CN103613682B - 一种制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，属于生物技术领域。所述酵母葡聚糖和甘露聚糖及海藻糖为从啤酒酵母细胞中提取得来的多糖，采用复合蛋白酶、氢氧化钠水解破壁，结合离心、超滤的分离纯化方法，获得酵母葡聚糖，并联产甘露聚糖和海藻糖。本发明的酵母多糖，得率、纯度高，时间短，碱用量少，保持多糖原有的结构和最高的生理活性，且联产获得多糖系列产品。

Description

一种制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法

技术领域

本发明涉及一种制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，属于生物技术领域。

背景技术

 在啤酒生产过程中，每生产 1 000吨啤酒，就会产生 100-115吨废酵母。酵母细胞的细胞壁中含有质量分数为25%-35%的酵母多糖，主要为葡聚糖和甘露聚糖。葡聚糖具有抗肿瘤、增强机体免疫力、抗菌抗病毒等功能，因其高度的粘性、持水性和热稳定性等优点，在食品、医药、化妆品等行业中广泛应用。甘露聚糖位于细胞壁最外层，具有抗辐射、抗肿瘤、降低胆固醇含量的作用。海藻糖分布在酵母细胞质中，对生物体和生物大分子有良好的非特异性保护作用，在食品、化妆品和医药等方面有一定的应用。

啤酒酵母多糖是从啤酒酵母细胞中提取得来的，具有价廉易得、周期短、不污染环境等特点，可以研制开发出机体免疫调节剂等产品，具有很大的市场开发前景，因而引起了学术界广泛的关注。

酵母葡聚糖的制备，可单纯用酸法或者碱法制备，其产品中蛋白质和甘露聚糖等杂质含量很高，使得样品纯度较低。Ferencik和 Williams（1.Ferencik M, Masler L. Modulatory effect of glucans on the functional and biochemical activities of guinea-pig macrophages [J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 1986, 8: 163-166. 2.Williams D L, McNameeR B. Development of a water-soluble, sulfatedβ-(1-3)-D-glucan biological response modifier derived from Saccharomyces cerevisiae[J]. Carbohydrate Research, 1992, 235: 247-257.）报道了酸法和碱法联用制备酵母葡聚糖的方法，酵母葡聚糖得率约为9.1%（质量分数），纯度在 90%（质量分数），但是在提取过程酸碱用量较大，不但造成环境的严重污染，并且酸碱使多糖水解，从而最终降低了产品的得率。Naohito和Yajun（1. Naohito O, Aiko T. Solubilization of yeast cell-wall β-(1.3)-D-glucan by sodium hypochlorite oxidation and dimethyl sulfoxide extraction [J]. Carbohydrate Research, 1999, 316: 161-172.  2.Yajun W, Tianxing W. Combination of induced autolysis and sodium hypochlorite oxidation for the production of Saccharomyces cerevisiae (1→3)-β-D-glucan[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2003, 19: 947-952.）用次氯酸钠和二甲基亚砜提取酵母细胞壁中的葡聚糖，这样避免了酸碱的介质环境，因而酵母葡聚糖的回收率高达 89%（质量分数）左右。然而次氯酸钠易使葡聚糖发生氧化降解，导致得率较低，并且会破坏葡聚糖天然的螺旋构象而严重破坏其生理活性。赵光远等（赵光远, 钟文辉, 殷蔚申. 用废啤酒酵母自溶残渣制碱不溶性葡聚糖的研究[J]. 食品科学，1997（2）:23-27.）首先利用蛋白酶对新鲜的酵母细胞进行酶解，再加入NaOH 溶液进行处理。这些改进了的方法减少了酸碱用量，而且减轻了对环境的污染。

对于酵母甘露聚糖的制备，李卫芬（李卫芬, 孙建义, 顾赛红. β-葡聚糖酶的分离纯化和特性研究[J]. 菌物系统, 2001(02): 178-183.）采用酸法提取得到的甘露聚糖成品，蛋白质含量较低，且总糖含量很高，但酸性条件可能会导致甘露聚糖的部分水解，不但会破坏甘露聚糖本来的结构，还可能降低产物的得率。碱法提取过程中碱液用量较大，不但会造成多糖降解还会污染环境。酶法相比酸碱法条件更为温和，对甘露聚糖的结构损伤较小，故能尽可能的维持甘露聚糖本来的结构，以保持其生理活性的完整性。盐法提取会导致盐量过高。

海藻糖的提取关键是酵母细胞破壁，马森等（马森, 卢家炯, 初兰娜, 莫海涛. 超声波辅助提取啤酒废酵母中活性成分的研究[J]. 四川食品与发酵, 2008, 6（44）: 1-13.）用乙醇提取得到海藻糖。

上述分离纯化方法只是提取单一组分，并且纯度和得率低，且污染严重，在提取中用到酸碱会引起多糖的降解，影响多糖的生理活性。

发明内容

本发明的目的是克服以上技术不足，提供一种酶-碱法结合超滤的分离纯化方法，保持多糖原有的结构和最高的生理活性，且联产获得多糖系列产品。

本发明获得酵母葡聚糖、甘露聚糖和海藻糖的提取率质量分数分别为14.17%、11.82%、8.81%，纯度质量分数分别为92%、94%、99%，碱用量质量分数为1.12%。葡聚糖、甘露聚糖制备时间为2.5h。

本发明的一种制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，步骤如下：

①酶-碱法对啤酒酵母进行破壁

将干酵母粉加入到缓冲溶液中，使其浓度为75-85 g/L，调初始pH为5.5-6.5；按木瓜蛋白酶与中性蛋白酶以酶活单位8-10:1，加入木瓜蛋白酶与中性蛋白酶，使每克干酵母粉加入30000-35000U，60℃酶解0.5-1.5 h；向水解液中加入NaOH碱解，使其质量分数 为1-2%、50-55℃恒温0.5-1.5 h，得水解液；

所述酶解，为加入木瓜蛋白酶与中性蛋白酶催化酵母细胞壁蛋白水解；

所述碱解，为加入NaOH水解酵母细胞壁蛋白；

所述干酵母粉是将新鲜的啤酒酵母用自来水洗3-4次后，2500r/min离心5min，沉淀50℃烘干，粉碎，过80目筛；

所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶均为食品级；

所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液。

②酵母多糖的分离纯化

将①制得的水解液经4000r/min离心10min，所得沉淀经Seveage法脱蛋白、石油醚脱脂，浓缩干燥得酵母葡聚糖产品，所得上清液依次经30000Da(分子量)、3000Da(分子量)超滤膜超滤，其截留液经Seveage法脱蛋白、浓缩干燥得酵母甘露聚糖，其滤液经活性炭脱色、Seveage法脱蛋白浓缩干燥得海藻糖；

所述超滤，所用超滤膜为美国Milliper公司超滤管；

所述Seveage法脱蛋白，是去除游离蛋白的有效方法。在粗多糖溶液中加入氯仿—正丁醇混合溶液,将游离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离去除。

当前发明获得的酵母葡聚糖联产甘露聚糖和海藻糖的提取率质量分数为13-15%、10-12%、7-10%，纯度质量分数分别为86-92%、90-94%、96-99%，碱用量质量分数为1-1.5%。葡聚糖、甘露聚糖制备时间为2-3h。

与现有技术相比较，本发明制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，具有以下显著特点：

（1）采用复合蛋白酶、NaOH水解酵母蛋白质，进行破壁处理；

（2）利用啤酒酵母为原料，以不同配比木瓜蛋白酶与中性蛋白酶对酵母蛋白进行水解，得到最佳复合酶配比为木瓜蛋白酶与中性蛋白酶以酶活单位9:1的比例，减少了后续碱提过程中的碱液浓度和用量；

（3）水解液经离心，所得沉淀经Seveage法脱蛋白、石油醚脱脂，浓缩干燥得酵母葡聚糖产品，所得上清液依次经30000Da(分子量)、3000Da(分子量)超滤膜超滤，其截留液经Seveage法脱蛋白、浓缩干燥得酵母甘露聚糖，其滤液经活性炭脱色、Seveage法脱蛋白浓缩干燥得海藻糖，获得制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的工艺；

（4）优化的工艺条件为复合酶配比为木瓜蛋白酶与中性蛋白酶以酶活单位9:1，碱提NaOH 质量分数 1.12%、51.9℃恒温1.0h。经离心、超滤、脱蛋白，获得酵母葡聚糖的同时，联产甘露聚糖和海藻糖产品。

（5）本发明获得的酵母葡聚糖、甘露聚糖和海藻糖相对于Ferencik、 Williams、李卫芬、马森法（1.Ferencik M, Masler L. Modulatory effect of glucans on the functional and biochemical activities of guinea-pig macrophages [J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 1986, 8: 163-166.  2.Williams D L, McNameeR B. Development of a water-soluble, sulfatedβ-(1-3)-D-glucan biological response modifier derived from Saccharomyces cerevisiae[J]. Carbohydrate Research, 1992, 235: 247-257. 3.李卫芬, 孙建义, 顾赛红. β-葡聚糖酶的分离纯化和特性研究[J]. 菌物系统, 2001(02): 178-183. 4.马森, 卢家炯, 初兰娜, 莫海涛. 超声波辅助提取啤酒废酵母中活性成分的研究[J]. 四川食品与发酵, 2008, 6（44）: 1-13），提取率提高到14.17%、11.82%、8.81%（质量分数），葡聚糖、甘露聚糖制备时间缩短到2.5h，碱用量减少到1.12%（质量分数）。

（6）本发明获得的酵母葡聚糖、甘露聚糖和海藻糖的纯度分别达到了质量分数为92%、94%、99%。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不限于实施例。

实施例1：

①酶-碱法对啤酒酵母进行破壁

干酵母粉加入到15 mL缓冲液使其浓度为80 g/L，调初始pH为6.0，按木瓜蛋白酶与中性蛋白酶以酶活单位9:1，调节加入蛋白酶使每克干酵母粉加入32000U，60℃水解1 h。向水解液中加入NaOH，使其质量分数 1.12%，51.9℃恒温1.0 h，得水解液。

所述干酵母粉是将新鲜的啤酒酵母用自来水洗3-4次后，2500r/min离心5min，沉淀50℃烘干，粉碎，过80目筛。

所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶均为食品级；

所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液。

②酵母多糖的分离纯化

水解液经4000r/min离心10min，所得沉淀经Seveage法脱蛋白、石油醚脱脂，浓缩干燥得酵母葡聚糖产品。所得上清经30000 D(分子量)、3000 D(分子量)分级超滤，其截留液经Seveage法脱蛋白、浓缩干燥得酵母甘露聚糖，其滤液经活性炭脱色、Seveage法脱蛋白浓缩干燥得海藻糖。

所述超滤过程所用超滤膜为美国Milliper公司超滤管；

所述Seveage法脱蛋白是去除游离蛋白的有效方法。在粗多糖溶液中加入氯仿—正丁醇混合溶液,将游离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离去除。

当前发明制备的酵母葡聚糖、甘露聚糖和海藻糖的提取率质量分数为14.17%、11.82%、8.81%，纯度质量分数分别为89.0%、92.0%、98.4%，碱用量质量分数为1.12%。葡聚糖、甘露聚糖制备时间为2.5h。

实施例2：

①酶-碱法对啤酒酵母进行破壁

干酵母粉加入到15 mL缓冲液使其浓度为75.0 g/L，调初始pH为6.5，按木瓜蛋白酶与中性蛋白酶以酶活单位10:1，调节加入蛋白酶使每克干酵母粉加入35000U，60℃水解1.5 h。向水解液中加入NaOH，使其质量分数 1.5%，55℃恒温1.5 h，得水解液。

所述干酵母粉是将新鲜的啤酒酵母用自来水洗3-4次后，2500r/min离心5min，沉淀在50℃烘干，粉碎，过80目筛。

所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶均为食品级。

所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液。

②酵母多糖的分离纯化

水解液经4000r/min离心10min，沉淀经Seveage法脱蛋白、石油醚脱脂，浓缩干燥得酵母葡聚糖产品。上清经30000 D(分子量)、3000 D(分子量)分级超滤，截留液经Seveage法脱蛋白、浓缩干燥得酵母甘露聚糖，滤液经活性炭脱色、Seveage法脱蛋白浓缩干燥得海藻糖。

所述超滤过程所用超滤膜为美国Milliper公司超滤管；

所述Seveage法脱蛋白是去除游离蛋白的有效方法。在粗多糖溶液中加入氯仿—正丁醇混合溶液,将游离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离去除。

当前发明获得的酵母葡聚糖、甘露聚糖和海藻糖的提取率质量分数为13.85%、11.36%、8.43%，纯度质量分数分别为88.0%、90.6%、97.2%。

实施例3：

①酶-碱法对啤酒酵母进行破壁

干酵母粉加入到15 mL缓冲液使其浓度为84.0 g/L，调初始pH为6.3，按木瓜蛋白酶与中性蛋白酶以酶活单位8:1，调节加入蛋白酶使每克干酵母粉加入31000U，60℃水解0.5 h。向水解液中加入NaOH ，使其质量分数为 1.0%，50℃恒温0.8 h，得水解液。

所述干酵母粉是将新鲜的啤酒酵母用自来水洗3-4次后，2500r/min离心5min，沉淀在50℃烘干，粉碎，过80目筛。

所述木瓜蛋白酶、中性蛋白酶均为食品级；

所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液。

②酵母多糖的分离纯化

水解液经4000r/min离心10min，沉淀经Seveage法脱蛋白、石油醚脱脂，浓缩干燥得酵母葡聚糖产品。上清经30000 D(分子量)、3000 D(分子量)分级超滤，截留液经Seveage法脱蛋白、浓缩干燥得酵母甘露聚糖，滤液经活性炭脱色、Seveage法脱蛋白浓缩干燥得海藻糖。

所述超滤过程所用超滤膜为美国Milliper公司超滤管；

所述Seveage法脱蛋白是去除游离蛋白的有效方法。在粗多糖溶液中加入氯仿—正丁醇混合溶液,将游离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离去除。

当前发明获得的酵母葡聚糖、甘露聚糖和海藻糖提取率质量分数为13.60%、11.06%、8.22%，纯度质量分数分别为87.9%、90.61%、96.8%。

Claims (8)

1.一种制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，步骤如下：

①酶-碱法对啤酒酵母进行破壁

将干酵母粉加入到缓冲溶液中，使其浓度为75-85 g/L，调初始pH为5.5-6.5；按木瓜蛋白酶与中性蛋白酶以酶活单位8-10:1，加入木瓜蛋白酶与中性蛋白酶，使每克干酵母粉加入30000-35000U，60℃酶解0.5-1.5 h；向所得酶解液中加入NaOH碱解，使其质量分数为1-2%，50-55℃恒温0.5-1.5 h，得水解液；

②酵母多糖的分离纯化

将①制得的水解液经4000r/min离心10min，所得沉淀经Seveage法脱蛋白、石油醚脱脂，浓缩干燥得酵母葡聚糖产品，所得上清液依次经分子量为30000Da、3000Da的超滤膜超滤，其截留液经Seveage法脱蛋白、浓缩干燥得酵母甘露聚糖，其滤液经活性炭脱色、Seveage法脱蛋白、浓缩干燥得海藻糖。

2.如权利要求1所述的制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，所述酶解，为加入木瓜蛋白酶与中性蛋白酶催化酵母细胞壁蛋白水解。

3.如权利要求1所述的制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，所述碱解，为加入NaOH水解酵母细胞壁蛋白。

4.如权利要求1所述的制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，所述干酵母粉是将新鲜的啤酒酵母用自来水洗3-4次后，2500r/min离心5min，沉淀、50℃烘干，粉碎，过80目筛。

5.如权利要求1所述的制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液。

6.如权利要求1所述的制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，所述Seveage法脱蛋白，是去除游离蛋白的有效方法，在粗多糖溶液中加入氯仿—正丁醇混合溶液,将游离蛋白变性成为不溶性物质,经离心分离去除。

7.如权利要求1所述的制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，所述酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖，其提取率质量分数分别为13-15%、10-12%、7-10%，纯度质量分数分别为86-92%、90-94%、96-99%。

8.如权利要求1所述的制备酵母葡聚糖联产甘露聚糖及海藻糖的方法，所述葡聚糖、甘露聚糖制备时间为2-3h。