CN102898600A

CN102898600A - 一种固定化酶用的磁性三组分环氧大孔树脂及其制备方法

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Publication number: CN102898600A
Application number: CN2012104419867A
Authority: CN
Inventors: 段洪东; 齐慧敏; 卜娟; 王兴建; 孟霞
Original assignee: Shandong Institute of Light Industry
Current assignee: Shandong Institute of Light Industry
Priority date: 2012-11-08
Filing date: 2012-11-08
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2032-11-08
Also published as: CN102898600B

Abstract

本发明涉及一种磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法。采用悬浮聚合，以甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟乙酯为功能单体，以二甲基丙烯酸乙二醇酯为交联剂，以表面改性的四氧化三铁磁性纳米粒子为磁性粒子制备磁性三组分环氧基大孔树脂。合成产物中的羟基基团能够与酶互溶，且其较大的比表面积和环氧基团增加了与酶化学结合的活性点，同时，该聚合物在外加磁场的作用下能够快速运动和分离。因此，该树脂可以应用于固定化酶领域。

Description

一种固定化酶用的磁性三组分环氧大孔树脂及其制备方法

技术领域：

本发明涉及固定化酶生物技术领域，尤其涉及了一种用于固定化酶的磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法。

背景技术：

载体材料是成功固定化酶以及影响固定化酶活力高低的重要因素。由于酶蛋白的活性中心是酶催化的关键，同时，酶的空间结构也与酶活密切相关，因此，在固定过程中必须注意酶活性中心不受载体材料的影响。

从载体材料的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为无机载体、高分子载体、复合载体及新型载体等。无机载体的稳定性好、机械强度高、对酶和微生物无毒性、耐酸碱、成本较低，其不足之处在于结构不易调控，影响传质且键合酶的能力差。高分子载体包括天然高分子材料与合成高分子材料：（1）天然高分子材料如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，此类载体亲水性好，但机械强度差、易生物降解、成本高。(2)合成高分子材料包括很多种，常用的有聚丙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈等。此类载体的合成简单，与酶的共价键结合强度高。复合载体是将有机材料与无机材料复合组成的新型材料。目前主要有磁性高分子微球，这种载体可以在外加磁场的作用下，进行快速运动或分离。新型载体主要有：（1）介孔材料，介孔材料是一种多孔固体材料，它有蜂网状的通道，大小只有2~50nm，具有较大的孔径和比表面积，理论上具有较大的固载量。（2）环境敏感性载体，此类载体是非水溶性的，通过调节体系的温度或pH实现酶与底物和产物的分离。（3）导电载体，导电载体具有一定的电子传导性，在基于酶电极的生物传感器领域得到了广泛的应用，然而导电载体制备成本高，加工成型差不利于酶生物传感器的广泛应用。

2009年王霞等发表了关于磁性载体的文章，该文章中报道的反应体系是：首先甲基丙烯酸缩水甘油酯在油酸包裹的四氧化三铁上发生聚合反应引入环氧基，然后加入乙二胺引入氨基，最后加入戊二醛使载体和酶交联。虽然酶在载体上的活性没有减少，但是每克载体的装载酶量只有16.1mg/g[Xia Wang，Wen Wang, Yi Xu，and Zhi Li/Journal of the american chemical society . 220，131，12892-12893]。其后，又发表一篇文献，反应体系为：氨水共沉淀铁离子产生带有氨基的四氧化三铁颗粒，然后用戊二醛使酶和载体交联。方法虽然巧妙的利用四氧化三铁上残留的氨基，但是酶的装载量有限，文献中并没有给出具体数值[Xia Wang，Peipei Dou， Peng Zhao，Yi Ding，and Ping Xu/ ChemSusChem. 2009, 2,947-950]。为进一步提高磁性固定化酶载体材料的性能及固载量，我们合成了磁性三组分环氧基大孔树脂，该树脂除了具有磁性外还具有一定的孔径分布和比表面积，相比其它文献，我们合成的产品具有一些优势。

发明内容：

本发明的目的是提供一种磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法。合成的树脂中含有磁性材料，能够快速运动和分离，同时该聚合物是一种多孔共聚物，具有一定的孔径分布和较大的比表面积；反应单体中含有环氧基团，羟基基团，所以聚合物与酶能够互溶，且能利用共价键固定化酶。因此，该类载体既具有磁性材料的优势，又有介孔材料的高固载量和天然高分子材料良好的亲水性。

本发明制备磁性三组分环氧基大孔树脂包括如下步骤：

磁性三组分环氧基大孔树脂的合成

表面改性的Fe₃O₄纳米粒子参考相关文献合成。

采用悬浮聚合，以去离子水、电解质氯化钠、分散剂聚乙烯醇吡咯烷酮和聚乙烯醇的混合物为分散相，电解质的用量为分散相用量的1.0%~15.0%，分散剂的用量为分散相用量的0.1wt%~5.0wt%；以功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯和甲基丙烯酸羟乙酯、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、混合致孔剂乙酸丁酯和正辛醇、油溶性引发剂偶氮二异丁腈、表面改性的Fe₃O₄纳米粒子为油相，超声使其完全分散，将其置于45~80℃的恒温水浴槽中反应6~10小时。含环氧基功能单体的用量为聚合相摩尔质量百分数的10.0%~90.0%；，含羟基功能单体的用量为聚合相摩尔质量百分数的5.0%~15.0%；交联剂用量为聚合相摩尔质量百分数10.0%~90.0%；磁性纳米粒子占油相的质量分数为0.2%~5.0%；引发剂用量为聚合相质量百分数0.1%~2.0%；混合致孔剂，二者的体积比为1:1~9:1；混合致孔剂同聚合相的体积比为1:3~3:1；分散相的体积同聚合相和混合致孔剂二者体积之和比3:1~12:1。

具体实施方式：

为了更好的理解本发明的技术方案，以下通过具体的实施例作进一步详细描述。

实施例1

250ml四口瓶中加入0.90g聚乙烯吡咯烷酮，0.07g聚乙烯醇，12.00g氯化钠和113.00g去离子水，在水浴中搅拌加热到45℃；将4.75g甲基丙烯酸缩水甘油酯，2.31g二甲基丙烯酸乙二醇酯，0.56g甲基丙烯酸羟乙酯，0.08g偶氮二异丁腈，9.27g乙酸丁酯，1.25g正辛醇和0.19g表面改性的Fe₃O₄纳米粒子加入到50ml单口烧瓶中，常温超声分散均匀；将混匀的反应性单体加入到四口瓶中，63℃恒温反应4h后，在75℃恒温反应2h，然后在80℃恒温反应3h，得到一定粒径分布的磁性微球；然后用乙醇将微球中的致孔剂萃取出来，再用去离子水淋洗微球，最后将磁性微球置于40℃下真空干燥至恒重。

实施例2

250ml四口瓶中加入0.90g聚乙烯吡咯烷酮，0.07g聚乙烯醇，12.00g氯化钠和113.00g去离子水，在水浴中搅拌加热到45℃；将3.83g甲基丙烯酸缩水甘油酯，4.11g二甲基丙烯酸乙二醇酯，0.54g甲基丙烯酸羟乙酯，0.08g偶氮二异丁腈，9.27g乙酸丁酯，1.25g正辛醇和0.19g表面改性的Fe₃O₄纳米粒子加入到50ml单口烧瓶中，常温超声分散均匀；将混匀的反应性单体加入到四口瓶中，63℃恒温反应4h后，在75℃恒温反应2h，然后在80℃恒温反应3h，得到一定粒径分布的磁性微球；然后用乙醇将微球中的致孔剂萃取出来，再用去离子水淋洗微球，最后将磁性微球置于40℃下真空干燥至恒重。

实施例3

250ml四口烧瓶中加入0.90g聚乙烯吡咯烷酮，0.07g聚乙烯醇，12.00g氯化钠和113.00g去离子水，在水浴中搅拌加热到45℃；将3.00g甲基丙烯酸缩水甘油酯，4.97g二甲基丙烯酸乙二醇酯，0.52g甲基丙烯酸羟乙酯，0.08g偶氮二异丁腈，9.27g乙酸丁酯，1.25g正辛醇和0.19g表面改性的Fe₃O₄纳米粒子加入到50ml单口烧瓶中，常温超声分散均匀；将混匀的反应性单体加入到四口瓶中，63℃恒温反应4h后，在75℃恒温反应2h，然后在80℃恒温反应3h，得到一定粒径分布的磁性微球；然后用乙醇将微球中的致孔剂萃取出来，再用去离子水淋洗微球，最后将磁性微球置于40℃下真空干燥至恒重。

实施例4

250ml四口烧瓶中加入0.90g聚乙烯吡咯烷酮，0.07g聚乙烯醇，12.00g氯化钠和113.00g去离子水，在水浴中搅拌加热到45℃；将2.2g甲基丙烯酸缩水甘油酯，5.76g二甲基丙烯酸乙二醇酯，0.50g甲基丙烯酸羟乙酯，0.08g偶氮二异丁腈，9.27g乙酸丁酯，1.25g正辛醇和0.19g表面改性的Fe₃O₄纳米粒子加入到50ml单口烧瓶中，常温超声分散均匀；将混匀的反应性单体加入到四口瓶中，63℃恒温反应4h后，在75℃恒温反应2h，然后在80℃恒温反应3h，得到一定粒径分布的磁性微球；然后用乙醇将微球中的致孔剂萃取出来，再用去离子水淋洗微球，最后将磁性微球置于40℃下真空干燥至恒重。

实施例5

250ml四口烧瓶中加入0.90g聚乙烯吡咯烷酮，0.07g聚乙烯醇，12.00g氯化钠和113.00g去离子水，在水浴中搅拌加热到45℃；将1.83g甲基丙烯酸缩水甘油酯，6.13g二甲基丙烯酸乙二醇酯，0.50g甲基丙烯酸羟乙酯，0.08g偶氮二异丁腈，9.27g乙酸丁酯，1.25g正辛醇和0.19g表面改性的Fe₃O₄纳米粒子加入到50ml单口烧瓶中，常温超声分散均匀；将混匀的反应性单体加入到四口瓶中，63℃恒温反应4h后，在75℃恒温反应2h，然后在80℃恒温反应3h，得到一定粒径分布的磁性微球；然后用乙醇将微球中的致孔剂萃取出来，再用去离子水淋洗微球，最后将磁性微球置于40℃下真空干燥至恒重。

实验例：

采用QuadraSorb SI4 -中孔分析多站物理吸附仪测定实施例1~5磁性树脂的孔径及其表面积，并用Bradford法进行固定化酶量的检测。

在100ml锥形瓶中，加入1.0g湿树脂，20.0ml 5mg/ml的纤维素酶溶液和30.0ml pH=4.8的醋酸缓冲溶液，在集热恒温加热磁力搅拌器中采用水浴加热，在磁力搅拌，50℃，200r/min条件下转动12h，然后检测纤维素酶的固定化量。每种树脂的纤维素酶固定化都采用上述步骤，为保证实验的准确性，加入空白实验。在进行纤维素酶的固定化时，在水浴中加入一个装有10.0ml 5mg/ml的纤维素酶溶液和15.0ml pH=4.8的磷酸缓冲溶液的50ml的锥形瓶，加热同样的时间。实验结束后，待溶液冷却到室温时，测试纤维素酶的固定化量。

以考马斯亮蓝G250为指示剂，采用Bradford法进行固定化酶量的检测。树脂固定化酶后，待冷却至室温，取0.5ml上清酶液，加入0.5mlpH=4.8的醋酸缓冲溶液，然后加入5.0mlDNS显色剂并摇匀，静止5min后在540nm下检测溶液的吸光光度值，然后同为固定化的游离纤维素酶比较，通过计算二者的吸光光度值差值对比牛血清蛋白标准曲线得到树脂的固定化纤维素酶（结果见表1）。

表1 磁性多孔树脂的物理数据及固定化酶量

研究结果表明：该磁性树脂具有较高的酶固载量。

Claims

1.一种磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法，其特征是：采用悬浮聚合，聚合相由功能单体、交联剂、表面改性的四氧化三铁磁性纳米粒子、引发剂和致孔剂组成；分散相是由去离子水、无机盐和分散剂组成。

2.根据权利要求1所述磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法，其特征是：该制备方法合成的具有磁性的三组分环氧基大孔树脂可用于固定化酶。

3.根据权利要求1所述磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法，其特征是：功能单体甲基丙烯酸缩水甘油酯的用量占聚合相摩尔质量百分数的10.0%~90.0%；功能单体甲基丙烯酸羟乙酯或二甲基丙烯酸甘油酯的用量占聚合相摩尔质量百分数的5.0%~15.0%；交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、四乙二醇二甲基丙烯酸酯或双季戊四醇五丙烯酸酯用量占聚合相摩尔质量百分数的10.0%~90.0%；表面改性的四氧化三铁纳米粒子占聚合相的质量百分数为0.2~5.0%；引发剂偶氮二异丁腈或过氧化二苯甲酰的用量占聚合相质量百分数的0.1%~2.0%；致孔剂乙酸丁酯和正辛醇同聚合相的体积比为1:3~3:1。

4.根据权利要求1所述磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法，其特征是：无机盐为氯化钠、氯化钾或氯化钙中的任意一种，且其用量为分散相用量的1.0 wt %~15.0 wt %；分散剂为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的混合物，且其用量为分散相用量的0.1wt%~5.0wt%。

5.根据权利要求4所述磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法，其特征是：分散剂为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的混合物，且其质量比为20：1~1：1。

6.根据权利要求6所述的磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法，其特征是：致孔剂中乙酸丁酯和正辛醇的体积比为1:1~9:1。

7.根据权利要求1所述磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法，其特征是：表面改性的四氧化三铁纳米粒子参考相关文献合成。

8.根据权利要求1所述的磁性三组分环氧基大孔树脂及其制备方法，其特征是：悬浮聚合的分散相的体积同聚合相体积之和比为3:1~12:1。

9.根据权利要求1所述的磁性三组分环氧基大孔树脂制备方法，其合成步骤为：磁性三组分环氧基大孔树脂的制备

a.向反应釜中加入按照一定比例混合的聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇、氯化钠和去离子水，搅拌、水浴加热至45~60℃；

b.将一定量的功能单体、交联剂、引发剂、致孔剂、表面改性的四氧化三铁磁性纳米粒子加入另一搅拌釜中，超声分散混匀；将混匀的功能单体单体、交联剂、引发剂、致孔剂、磁性粒子加入到a所述的反应体系中，选择合适的转速，然后升温到63~75℃恒温反应3~5h，再升温到75~85℃恒温反应2~4h，最后升温到80~90℃保温2~4h，得到一定粒径分布的磁性三组分环氧基大孔树脂。

c.反应结束后用有机溶剂乙醇、丙酮等将微球中的致孔剂抽提萃取出来，然后再用去离子水淋洗微球，最后，将所得产品在40~80℃下真空干燥至恒重。