JP2002272452A - バークホルデリア・セパシア、キチナーゼ、キチナーゼの製法及びキチンオリゴ糖の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 重合度の高い５糖、６糖以上のキチンオリゴ
糖を効率良く生産できるキチンオリゴ糖の製法を提供す
ることにある。 【解決手段】 キチナーゼ生産能を有するバークホルデ
リア・セパシアを培養する。次に、この培養物中に分泌
生産されたキチナーゼを分離精製する。その後、分離精
製して得られたキチナーゼにてキチンを分解してキチン
オリゴ糖を調製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、バークホルデリア
・セパシア、キチナーゼ、キチナーゼの製法及びキチン
オリゴ糖の製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】キチンオリゴ糖は、難消化性、ビフィズ
ス菌利用性、免疫賦活活性、抗感染病効果、植物生長促
進作用等の作用を示すため、機能性食品、医薬品、農業
分野等で利用されている。特に、５〜８糖のキチンオリ
ゴ糖は、その作用に優れている。しかして、従来よりキ
チンオリゴ糖は、キチンを酸加水分解する化学的方法に
より製造されていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
化学的方法では、５糖、６糖以上のキチンオリゴ糖の生
産性が低いという問題があった。一方、キチナーゼを用
いた酵素法でキチンオリゴ糖の調製が試みられたが、得
られたキチンオリゴ糖は２糖がほとんどであり、重合度
の高い５糖、６糖以上のキチンオリゴ糖は未だに得られ
ていない。

【０００４】そこで、本発明は、重合度の高い５糖、６
糖以上のキチンオリゴ糖を効率良く生産できるバークホ
ルデリア・セパシア及びキチナーゼを提供し、さらに、
キチナーゼの製法及びキチンオリゴ糖の製法を提供する
ことを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上述の目的を達成するた
めに、本発明に係るバークホルデリア・セパシアは、キ
チナーゼ生産能を有するものである。また、本発明に係
るキチナーゼは、バークホルデリア・セパシアによって
生産されたものである。このとき、このキチナーゼは、
キチンに作用して機能性の高い（ＧicＮＡc ）５〜８を
含むキチンオリゴ糖を生産するものである。また、本発
明に係るキチナーゼの製法は、キチナーゼ生産能を有す
るバークホルデリア・セパシアを培養し、この培養物中
に分泌生産されたキチナーゼを分離精製するものであ
る。また、本発明に係るキチンオリゴ糖の製法は、キチ
ナーゼ生産能を有するバークホルデリア・セパシアを培
養し、この培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離
精製し、分離精製して得られたキチナーゼにてキチンを
分解してキチンオリゴ糖を調製するものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳説する。

【０００７】近年、キチンオリゴ糖は、難消化性、ビフ
ィズス菌利用性、免疫賦活活性、抗感染病効果、植物生
長促進作用などの作用があるとして機能性食品、医薬
品、農業分野等で利用されており、特に、５糖、６糖以
上のキチンオリゴ糖がその作用に優れていることが知ら
れている。

【０００８】本発明者等は、試行錯誤の実験等を重ねた
結果、バークホルデリア・セパシア（Ｂurkholderia ce
pacia ）に属する菌がキチナーゼ生産能を有し、バーク
ホルデリア・セパシアに属するキチナーゼ生産菌にて作
られたキチナーゼが、キチンを重合度の高い５糖、６糖
以上のキチンオリゴ糖に効率良く変換しうることを見出
した。

【０００９】そこで、本発明は、重合度の高い５糖、６
糖以上のキチンオリゴ糖に効率良く得るためのものであ
って、その第１の本発明は、キチナーゼ生産能を有する
バークホルデリア・セパシアである。また、第２の本発
明は、バークホルデリア・セパシアによって生産された
キチナーゼであって、キチンに作用して機能性の高い
（ＧicＮＡc ）５〜８を含むキチンオリゴ糖を生産する
ものである。また、第３の本発明は、キチナーゼ生産能
を有するバークホルデリア・セパシアを培養し、この培
養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精製するキチ
ナーゼの製法である。そして、第４の本発明は、キチナ
ーゼ生産能を有するバークホルデリア・セパシアを培養
し、この培養物中に分泌生産されたキチナーゼを分離精
製し、分離精製して得られたキチナーゼにてキチンを分
解してキチンオリゴ糖を調製するキチンオリゴ糖の製法
である。

【００１０】キチナーゼ生産能を有するバークホルデリ
ア・セパシアとしては特に限定されないが、バークホル
デリア・セパシアＫＨ２株の使用が好ましい。このバー
クホルデリア・セパシアＫＨ２株は、椎茸生産現場のホ
ダ木から、キチナーゼ生産能に関するスクリーニングに
より新規に見出されたものであり、2001年３月16日に
「バークホルデリア・セパシアＫＨ２株」（受託番号FE
RM P-18257）として産業技術総合研究所生命工学工業技
術研究所に寄託され、下記の細菌学的性質を有する。

【００１１】１．態学的性質 菌形：カン菌 大きさ：0.5-1.0 ×1.0-3.0 μm 胞子の形成：陰性 運動性：陽性 ２．生理学的性質 グラム染色性：陰性 カタラーゼ：陽性 酸素に対する態度：好気性 蛍光色素の生成：陰性 硝酸塩の還元性：陰性 インドールの生成：陰性 グルコースの発酵性：陰性 アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 ウレアーゼ：陰性 エスクリンの分解：陰性 ゼラチンの液化：陽性 Ｂ−ガラクトシダーゼ：陰性 資化性 グルコース：陽性 Ｌ−アラビノース：陰性 Ｄ−マンノース：陽性 Ｄ−マンニトール：陽性 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：陽性 マルトース：陰性 グルコン酸カリウム：陽性 ｎ−カプリン酸：陽性 アジピン酸：陰性 dl−リンゴ酸：陽性 クエン酸ナトリウム：陽性 酢酸フェニル：陽性 オキシダーゼ：陰性 セロビオースからの酸の産生：陽性

【００１２】以上の菌学的性質を有する菌について、腸
内細菌以外のグラム陰性カン菌同定キットＡＰＩ20ＮＥ
を用いて測定したところ、蛍光色素の生成が見られなか
ったことからバークホルデリア・セパシア（Ｂurkholde
ria cepacia ）と同定した。本菌株はバークホルデリア
・セパシアに属すると認められ、上述の如く「バークホ
ルデリア・セパシアＫＨ２株」と命名した。

【００１３】このバークホルデリア・セパシアＫＨ２株
の培養においては、通常の細菌の培養法が一般的に用い
られる。培養のための栄養源としては下記に示す如く色
々なものを用いることができる。即ち、炭素源、窒素
源、無機塩類を適宜含有する培地であれば、天然培地で
も合成培地でも使用できる。

【００１４】窒素源としては、硝酸カリウム、硝酸ナト
リウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、コーングルテンミー
ル、コーンステイープリカー、ペプトン、ソイビーンミ
ール、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、大豆粉など
を使用できる。

【００１５】無機塩類としては、ナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム、カルシウム、マンガン、鉄、亜鉛、
銅等の塩類、例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄、硫酸亜
鉛、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、塩化カルシウ
ム、塩化カリウム等を使用できる。これらの他、添加可
能な栄養因子としてはビタミン類、アミノ酸、核酸及び
その塩類などが例示される。

【００１６】培養は、好気的条件、例えば振とう培養
法、通気攪拌培養法が好適であるが、適宜液体静置培養
を組み合わせることもできる。培養温度は、25〜37℃、
特に28〜32℃が好適である。培地の初発のpHは6.0 〜7.
0 、好ましくは6.5 付近である。培養時間は、培地量、
培養温度、培養法、pH等に応じて適宜選択することがで
き、特に制限されない。好ましくは、48〜120 時間、さ
らに好ましくは72〜96時間である。通気攪拌培養等で培
養物中にキチナーゼが分泌生産される。

【００１７】分泌生産されたキチナーゼを含む培養物
は、濾過又は遠心分離等の操作にて菌体を除去した培養
液とされ、その培養液をそのまま粗キチナーゼとして使
用することができる。

【００１８】粗キチナーゼからのキチナーゼの分離精製
は、硫安による分画沈殿、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ
−６Ｂによるカラムクロマトグラフィー、セファアクリ
ルによるゲル濾過等の公知の酵素精製法を用いることが
でき、高純度のキチナーゼを得ることができる。

【００１９】このようにして分離精製されたキチナーゼ
は、下記の理化学的性質を備えている。 分子量：34,000（測定方法；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
法） 等電点：5.9 （アクリルアミド等電点電気泳動法によ
る） 最適pH：4.0 〜4.5 pH安定性：4.0 〜5.5 最適温度：45〜50℃ 温度安定性：50℃まで安定 基質特異性：本酵素（キチナーゼ）によるキチン加水分
解物をＴＬＣ及びＨＰＬＣで分析した結果、機能性の高
い（ＧicＮＡc ）５〜８を含むキチンオリゴ糖が得られ
た。また、生成糖の関係を調べた結果、本酵素はエンド
型のキチナーゼであることが判明した。

【００２０】

【実施例】Ａ．キチナーゼ生産能を有するバークホルデ
リア・セパシアの選抜 キチンを含まない最小培地と、キチンを唯一の炭素源と
する最小培地の夫々のプレートに植菌し、30℃で５日間
培養した。 （キチンを含まない最小培地）硫酸アンモニウム８ｇ、
リン酸二水素カリウム６ｇ、リン酸水素二カリウム14
ｇ、寒天15ｇ、蒸留水１Ｌを混合したものを pH 7.0 に
調製してオートクレーブで 121℃、20分間滅菌した。そ
の後、濾過滅菌した硫酸マグネシウム７水和物を0.02％
になるように加えて混ぜ合わせ分注し、プレートを作成
した。 （キチンを唯一の炭素源とする最小培地）キチン20ｇ、
硫酸アンモニウム８ｇ、リン酸二カリウム６ｇ、リン酸
水素二カリウム14ｇ、寒天15ｇ、蒸留水１Ｌを混合した
ものをpH 7.0に調製してオートクレーブで 121℃、20分
間滅菌した。その後、濾過滅菌した硫酸マグネシウム７
水和物を0.02％になるように加えて混ぜ合わせ分注し、
プレートを作成した。

【００２１】キチンを唯一の炭素源とする最小培地に生
育した菌株を、キチンを含まない最小培地に生育したも
のと比較して、生育の良かったＨ５、Ｔ１（元株）、Ｔ
１（Bac ）、Ｕ１、Ｈ１、Ｙ９、Ｃ２Ｆを選抜した。

【００２２】その後、選抜した菌株を下記の培地１〜７
に夫々植菌し、液体培地は振とう培養で、固体培地は静
置培養で30℃、６日間培養した。 （培地１）コーングルテンミール 3.5ｇ、グルコース
0.5ｇ、リン酸二水素カリウム0.05ｇ、硝酸カリウム 0.
1ｇ、キチン 0.5ｇ、蒸留水50mlを混合し、オートクレ
ーブで 121℃、20分間滅菌した。 （培地２）ハートインフュージョンブロス 3.5ｇ、グル
コース 0.5ｇ、リン酸二水素カリウム0.05ｇ、硝酸カリ
ウム 0.1ｇ、キチン 0.5ｇ、蒸留水50mlを混合し、オー
トクレーブで 121℃、20分間滅菌した。 （Natic 培地） 10×Ａ液：硫酸アンモニウム14ｇ、リン酸水素二カリウ
ム20ｇ、尿素 0.3ｇ、塩化カルシウム３ｇ、硫酸マグネ
シウム７水和物 0.3ｇ、蒸留水100ml を混合した。 Ｂ液：硫酸鉄水和物0.05ｇ、硫酸マンガン 0.016ｇ、硫
酸亜鉛水和物0.014ｇ、塩化カルシウム0.02ｇ、蒸留水
100mlを混合した。10×Ａ液10ml、Ｂ液１mlを蒸留水で
100mlに定容した。 （培地３）キチン0.25ｇ、乾燥椎茸粉末0.25ｇ、小麦胚
芽粉末0.05ｇ、Natic 培地50mlを混合し、オートクレー
ブで 121℃、20分間滅菌した。 （培地４）キチン0.25ｇ、乾燥椎茸粉末0.25ｇ、Natic
培地50mlを混合し、オートクレーブで 121℃、20分間滅
菌した。 （培地５）ふすま５ｇ、Natic 培地50mlを混合し、オー
トクレーブで 121℃、20分間滅菌した。 （培地６）AvicelＰＨ101 4.5ｇ、キチン0.25ｇ、小麦
胚芽粉末0.25ｇ、Natic 培地50mlを混合し、オートクレ
ーブで 121℃、20分間滅菌した。 （培地７）ふすま4.75ｇ、キチン0.25ｇ、Natic 培地50
mlを混合し、オートクレーブで121℃、20分間滅菌し
た。

【００２３】上記培地１〜７で各菌株を培養した後、得
られた粗酵素液のキチナーゼ活性を測定した。その結果
を表１に示した。

【００２４】

【表１】

【００２５】測定結果から、Ｔ１（Bac ）、Ｕ１、Ｃ２
Ｆの活性が強いことが分かった。さらにこれらの菌株を
最終的に選抜するため、培地３と培地４に夫々植菌し、
30℃、５日間振とう培養した。そして、得られた酵素液
のキチナーゼ活性を測定した。その結果を表２に示し
た。

【００２６】

【表２】

【００２７】測定結果から、Ｔ１（Bac ）のキチナーゼ
活性が最も強いことが分かった。このＴ１（Bac ）につ
いて、各種の形態学的性質、生理学的性質、化学分類学
的性質を調べ、バークホルデリア・セパシアに属する菌
であると同定し、バークホルデリア・セパシアＫＨ２株
と命名した。

【００２８】Ｂ．キチナーゼ生産菌「バークホルデリア
・セパシアＫＨ２株」からのキチナーゼの精製 (1) キチンパウダー 2.5％、乾燥椎茸粉末 2.5％、小
麦胚芽粉末 0.5％とＮatick 培地50ccを500cc のフラス
コに分注し、 120℃で30分間滅菌した。 (2) 前培養として、上記フラスコにＫＨ２株を植菌
し、30℃で24時間振とう培養を行った。 (3) この前培養液10ccを、 120℃で30分間滅菌処理し
た上記培地に植菌し、通気量１Ｌ／分、回転数 300rpm
で30℃，72時間通気攪拌培養を行った。 (4) 培養後、7000rpm ，10分間遠心分離を行い、培養
上清液を得た。 (5) 次に、上清液に対し飽和量の硫安を加え塩析を行
った。 (6) 生じた沈殿物を7000rpm ，２分間遠心分離して沈
殿を捕集し、脱イオン水350cc に溶解し、溶解後セロハ
ンチューブに入れ、脱イオン水に対して十分に透析し
た。 (7) この透析された溶液を凍結乾燥して粗酵素サンプ
ル15ｇを得た。 (8) この粗酵素のチキナーゼ活性を下記の力価測定法
（Rondle-Morgan 測定法）により測定したところ、1500
u/ｇであった。 力価測定法：試験管に試料2.0cc を入れ、45℃の恒温槽
中で基質2.0cc を加え、２時間反応させた。この時のブ
ランクは、基質2.0cc に0.05Ｍ酢酸緩衝液（pH5.0 ）
2.0ccを加えたものを使用した。反応後、フィルター濾
過し、別の試験管に上澄み液を 0.5ccとり、それにpH9.
1 のホウ酸緩衝液 0.5ccを添加し、管口に蓋をして沸騰
水中で３分間煮沸した。直ちにこれを冷却し、酢酸で10
倍希釈したDMAB溶液 3.0ccを加え、38℃の恒温槽中に20
分間放置し、 550nmにおける吸光度を測定し、生成した
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン量を求め、酵素力価を
算出した。なお、上記条件下において、１分間に１μＭ
のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（分子量221.21）を
生成する酵素量を１単位とする。

【００２９】(9) 上記粗酵素サンプルを20mMトリス塩
酸緩衝液（pH7.0 ）に溶解して、10,000rpm で10分間遠
心分離を行い上清液を得た。 (10) この上清液を20mMトリス塩酸緩衝液（pH7.0 ）で
平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを充填し
たカラム（ 2.6cm×40cm）に通じてキチナーゼを吸着さ
せた後、０〜 0.6ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で酵素タ
ンパク質を溶出する陰イオン交換クロマトグラフィーを
行った。 (11) その結果、キチナーゼの活性ピークが２つ得ら
れ、活性の高い方のピークフラクションを集め、コロジ
オンバッグによる濃縮及び透析を行った。 (12) この濃縮液を再度ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂカラムに吸着させ、０〜 0.4ＭのＮａＣｌの直線濃
度勾配で酵素タンパク質を溶出した。 (13) その結果、キチナーゼの活性ピークが２つ得ら
れ、活性の高い方のピークフラクションのキチナーゼ比
活性を測定したところ18.0単位/mｇであり、粗酵素サン
プルの12倍であった。 (14) このフラクションを濃縮及び透析し、セファアク
リルＳ100 ＨＲカラムによりゲル濾過クロマトグラフィ
ーを行った。 (15) このフラクションについてポリアクリルアミド電
気泳動を行った結果、単一のバンドが確認されたので、
これをＫＨ２株由来の精製酵素であるキチナーゼとし
た。また、本酵素の分子量は約3,4000であると推測され
た。また、 pＩは5.90であった。

【００３０】Ｃ．バークホルデリア・セパシアＫＨ２株
由来の酵素キチナーゼの性質 （最適基質の測定） 精製酵素に調製済みの各基質（ 0.2％グリコールキチン
溶液、 0.2％キトサンＥＬ溶液、 0.2％キトサン９Ｂ溶
液、 0.2％キトサン８Ｂ溶液、 0.2％キトサン10溶液、
0.2％コロイダルキチン溶液、 0.2％ＰＤＣ、 0.2％キ
トサン７Ｂ溶液）を加え、45℃において反応させ、上記
Rondle-Morgan 法に従って酵素活性を測定した。その結
果、図１に示すように、脱アセチル化度が70％のキトサ
ン７Ｂで最も高い活性を示していることが分かった。ま
た、本酵素は、ある程度脱アセチル化されたキチンに対
してもよく反応した。

【００３１】（最適pHの測定）pH3.0 〜pH8.5 の各pHの
緩衝液で希釈した精製酵素に 0.2％キトサン７Ｂ溶液を
基質として加え、上記Rondle-Morgan 法に従って酵素活
性を測定した。その結果、図２に示すように、最適pHは
4.0 〜4.5 であることが分かった。

【００３２】（pH安定性の測定）pH3.0 〜pH8.5 の各pH
の緩衝液で希釈した精製酵素を一定時間静置後、0.2％
キトサン７Ｂ溶液を基質として加え、上記Rondle-Morga
n 法に従って酵素活性を測定した。その結果、図３に示
すように、pH4.0 〜pH5.5 で安定を保つことが分かっ
た。

【００３３】（最適温度の測定）精製酵素に 0.2％キト
サン７Ｂ溶液を基質として加え、30〜70℃まで５℃毎に
設定した恒温槽で反応させ、上記Rondle-Morgan 法に従
って酵素活性を測定した。その結果、図４に示すよう
に、最適温度は45〜50℃であることが分かった。

【００３４】（温度安定性の測定）30〜70℃まで５℃毎
に設定した恒温槽に精製酵素を一定時間静置した後、
0.2％キトサン７Ｂ溶液を基質として加え、上記Rondle-
Morgan 法に従って酵素活性を測定した。その結果、図
５に示すように、熱に対しては50℃まで安定で、60℃で
完全に失活することが分かった。

【００３５】（加水分解産物のＴＬＣによる分析）基質
である１％ＰＤＣ溶液 0.9mlに本酵素 0.1mlを加え、45
℃で 0.5，１，２，６，12，24時間反応させた後、５分
間煮沸し反応を停止させ、凍結乾燥により濃縮し、これ
を薄層プレートにスポットした。展開溶媒は、ブタノー
ル：エタノール：アンモニア＝４：３：３（v/v ）を用
いた。展開後、30％硫酸を噴霧し、 120℃で15分静置し
た。標準試料によるＴＬＣの結果、１時間反応後より、
機能性の高いとされる５〜８糖のキチンオリゴ糖の生成
が明らかとなった。

【００３６】（オリゴマー加水分解産物のＨＰＬＣによ
る分析）基質である１％ＰＤＣ溶液0.9ml に本酵素0.1m
l を加え、45℃で0.5 ，１，２，６，12，24時間反応さ
せた後、５分間煮沸し反応を停止させ、これをサンプル
とし、10μl をロードした。その結果を表３に示した。
なお、分析条件は以下の通りである。 ポンプ：ＣＣＰＭ（東ソー株式会社） ディレクター：ＲＩ−8010（東ソー株式会社） カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ−ＮＨ２−60 4.6×250nm カラム恒温槽：ＣＯ−8011（東ソー株式会社） レコーダー：Sic Chromatocorder 12 （システム・イン
スツルメンツ） 溶媒：アセトニトリル：蒸留水＝65：35（v/v ） 流速：1.0ml/min カラム温度：36℃

【００３７】

【表３】

【００３８】標準試料によるＨＰＬＣの結果、モノマー
とダイマーについては全く変化がなかった。ダイマーを
分解しないということから、本酵素にはβ−Ｎ−アセチ
ルグルコサミニダーゼ活性がないと示唆された。トリマ
ーからヘキサマーまでのオリゴ糖については、ほとんど
がダイマーに分解されていた。しかしながら、テトラマ
ーに関しては、基質以上に大きいペンタオース、ヘキサ
オースが生成していることが分かった。

【００３９】（オリゴマー加水分解産物のＨＰＬＣによ
る分析）各オリゴマーの 2.5％溶液を 250μl に調製
し、これに本酵素10μl を45℃で１時間反応させ、その
後煮沸して反応を停止した。これをサンプルとし、10μ
l をロードした。このとき、分析条件は上述と同様であ
る。その結果を表４に示した。

【００４０】

【表４】

【００４１】標準試料によるＨＰＬＣの結果、時間が経
つにつれてヘキサオース、ヘクタオースが増加してい
た。また、ペンタオース、ヘキサオースと思われるピー
クのリテンションタイムが、スタンダードのリテンショ
ンタイムと一致していなかった。これは、基質として用
いたキチンが、 100％Ｎ−アセチルグルコサミンのポリ
マーでなく、部分的に脱アセチル化されているために、
生成したオリゴ糖にＮ−グルコサミンが含まれることに
なり、スタンダードとのリテンションタイムにずれが生
じたのではないかと推測された。

【００４２】また、本酵素キチナーゼのＮ末端アミノ酸
配列を調べたところ、A-L-P-S-N-F-I-F-S-A-Y-K-D-I-T
であり、Burkholderia gladioli との相同性が認められ
た。

【００４３】

【発明の効果】本発明は上述の如く構成されるので、次
に記載する効果を奏する。

【００４４】（請求項１によれば）キチナーゼ生産能を
有するバークホルデリア・セパシア（特に、バークホル
デリア・セパシアＫＨ２株）は、キチナーゼ活性が高
く、機能性の高い（ＧicＮＡc ）５〜８を含むキチンオ
リゴ糖を生産するキチナーゼを生成することができる。
また、椎茸生産現場のホダ木に生息するため、採取が容
易であると共に、通常の細菌の培養法を用いて培養する
ことができ、かつ、培養のための栄養源として炭素源、
窒素源、無機塩類等を適宜含有する培地であれば天然培
地でも合成培地でも使用でき、培養が容易である。

【００４５】（請求項２によれば）バークホルデリア・
セパシアによって生産（生成）されたキチナーゼは、重
合度の高い５糖、６糖以上のキチンオリゴ糖を生産する
ことができる。 （請求項３によれば）キチナーゼを利用して機能性の高
い（ＧicＮＡc ）５〜８を含むキチンオリゴ糖を確実に
生産することができる。従って、この重合度の高いキチ
ンオリゴ糖の各種利用分野（機能性食品、医薬品、農業
分野等）への使用拡大を図ることができる。

【００４６】（請求項４によれば）機能性の高い（Ｇic
ＮＡc ）５〜８を含むキチンオリゴ糖を生産するキチナ
ーゼを、高純度で効率良くかつ比較的簡単に生産（生
成）することができる。

【００４７】（請求項５によれば）機能性の高い（Ｇic
ＮＡc ）５〜８を含むキチンオリゴ糖を、高純度で効率
良くかつ比較的簡単に生産することができる。従って、
この重合度の高いキチンオリゴ糖を各種利用分野（機能
性食品、医薬品、農業分野等）へ低コストにて提供する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のキチナーゼの最適基質の測定結果を示
すグラフ図である。

【図２】本発明のキチナーゼの最適pHの測定結果を示す
グラフ図である。

【図３】本発明のキチナーゼのpH安定性の測定結果を示
すグラフ図である。

【図４】本発明のキチナーゼの最適温度の測定結果を示
すグラフ図である。

【図５】本発明のキチナーゼの温度安定性の測定結果を
示すグラフ図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 9/24 (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 19/26 (Ｃ１２Ｐ 19/26 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 三島 啓助 宮崎県宮崎市学園木花台西１丁目１番地 宮崎大学農学部内 (72)発明者 オムマサバ エー．クリスピナス 宮崎県宮崎市学園木花台西１丁目１番地 宮崎大学農学部内 (72)発明者 吉田 直人 宮崎県宮崎市学園木花台西１丁目１番地 宮崎大学農学部内 (72)発明者 仮屋 勲一 大阪府大阪市淀川区西中島３丁目９番13号 大北ビル５階 協和化成株式会社内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 FF04E FF05E FF11E FF12E FF13E LL05 4B064 AF21 CA02 CB07 CD12 DA01 DA10 4B065 AA01X AC14 BB14 CA19 CA31 CA41 CA44

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 キチナーゼ生産能を有することを特徴と
   するバークホルデリア・セパシア。
2. 【請求項２】 バークホルデリア・セパシアによって生
   産されたことを特徴とするキチナーゼ。
3. 【請求項３】 キチンに作用して機能性の高い（ＧicＮ
   Ａc ）５〜８を含むキチンオリゴ糖を生産する請求項２
   記載のキチナーゼ。
4. 【請求項４】 キチナーゼ生産能を有するバークホルデ
   リア・セパシアを培養し、この培養物中に分泌生産され
   たキチナーゼを分離精製することを特徴とするキチナー
   ゼの製法。
5. 【請求項５】 キチナーゼ生産能を有するバークホルデ
   リア・セパシアを培養し、この培養物中に分泌生産され
   たキチナーゼを分離精製し、分離精製して得られたキチ
   ナーゼにてキチンを分解してキチンオリゴ糖を調製する
   ことを特徴とするキチンオリゴ糖の製法。