリゴ糖を形成するステップであって、ステップc)は、インキュベート中の混合物から、すなわち、インキュベーション時に、ガラクトシルドナーから放出された脱離基を除去することにより、1種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物を取得することをさらに含む形成するステップ、
を含む。
(Nref−Ndif)×100)/(Nref)
(ここで、Ndifは、2つの配列中の同一でない残基の全数であり、かつNrefは、1つの配列中の残基の数である)
として計算可能である。したがって、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCに対して75%の配列同一性(Ndif=2およびNref=8)を有するであろう。ギャップは、特定の残基の非同一物としてカウントされる。すなわち、DNA配列AGTGTCは、DNA配列AGTCAGTCに対して75%の配列同一性(Ndif=2およびNref=8)を有であろう。配列同一性は、たとえば、米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)により提供されるBLASTpアルゴリズムなどの適切なBLASTプログラムを用いて計算可能である。
・配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Met(1)〜Ile(1174)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Gly(950)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Ile(1174)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含みうる。
・配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Met(1)〜Ile(1174)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Gly(950)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Ile(1174)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなりうる。
・配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Met(1)〜Ile(1174)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Gly(950)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Ile(1174)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Glu(917)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含みうる。
・配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Met(1)〜Ile(1174)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Gly(950)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Ile(1174)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Glu(917)に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなりうる。
a)
・脱離基に結合されたガラクトシル基を含むガラクトシルドナーであって、多くとも350g/molのモル重量を有するガラクトシルドナーと、
・ガラクトシルドナーとは異なるガラクトシルアクセプターであって、糖または糖アルコールであるガラクトシルアクセプター、
を含む混合物を提供するステップであって、ガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも1:10であり、かつ混合物は、少なくとも0.05mol/Lのガラクトシルアクセプターを含む提供するステップ、
b)第1の酵素と第2の酵素とを提供するステップであって、前記第1の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性を有しかつT値が多くとも0.9であり、前記第2の酵素は、ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能であり、かつ前記第1および第2の酵素は、混合物に接触する提供するステップ、および
c)第1の酵素によりガラクトシルドナーの脱離基を放出させてガラクトシルドナーのガラクトシル基をガラクトシルアクセプターに転移することによりガラクトオリゴ糖を形成するとともに、ガラクトシルドナーから放出された脱離基を第2の酵素により変換することにより、ガラクトオリゴ糖を含む組成物を取得するステップ、
を含む。
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも10倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも10倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも10倍
である。
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも102倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも102倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも102倍
でありうる。
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも103倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも103倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも103倍
でありうる。
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも104倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも104倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも104倍
でありうる。
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも105倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも105倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも105倍
でありうる。
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも106倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも106倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも106倍
であることがさらにより好ましい。
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも107倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも107倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも107倍
である。
d)ステップc)の組成物のガラクトオリゴ糖を富化するステップ
をさらに含む。
・一般式Gal−Xを有する第1のガラクトオリゴ糖と、
・化学量論式(Gal)2X、たとえば、一般式Gal−Gal−Xなどを有する第2のガラクトオリゴ糖と、
・化学量論式(Gal)3X、たとえば、一般式Gal−Gal−Gal−Xなどを有する第3のガラクトオリゴ糖と、
を含む。ただし、Xは、ラクトシルでもグルコシルでもないグリコシル基である。
・ガラクトオリゴ糖Gal−X、(Gal)2X、および(Gal)3Xの全量と、
・ガラクトオリゴ糖Gal−Glc、Gal2Glc、Gal3Glcの全量と、
のモル比が少なくとも5:95である。たとえば、以上に挙げたモル比は、少なくとも1:4、好ましくは少なくとも1:1、さらにより好ましくは少なくとも2:1でありうる。さらに、以上に挙げたモル比は、少なくとも5:1、好ましくは少なくとも10:1、さらにより好ましくは少なくとも20:1であることが好ましいこともありうる。
・ガラクトオリゴ糖Gal−X、Gal−Gal−X、およびGal−Gal−Gal−Xの全量と、
・ガラクトオリゴ糖Gal−Glc、Gal−Gal−Glc、Gal−Gal−Gal−Glcの全量と、
のモル比が少なくとも5:95である。たとえば、以上に挙げたモル比は、少なくとも1:4、好ましくは少なくとも1:1、さらにより好ましくは少なくとも2:1でありうる。さらに、以上に挙げたモル比は、少なくとも5:1、好ましくは少なくとも10:1、さらにより好ましくは少なくとも20:1であることが好ましいこともありうる。
12時間増殖させた3.0のOD600を有する100mg/Lアンピシリン入りの溶原性ブロス(LB)培地の2mLのスターター培養物を750mLの実効体積の発酵培地に接種した。2%(w/v)酵母エキスと2%(w/v)ダイズペプトンと1%(w/v)グルコースと100mg/Lアンピシリンとを含有するEC培地中で発酵を行った。OLGA347β−ガラクトシダーゼ(配列番号2の配列Val(33)〜Ile(1174)を有する)を発現するE.コリ(E.coli)株は、以前に記載されたように調製した(Jorgensenらの米国特許第6,555,348B2号明細書の実施例1および2)。発酵槽は、全容積2Lのガラス皿状底槽を含むApplikon製のものであり、2つのRushtonインペラーを備えていた。発酵時、2M NaOHおよび2M H3PO4の適切な添加によりpHをpH6.5に維持し、かつ温度を37℃に制御した。1〜2L/minの速度で空気をバブリングすることにより酸素を供給し、かつ撹拌速度を増加させることによりpO2を30%に維持した。オフラインOD600読取りにより、増殖を追跡した。約10時間の増殖後、29.7のOD600値で培養物を遠心分離により採取した。650mLの培養上清を−20℃で貯蔵した。細胞ペレットを200mLのスクロース緩衝液(30mM Tris−HCl、40%スクロース、2mM EDTA、pH7.5)中に再懸濁させて、室温で10分間インキュベートすることにより、ペリプラズムタンパク質を浸透圧ショックにより細胞ペレットから単離した。遠心分離後、上清を廃棄して、ペレットを200mLの冷水中に再懸濁させた。83μLの飽和MgCl2溶液を添加して、ペリプラズムタンパク質を含有する上清を遠心分離ステップにより捕集した。ペリプラズム画分を0.2μmのMillipak 40フィルターに通して濾過滅菌し、そして−20℃で貯蔵した。
実施例1に記載の手順に沿って、ただし、配列番号2のアミノ酸配列Val(33)〜Glu(917)の発現に基づいて、第2のβ−ガラクトシダーゼ(OLGA917)を調製した。
β−ガラクトシダーゼ酵素のT値は、以下に与えられるアッセイおよび式に従って決定される。
試験されるβ−ガラクトシダーゼ酵素、10mMクエン酸ナトリウム、1mMクエン酸マグネシウム、1mMクエン酸カルシウム、Milli−Q水(Millipore、USA)からなるpH6.5の3.3mLの酵素溶液を調製する。酵素溶液は、添加された33%(w/w)のラクトースを存在するアッセイ条件下で1時間以内に使用するのに十分な量でβ−ガラクトシダーゼ酵素を含有すべきである。酵素溶液の温度は、37℃にすべきである。
生成されたガラクトースの量(mol単位)および使用されたラクトース(mol単位)の量の決定は、任意の好適な分析技術を用いて行われうる。たとえば、Richmond et al.(1982)およびSimms et al.(1994)に記載の方法に従って、希釈混合物をHPLCにより分析しうる。他の有用な分析技術は、El Razzi(2002)に記載されている。
実施例1のOLGA347酵素を用いて、以上に述べたアッセイを行った。
実施例2で生成されたOLGA917酵素を用いて、以上に述べたT値アッセイを行い、以上に説明した手順に従って、T値を決定した。
市販の従来のラクターゼ酵素Lactozym Pure2600L(Novozymes、Denmark)を用いて、以上に述べたアッセイを行った。OLGA347酵素に関連して記載したように、アッセイから得られた希釈混合物を分析した。三糖および四糖は、検出可能量で存在しなかった。また、等量のグルコースおよびガラクトースが見られた。対応するT値は、1である。
表7に見いだされる量のL−(−)フコースおよびラクトース一水和物を100mLのMilliQ水中に溶解させた。各サンプルを37℃の温度に維持した。また、NaOHの連続添加によりpHを6.5に維持する。100L/minの速度で空気を混合物中に連続的にポンプ注入した。グルコースオキシダーゼ酵素GOX(DuPont、Denmark)をサンプル2に添加した。グルコースオキシダーゼ酵素Gluzyme(Novozymes、Denmark)をサンプル3に添加した。ミクロコッカス・リソデイクティカス(Micrococcus lysodeikticus)由来のカタラーゼ酵素(Sigma−Aldrich、Denmark)をサンプル2および3に添加した。実施例2のOLGA917酵素を各サンプルに添加した。250mLの全プロセス体積になるようにMilliQ水を添加した。この時間をT=0として定義した。ラクトース一水和物を30分間隔で5時間にわたりサンプルに添加した。
表8に見いだされる量のL−(−)フコースおよびラクトース一水和物を100mLのMilliQ水中に溶解させた。各サンプルを37℃の温度に維持し、NaOHの連続添加によりpHを6.5に維持した。100L/minの速度で空気を混合物中に連続的にポンプ注入した。陰イオン交換樹脂Dowex66(Sigma−Aldrich、USA)を用意し、サンプル3に添加した。グルコースオキシダーゼ酵素GOX(DuPont、Denmark)をサンプル2および3に添加した。ミクロコッカス・リソデイクティカス(Micrococcus lysodeikticus)由来のカタラーゼ酵素(Sigma−Aldrich、Denmark)をサンプル2および3に添加した。実施例2のOLGA917酵素を各サンプルに添加した。表8に見いだされる全プロセス体積になるようにMilliQ水を添加した。この時間をT=0として定義した。
表9に見いだされる量のL−(−)フコースおよびラクトース一水和物を100mLのMilliQ水中に溶解させた。各サンプルを37℃の温度に維持し、NaOHの連続添加によりpHを6.5に維持した。100L/minの速度で空気を混合物中に連続的にポンプ注入した。陰イオン交換樹脂Dowex66(Sigma−Aldrich、USA)を用意し、各サンプルに添加した。グルコースオキシダーゼ酵素GOX(Danisco/DuPont、Denmark)をサンプル2に添加した。グルコースオキシダーゼ酵素Gluzyme(Novozymes、Denmark)をサンプル3に添加した。ミクロコッカス・リソデイクティカス(Micrococcus lysodeikticus)由来のカタラーゼ酵素(Sigma−Aldrich、Denmark)をサンプル2および3に添加した。実施例2のOLGA917酵素を各サンプルに添加した。250mLの全プロセス体積になるようにMilliQ水を添加した。この時間をT=0として定義した。ラクトース一水和物を30分間隔で5時間にわたりサンプルに添加した。
この実施例では、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合、ガラクトシル化アクセプター(意図された生成物)とガラクトシル化ドナー/脱離基(副生成物)との比が有意に増加することが実証される。
捕集されたサンプルをMilli−Q水で1:10希釈し、85℃で15分間加熱することにより不活性化させた。特徴付けまで不活性化混合物を−20℃に維持した。
Buchholz(2005)“Biocatalysts and Enzyme technology”,Klaus Buchholz et al.,ISBN−10:3−527−30497−5,2005,Wiley VCH Verlag GmbH
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Yun(1996)“Fructooligosaccharides−Occurrence,preparation,and application”,J.W.Yun,Enzyme and Microbial Technology 19:107−117,1996
Kunz(2000)“Oligosaccharides in human milk:Structural,functional and metabolic aspects”,Kunz et al.,Ann.Rev.Nutr.2000.20:699−722
Simms et al.(1994)Simms,P.J.;Hicks,K.B.;Haines,R.M.;Hotchkiss,A.T.and Osman,S.F.;(1994)Separations of lactose,lactobionic and lactobionolactose by high performance liquid chromatography.J.of Chromatography,667,67−73
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Walstra et al.(2006)“Dairy science and technology”,Walstra et al.,CRC Press,Second edition,2006
Scopes Protein Purification:Principles and Practice;Robert K.Scopes;3rd edition,Springer Verlag New York,Inc.,ISBN 0−387−94072−3
国際公開第01/90,317A2号パンフレット
欧州特許出願公開第2138586A1号明細書
国際公開第2009/113,030A2号パンフレット
国際公開第2012/010,597A1号パンフレット
Claims (14)
- 1種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物の製造方法において、
a)
・脱離基に結合されたガラクトシル基を含むガラクトシルドナーであって、多くとも350g/molのモル重量を有するガラクトシルドナーと、
・前記ガラクトシルドナーとは異なるガラクトシルアクセプターであって、糖または糖アルコールであるガラクトシルアクセプター、
を含む混合物を提供するステップであって、前記ガラクトシルアクセプターと前記ガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも1:10であり、かつ前記混合物は、少なくとも0.05mol/Lのガラクトシルアクセプターを含むステップ、
b)第1の酵素を提供するステップであって、前記第1の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性とガラクトシル転移活性とを有するとともに、前記第1の酵素は、前記混合物に接触するステップ、および
c)前記混合物と前記第1の酵素とをインキュベートして、前記第1の酵素により前記ガラクトシルドナーの脱離基を放出させるとともに、前記ガラクトシルドナーのガラクトシル基を前記ガラクトシルアクセプターに転移することにより、前記ガラクトオリゴ糖を形成するステップであって、ステップc)は、前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベート中の混合物から除去することをさらに含み、かつ前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基の除去は、遊離脱離基をインキュベート中の混合物から物理的に除去することおよび/または遊離脱離基をインキュベート中の混合物中に依然として存在しうる1種以上の他の化学種に変換することを含み、それにより、1種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物を取得するステップ、
を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーの脱離基がグリコシル基であることを特徴とする方法。
- 請求項1または2に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーがラクトースまたはラクチトールであることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至3の何れか1項に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能な微生物を提供するステップと、前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベーション時に前記微生物により除去するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至4の何れか1項に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能な第2の酵素を提供するステップと、前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベーション時に前記第2の酵素により変換するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
- 請求項5に記載の方法において、前記第2の酵素がグルコースオキシダーゼ活性を有することを特徴とする方法。
- 請求項5または6に記載の方法において、
a)前記遊離脱離基に対する前記第2の酵素の特異性定数が、前記ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも10倍であるか、
b)前記遊離脱離基に対する前記第2の酵素の特異性定数が、前記ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも10倍であるか、または
c)前記遊離脱離基に対する前記第2の酵素の特異性定数が、前記モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも10倍である
ことを特徴とする方法。 - 請求項6または7に記載の方法において、カタラーゼ活性を有する酵素をさらに提供することを含み、この酵素がインキュベート中の混合物に接触することを特徴とする方法。
- 請求項5乃至8の何れか1項に記載の方法において、前記第2の酵素により前記脱離基を変換することにより得られた変換生成物の少なくとも一部を除去可能な除去剤を提供するステップと、前記除去剤により前記変換生成物の少なくとも一部をインキュベーション時に除去するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
- 請求項9に記載の方法において、前記除去剤が二価イオンまたは三価金属イオンの塩を含むことを特徴とする方法。
- 請求項9に記載の方法において、前記除去剤が陰イオン交換材料を含むか、さらにはそれからなることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至11の何れか1項に記載の方法において、ステップc)がさらなるガラクトシルドナーの添加を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至12の何れか1項に記載の方法において、ステップc)での前記混合物のガラクトシルドナーの濃度が0.01〜1mol/Lの範囲内の濃度に維持されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至13の何れか1項に記載の方法において、
d)ステップc)の組成物のガラクトオリゴ糖を富化するステップ
をさらに含むことを特徴とする方法。
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