CN101235404A - 一种制备聚合度为4-7的壳寡糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备聚合度为4－7的壳寡糖的方法，属生物技术领域。采用脱乙酰化度75－95％的壳聚糖为原料，用浓度为1％的乙酸溶解其浓度(W/V)为1－5％乙酸溶解，加入壳聚糖内切酶3－6u/g壳聚糖水解，粘度下降70％，继续水解后，间隔一定时间取上述水解液2ml，加入2ml 1mol/L的NaOH，使其成为碱性酶解液。当碱性液透光率达到70－85％时，100℃灭酶，离心20分钟，取上清液，浓缩至固形物含量10－20％，用乙醇或丙酮(终浓度为85－95％)沉淀，再复溶和离心，最后真空干燥，得到本发明聚合度为4－7的壳寡糖，得率为85－90％。本发明用单一酶降解壳聚糖，具有酶解效率高，酶解可在2小时内完成，制备过程控制方便，具有应用和推广价值。
Description
技术领域
本发明公开了一种制备聚合度为4-7的壳寡糖的方法，属生物技术领域。
技术背景
壳寡糖(Chitosan oligosaccharide)是指2-10个氨基葡萄糖以β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖，学名为β-1，4-寡聚-葡萄糖胺。它通常是由甲壳素(虾、蟹壳等)脱乙酰化的产物壳聚糖(脱乙酰化度≥70％)，通过生物工程技术降解制备的低聚氨基葡萄糖(壳寡糖)。是一种水溶性好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品。壳寡糖在人体内吸收率近100％，其功效是壳聚糖的数十倍。研究证明：壳寡糖具有提高免疫，抑制癌肿瘤细胞生长，促进肝脾抗体形成，预防成人疾病等功能，可应用于医药、功能性食品等领域。
壳寡糖的结构与功能密切相关，聚合度范围越宽，其功能就越不明确。如聚合度为6的壳寡糖对肿瘤细胞的生长和癌细胞的转移有明显的抑制效果，而较高聚合度的壳寡糖比壳聚糖本身和低聚合度壳寡糖对真菌和细菌的抑制作用更大。
壳寡糖目前主要是由壳聚糖经化学法和酶法水解制备。化学法因反应条件剧烈，选择性差，而使产物杂质多、单糖含量高，低聚糖得率低；
酶法降解，是用专一性或非专一性酶对壳聚糖进行降解而得到的壳寡糖。酶法降解避免了低聚糖的破坏，食用安全性好，但主要是缺乏高水解活力以及有商业化来源的酶制剂。
目前的研究重点多集中在一些较为便宜的商业酶制剂上，包括葡萄糖酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶、糊精酶、半纤维素酶和果胶酶都能在室温及相对较低的pH值(pH3.3-4.5)和较高的酶底比下水解壳聚糖，酶解效率低。如[申请号]00110009，一种酶法降解壳聚糖与膜分离相耦合生产壳寡糖的方法，酶解工艺复杂，酶解时间长，效率低。又如[申请号]200510042017.4，一种利用腐皮镰孢菌生产壳寡糖的方法，同样存在酶解时间长，酶解需要6-8h；效率低，在原料经过超声波或辐照技术处理后，一次酶解得率仅75％；分离提取需采用多种膜滤技术，工艺复杂。为此，有必要采用新的制备技术，生产聚合度集中，抑制肿瘤作用明显的壳寡糖。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明采用单一的曲霉产内切壳聚糖酶，通过采用简便、快速的透光率变化指标来确定酶反应终点，再用有机溶液沉淀，去掉少量的单糖、二糖，可制备得到聚合度为4-7的壳寡糖。
本发明的工艺流程：壳聚糖原料→壳聚糖乙酸溶液→加酶水解→加NaOH→检测碱性酶的透光率→灭酶→离心→浓缩→有机溶液沉淀→复溶→再离心→干燥。
具体操作方法：
1、壳聚糖原料：脱乙酰化度为75-95％的壳聚糖。
2、壳聚糖乙酸溶液：壳聚糖用浓度为1％乙酸水溶液溶解，壳聚糖乙酸溶液浓度(w/v)为1％-5％。
3、酶法水解：加壳聚糖内切酶3-6u/g壳聚糖，40-60℃，水解15-20分钟，黏度下降70％后，继续水解，水解80-100分钟左右。
4、加NaOH：间隔一定时间取上述水解液2ml，加入2ml 1mol/L的NaOH，使其成为碱性酶解液。
5、检测碱性酶解液的透光率及灭酶：当上述碱性酶解液透光率达到70-85％，100℃灭酶15分钟。
6、离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液。
7、浓缩：真空浓缩至固形物含量为10-20％。
8、有机溶剂沉淀：用乙醇或丙酮(终浓度为85-95％)有机溶剂沉淀法，去除少量单糖、二糖，取沉淀。
9、复溶：用水复溶解，固形物含量20％。
10、再离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液。
11、干燥：采用真空干燥法将上清液干燥。得到本发明聚合度为4-7的壳寡糖。
本发明实现了用单一性酶简便、快速、高效的制备聚合度为4-7的壳寡糖，避免了化学法带来的环境污染以及其他制备方法需要结合复杂的膜分离技术等生产成本高的不利，酶解反应仅需2小时内可完成，酶解得率在85-90％，酶解工艺简单，主要设备仅需恒温反应釜，生产过程控制简单、方便，所得壳寡糖聚合度明确，结构清楚，得率高的优点。
具体实施方式
本发明实施例一：
1、壳聚糖原料：脱乙酰化度为75％的壳聚糖。
2、壳聚糖乙酸溶液：壳聚糖用浓度为1％乙酸水溶液溶解，壳聚糖乙酸溶液浓度(w/v)为1％。
3、酶法水解：加壳聚糖内切酶3u/g壳聚糖，40℃，水解15分钟，黏度下降70％后，继续水解，水解80分钟。
4、加NaOH：间隔一定时间取上述水解液2ml，加入2ml 1mol/L的NaOH，使其成为碱性酶解液。
5、检测碱性酶解液的透光率及灭酶：当上述碱性酶解液透光率达到70％，100℃灭酶15分钟。
6、离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液。
7、浓缩：真空浓缩至固形物含量为10％。
8、有机溶剂沉淀：用乙醇或丙酮(终浓度为85-95％)有机溶剂沉淀法，去除少量单糖、二糖，取沉淀。
9、复溶：用水复溶解，固形物含量20％。
10、再离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液。
11、干燥：采用真空干燥法将上清液干燥。得到本发明聚合度为4-7的壳寡糖。
本发明实施例二：
1、壳聚糖原料：脱乙酰化度为85％的壳聚糖。
2、壳聚糖乙酸溶液：壳聚糖用浓度为1％乙酸水溶液溶解，壳聚糖乙酸溶液浓度(w/v)为3％。
3、酶法水解：加壳聚糖内切酶4.5u/g壳聚糖，50℃，水解20分钟，黏度下降70％后，继续水解，水解90分钟。
4、加NaOH：间隔一定时间取上述水解液2ml，加入2ml 1mol/L的NaOH，使其成为碱性酶解液。
5、检测碱性酶解液的透光率及灭酶：当上述碱性酶解液透光率达到75％，100℃灭酶15分钟。
6、离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液。
7、浓缩：真空浓缩至固形物含量为20％。
8、有机溶剂沉淀：用乙醇或丙酮(终浓度为90％)有机溶剂沉淀法，去除少量单糖、二糖，取沉淀。
9、复溶：用水复溶解，固形物含量20％。
10、再离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液。
11、干燥：采用真空干燥法将上清液干燥。得到本发明聚合度为4-7的壳寡糖。
本发明实施例三：
1、壳聚糖原料：脱乙酰化度为95％的壳聚糖。
2、壳聚糖乙酸溶液：壳聚糖用浓度为1％乙酸水溶液溶解，壳聚糖乙酸溶液浓度(w/v)为5％。
3、酶法水解：加壳聚糖内切酶6u/g壳聚糖，60℃，水解20分钟，黏度下降70％后，继续水解，水解100分钟。
4、加NaoH：间隔一定时间取上述水解液2ml，加入2ml 1mol/L的NaOH，使其成为碱性酶解液。
5、检测碱性酶解液的透光率及灭酶：当上述碱性酶解液透光率达到85％，100℃灭酶15分钟。
6、离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液。
7、浓缩：真空浓缩至固形物含量为10％。
8、有机溶剂沉淀：用乙醇或丙酮(终浓度为90％)有机溶剂沉淀法，去除少量单糖、二糖，取沉淀。
9、复溶：用水复溶解，固形物含量20％。
10、再离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液。
11、干燥：采用真空干燥法将上清液干燥。得到本发明聚合度为4-7的壳寡糖。
本发明以单一性酶降解壳聚糖，采用方便，快速的透光率变化指标来确定酶解反应终点，然后通过有机溶液沉淀除去少量单糖、二糖，可得到高浓度聚合度为4-7的壳寡糖，得率在85％-90％之间，可广泛应用于医药、功能性食品等行业，具有应用和推广价值。
Claims (1)
1. 一种制备聚合度为4-7的壳寡糖的方法，其特征在于按下面方法操作：
(1)壳聚糖原料：脱乙酰化度为75-95％的壳聚糖；
(2)壳聚糖乙酸溶液：壳聚糖用浓度为1％乙酸水溶液溶解，壳聚糖乙酸溶液重量体积百分比浓度为1％-5％；
(3)酶法水解：加壳聚糖内切酶3-6u/g壳聚糖，40-60℃，水解15-20分钟，黏度下降70％后，继续水解，水解80-100分钟左右；
(4)加NaOH：取上述水解液2ml，加入2ml 1mol/L的NaOH，使其成为碱性酶解液；
(5)检测碱性酶解液的透光率及灭酶：当上述碱性酶解液透光率达到70-85％，100℃灭酶15分钟；
(6)离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液；
(7)浓缩：真空浓缩至固形物含量为10-20％；
(8)有机溶剂沉淀：用终浓度为85-95％乙醇或丙酮有机溶剂沉淀法，去除少量单糖、二糖，取沉淀；
(9)复溶：用水复溶解，固形物含量20％；
(10)再离心：离心机转速为5000rpm，离心20分钟，取上清液；
(11)干燥：采用真空干燥法将上清液干燥，得到本发明聚合度为4-7的壳寡糖。
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