JPH0131487B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はビフイドバクテリウム菌の増殖促進物
質を必須有効成分とする新規な血中アンモニア低
下剤に関するものである。 血液中に存在するアンモニアには、体内の代謝
により発生したものと腸から吸収されたものとが
あるが、肝臓に入るなどして障害を起こす遊離ア
ンモニアの大部分は、後者の腸管由来のアンモニ
アであるとされている。腸管内にアンモニアが発
生するのは、食餌性アミノ酸及び腸管へ排泄され
た尿素が、腸内細菌によりアンモニアにまで分解
されるためである。 このような血中アンモニアの量が異常に多いと
き、これを直接又は間接的に低下させることによ
り高アンモニア血症を予防又は治療し、あるいは
肝臓障害患者の肝機能負担を軽減する血中アンモ
ニア低下剤としては、従来非吸収性の抗生物質、
ラクチユロース、生菌製剤、NHA・プリヒドロ
キサム酸等のウレアーゼ阻害剤などが知られてい
る。しかしながら、これらは安全性や有効性にお
いて、一長一短あるものであつた。 ところで本発明者らは、腸内細菌叢に関する研
究の過程で、腸内常在細菌の一種であるビフイド
バクテリウム菌を腸内に特異的に増殖させると腸
管内アンモニアやインドールが顕著に低下するこ
とを知つた。本発明は、かかる知見及びビフイド
バクテリウム菌増殖促進物質TOSに関する別の
発明に基づいて完成されたものであつて、腸管内
におけるアンモニアの生成を抑制することにより
血中アンモニアを低下させる血中アンモニア低下
剤として、一般式Gal―（Gal）_o―Glcで示される
オリゴ糖を有効成分とするもの、並びに上記オリ
ゴ糖とビフイドバクテリウム菌を有効成分とする
ものの二つを提供するものである（但し上式にお
いてGalはガラクトース残基、Glcはグルコース
残基、ｎは１〜４の整数を、それぞれ表わす。）。 本発明によるアンモニア低下剤の必須有効成分
である上記オリゴ糖（以下TOSという）は腸内
におけるビフイドバクテリウム菌の増殖を著しく
促進し、その結果、前記機構により腸内アンモニ
ア、ひいては血中アンモニアを低下させるのであ
る。 ビフイドバクテリウム菌増殖促進物質としての
TOS及びその製造法の発明についてはさきに特
許出願（特願昭54―12837号・特公昭58―20266
号）したが、TOSの多くは文献未載の化合物な
ので、以下これについてやや詳細に説明する。 前述のように、TOSはβ―ガラクトシダーゼ
でラクトースを処理すると生成するオリゴ糖であ
る。この方法によつてTOSを製造する場合、β
―ガラクトシダーゼで処理するラクトースは特に
高純度のものを用いる必要はなく、通常市販され
ているものをそのまま使用することができる。ま
た全乳、脱脂乳のようにラクトースを一成分とし
て含有する物質も原料として用いることができ
る。β―ガラクトシダーゼとしては、アスペルギ
ルス・オリゼの生産したものが好ましい。 酵素処理を行なう場合、基質濃度は10〜50％程
度、PHは３〜6.5、酵素濃度は１〜100units／ml、
温度は20〜50℃が適当である。 反応時間はオリゴ糖の収率に大きな影響を及ぼ
す。酵素処理の一例における反応時間と生成糖類
の量との関係を示す第１図から明らかなように、
反応初期にはグルコース、ガラクトース及びオリ
ゴ糖がほぼ直線的に増加するが、その後はいずれ
もやや複雑な曲線を描き、オリゴ糖はある時点か
ら徐々に減少する傾向を示す。オリゴ糖の収率が
最大になる時間は他の反応条件によつて異なるか
ら、最適反応時間は実験により確認することが望
ましい。 なお反応混合物中のオリゴ糖は、例えば薄層ク
ロマトグラフイーにより他の成分と分離した後、
Anthrone法によつて定量することができる。 酵素反応は処理液を約90℃以上に５〜10分加熱
することにより停止させることができる。 酵素処理を終つた反応混合物はそのまま適宜濃
縮し更に乾燥して粉末化したものを本発明の医薬
の構成成分として利用してもよいが、有効成分で
あるオリゴ糖濃度を高めるための精製を行うこと
が望ましい。精製は種々の方法で行うことができ
るが、例えば反応混合物をイオン交換樹脂で処理
して予備的に精製した後、活性炭カラムに通して
これにオリゴ糖を吸着させ、次いでアルコール水
溶液で溶出させる方法がある。又反応混合物に単
糖類及び２糖類を資化する微生物を接種し培養し
て単糖類及び２糖類を消費させることによりオリ
ゴ糖の単離を容易にする方法もある。 以上のようにして製造されたオリゴ糖混合物の
形のTOSは、そのほぼ半量が３糖類であり、４
糖類が約1/3、残りが他の多糖類である。またこ
れらのオリゴ糖におけるガラクトース―ガラクト
ース間結合はβ―１，３結合、β―１，４結合又
はβ―１，６結合であつてβ―１，６結合が主で
あり、ガラクトース―グルコース間結合はβ―
１，３結合、β―１，４結合又はβ―１，６結合
であつてβ―１，４結合が主であることが確認さ
れている。 しかしながら、これらのオリゴ糖は、単離され
たものについて検討した限りにおいて、個々のオ
リゴ糖単独でもビフイドバクテリウム菌増殖促進
因子として働き、したがつて本発明の医薬の構成
成分として使用することができる。 なおTOSの毒性については、ICR系マウス、
Wistar系ラツト雌雄各40匹を用いて、経口投与
により急性毒性試験を行なつたが、LD₅₀はいず
れも15ｇ／Kg以上であり、異常は認められなかつ
た。 TOSは、それ単独で服用しても、腸内常在性
ビフイドバクテリウム菌を特異的に増殖させて腸
管内アンモニア発生量の低減に貢献するが、
TOSに適量のビフイドバクテリウム菌末を併用
するときは、上記機構によるアンモニア発生の抑
制は一層効果的に行われる。 TOSと共に用いるビフイドバクテリウム菌末
としては、ビフイドバクテリウム・ブレーベ（例
えば微工研菌寄第3906号、ATCC15700等）、同ロ
ンガム（例えばATCC15707）、同アドレスセンテ
イス（例えばATCC15703）、同インフアンテイス
（例えばATCC15697）、などの常法による凍結乾
燥菌末を用いることができる。また製剤化のため
の賦形剤としては、デンプン、ヒドロキシプロピ
ルセルロースなどが適当であり、生菌数は１×
10⁸個／ｇ以上とすることが望ましい。 ビフイドバクテリウム菌の安全性はWistar系
ラツト雌雄を用いた亜急性毒性試験を行なつて確
認されており、菌投与ラツトの一般症状、体重の
変化、飼料摂取量、血液学的検索、血清学的検
索、尿検査、臓器重量測定、剖検及び病理組織学
的検索のすべてにおいて、異常を認めなかつた。 本発明の第２におけるTOSとビフイドバクテ
リウム菌の配合比は、生菌数約１×10⁹／ｇの菌
末の場合で、TOS100重量部当り菌末５〜30重量
部とすることが望ましい。但し、両者は一緒に製
剤化する必要はなく、別個に散剤、顆粒、錠剤等
として包装しておき、服用時に適宜併用するよう
にしても差支えない。 本発明の血中アンモニア低下剤は、TOS単用
の場合、成人１日当り２〜10ｇを２〜４日間又は
それ以上の期間、経口服用すればよい。TOSと
ビフイドバクテリウム菌の併用剤の場合は、ビフ
イドバクテリウム菌生菌数が成人１日当り10⁸〜
10¹⁰個となるよう服用するとよい。なお生菌数が
10⁹個／日以上の場合は、上記TOS単用剤の場合
よりもTOS服用量を減らしてもよい。 以下試験例及び実施例を示して本発明を説明す
る。なお各例中、「Ｂ菌」とあるのはビフイドバ
クテリウム菌を意味する。 実施例 １ 3.6Kgのラクトースを約６の温水に溶解し、
1M―酢酸緩衝溶液（PH4.6）50ml、β―ガラクト
シダーゼ10万単位及び水を加えて10とし、37℃
で５時間反応させた。次いで反応液を加熱して酵
素を変性させ、変性タンパク質を別した後、陽
イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂のカラムを
通した。通過液は30×30cmの活性炭充填カラムに
一夜接触させ、その後活性炭を脱イオン水60で
水洗いして単糖類を溶出した後、５％エタノール
60、次いで50％エタノール60で溶出した。こ
の50％エタノール溶出区分を約７に濃縮し、孔
径0.2μのメンプランフイルターで無菌過した
後、再度イオン交換、減圧濃縮、過を行ない、
液を凍結乾燥して白色のTOS粉末を得た。こ
のTOSは３糖類55％、４糖類32％、その他13％
からなるものであつた。これを粉砕機にて粉砕混
合し、分包充填機にてアルミ分包し、TOS製剤
を製造した。 実施例 ２ 実施例１と同様にして製造したTOS粉末を水
に溶解し、加熱殺菌後濃縮し、濃度50〜80％のシ
ロツプ剤とする。またはそのまま、あるいは少量
のヒドロキシプロピルセルロースを加え、顆粒剤
とする。またこれにステアリン酸マグネシウム滑
沢剤として加え打錠し、TOS錠剤とする。 実施例 ３ ビフイドバクテリウム・ブレーベYIT4006（微
工研菌寄第3906号）をVL―Ｇ培地にて48時間培
養後、遠心分離機により集菌した。この後分散媒
を加え凍結乾燥した菌体を水に懸濁し、生菌数を
１×10⁹／mlに調整した。 実施例 ４ 実施例３と同様にして得た菌体をデンプンと混
合して生菌数を１〜２×10⁹／ｇに調整し、次に
ヒドロキシプロピルセルロースを加えて練合し、
造粒機にて顆粒剤とした後、アルミ分包してビフ
イドバクテリウム菌末製剤を得た。 これに実施例２と同様にして製造したTOS顆
粒剤を85重量％に混合しTOSとビフイドバクテ
リウム菌との混合顆粒剤を製造した。 試験例 １ 健康成人16人に対し、次のような実験を行なつ
た。用いたTOSとＢ菌液は、実施例１および３
の方法で調製したものである。またTOSは微温
湯に溶解し、昼食後に服用した。 〔実験設定〕 (1)群：TOSのみ投与群（５例） スケジユール １週目……TOS無投与 ２週目……TOS（３ｇ／日）を投与 ３週目……TOS（10ｇ／日）を投与 (2)群：Ｂ菌液とTOSの併用投与群（５例） スケジユール １週目……Ｂ菌液（１ml／日）のみ投与 ２週目……Ｂ菌液（１ml／日）及びTOS
（３ｇ／日）を投与 ３週目……Ｂ菌液（１ml／日）及びTOS
（10ｇ／日）を投与 (3)群：Ｂ菌液のみ全期間投与群（６例） 測 定：各週３日目、５日目及び７日目に、各
人の糞便中のアンモニア含量と尿中のイン
ジカン量を測定し、その週における平均値
を求めた。 結果は第２図及び第３図のとおりであつて、
TOSの投与により糞便中のアンモニア含量、お
よび早朝尿中のインジカンの低下が認められる。
またTOSとＢ菌の併用投与は、TOS単独投与よ
りも有効であることが認められた。 試験例 ２ SD系成熟雄ラツト１群６匹を用いてTOSの投
与試験を行なつた。用いたTOSとＢ菌液は実施
例１と３で調製したもので、TOSは微温湯に20
重量％溶解し、Ｂ菌液は生菌数１×10ｇ／mlと
し、各々経口投与した。 〔実験設定〕 群：TOSとＢ菌液の併用投与群（投与量
TOS 1.5ｇ／日、菌液 ３ml／日） 群：TOSのみ投与群（投与量 TOS 1.5
ｇ／日） 群：無投与群 群：無処理群 上記〜各群の全ラツトは卵白を食餌に20％
添加した高蛋白食飼育を行なつた。群は通常食
餌にて飼育した。 測 定：上記実験設定のもとに４週間飼育した
後、全ラツトの門脈血および盲腸内容物を
採取しアンモニア量を測定した。 実験結果は表１のとおりであつて、高蛋白食飼
育を行うことにより、通常食飼育を行なつた群
に比べ有意な門脈血中アンモニア量の上昇がみら
れた。門脈血中アンモニアの低下作用はTOSと
Ｂ菌液の併用投与群、TOSのみ投与群の順で高
く、有意な低下効果が認められた。また盲腸内容
物のアンモニア量についても測定したところ、同
様の結果が得られ、TOS単独、あるいはTOSと
Ｂ菌の併用投与により腸管内のアンモニア産生を
抑制し、血中のアンモニア量を低下し得ることが
認められた。 【表】

【図面の簡単な説明】

第１図はラクトースをβ―ガラクトシダーゼで
処理したときの変化を示すグラフである。第２図
及び第３図はいずれも試験例１における測定結果
を示すグラフである。 Ｃ：無投与、Ｔ：TOS投与、Ｂ：Ｂ菌投与、
Ｂ＋Ｔ：Ｂ菌及びTOSを投与。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式Gal―（Gal）_o―Glc（但し式中Galはガ
   ラクトース残基、Glcはグルコース残基、ｎは１
   〜４の整数を、それぞれ表わす）で示されるオリ
   ゴ糖を有効成分とする血中アンモニア低下剤。 ２ 一般式Gal―（Gal）_o―Glc（但し式中Galはガ
   ラクトース残基、Glcはグルコース残基、ｎは１
   〜４の整数を、それぞれ表わす）で示されるオリ
   ゴ糖及びビフイドバクテリウム菌を有効成分とす
   る血中アンモニア低下剤。