KR20030045315A

KR20030045315A - 천연소재 항암제 엔-아세틸-디-키토올리고 6당 및 7당,그리고 그 제조방법

Info

Publication number: KR20030045315A
Application number: KR1020010075813A
Authority: KR
Inventors: 김광
Original assignee: 김광
Priority date: 2001-12-03
Filing date: 2001-12-03
Publication date: 2003-06-11

Abstract

본 발명은 탈아세틸화도가 75%, 85% 및 95%이상의 부분 탈아세틸화 키토산을 비정질의 수용성 키토산으로 제조하여 기질로 사용하고, 이 기질을 효소 키티나아제와 키토 바이아제에 의하여 가수분해 한 후, 여기에 약산을 첨가하여 N-아세틸화 한 다음, 이를 크로마토그래피에 의하여 분획추출하고 투석 방법에 의하여 정제단계를 거쳐 동결 건조시켜 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당을 제조하는 과정으로 이루어진다.

Description

천연소재 항암제 엔-아세틸-디-키토올리고 6당 및 7당, 그리고 그 제조방법{ N-ACETYL-D-GLUCOSAMINE CHITOHEXAOSE AND CHITOHEPTAOSE AS ANTITUMOR AGENT FROM NATURAL BIOMASS AND METHOD OF MANUFACTURE}

본 발명은 항암제 제조방법에 관한 것으로서, 특히 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 분리추출에 의한 물질 및 이 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

기존의 항암제들은 암세포의 증식을 억제하여 치료 효과를 보여주는 한편, 대부분의 경우 정상세포에 대해서도 부작용을 나타낸다. 따라서 항암제 자체의 독성을 낮추고 암세포에만 선택적으로 작용하여 그 증식을 억제시키기 위한 연구가 진행중이다.

최근들어, 기존의 합성 물질 항암제 이외에 항암력을 가지고 있는 것으로 밝혀진 천연의 항암제들이 발견되고 있는데, 이들은 주로 각종 균체에 대한 효소의 작용 또는 균 생산물로부터 얻어지는 단당 및 올리고머당으로 다당류로 이루어진다. 이중에서 키틴, 키토산 또는 키틴의 부분탈아세틸화물 등은 우수한 항암력을 나타내는 것으로 알려져 있는데, 그 중에서도 키틴 및 키토산 올리고머가 우수한 항암력을 갖는 것으로 보고되고 있다.

따라서, 본 발명은 전술한 바와 같은 제반적인 사안들을 감안한 것으로, 그 목적은 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 물질 및 이 물질을 제조할 수 있는 방법을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 제1견지에 있어 본 발명은 탈아세틸화도가 75%, 85% 및 95%이상의 부분 탈아세틸화 키토산을 비정질의 수용성 키토산으로 제조하여 기질로 사용하고, 이 기질을 효소 키티나아제와 키토 바이아제에 의하여 가수분해 한 후, 여기에 약산을 첨가하여 N-아세틸화 한 다음, 이를 크로마토그래피에 의하여 분획추출하고 투석 방법에 의하여 정제단계를 거쳐 동결 건조시켜 제조하는 과정으로 이루어짐을 특징으로 한다.

이때 보다 바람직하기로는, 상기와 같은 방법으로 제조된 천연소재 항암제N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당을 그 특징으로 한다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시 예에 따른 N-아세틸-D-글루코사민 올리고당들을 210nm의 흡광도에서 측정한 결과를 나타낸 그래프.

도 2는 본 발명에 일 실시 예에 따른 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 질량을 분석하여 나타낸 그래프.

이하 본 발명에 따른 바람직한 실시 예를 상세히 설명한다. 하기의 설명에서는 본 발명을 이해하는데 필요한 부분만이 설명되며 그 이외 부분의 설명은 본 발명의 요지를 흐트리지 않도록 생략될 것이라는 것을 유의하여야 한다.

키틴은 N-아세틸-D-글루코사민 잔당(GlcNAc)n이 β-1,4결합한 선상 고분자로서 D-글루코사민 잔당(GlcN)n이 일부 포함되어 있다. 이것은 동물체내에서 생분해 될 수 있고 항원성 고분자가 거의 없다.

가수 분해된 키틴은 효소 키타나제에 의해 키틴 구성단위인 N-아세틸-D-글루코사민 사이의 β-1,4-글루코스의 결합을 임의로 분해하여 저분자량을 갖는 수용성 중간체로 생성된다. 이것은 β-N,N'디아세틸글루코사미니다제(키토바이아제)에 의하여 키토올리고당이 키틴의 단당인 N-아세틸-D-글루코사민 단위로 최종 가수분해된다. 키토바이아제를 포함한 키티나아제 효소는 무정형 키틴과 결정성 키틴 두 가지 모두를 가수 분해하는 활성을 갖고 있으며, 특히 결정성 키틴에 대한 활성은 특수공정에서 요구되는 키틴의 처리과정을 줄일 수 있으므로 경제적으로는 매우 매력이 있는 점이다. 이 두 효소는 키티나제 이원성 성분계로도 작용이 되며 수용성과 완충 용액성을 갖는 저분자량인 N-아세틸-D-글루코사민의 키틴 올리고당 및 D-글루코사민의 키토산 올리고당이 키틴과 키토산을 알맞게 가수분해함으로써 각각 제조될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 제조방법을 최상의 실시예(best mode)를 들어 설명하면 아래와 같다.

{실시예 1}

본 발명에 따른 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 제조방법에 있어서, 기질 특이성은 탈 아세틸화도에 의존되어 변화되므로 효소가수분해 할 때 탈 아세틸화도 75%, 85%, 및 95%이상을 각각 갖는 부분적으로 탈 아세틸화한 키토산을 기질로 사용하여 효소 반응시킴으로서, N-아세틸-D-글루코사민올리고당;(GlcNAc)_6,76당과 7당을 분리추출 하였다.

또한, 탈아세틸화도 75%, 85%, 및 95%이상을 각각 갖는 부분적으로 탈아세틸화한 키토산은 본 발명자가 1997. 6. 5. 출원하여 1999. 5. 28.자로 등록된 등록번호 제 216301 호(탈아세틸화도가 75-100%인 키토산의 제조방법)에 기술된 방법으로 제조하였다.

그리고, N-아세틸-D-글루코사민 올리고당들을 경제적으로 저렴하게 제조하기 위하여 효소 키티나제 역시 저효소를 직접 반응시켰다. 특히 병리학적으로 효과적인 항암활성을 갖는 N-아세틸-D-글루코사민 올리고 6,7당;(GlcNAc)_6,7을 효소 키토바이아제를 함께 포함하는 키티나제와 부분적으로 탈아세틸화한 키토산류 중에서 가장 기질특이성이 높은 50~100%의 부분적으로 탈아세틸화한 키토산을 기질로 하여 효소 가수분해 반응시켜 분리 추출하여 제조하고, 또한 고도로 정밀한 제품을 얻기위하여 제조와 정제과정을 반복 시행하였다.

특히, 조효소 키티나제(1.5 unit/ml)[키토바이아제(3.48 unit/ml)가 포함됨]에 의한 부분탈 아세틸화 키토산을 효소 가수 반응시킴으로서 생성된 중합도 n=20이하를 갖는 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)_n키토올리고당을 제조하고, 이로부터 CM-Sephadex 크로마토그라피에 의하여 분획시켜 추출한 헤테로-키토올리고당들을 당별로 다시 N-아세틸화한 생성물을 전기투석장치로서 정제하여 천연항암제로 주목되고 있는 키토올리고6,7당을 각각 제조한다.

부분탈아세틸화 키토산(환원당으로서 2697mg/mL)을 효소반응에 의해 생성시킨 키토올리고당은 6당 (GlcNAc)₆=3.84%, (GlcNAc)_7,(GlcNAc)₈의 7,8당이상이 7.44%제조되었다.

한편, 전술한 실시예 1의 방법으로 제조된 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당의 화학식은 다음과 같다.

{화학식 1}

또 한편으로, 전술한 실시예 1의 방법으로 제조된 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 7당의 화학식은 다음과 같다.

{화학식 2}

여기서 전술한 제조과정 중에서 효소 가수분해에 의한 N-아세틸-D-글루코사민의 제조과정을 서술하면 다음과 같다.

{화학식 3}

{화학식 4}

(키티나아제와 키토바이아제의 활성에 의한 50~100% 부분 탈아세틸화 키토산의 가수 분해물.)

한편, 아래에서는 N-아세틸-키토올리고 6당 및 7당의 HPLC에 의한 분석과 질량 분석기 MALDI-TOF MS에 의한 올리고당의 구조 분석을 하였다.

즉, 생성된 N-아세틸-키토올리고 6당 및 7당을 고성능 액체크로마토 그래피(HPLC) 875-UV/VIS detector(Japan Spectroscopic Co. Ltd.)와 D-2500 Chromato -Integrator (Hitachi Ltd.)을 사용하여 N-아세틸-D-글루코사민의 UV분석(도 1의 좌측 그래프)과 D-글루코사민 키토-올리고머 RI분석(도 1의 우측 그래프)에 의한 환원당측정은 분당 2.0㎖의 유속에서 아세토니트릴-물의 이동상에서 Radical-PAK Bondapak NH₂컬럼(8.0x 100mm, Millipore Co.)을 사용하여 분리하였다. N-아세텔-D-글루코사민 올리고당들은 210nm의 흡광도에서 측정하였으며, 그 결과를 도 1에 표시하였다.

상기 도 1에 도시한 바와 같이, F-8은 해테르-키토올리고당으로써 D-글루코사민의 4량체와 N-아세틸-D-글루코사민의 2량체로 구성되어 있는 6당을 나타내고 있다. F-7은 4당이 포함된 7당의 헤테르-키토올리고당을 나타내고 있으며 F-10은 9당을 포함한 7당을 나타낸다.

한편, 도 2의 그래프에 나타낸 바와 같이, F-8이 6당임을 질량분석에 의하여 분자량을 나타내고 있으며 F-7과 F-10이 4당을 포함한 7당과 9당을 포함한 7당을 각각 나타내고 있다.

N-아세틸 키토올리고당의 질량분석은 Voyager Elite matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometer(MALDI-TOF MS, PerSepive Biosystems, Framingham, MA, USA).를 사용하였고, 가속전압을 20kV로 하였고, matrix는 2,5-dihydroxybenzoic acid(DHB)를 사용하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

이상으로 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법으로 제조된 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 기대되는 기능 또는 용도를 서술하면 다음과 같다.

즉, 글루코사민계인 올리고당은 면역강화, 항종양성, 향균성, 항콜레스테롤 등의 생리활성을 갖는다는 점이 그 이용 연구의 촛점이 되고 있다. 특히 항종양성 및 항암성의 활성과 높은 면역강화 작용을 구현할 수 있으며, 또한 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고6,7당 용도에 대응하여 여러 가지 규격의 제품을 제조할 수 있는 상승적인 효과가 있다.

Claims

탈아세틸화도가 50~75%, 75~85% 및 85~95%의 부분 탈아세틸화 키토산을 비정질의 수용성 키토산으로 제조하여 기질로 사용하고, 이 기질을 효소 키티나아제와키토 바이아제에 의하여 가수분해 한 후, 여기에 약산을 첨가하여 N-아세틸화 한 다음, 이를 크로마토그래피에 의하여 분획추출하고 투석 방법에 의하여 정제단계를 거쳐 동결 건조시켜 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당을 제조하는 과정으로 이루어짐을 특징으로 하는 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 제조방법.
제1항에 있어서, 조효소 키티나제와 키토바이아제가 함유된 이성분 효소계 (효소 활성비 1 : 2.5)에 의하여 아세테이트 완충용액에 균일반응 조건에서 키토산 기질을 0.2~1.5%의 농도변화로써 각각 제조한 효소반응 혼합물을 30~40??의 온도에서 36~72시간 반응시켜 가수분해된 헤테로 키토올리고당을 제조함을 특징으로 하는 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 제조방법.
제1항에 있어서, CM-Sephadex 컬럼 크로마토그래피방법을 응용하여 키토올리고당을 분획추출한 다음, 상기 분획추출된 키토올리고 6당과 7당을 당별분리 한 후, 증발기에 의한 농축과정과 동결건조과정으로 이루어짐을 특징으로 하는 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 제조방법.
제1항에 있어서, 당별분리 후 농축과정과 동결제조된 헤테로 키토올리고당을 0.1~2N의 산을 가하여N-아세틸화함으로서N-아세틸-D-글루코사민의 키토올리고 6당과 7당을 각각 제조함을 특징으로 하는 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 방법으로 제조된 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당 및 7당.
하기 화학식으로 이루어진 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 6당.
하기 화학식으로 이루어진 천연소재 항암제 N-아세틸-D-키토올리고 7당.