FI105346B - Fermentointiprosessi ksantaanikumin valmistamiseksi - Google Patents

Description

105346

Fermentointiprosessi ksantaanikumin valmistamiseksi - Keksintö koskee fermentointiprosessia ksantaanikumin valmistami seksi. Erityisesti keksintö koskee mannoosia sisältävän syötetteen käyttöä 5 fermentointiprosessissa ksantaanikumin tuottamiseksi.

Fermentointiprosessien merkitys monimutkaisten orgaanisten molekyylien tuottamiseksi, joita ei voida syntetisoida teollisessa mittakaavassa tai muista syistä, on kasvanut viimeiset viisikymmentä vuotta. Joskin klassiset fermentointiprosessit ovat olleet tunnettuja ja niitä on käytetty vuosisatoja yk-10 sinkertaisten tuotteiden kuten etanolin ja etikkahapon tuottamiseksi, mikrobi-fermentointiprosesseja on kehitetty vasta suhteellisen myöhään monimutkaisempien tuotteiden valmistamiseksi elintarvike-, kemian- ja lääketeollisuutta varten.

Tyypillinen fermentointiprosessi käsittää selektiivisen mikro-15 organismin viljelyn sopivan syötteen pinnalla siten, että organismi lisääntyy ja tuottaa samalla tai myöhemmin metaboliitteja, joista eräät tai kaikki ovat haluttuja prosessituotteita. Eräs esimerkki on Xanthomonas campestriksen kasvatus sopivalla elatusalustalla siten, että se tuottaa haluttua metaboliittia ksantaanikumia. Ksantaanikumi on monimutkainen, D-glukoosia, D-mannoosia 20 ja D-glukuronihappoa sisältävä polysakkaridi, jonka erinomaiset Teologiset ... ominaisuudet tekevät siitä käyttökelpoisen elintarvike-, lääke- ja kemianteollisuudessa.

f « ΐ ’ ’· Mikrobifermentointiprosessien aluetta on hiljattain laajennettu ge- ...T neettisesti muunnettujen mikro-organismien käytöllä ja lisäksi on kehitetty fer-

Hl 25 mentointiprosesseja, joissa fermentoivat entsyymit saadaan viljelemällä eläin-soluja valmistettaessa esim. glykoprotefineja kuten ihmisen antihemofiliateki-jää Vili.

Syöte mikrobi- tai soluviljelyfermentointiprosessia varten sisältää .··*. yleensä hiilihydraattia, typpilähdettä ja erilaisia kivennäissuoloja.

* > .···, 30 Hiilihydraatti voi olla monimutkainen aine kuten tärkkelys tai malto- " '.** dekstriini, jonka mikro-organismi pystyy pilkkomaan yksinkertaisiksi sokereiksi • · :.· : ennen tällaisten sokerien käyttöä metabolisissa prosesseissa. Fermentointi- syöte muodostuu kuitenkin tavallisemmin suoraan yksinkertaisesta sokerista maltoosista tai tavallisemmin glukoosista. Käytännössä on tapana käyttää glu- • · « « * · · « v 105346 2 koosia hiilihydraattikomponenttina esim. yllä kuvatussa Xanthomonas cam-pestris -fermentoinnissa.

Olemme havainneet, että määrätyissä fermentointiprosesseissa, joissa haluttu tuote rakentuu kuten ksantaanikumissa mannoosiyksiköistä, voi-5 daan halutun metaboliitin saantoa parantaa käyttämällä mannoosia osana fermentointisyötteen hiilihydraattikomponentista. Mannoosi on glukoosin epi-meeri, mutta se on niukemmin saatavissa kuin glukoosi ja siten kalliimpi. Olemme kuitenkin havainneet, että mannoosin kalleudesta huolimatta voi olla taloudellista korvata osa fermentoinnissa tavallisesti käytetystä glukoosista 10 etenkin, jos korvaaminen suoritetaan alla kuvatulla halvemmalla mannoosin ja glukoosin seoksella, koska tavallisesti hyvälaatuisen tuotteen parantunut saanto korvaa hyvinkin syötteestä mahdollisesti johtuvan kustannusnousun. Mannoosilla tarkoitetaan tässä patenttiselityksessä D-mannoosia.

Tämän keksinnön mukaiselle fermentointiprosessille ksantaaniku-15 min valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

Fermentointisyötteen sokerikomponenttina on edullisesti mannoosin ja glukoosin seos, edullisemmin seos, jossa on 5-60 paino-% mannoosia, erityisesti 20- 45 paino-% mannoosia lopun muodostuessa suurimmaksi 20 osaksi glukoosista, joskin mukana voi olla pieniä määriä muita sokereita kuten maltoosia. Mannoosi voidaan valmistaa epimeroimalla glukoosia katalyytin kuten molybdeeniyhdisteen läsnä ollessa. Tässä epimerointireaktiossa muo- f dostunut tuote on mannoosin ja glukoosin seos, joka sisältää tyypillisesti noin « «< ' / 30 paino-% mannoosia, ja erityisesti tätä seosta voidaan käyttää käsiteltävänä 25 olevan keksinnön mukaisesti fermentointisyötteenä. On myös mahdollista • · *··;’ käyttää epimerointisyötteenä glukoosisiirappia, esim. seosta, jossa on 90 % tai ·.’:* enemmän glukoosia tai glukoosin oligomeerejä kuten maltoosia. Fermentointi- • · · v ; syöte sisältää tällaisessa tapauksessa myös pieniä määriä glukoosin oligo meerejä. Epimerointituotetta voidaan myös käsitellä esim. kromatografisesti 30 mannoosin ja sivutuotteena muodostuvan, glukoosia ja mannoosia käsittävän ·’**: raffinaattivirtauksen erottamiseksi toisistaan. Tällainen raffinaattivirtaus voi si-

Ml sältää 5-15 paino-% mannoosia ja sitäkin voidaan käyttää syötteenä käsitel-tävänä olevan keksinnön mukaisessa prosessissa. Jos haluttu fermentointi-

f I

’ · · · * tuote sisältää suhteellisen paljon mannoosiyksikköjä, on vaihtoehtoisesti mah- : 35 dollista lisätä mannoosia epimerointituotteeseen tai rikastaa tuote kromatogra- • ·« « fisesti sopivaksi fermentointisyötteeksi. Mannoosi/glukoosiseokset ovat erityi- 3 105346 sen käyttökelpoisia valmistettaessa sekä mannoosi- että glukoosiyksikköjä sisältävä fermentointituote.

Keksinnön mukainen fermentointisyöte on erityisen käyttökelpoinen valmistettaessa ksantaanikumia fermentointiprosessilla, erityisesti käytettäes-5 sä organismina Xanthomonas campestrista. Kuten patenttiselitystä seuraa-vista esimerkeistä käy ilmi, korvattaessa tällaisessa fermentoinnissa osa glukoosista ekvivalenttimäärällä mannoosia voidaan ksantaanikumin saantoa lisätä yli 30 paino-%:lla.

Keksinnön mukainen fermentointiprosessi voidaan toteuttaa panok-10 sittain, jolloin syöte lisätään kokonaisuudessaan fermentoinnin käynnistyessä, tai puolijatkuvatoimisesti, jolloin syöte lisätään vähitellen fermentoinnin aikana. Mannoosi ja muu yksinkertainen sokeri kuten glukoosi lisätään joko erikseen tai edullisesti yhdessä.

Keksintöä kuvataan ja valaistaan nyt lisää seuraavien esimerkkien 15 avulla.

Esimerkit 1-4

Seuraavissa fermentoinneissa käytetty organismi oli Xanthomonas campestris NRRL 1459 -14 (LMG 574) tyyppi tl.

Käytettiin esiviljelyelatusalustaa fermentoinnin inokulaatin valmis- 20 tamiseksi. Tämä elatusalustan koostumus oli (kaikki prosenttiarvot ovat näissä esimerkeissä painoprosentteja):

Mallasuutetta 0,3 % t\ Hiivauutetta 0,3%

Bacto-peptonia (typpilähde) 0,5% l;;; 25 Dikaliumvetyfosfaattia 0,5% • ·

Magnesiumsulfaattia 0,02 % ··· Liuoksen pH säädettiin arvoon 7 lisäämällä rikkihappoa ennen ste- v : rilointia, joka tapahtui kuumentamalla 120 °C:ssa 20 minuuttia.

20-prosenttista hiilihydraattiperusliuosta, joka oli steriloitu erikseen :]**: 30 kuumentamalla 120 °C:ssa 20 minuuttia, lisättiin yllä mainittuun liuokseen ' ·**’: 2-prosenttisena liuoksena, jossa oli joko glukoosia tai seosta 30 % mannoosia

Ml ja 70 % glukoosia.

100 ml näin valmistettua esiviljelyelatusalustaa inokuloitiin Xantho- < · monas campestris -organismilla Revco-putkesta ja inkuboitiin 28 °C:ssa pyö- : 35 rivällä jalustalla 2 vrk.

11*1 *

I I

4 105346

Esimerkeissä käytetty fermentointielatusalusta sisälsi Mallasuutetta 0,3 %

Hiivauutetta 0,3 %

Bacto-peptonia 0,5 % 5 Kaliumdivetyfosfaattia 0,5 %

Magnesiumsulfaattia 0,02 % Tämän liuoksen pH säädettiin arvoon 7 ennen sterilointia. Fermentointielatusalustan hiilihydraattikomponentit olivat glukoosi tai seos 30 % mannoosia ja 70 % glukoosia. Glukoosi tai glukoo-10 si/mannoosiseos liuotettiin 100 ml:aan vettä konsentraatioiksi 1 %, 1,5 %, 2 % ja vastaavasti 3 %.

Fermentorin tilavuus oli 2 litraa ja se sisälsi 1,3 litraa yllä kuvattua steriloitua elatusalustaa plus 100 ml glukoosi- tai mannoosi/glukoosiliuosta plus 100 ml esiviljelyinokulaattia. Lämpötila pidettiin 29 °C:ssa, ilmastusmäärä 15 oli 1,5 vvm (3 litraa per minuutti) ja sekoitusnopeus 850 kierr/min.

Jokainen fermentointi sai jatkua 18 tuntia, jonka jälkeen määritettiin muodostuneen ksantaanikumin määrä ja mitattiin jäännössokerien määrä. Ksantaanikumi määritettiin laimentamalla fermentointielatusalusta kolminkertaisella tilavuudella isopropanolia ja eristämällä saostunut ksantaanikumi suo-20 dattamalla. Kun sakka oli pesty kaksinkertaisella tilavuudella isopropanolia, suodatettu ja kuivattu lämpökaapissa 40 °C:ssa yli yön, ksantaanikumi punnit-tiin.

< Jäännössokerit määritettiin korkeapainenestekromatografisesti elatusalustasta ksantaanikumin saostamisen ja isopropanolin haihduttamisen 25 jälkeen.

• · '··’ Saatiin seuraavat fermentointitulokset: • · · • · · · • · · • · · • · · * • · 1 • • · • · · ·«· • · p • · · • · • · 1 " · · 1 · t 5 105346

Esimerkki Sokeri (sokerit) Sokerin Ksantaani- Ksantaa- Ksantaa- (sokerien) kons. g/1 nin saan- nin saanto kons. to kulu- kokonaisso- ’ g neesta keristä sokeris- (-sokereista) ta (so- laskettuna keroista) _laskettuna___ 1 (a) glukoosi 1 % 10,4 104 104 1 (b) mannoosi/glukoosi λ % 11,6 119 116 2 (a) glukoosi 1,5 % 11,7 87 78 2 (b) mannoosi/glukoosi 1,5 X 14,0 102 93 3 (a) glukoosi 2,0 % 13,6 68 3 (b) mannoosi/glukoosi 2,0 % 14,5 91 72

ID

4 (a) glukoosi 3,0 % 10,4 35 4 (b) mannoosi/glukoosi 3,0 % 13,9 88 46

Kuten tuloksista ilmenee, saanto parani kaikissa neljässä koeparis-20 sa mannoosi/glukoosiseoksella verrattuna pelkkään glukoosiin siten, että suurin prosentuaalinen kasvu 34 % saavutettiin esimerkissä 4.

Esimerkit 5 ja 6 c , \ j Kuten esimerkeissä 1 - 4 käytetty organismi oli Xanthomonas cam- pestris NRLL 1459-14 (LMG 574) tyyppi tl.

'' 25 Käytettiin esiviljelyelatusalustaa fermentoinnin siirroksen valmista- **·;’ miseksi. Tämän elatusalustan koostumus oli (kaikki prosenttiarvot ovat näissä • · · ;;j esimerkeissä painoprosentteja): :·; ; Mallasuutetta 0,3 %

Hiivauutetta 0,3 % 30 Bacto-peptonia (typpilähde) 0,5 %

Dikaliumvetyfosfaattia 0,5 % ; *.n Magnesiumsulfaattia 0,02 %

Liuoksen pH säädettiin arvoon 7 lisäämällä rikkihappoa ennen ste-' ·:'" rilointia, joka tapahtui kuumentamalla 120 °C:ssa 20 minuuttia.

C « ( • · ( « · 6 105346 20-prosenttista hiilihydraattiperusliuosta, joka oli steriloitu erikseen kuumentamalla 120 °C:ssa 20 minuuttia, lisättiin yllä mainittuun liuokseen 2-prosenttisena glukoosiliuoksena.

100 ml näin valmistettua esiviljelyelatusalustaa inokuloitiin Xantho-5 monas campestris -organismilla petrimaljalta ja inkuboitiin 28 °C:ssa pyörivällä jalustalla 4 vrk.

Esimerkeissä käytetty fermentointielatusalusta sisälsi: Ammoniumnitraattia 1,144 g/l

Kaliumdivetyfosfaattia 2,866 g/l 10 Magnesiumkloridia 0,507 g/l

Natriumsulfaattia 0,089 g/l

Sitruunahappomonohydraattia 2,3 g/l

Boorihappoa 0,006 g/l

Ferrikloridia 0,024 g/l 15 Kalsiumkarbonaattia 0,020 g/l

Sinkkikloridia 0,030 g/l Väkevää kloorivetyhappoa 0,13 ml Tämän liuoksen pH säädettiin arvoon 7 5 N natriumhydroksidiliuok-sella ennen sterilointia.

20 Fermentointielatusalustan hiilihydraattikomponentit olivat glukoosi tai seos 30 % mannoosia ja 70 % glukoosia. Glukoosi tai glukoo-_si/mannoosiseos liuotettiin 100 ml:aan vettä konsentraatioksi 3 %.

Fermentorin tilavuus oli 2 litraa ja se sisälsi 1,3 litraa yllä kuvattua steriloitua elatusalustaa plus 100 ml glukoosi- tai mannoosi/glukoosiliuosta 25 plus 100 ml esiviljelyinokulaattia. Lämpötila pidettiin 29 °C:ssa, ilmastusmäärä • · *··;’ oli 1,5 vvm (3 litraa per minuutteja sekoitusnopeus 850 kierr/min. pH pidettiin • · · fermentointien aikana vakiona arvossa 7 lisäämällä 2 N kaliumhydroksidivesi-: liuosta.

6,6 vuorokauden kuluttua, jolloin sokerit oli kulutettu täysin, muo-30 dostunut ksantaanikumi määritettiin laimentamalla fermentointielatusalusta « · · kolminkertaisella tilavuudella isopropanolia ja saostunut ksantaanikumi eristet-tiin suodattamalla. Kun sakka oli pesty kaksinkertaisella tilavuudella isopropanolia, suodatettu ja kuivattu lämpökaapissa 40 °C:ssa yli yön, ksantaanikumi punnittiin.

: 35 Saatiin seuraavat fermentointitulokset: <11 I « « 7 105346

Esimerkki Sokeri (sokerit) Ksantaani- Ksantaanin Myötöraja* kone. g/1 saanto koko- Pa naissokerista (-sokereista) _ ____laskettuna_ 5 5 (a) glukoosi 9,78 32 20,5 5 (b) glukoosi/mannoosi 10,97 36 21,5 6 (a) glukoosi 10,5 35 18,5 6 (b) glukoosi/mannoosi H,4 48 17,5 10 * Myötöraja mitattiin 20 eC:ssa Bohlin CS reometrillä 3-prosenttisesta, 0,1 % natriumkloridia sisältävästä ksantaanivesiliuoksesta.

* Myötöraja mitattiin 20 °C:ssa Bohlin CS reometrillä 15 3-prosenttisesta, 0,1 % natriumkloridia sisältävästä ksantaanivesiliuoksesta.

< t I < «

« « I

« i • « t i · f

< t I

• · • * • •e •

Ml a ··♦·

• M

• · * * · « ·«· • · a · ··· M» » ♦ · « • · · • · « n • 4 r.

I t f * < r

• « 4 I

• • · t

Claims (6)

1. Fermentointiprosessi ksantaanikumin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että fermentointisyöte sisältää glukoosin ja mannoosin seosta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen prosessi, tunnettu siitä, että mannoosin ja glukoosin seos sisältää pieniä määriä muita sokereita.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen prosessi, tunnettu siitä, että mannoosin ja glukoosin seos sisältää 5-60 paino-% mannoosia, edullisesti 20 -45 paino-% mannoosia lopun muodostuessa glukoosista ja valinnaisesti pienistä 10 määristä muita sokereita.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai patenttivaatimuksen 3 mukainen prosessi, tunnettu siitä, että mannoosin ja glukoosin seos valmistetaan epimeroi-malla glukoosia.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen prosessi, tunnettu siitä, että 15 mannoosin ja glukoosin seos on glukoosin epimeroinnista saatava raffinaattivir- taus ja sisältää 5-15 paino-% mannoosia.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen prosessi, tunnettu siitä, että ksantaanikumi muodostuu fermentointiprosessissa Xanthomonas campestriksen vaikutuksesta.

4 I 4 « · < ' I < ( « c T · c • A • · ··« A AA1 • • · · · • f · • I » A A 4 A A A A V A • A • •A • A A • A A • AA A A A = . ,r » 4. r, t I f • < r • t K «li r t « 105346