CN108169305A - 以水分子为催化反应基底的电信号标记物及传感方法 - Google Patents
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Abstract
以水分子为催化反应基底的电信号标记物，所述的电信号标记物为多肽‑铜离子络合物，所述的多肽的序列特征是XYH三肽，从N‑端开始计算，第三个氨基酸H是组氨酸，X、Y是除组氨酸和脯氨酸之外的任意氨基酸。以水分子为催化反应基底的传感方法，包括以下步骤：A：识别探针/多肽‑铜离子/纳米金复合物的制备，B：工作电极的制备；C：将得到的电极采用循环伏安法进行电化学测试。本发明采用水分子作为电化学传感器催化反应的基底，具有环境友好、操作简单、成本较低、稳定性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学检测方法，特别涉及以水分子为催化反应基底的电信号标记物及传感方法，属于化学技术领域。
背景技术
电化学传感器在生物分析、临床诊断等方面具有广大的应用前景。目前，酶（如过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸单酯酶）是电化学传感器常用的电信号标记物，然而，这些天然酶具有一些潜在的缺点，比如，稳定性差、成本高、制备较困难。此外，过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶的金属催化中心被埋藏在蛋白质中间，在电极表面不易直接发生电子传递；碱性磷酸单酯酶的催化产物抗氧化能力较差、电信号较弱、容易形成聚合物而钝化电极。并且这些酶都需要采用特殊的酶催化基底（如过氧化氢、葡萄糖等），检测程序复杂。这些问题严重限制了电化学传感器的实际应用。目前，尚未见以水分子作为酶基底和以水氧化催化剂作为电信号标记物的电化学传感器。介于水的丰富性及清洁性，基于模拟酶的稳定性好、容易合成、尺寸小等优点，开发研制一种以水分子作为催化反应基底的电化学传感器具有非常好的的应用前景。
电催化水氧化体系是利用电化学方法来研究水分子催化氧化的一种研究体系。自1982年首例具有催化活性的均相水氧化催化剂“blue dimmer”（双核联吡啶钌配合物）被报道以来，含Ru, Ir, Mn, Co, Fe 和Cu的配合物及半导体氧化物不断被发现。铜是自然界中较为丰富廉价的过多金属元素。2012年，Mayer研究小组报道了首例铜离子络合物的水氧化电催化剂（A soluble copper–bipyridine water-oxidation electrocatalyst, Nat.Chem., 2012, 4, 498-502），这类催化剂是以双吡啶作为铜离子的配体。以吡啶衍生物为配体，随后，人们报道了一系列基于铜离子络合物的电催化剂（A Biomimetic CopperWater Oxidation Catalyst with Low Overpotential，J. Am. Chem. Soc. 2014, 136,273−281；Electrocatalytic Water Oxidation by a Homogeneous Copper CatalystDisfavors Single-Site Mechanisms, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 8586−8600;Electrocatalytic Water Oxidation by a Copper(II) Complex of an Oxidation-Resistant Ligand, ACS Catal., 2017, 7, 3384−3387; Oxygen reduction catalyzedby a water-soluble binuclear copper(II) complex from a neutral aqueoussolution, Chem. Commun., 2017, 53, 3189-3192），这类催化剂对水分子的电催化具有较好的稳定性和较高的催化效率，相对于贵金属与低催化速率的其他非贵金属，这类催化剂的优势十分明显。然而，这些催化剂往往需要在较高的pH（大于11）及电位（大于1 V，相对于Ag/AgCl参比电极）下才能进行催化。
金属离子能够与生物分子相互作用，形成具有催化活性的配合物（金属酶）。在大多数金属酶中，金属离子是与多肽形成络合物的，生物体内很多生物化学反应都是在这种金属酶的催化作用下完成的。此外，多肽配体的结构可以调控、容易合成，多肽侧链上的基团可以用于将多肽修饰到电极或载体材料表面。Mayer研究小组报道了多肽GGGG-Cu(II)络合物可以催化水分子的电氧化(Electrocatalytic Water Oxidation with a Copper(II)Polypeptide Complex, J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 2048−2051），然而，该多肽需要在pH 11的条件下才能脱去肽键上的质子而与铜离子形成金属络合物，此外，GGGG-Cu(II)络合物需要在1.32 V的电压下才能催化水分子的电氧化。高的pH将会破环生物分子之间的相互作用，高的氧化电位将会产生较大的背景电流，因此，GGGG-Cu(II)络合物不适合用作电化学传感器的电信号标记物。研制能够在中性pH（本发明的中性pH环境指pH值为6-8）、低电压的条件下即可催化水分子氧化的电化学传感标记物及电化学传感器有着广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服目前的电化学传感器中存在的上述问题，提供一种以水分子为催化反应基底的电信号标记物及传感方法。
为实现本发明的目的，采用了下述的技术方案：以水分子为催化反应基底的电信号标记物，所述的电信号标记物为多肽-铜离子络合物，所述的多肽的序列特征是XYH三肽，从N-端开始计算，第三个氨基酸H是组氨酸，X、Y是除组氨酸和脯氨酸之外的任意氨基酸；进一步的；所述的多肽为DCH或CDH或ECH或CEH。
以水分子为催化反应基底的传感方法，所述的传感方法采用上述的电信号标记物，包括以下步骤：
A：识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的制备，包括以下子步骤：
A1：纳米金粒子的合成；
采用前驱体为氯金酸，还原剂为柠檬酸钠，将氯金酸溶液加热至沸腾，然后快速加入柠檬酸钠溶液，继续加热沸腾30分钟，然后将溶液冷却到室温，即得到柠檬酸稳定的纳米金粒子溶液；
A2：识别探针/多肽/纳米金复合物的合成；
用移液枪取出A1得到的纳米金粒子溶液，然后加入包含识别探针的PBS溶液，PBS溶液浓度为2 mM, pH 为7.0，静止12小时以上得到识别探针修饰的纳米金，再向反应溶液中加入多肽溶液，震荡混合12小时以上得到识别探针/多肽/纳米金复合物，将该反应产物离心分离，弃除上层未反应的识别探针和多肽，将所得沉淀物用二次水洗涤后，再用PBS溶液分散；
A3：识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的合成;
向A2所得的分散液中加入含硫酸铜的PBS溶液，得到识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物，低温保存备用；
B：工作电极的制备；
B1：在金电极表面修饰捕获探针，将金电极浸泡在含有捕获探针的溶液中；
B2：采用6-巯基己醇封闭B1得到的电极上的未反应的金表面，将B1得到的电极在1 mM的6-巯基己醇溶液中浸泡2小时，再用乙醇和蒸馏水冲洗电极表面，晾干；
B3：检测目标物和识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物捕获，将B2得到的电极在含检测目标物和识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的PBS溶液中浸泡，再用蒸馏水冲洗干净电极表面，晾干；
C：将B3得到的电极采用循环伏安法进行电化学测试;
进一步的；步骤A3得到的识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物低温保存备用，所述的保存温度为4 ℃；
进一步的；步骤B1中的金电极直径为2 mm，捕获探针溶液中的捕获探针分子的浓度为2µM，捕获探针溶液采用包含10 mM TCEP、1 mM EDTA和0.1 M NaCl的Tris缓冲溶液配制，Tris缓冲溶液的浓度为10 mM，pH为7.4；
进一步的；步骤B2中的6-巯基己醇用乙醇溶解，浓度为1 mM；
进一步的；步骤B3中的检测目标物用包含0.1 M NaCl的PBS缓冲溶液配置，PBS缓冲溶液的浓度为10 mM，pH为7.4；
步骤C中电化学测试采用三电极体系，步骤B3制备得到的电极作为工作电极，饱和的Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为辅助电极, 电解质为0.2 M的PBS缓冲溶液，pH 7.4。
本发明所提供的以水分子为催化反应基底的电信号标记物及传感方法的有益技术效果为：本发明采用水分子作为电化学传感器催化反应的基底，具有环境友好、操作简单、成本较低、稳定性好等优点；采用多肽-铜离子络合物作为水分子氧化的电催化剂及电信号标记物，具有稳定性好、分子量小、容易合成、能够在电极表面发生直接电子转移等优点；本发明多肽-铜离子络合物作为电信号标记物可在中性pH环境及低电压下的条件下使用，不会破坏生物分子之间的相互作用，能够满足生物分析、临床诊断的需要，本方法中采用纳米金作为电催化剂和识别分子的载体，有利于增加电催化剂的装载量、增强导电性、提高传感器的灵敏性。
附图说明
图1是纳米金和DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物的紫外-可见吸收光谱图。
图2为DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物的透射电镜表征图。
图3是捕获探针DNA-3修饰电极在经过不同浓度的检测目标物DNA-2修饰步骤后，再经DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物修饰步骤处理的循环伏安图。
图4为捕获探针DNA-3修饰电极在经过不同浓度的检测目标物DNA-2修饰步骤后，再经DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物修饰步骤处理的峰电流与检测目标物DNA-2浓度的线性关系。
图5是传感器对不同序列的DNA的响应图。
图6是氧化电流强度与凝血酶浓度的关系图。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，提供本发明的实施实例。这些实施实例仅仅是对该工艺的阐述，不限制本发明的范围，本发明中用以下实施例说明，但不限于下述实施例，任何变化实施都包含在本发明的技术范围内。
本发明中所述的电信号标记物为多肽-铜离子络合物，所述的多肽的序列特征是XYH三肽，从N-端开始计算，第三个氨基酸H是组氨酸， X、Y是除组氨酸和脯氨酸之外的任意氨基酸。本发明中各种缩写所代表的物质分别为：
实施例1中的识别探针：DNA-1，5’-TTATAACTATTCCTATTTTT-(CH2)6-SH-3’；
实施例1中的检测目标物：DNA-2，5’-TAGGAATAGTTATAACTGGCCGTCGTTTTAC-3’；实施例1中的捕获探针：DNA-3，5’-SH-(CH2)6-GTAAAACGACGGCCAG-3’；
PBS：磷酸盐缓冲液，MCH：6-巯基己醇；Tris，三羟甲基氨基甲烷；TCEP，三(2-羧乙基)膦；M、mM、µM、nM、pM均为浓度单位，分别代表mol/L、10-3 mol/L、10-6 mol/L、10-9 mol/L、10-12 mol/L。图1中，曲线a为纳米金的紫外-可见吸收光谱图，曲线b为DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物的紫外-可见吸收光谱图，图2为DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物的透射电镜表征图。图3为DNA-3修饰的电极在经过不同浓度的目标DNA-2和DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物修饰步骤处理的循环伏安图， DNA-2的浓度从下向上依次为0, 0.1, 0.5, 1, 2,2.5, 5和10 pM，支持电解质为0.2 M的PBS溶液；图4为0.9 V处的峰电流与DNA-2浓度的线性关系。图5为电极在经过空白样品、目标检测物DNA-2、单碱基错配、三碱基错配完全不互补的DNA序列修饰步骤的电流响应，图中的柱1~5分别对应的是：空白样品，目标检测物DNA-2，单碱基错配序列，三碱基错配序列，完全不互补序列。检测目标物DNA-2的浓度为10 pM，其它序列的浓度均为100 pM。单碱基错配、三碱基错配、完全不互补的DNA的序列依次是：
单碱基错配：5’-TAGGAATAGTTATAACTGGCCGTAGTTTTAC-3’；
三碱基错配：5’-TAGTAATAGTTATAACTAGCCGTAGTTTTAC-3’；
完全不互补：5’-TAGGAATAGTTATAAAAAGCTGACCAGACAG-3’。
实施例2中的识别探针为适配体1，捕获探针为适配体2，
适配体1序列为：5’-HS(CH2)6-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3’，
适配体2序列为：5’-HS(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG-3’，
实施例2中的检测目标物为凝血酶。
实施例1：DNA的检测；检测目标物：DNA-2，
A：DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物的的制备；
A1：纳米金粒子的合成：采用体积比为1:3的HNO3/HCl混合液将三颈烧瓶、球形冷凝管、量筒清洗干净，晾干。往三颈烧瓶中加入50 mL 1 mM的HAuCl4，加热至沸腾，然后快速加入5mL 38.8 mM的柠檬酸钠溶液，继续加热沸腾30分钟，然后将该红色溶液冷却到室温，于4℃的冰箱中储存2天后备用；
A2：DNA-1/多肽/纳米金复合物的合成：用移液枪取出上述纳米金溶液0.5 mL，然后加入0.5 mL包含40 nM识别探针DNA-1和500 µM TCEP的PBS缓冲溶液（10 mM，pH 7.4），静置30分钟后，再加入0.5 mL含10 µM DCH多肽的PBS溶液，震荡混合12小时。于13000 rpm/min的转速下离心，弃除上层未反应的DNA-1和DCH多肽。将所得的DNA-1/多肽/纳米金复合物用PBS溶液离心洗涤两次，最后将该复合物用PBS溶液分散；
A3：DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物的合成：向上述DNA-1/多肽/纳米金复合物中加入1.5 mL含3 µM 硫酸铜的PBS溶液，即得到DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物，保存于4℃冰箱中备用。所合成的DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物采用紫外-可见分光光度计和透射电镜表征。从图1可以看出，所合成的纳米金在520 nm处有一个较强的吸收峰（曲线a），经DNA-1和多肽-铜离子修饰后，纳米金粒子的吸收峰位置没有发生明显变化（曲线b），表明DNA-1和多肽-铜离子的修饰并没有导致纳米金聚集；图2中的投射电镜图谱也表明DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物呈现单分散状态；
B：工作电极的制备；
B1：在金电极表面修饰捕获探针DNA-3，即将直径为2 mm的金电极在含2 µM的捕获探针DNA-3、10 mM TCEP、1 mM EDTA和0.1 M NaCl的Tris（10 mM，pH 7.4）中浸泡12小时以上，再用二次水冲洗电极表面，自然晾干；
B2：采用6-巯基己醇（MCH）封闭B1得到的电极上的未反应的金表面，即将B1得到的电极在1 mM的MCH溶液中浸泡2小时，再用乙醇和蒸馏水冲洗电极表面，自然晾干；
B3： DNA-2和DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物捕获，将B2得到的电极在50 µL含一定浓度目标DNA-2和1 nM的DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物的PBS溶液中浸泡1小时，再用蒸馏水冲洗干净电极表面，自然晾干；
C：电化学测试；
电化学检测采用三电极体系，DNA-1/多肽-铜离子/纳米金复合物修饰的金电极为工作电极，饱和的Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为辅助电极。测试结果如图3所示。曲线a~h是工作电极经过B1-B3步骤的循环伏安测试结果，图中的氧化峰是由该电催化剂催化水氧化而产生的。从图中可以看出，催化峰电流随着DNA-2浓度的增加而增加，说明电极吸附电催化剂的数量取决于DNA-2的浓度，图4为氧化电流与DNA-2浓度的关系。从图4可以看出，电流强度随DNA-2浓度（0~2.5 pM）的增加而呈线性增加，表明该方法可以用于DNA-2的定量检测。检测限为0.1 pM。以上结果表明该类水氧化催化剂可以用作电化学传感器的电信号标记物。
对DNA-2类似序列的响应实施例：
将步骤B3中DNA-2换成其它待测试的序列，其它步骤的条件不改变，实验结果如图5所示。从图5中可以看出，单碱基错配序列产生的催化峰电流远远小于DNA-2产生的催化峰电流，三碱基错配和完全不匹配的序列产生的电流接近于空白样品。因此，该方法可以特异性检测DNA序列。图5中的柱1~5分别对应的是：空白样品，目标DNA-2，单碱基错配序列，三碱基错配序列，完全不互补序列。目标DNA-2的浓度为10 pM，其它序列的浓度均为100 pM。
实施例2：蛋白质的检测；检测目标物：凝血酶
A：识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的的制备；
A1：纳米金粒子的合成：采用体积比为1:3的HNO3/HCl混合液将三颈烧瓶、球形冷凝管、量筒清洗干净，晾干。往三颈烧瓶中加入50 mL 1 mM的HAuCl4，加热至沸腾，然后快速加入5mL 38.8 mM的柠檬酸钠溶液，继续加热沸腾30分钟，然后将该红色溶液冷却到室温，于4 ℃的冰箱中储存2天后备用；
A2：识别探针/多肽/纳米金复合物的合成：用移液枪取出上述纳米金溶液0.5 mL，然后加入0.5 mL包含40 nM适配体1和500 µM TCEP的PBS缓冲溶液（10 mM，pH 7.4），静置30分钟后，再加入0.5 mL含10 µM DCH多肽的PBS溶液，震荡混合12小时。于13000 rpm/min的转速下离心，弃除上层未反应的适配体和DCH多肽。将所得的适配体/多肽/纳米金复合物用PBS溶液离心洗涤两次，最后将该复合物用PBS溶液分散；
A3：识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的合成：向上述识别探针/多肽/纳米金复合物中加入1.5 mL含3 µM 硫酸铜的PBS溶液，即得到适配体/多肽-铜离子/纳米金复合物，保存于4 ℃冰箱中备用；
B：工作电极的制备；
B1：在金电极表面修饰捕获探针，即将直径为2 mm的金电极在含2 µM的适配体2、10 mMTCEP、1 mM EDTA和0.1 M NaCl的Tris（10 mM，pH 7.4）中浸泡12小时以上，再用二次水冲洗电极表面，自然晾干；
B2：采用6-巯基己醇（MCH）封闭B1得到的电极上的未反应的金表面，即将B1得到的电极在1 mM的MCH溶液中浸泡2小时，再用乙醇和蒸馏水冲洗电极表面，自然晾干；
B3： 凝血酶和识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物捕获，将B2得到的电极在50 µL含一定浓度凝血酶和2 nM的识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的PBS溶液中浸泡1小时，再用蒸馏水冲洗干净电极表面，自然晾干；
C：电化学测试；
电化学检测采用三电极体系，B3得到的识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物修饰的金电极为工作电极，饱和的Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为辅助电极。图6是氧化电流值与凝血酶浓度的关系。从图6中可以看出，电流强度随凝血酶浓度（0.005, 0.02, 0.1,0.2, 0.5 ng/mL）的增加而呈线性增加，检测限为0.001 ng/mL。表明该电化学信号标记物也适用于蛋白质的定量检测。
将实施例1、实施例2中的多肽更换为CDH、ECH、CEH重复以上步骤，可以得到相似的结果。
在详细说明本发明的实施方式之后，熟悉该项技术的人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围，且本发明亦不受限于说明书中所举实例的实施方式。
序列表
<110> 安阳师范学院
<120> 以水分子为催化反应基底的电信号标记物及传感方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ttataactat tcctattttt 20
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
taggaatagt tataactggc cgtcgtttta c 31
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
gtaaaacgac ggccag 16
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
taggaatagt tataactggc cgtagtttta c 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
tagtaatagt tataactagc cgtagtttta c 31
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
taggaatagt tataaaaagc tgaccagaca g 31
<210> 7
<211> 50
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
gccttaactg tagtactggt gaaattgctg ccattggttg gtgtggttgg 50
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
ggttggtgtg gttgg 15
Claims (7)
1.以水分子为催化反应基底的电信号标记物，其特征在于：所述的电信号标记物为多肽-铜离子络合物，所述的多肽的序列特征是XYH三肽，从N-端开始计算，第三个氨基酸H是组氨酸，X、Y是除组氨酸和脯氨酸之外的任意氨基酸。
2.根据权利要求1所述的以水分子为催化反应基底的电信号标记物，其特征在于：所述的多肽为DCH或CDH或ECH或CEH。
3.以水分子为催化反应基底的传感方法，所述的传感方法采用权利要求1所述的电信号标记物，其特征在于：包括以下步骤：
A：识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的制备，包括以下子步骤：
A1：纳米金粒子的合成；
采用前驱体为氯金酸，还原剂为柠檬酸钠，将氯金酸溶液加热至沸腾，然后快速加入柠檬酸钠溶液，继续加热沸腾30分钟，然后将溶液冷却到室温，即得到柠檬酸稳定的纳米金粒子溶液；
A2：识别探针/多肽/纳米金复合物的合成；
用移液枪取出A1得到的纳米金粒子溶液，然后加入包含识别探针的PBS溶液，PBS溶液浓度为2 mM, pH为7.0，静止12小时以上得到识别探针修饰的纳米金，再向反应溶液中加入多肽溶液，震荡混合12小时以上得到识别探针/多肽/纳米金复合物，将该反应产物离心分离，弃除上层未反应的识别探针和多肽，将所得沉淀物用二次水洗涤后，再用PBS溶液分散；
A3：识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的合成;
向A2所得的分散液中加入含硫酸铜的PBS溶液，得到识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物，低温保存备用；
B：工作电极的制备；
B1：在金电极表面修饰捕获探针分子，将金电极浸泡在含有捕获探针的溶液中；
B2：采用6-巯基己醇封闭B1得到的电极上的未反应的金表面，将B1得到的电极在1 mM的6-巯基己醇溶液中浸泡6-巯基己醇乙醇和蒸馏水冲洗电极表面，晾干；
B3：检测目标物和识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的捕获，将B2得到的电极在含检测目标物和识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物的PBS溶液中浸泡，再用蒸馏水冲洗干净电极表面，晾干；
C：将B3得到的电极采用循环伏安法进行电化学测试。
4.根据权利要求3所述的以水分子为催化反应基底的传感方法，其特征在于：步骤A3得到的识别探针/多肽-铜离子/纳米金复合物低温保存备用，所述的保存温度为4 ℃。
5.根据权利要求3所述的以水分子为催化反应基底的传感方法，其特征在于：步骤B1中的金电极直径为2 mm，捕获探针溶液中的捕获探针的浓度为2 µM，捕获探针溶液采用包含10 mM TCEP、1 mM EDTA和0.1 M NaCl的Tris缓冲溶液配制，Tris缓冲溶液的浓度为10 mM，pH为7.4。
6.根据权利要求3所述的以水分子为催化反应基底的传感方法，其特征在于：步骤B2中的6-巯基己醇用乙醇溶解，浓度为1 mM。
7.根据权利要求3所述的以水分子为催化反应基底的传感方法，其特征在于：步骤B3中的检测目标物用包含0.1 M NaCl的PBS缓冲溶液配置，PBS缓冲溶液的浓度为10 mM，pH为7.4；根据权利要求3所述的以水为催化反应基底的传感方法，其特征在于：步骤C中电化学测试采用三电极体系，步骤B3制备得到的电极作为工作电极，饱和的Ag/AgCl电极为参比电极，Pt电极为辅助电极，电解质为0.2 M的PBS缓冲溶液，pH 7.4。
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